CN1943784A - 新型疫苗佐剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型疫苗佐剂，即低分子量乙酰硫酸肝素在制备免疫疫苗的佐剂方面的应用。所述低分子量乙酰硫酸肝素与疫苗联合应用能够有效增强疫苗的体液免疫应答，增强效果与铝佐剂相似，并且所述新型疫苗佐剂能够显著增强疫苗的细胞免疫应答，适应于治疗性疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种疫苗佐剂，尤其涉及低分子量乙酰硫酸肝素在制备疫苗免疫佐剂中的应用，属于免疫学领域。
背景技术
免疫识别的基本问题有：①为什么免疫系统知道哪些物质可以接受、哪些物质不能接受？②免疫识别的物质基础是什么？③免疫反应的始动因素是什么？④自我耐受是否存在？……等等。对以上问题的回答先后产生了下列4种不同的解释模式，这些模式不能互相代替，但能互相补充：(1)“有害—无害”模式——100年前，Paul Ehrlich提出抗体形成的“侧链”学说，认为免疫反应由抗原本身的“有害—无害”(noxious and non-noxious)属性所决定。(2)“自我—非自我”分辩模式——F.Burnet设想免疫识别可能是机体对“自我”和“非自我”物质的一种分辩功能，但是他提出的模式难以解释哺乳类母体不排斥胎儿现象。(3)“感染的非自我”与“非感染的自我”模式——Charles Janeway认为免疫识别主要是区别“感染的非自我”与“非感染的自我”。该学说忽略感染以外的抗原因素。(4)“危险信号”模式——P.Matzinger于1994年提出免疫系统根本不在意“自我—非自我”，仅在意是否对机体构成危害，认为细胞在受“难”时释放出一种或一类称之为“危险信号”的物质，该物质使处于静息状态的APC转变成激活状态的APC。只有激活状态的APC能够完成抗原递呈过程从而激活T细胞。危险信号包括热休克蛋白、核苷酸、氧自由基、透明质酸或肝素降解物、神经介质、白介素等。当组织处于应激状态、损伤或非正常死亡时释放内源性危险因子。
以上对免疫识别基本问题的回答有助于我们利用其作用机制，设计出新型疫苗佐剂，达到增强疫苗免疫效果的目的。其中危险信号模式为我们提供了全新的视野。2003年，Shi等鉴定出受损细胞质的尿酸是一个危险信号分子，尿酸与gp120混合免疫后，能够有效增强gp120的免疫原性，进一步分析发现，尿酸能够刺激树突状细胞成熟，促进其提呈外源抗原，激活T淋巴细胞并增强CD8+T淋巴细胞的CTL活性(Nature，2003，425：516-521)。2006年，KA Scheibner等发现高分子量透明质酸的降解片段即低分子量透明质酸是一个内源性危险信号(the Journal ofImmunology，2006，177：1272-1281)。透明质酸是一种带负电的高分子量葡胺聚糖，广泛分布于细胞外基质，是正常肺组织、关节、玻璃状液(vitreousfluid)基底膜组分，在水平衡、血浆蛋白分布与输送、关节润滑、基质结构等方面发挥重要作用。当机体组织受损，高分子量透明质酸(分子量200万～600万)在氧自由基以及酶的作用下解聚为低分子量透明质酸。低分子量透明质酸与TLR-2作用后，以依赖于MyD88、IL-1R相关激酶、TNFR相关因子-6、蛋白激酶Cζ、NF-κB的方式进行信号传导，激活机体的天然免疫应答；高分子量透明质酸则抑制TLR-2的信号传导。研究结果表明，低分子量透明质酸能够增强卵清蛋白(OVA)特异性的T细胞应答。
佐剂指与抗原同时或预先应用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力或改变免疫反应类型的物质。理想的佐剂应具有以下特点：有效性、安全性、稳定性、经济性。目前常用的佐剂包括铝佐剂、脂质体、弗氏佐剂、粘膜免疫佐剂、CpG序列、皂角甙、细胞因子、纳米粒子佐剂以及天然来源佐剂，它们都能够有效增强抗原的免疫原性，但是上市的人用疫苗佐剂经美国FDA批准的只有铝佐剂，近年来经欧盟批准上市的新型疫苗佐剂也只有MF59、重组霍乱毒素B亚单位和AS04。
为什么对佐剂的研究广泛深入，但是能够应用的却很少？这是因为有许多问题亟待解决：(1)毒副作用问题如铝佐剂、QS21等；(2)免疫途径问题；(3)靶向性问题，如脂质体佐剂；(4)应用范围(用于不同的抗原)问题，如铝佐剂等；(5)免疫剂量问题，如CpG-OND等；(6)免疫作用机制的不合理及作用机制不清楚问题，如铝佐剂不能诱导产生Th1型反应，干扰细胞免疫。
