CN107261136B - 多聚磷酸钠的应用及含有多聚磷酸钠的疫苗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多聚磷酸钠的应用及含有多聚磷酸钠的疫苗剂，属于免疫学技术领域。将多聚磷酸钠作为疫苗佐剂应用在疫苗中，每单份疫苗剂中含有多聚磷酸钠0.5mg～1.5mg。该疫苗剂的制备方法是在抗原剂中加入多聚磷酸钠，再加生理盐水至注射所需量，按常规混合均匀，即得含有多聚磷酸钠的疫苗剂。多聚磷酸钠作为疫苗佐剂，安全、稳定、毒副作用小，能够有效诱导抗原特异性的体液免疫应答，适当的免疫剂量组所诱导的体液免疫应答效果优于无佐剂组以及铝佐剂组，具有良好的应用前景。

Description

多聚磷酸钠的应用及含有多聚磷酸钠的疫苗剂
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及多聚磷酸钠的应用及含有多聚磷酸钠的疫苗剂。
背景技术
佐剂是一种能够增强对疫苗组分抗原特异性免疫应答或改变免疫反应的物质。铝佐剂是最早被批准用于人类疫苗的佐剂，作为广泛应用于多种疫苗的佐剂，铝佐剂具有较高的安全性，价格便宜，免疫应答持续时间长等优点，但同时也具有许多不足之处，如刺激局部产生红斑，肉芽肿，皮下结节，不能很好的诱导细胞免疫。铝盐佐剂在提高抗体水平和安全方面已获得长期的实践证实，但其与许多新型疫苗如重组蛋白和亚单位疫苗抗原共同免疫时不能有效的激发免疫应答，使之很难满足新型疫苗发展的需要。
随着生物技术的发展，尽管已有大量的新型疫苗佐剂处于研究开发和临床试验阶段，但是真正获得批准用于人用疫苗的佐剂屈指可数。
多聚磷酸盐是广泛存在于自然界中的线性多聚体，由多个磷酸盐残基(Pi)通过高能磷酸键聚合形成，常以钠盐、钾盐、钙盐等多种形式存在。多聚磷酸盐作为重要的食品添加剂广泛应用于食品工业中。近来的研究发现，多聚磷酸盐还与骨改建和骨代谢关系密切，促进成纤维细胞的增殖和成熟，促进成牙骨质细胞中骨桥蛋白的基因转录。
骨桥蛋白(OPN)是磷酸化、糖基化的细胞外基质蛋白，是骨形成和骨改建的标志性蛋白之一。OPN刺激骨的矿化，参与细胞免疫应答和组织修复，并与牙周炎和种植体周围炎相关。多聚磷酸盐和OPN在骨代谢和骨改建中发挥重要的生物学功能。
发明内容
现有疫苗佐剂不能很好的满足新型疫苗的需求，为解决这一问题，本发明提供一种有效的多聚磷酸钠佐剂以及含有多聚磷酸钠佐剂的疫苗剂。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
多聚磷酸钠作为疫苗佐剂的应用。
本发明还提供一种含有多聚磷酸钠的疫苗剂，每单份疫苗剂中含有多聚磷酸钠0.5mg～1.5mg。
所述的多聚磷酸钠为市购产品，分子式为分子式为Na5P3O10；分子量为367.91。
所述每单份疫苗剂为临床使用的常规单次注射参考量。
本发明同时提供上述含有多聚磷酸钠的疫苗剂的制备方法，在抗原剂中加入多聚磷酸钠，再加生理盐水至注射所需量，按常规混合均匀，即得含有多聚磷酸钠的疫苗剂。
所述抗原剂为常规甲肝抗原或乙肝抗原中的一种。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
（1）本次发明将多聚磷酸钠应用于疫苗佐剂，拓宽了新型疫苗佐剂的种类；
（2）本发明将多聚磷酸钠作为疫苗佐剂，多聚磷酸钠的安全性高，在水中的溶解度较高，可以延缓蛋白的降解而且价格便宜，具有较好的佐剂效应；
（3）本发明提供的多聚磷酸钠佐剂与乙肝亚单位抗原共同免疫，能力有效的激发小鼠体液免疫应答，并且产生抗体水平显著高于铝佐剂激发产生的抗体水平。说明多聚磷酸钠佐剂能与亚单位疫苗抗原共同免疫有效的激发免疫应答。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供的佐剂由下列成分组成：多聚磷酸钠0.5mg。
本实施例提供的含有多聚磷酸钠佐剂的疫苗是将多聚磷酸钠0.5mg、甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为200μL的疫苗液。该抗原为常规甲肝病毒灭活抗原，由中国医学科学院医学生物学研究所提供，多聚磷酸钠购于中国医药集团上海化学试剂公司。
实施例所得甲肝病毒灭活抗原疫苗的免疫试验和效果如下：
A、免疫
将5～6周龄、18～22g的清洁级ICR小鼠分为多聚磷酸钠佐剂组、氢氧化铝佐剂组、无佐剂组和空白组，共四组，每组6只。
多聚磷酸钠佐剂组是将实施例1所得含有多聚磷酸钠佐剂以及甲肝病毒灭活抗原的疫苗液200μL经背部皮下注射到小鼠体内。
氢氧化铝佐剂组是将氢氧化铝300ug、甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为200μL的疫苗液，经背部皮下注射到小鼠体内。
无佐剂组是将甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水均匀混合制备成总体积为200μL的疫苗液，再经背部皮下注射到小鼠体内。
空白组；仅对每只小鼠注射200μL生理盐水。
免疫方案：在第0周经背部皮下多点注射到小鼠体内，免疫次数为一次。
B、ELISA检测血清抗－HAV IgG水平
在免疫后的第4、8、12、16周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗－HAV IgG水平，按KPL公司生产的小鼠IgG ELISA试剂盒说明书进行检测操作。
C、数据分析
对所获得的实验数据进行单因素方差分析，以（P﹤0.05）认为差异具有统计学意义。
表1为使用实施例1提供的多聚磷酸钠佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAVIgG抗体水平（抗体效价值）。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
通过数据分析，除空白对照组外，各组小鼠在免疫后第4、8、12、16周，均产生抗-HAV IgG，抗体水平随着免疫时间延长而逐渐升高，于第12周达到峰值。
8周、12周、16周多聚磷酸钠组的抗体水平高于无佐剂组与铝佐剂组的抗体水平相近，表明单一的多聚磷酸钠0.5mg组具有一定的疫苗佐剂效应。
实施例2
本实施例提供的佐剂由下列成分组成：多聚磷酸钠1.0mg。
本实施例提供的含有多聚磷酸钠佐剂的疫苗是将多聚磷酸钠1.0mg、甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为200μL的疫苗液。该抗原为常规甲肝病毒灭活抗原，由中国医学科学院医学生物学研究所提供，多聚磷酸钠购于中国医药集团上海化学试剂公司。
本实施例所得甲肝病毒灭活抗原疫苗的免疫试验和效果如下：
A、免疫
将5～6周龄、18～22g的清洁级ICR小鼠分为多聚磷酸钠组、氢氧化铝佐剂组、无佐剂组和空白组，共四组，每组6只。
多聚磷酸钠组是将实施例2所得含有多聚磷酸钠佐剂以及甲肝病毒灭活抗原的疫苗液200μL经背部皮下注射到小鼠体内。
氢氧化铝佐剂组是将氢氧化铝300ug、甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为200μL的疫苗液，经背部皮下注射到小鼠体内。
无佐剂组是将甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水均匀混合制备成总体积为200μL的疫苗液，再经背部皮下注射到小鼠体内。
空白组；仅对每只小鼠注射200μL生理盐水。
免疫方案：在第0周经背部皮下多点注射到小鼠体内，免疫次数为一次。
B、ELISA检测血清抗－HAV IgG水平
在免疫后的第4、8、12、16周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗－HAV IgG水平，按KPL公司生产的小鼠IgG ELISA试剂盒说明书进行检测操作。
C、数据分析
对所获得的实验数据进行单因素方差分析，以（P﹤0.05）认为差异具有统计学意义。
表2为使用实施例2提供的多聚磷酸钠佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAVIgG抗体水平（抗体效价值）。
表2
Figure 105648DEST_PATH_IMAGE002
通过数据分析，除空白对照组外，各组小鼠在免疫后第4、8、12、16周，均产生抗-HAV IgG，抗体水平随着免疫时间延长而逐渐升高，于第12周达到峰值，此后逐渐下降。4周、8周、12周及16周，多聚磷酸钠组的抗体水显著高于无佐剂组且差异具有统计学意义（P﹤0.05）。12周，多聚磷酸钠组的抗体水平显著高于铝佐剂组且差异具有统计学意义（P﹤0.05）。表明单一的多聚磷酸钠具有较好的佐剂效应且在一定剂量可以优于铝佐剂组，但是多聚磷酸钠作为佐剂的持续性较铝佐剂差。
实施例3
本实施例提供的佐剂由下列成分组成：多聚磷酸钠1.5mg。
本实施例提供的含有多聚磷酸钠佐剂的疫苗是将多聚磷酸钠1.5mg、甲肝病毒灭活抗原、18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为200μL的疫苗液。该抗原为常规甲肝病毒灭活抗原，由中国医学科学院医学生物学研究所提供，多聚磷酸钠购于中国医药集团上海化学试剂公司。
本实施例所得甲肝病毒灭活抗原疫苗的免疫试验和效果如下：
A、免疫
将5～6周龄、18～22g的清洁级ICR小鼠分为多聚磷酸钠组、氢氧化铝佐剂组、无佐剂组和空白组，共四组，每组6只。
多聚磷酸钠组是将实施例3所得含有佐剂以及甲肝病毒灭活抗原的疫苗液200μL经背部皮下注射到小鼠体内。
铝佐剂组是将氢氧化铝300ug、甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水混合均匀制备成总体积为200μL的疫苗液，经背部皮下注射到小鼠体内。
无佐剂组是将甲肝病毒灭活抗原18EU与生理盐水均匀混合制备成总体积为200μL的疫苗液，再经背部皮下注射到小鼠体内。
空白组；仅对每只小鼠注射200μL生理盐水。
免疫方案：在第0周经背部皮下多点注射到小鼠体内，免疫次数为一次。
B、ELISA检测血清抗－HAV IgG水平
在免疫后的第4、8、12、16周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗-HAVIgG水平，按KPL公司生产的小鼠IgG ELISA试剂盒说明书进行检测操作。
C、数据分析
对所获得的实验数据进行单因素方差分析，以（P﹤0.05）认为差异具有统计学意义。
表3为使用实施例3提供的多聚磷酸钠佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAVIgG抗体水平（抗体效价值）。
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE003
通过数据分析，除空白对照组外，各组小鼠在免疫后第4、8、12、16周，均产生抗-HAV IgG，抗体水平随着免疫时间延长而逐渐升高，于第12周达到峰值，此后逐渐下降。12周，多聚磷酸钠组的抗体水平高于无佐剂组但差异不具有统计学意义（P>0.05）。4周、8周、12周、16周，多聚磷酸钠组的抗体水平均低于铝佐剂组，表明多聚磷酸钠的佐剂效应在一定剂量内具有剂量依赖性，达到一定剂量后出现下降，存在最佳剂量。
实施例4
本实施例提供的佐剂由下列成分组成：多聚磷酸钠0.5mg。
本实施例提供的含有多聚磷酸钠佐剂的疫苗是将多聚磷酸钠0.5mg、乙肝抗原与生理盐水混合均匀制备成总体积为200μL的疫苗液。乙肝抗原为常规的含乙肝表面抗原1μg，由中国医学科学院医学生物学研究所提供。多聚磷酸钠购于中国医药集团上海化学试剂公司。
本实施例所得乙肝抗原的免疫试验和效果如下：
A、免疫
将5～6周龄、18～22g的清洁级ICR小鼠分为多聚磷酸钠佐剂组、氢氧化铝佐剂组、无佐剂组和空白组，共四组，每组6只。
多聚磷酸钠佐剂组是将实施例4所得含有多聚磷酸钠佐剂以及乙肝抗原的疫苗液200μL经背部皮下注射到小鼠体内。
氢氧化铝佐剂组是将氢氧化铝300ug、乙肝抗原与生理盐水混合均匀制备成总体积为200μL的疫苗液，经背部皮下注射到小鼠体内。
无佐剂组是将乙肝抗原与生理盐水均匀混合制备成总体积为200μL的疫苗液，再经背部皮下注射到小鼠体内。
空白组；仅对每只小鼠注射200μL生理盐水。
免疫方案：在第0周经背部皮下多点注射到小鼠体内，免疫次数为一次。
B、ELISA检测血清抗－HBV IgG水平
在免疫后的第4、8、12、16周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗－HBV IgG水平，按KPL公司生产的小鼠IgG ELISA试剂盒说明书进行检测操作。
C、数据分析
对所获得的实验数据进行单因素方差分析，以（P﹤0.05）认为差异具有统计学意义。
表4为使用实施例4提供的多聚磷酸钠佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HBVIgG抗体水平（抗体效价值）。
表4
Figure 990165DEST_PATH_IMAGE004
通过数据分析，除空白对照组外，各组小鼠在免疫后第4、8、12、16周，均产生抗-HBV IgG，抗体水平随着免疫时间延长而逐渐升高，于第12周达到峰值。12周，多聚磷酸钠组的抗体水平高于无佐剂组且差异具有统计学意义（P﹤0.05），8周、16周多聚磷酸组的抗体水平高于无佐剂组但差异不具有统计学意义（P>0.05），与铝佐剂的抗体水平相近，表明单一的多聚磷酸钠0.5mg组具有一定的疫苗佐剂效应。
实施例5
本实施例提供的佐剂由下列成分组成：多聚磷酸钠0.75mg。
本实施例提供的含有多聚磷酸钠佐剂的疫苗是将多聚磷酸钠0.75mg、乙肝抗原与生理盐水混合均匀制备成总体积为200μL的疫苗液。乙肝抗原为常规的含乙肝表面抗原1μg，由中国医学科学院医学生物学研究所提供。多聚磷酸钠购于中国医药集团上海化学试剂公司。
本实施例所得乙肝抗原的免疫试验和效果如下：
A、免疫
将5～6周龄、18～22g的清洁级ICR小鼠分为多聚磷酸钠佐剂组、氢氧化铝佐剂组、无佐剂组和空白组，共四组，每组6只。
多聚磷酸钠佐剂组是将实施例5所得含有多聚磷酸钠佐剂以及乙肝抗原的疫苗液200μL经背部皮下注射到小鼠体内。
氢氧化铝佐剂组是将氢氧化铝300ug、乙肝抗原与生理盐水混合均匀制备成总体积为200μL的疫苗液，经背部皮下注射到小鼠体内。
无佐剂组是将乙肝抗原与生理盐水均匀混合制备成总体积为200μL的疫苗液，再经背部皮下注射到小鼠体内。
空白组；仅对每只小鼠注射200μL生理盐水。
免疫方案：在第0周经背部皮下多点注射到小鼠体内，免疫次数为一次。
B、ELISA检测血清抗－HBV IgG水平
在免疫后的第4、8、12、16周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗－HBV IgG水平，按KPL公司生产的小鼠IgG ELISA试剂盒说明书进行检测操作。
C、数据分析
对所获得的实验数据进行单因素方差分析，以（P﹤0.05）认为差异具有统计学意义。
表5为使用实施例5提供的多聚磷酸钠佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HBVIgG抗体水平（抗体效价值）。
表5
Figure DEST_PATH_IMAGE005
通过数据分析，除空白对照组外，各组小鼠在免疫后第4、8、12、16周，均产生抗-HBV IgG，抗体水平随着免疫时间延长而逐渐升高，于第12周达到峰值。12周、16周，多聚磷酸钠组的抗体水平高于无佐剂组且差异具有统计学意义（P﹤0.05），4周、8周多聚磷酸组的抗体水平高于无佐剂组但差异不具有统计学意义（P>0.05），4周、12周，多聚磷酸钠组的抗体水平与铝佐剂的抗体水平相近，表明单一的多聚磷酸钠0.75mg组具有一定的疫苗佐剂效应。
实施例6
本实施例提供的佐剂由下列成分组成：多聚磷酸钠1.0mg。
本实施例提供的含有多聚磷酸钠佐剂的疫苗是将多聚磷酸钠1.0mg、乙肝抗原与生理盐水混合均匀制备成总体积为200μL的疫苗液。乙肝抗原为常规的含乙肝表面抗原1μg，由中国医学科学院医学生物学研究所提供。多聚磷酸钠购于中国医药集团上海化学试剂公司。
本实施例所得乙肝抗原的免疫试验和效果如下：
A、免疫
将5～6周龄、18～22g的清洁级ICR小鼠分为多聚磷酸钠佐剂组、氢氧化铝佐剂组、无佐剂组和空白组，共四组，每组6只。
多聚磷酸钠佐剂组是将实施例6所得含有多聚磷酸钠佐剂以及乙肝抗原的疫苗液200μL经背部皮下注射到小鼠体内。
氢氧化铝佐剂组是将氢氧化铝300ug、乙肝抗原与生理盐水混合均匀制备成总体积为200μL的疫苗液，经背部皮下注射到小鼠体内。
无佐剂组是将乙肝抗原与生理盐水均匀混合制备成总体积为200μL的疫苗液，再经背部皮下注射到小鼠体内。
空白组；仅对每只小鼠注射200μL生理盐水。
免疫方案：在第0周经背部皮下多点注射到小鼠体内，免疫次数为一次。
B、ELISA检测血清抗-HBV IgG水平
在免疫后的第4、8、12、16周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗－HBV IgG水平，按KPL公司生产的小鼠IgG ELISA试剂盒说明书进行检测操作。
C、数据分析
对所获得的实验数据进行单因素方差分析，以（P﹤0.05）认为差异具有统计学意义。
表6为使用实施例6提供的多聚磷酸钠佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HBVIgG抗体水平。
表6
Figure 769903DEST_PATH_IMAGE006
通过数据分析，除空白对照组外，各组小鼠在免疫后第4、8、12、16周，均产生抗-HBV IgG，抗体水平随着免疫时间延长而逐渐升高，于第12周达到峰值。4周、8周、12周、16周，多聚磷酸钠组的抗体水平高于无佐剂组且差异具有统计学意义（P﹤0.05），12周，多聚磷酸钠组的抗体水平显著高于铝佐剂组且差异具有统计学意义（P﹤0.05）。4周、8周、16周，多聚磷酸钠组的抗体水平与铝佐剂组的抗体水平相近，表明单一的多聚磷酸钠1.0mg组具有较好的疫苗佐剂效应。多聚磷酸钠组的抗体水平于12周达到峰值后较铝佐剂组下降较快，说明多聚磷酸钠组佐剂效应的持久性较差。
实施例7
本实施例提供的佐剂由下列成分组成：多聚磷酸钠1.5mg。
本实施例提供的含有多聚磷酸钠佐剂的疫苗是将多聚磷酸钠1.5mg、乙肝抗原与生理盐水混合均匀制备成总体积为200μL的疫苗液。乙肝抗原为常规的含乙肝表面抗原1μg，由中国医学科学院医学生物学研究所提供。多聚磷酸钠购于中国医药集团上海化学试剂公司。
本实施例所得乙肝抗原的免疫试验和效果如下：
A、免疫
将5～6周龄、18～22g的清洁级ICR小鼠分为多聚磷酸钠佐剂组、氢氧化铝佐剂组、无佐剂组和空白组，共四组，每组6只。
多聚磷酸钠佐剂组是将实施例4所得含有多聚磷酸钠佐剂以及乙肝抗原的疫苗液200μL经背部皮下注射到小鼠体内。
氢氧化铝佐剂组是将氢氧化铝300ug、乙肝抗原与生理盐水混合均匀制备成总体积为200μL的疫苗液，经背部皮下注射到小鼠体内。
无佐剂组是将乙肝抗原与生理盐水均匀混合制备成总体积为200μL的疫苗液，再经背部皮下注射到小鼠体内。
空白组；仅对每只小鼠注射200μL生理盐水。
免疫方案：在第0周经背部皮下多点注射到小鼠体内，免疫次数为一次。
B、ELISA检测血清抗－HBV IgG水平
在免疫后的第4、8、12、16周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗－HBV IgG水平，按KPL公司生产的小鼠IgG ELISA试剂盒说明书进行检测操作。
C、数据分析
对所获得的实验数据进行单因素方差分析，以（P﹤0.05）认为差异具有统计学意义。
表7为使用实施例7提供的多聚磷酸钠佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HBVIgG抗体水平（抗体效价值）。
表7
Figure DEST_PATH_IMAGE007
通过数据分析，除空白对照组外，各组小鼠在免疫后第4、8、12、16周，均产生抗-HBVIgG，抗体水平随着免疫时间延长而逐渐升高，于第12周达到峰值。8周、12周、16周，多聚磷酸钠组的抗体水平高于无佐剂组但差异不具有统计学意义（P>0.05）。12周，多聚磷酸钠组的抗体水平与铝佐剂组相近，其余时间段的抗体水平低于铝佐剂组且下降较快。表明单一多聚磷酸钠具有一定的佐剂效应但持久性较铝佐剂组差。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (3)

1.多聚磷酸钠作为疫苗佐剂在制备疫苗中的应用，其特征在于疫苗的抗原为甲肝病毒灭活抗原或乙肝表面抗原，每单份疫苗剂中含有多聚磷酸钠1.0mg，所述每单份疫苗剂为临床使用的单次注射量200μL。
2.权利要求1所述的多聚磷酸钠作为疫苗佐剂在制备疫苗中的应用，其特征在于：所述的多聚磷酸钠为市购产品，分子式为分子式为Na5P3O10；分子量为367.91。
3.权利要求1所述的多聚磷酸钠作为疫苗佐剂在制备疫苗中的应用，其特征在于疫苗制备方法如下：在抗原剂中加入多聚磷酸钠，再加生理盐水至注射所需量，混合均匀，即得含有多聚磷酸钠的疫苗剂。
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