新型疫苗佐剂的研究开发致力于解决上述问题，达到有效、安全、稳定、经济的目的。Geoffrey BJ等发现(the Journal of Immunology，2002，168：5233-5239)，可溶性硫酸肝素利用TLR4激活树突状细胞。硫酸肝素是一种酸性多糖，位于细胞膜和细胞外基质。在组织损伤、机体发生炎症、肿瘤细胞转移过程中，硫酸肝素会快速从细胞表面和基底膜脱落。硫酸肝素的降解产物，即低分子量硫酸肝素，能够活化树突状细胞。提示脊椎动物TLR能够监控组织损伤，因此，植物、无脊椎动物和高度进化的脊椎动物都能够通过受体系统识别组织损伤的通用信号，即内源性分子片段化。目前，低分子量硫酸乙酰肝素被认为是一种新型抗血栓和抗肿瘤转移药物，具有很强的抗血栓和抗肿瘤活性，调节免疫功能和调血脂、抗动脉粥样硬化等作用，药理作用强，无明显毒副作用。
TLR-2/4是一类模式识别受体，表达于哺乳动物的抗原提呈细胞，能区别机体的正常与疾病状态。迄今已发现了10种TLR(TLR1～TLR10)。TLRs的激活不仅引起天然免疫应答，而且还激活获得性免疫应答。因此，靶向TLR的疫苗能诱导对抗原的特异性免疫应答。
发明内容
为解决现有疫苗佐剂存在的毒副作用、价格昂贵等问题，本发明的发明人在“内源性危险信号”的基础上，经过大量实验和创造性劳动，提供了一种安全、有效、稳定、便宜的新型疫苗佐剂。
本发明的技术方案是：低分子量乙酰硫酸肝素在制备疫苗的佐剂方面的应用。尤其是低分子量乙酰硫酸肝素在制备乙肝疫苗的佐剂的应用。它与乙肝表面抗原混合后免疫动物，能显著增强抗原特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答。
所述低分子量乙酰硫酸肝素指分子量为0.45～1万的乙酰硫酸肝素。
所述由低分子量乙酰硫酸肝素制备的佐剂诱导的免疫反应以细胞免疫为主。
所述低分子量乙酰硫酸肝素在人体中的剂量推荐为：1.5～3mg。
本发明所述低分子量乙酰硫酸肝素和乙肝表面抗原混合物在动物试验中的注射量为：每只小鼠50～250μg低分子量乙酰硫酸肝素和5ug乙肝表面抗原。
本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：(1)低分子量乙酰硫酸肝素是内源性物质，在免疫剂量范围内是安全可靠的；(2)已有市售的低分子量乙酰硫酸肝素注射级产品，价格低，如按每人份2mg计算则为人民币1角钱左右，可与铝佐剂相比；(3)低分子量乙酰硫酸肝素作为疫苗佐剂，不仅能诱导抗原特异性的体液免疫应答，并且能诱导细胞免疫应答，这一点明显优于铝佐剂。
附图说明
图1为低分子量乙酰硫酸肝素与乙肝表面抗原免疫诱导的血清抗-HBs IgG水平。
具体实施方式
下面结合实施对本发明做进一步描述，但本发明之内容并不局限于此。
实施例1
A、免疫
BALB/c小鼠分为疫苗组、对照组、空白组，每组25只。疫苗组注射低分子量乙酰硫酸肝素和乙肝表面抗原的混合物，注射剂量为每只小鼠50μg低分子量乙酰硫酸肝素和5ug乙肝表面抗原；对照组注射含铝佐剂的重组(酵母)乙型肝炎疫苗，剂量为每只小鼠0.4mg Al(OH)3吸附5ug乙肝表面抗原；空白组，仅注射生理盐水，100μL/只。
免疫方案：共免疫3次，分别在0、1、6月皮下注射BALB/c小鼠。
B、ELISA检测血清抗-HBs IgG水平
在初次免疫后4、8、16、24、32周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗-HBs IgG水平，按蛋白微孔试剂盒方法进行检测，具体方法是：40μL HBsAg溶于10ml 1×包被稀释液，混匀，包被96孔酶标板，100ul/孔；酶标板放于湿盒，4℃过夜；掉孔内液体，拍净板子；加入1×BSA，200ul/孔，酶标板在37℃湿盒放置1h；倒掉孔内液体，拍净板子；血清经倍比系列稀释后，加入酶标板，100ul/孔，37℃湿盒放置1h；用试剂盒配制的洗液洗板4次，每次5min，末次拍净酶标板；加入试剂盒配制的二抗(peroxidase结合的羊抗鼠IgG)，100ul/孔，37℃湿盒放置1h；用洗液洗板4次，每次5min，末次拍净酶标板；加入试剂盒配制的显色液，100ul/孔，避光显色10-25min。加终止液，每孔100ul；酶标板放入酶标仪，在405nm处读板。
C、乳酸脱氢酶法检测细胞毒活性
在初次免疫后4、8、16、25周，检测疫苗组、对照组、空白组诱导的细胞免疫水平(CTL反应)。
(1)效应细胞制备
眼球取血后，快速取出小鼠脾脏，制成细胞悬液，用含10％小牛血清的RPMI 1640培养基调细胞浓度到107/mL。培养1天后，加入5mg/L HBsAgCTL表位、1×106U/L rmIL-2及5mg/L ConA，隔日半量换液，同时添加半量HBsAg CTL表位、rmIL-2及5mg/L ConA。第5天时，收集细胞、计数，调整细胞密度至1×106/mL，作为效应细胞。
(2)靶细胞制备
取对数生长期的P815细胞(P815传代后生长1d)，用含10mg/L HBsAgCTL表位的RPMI 1640培养液培养过夜，加入丝裂霉素至25mg/L，45min后收集细胞，调整细胞密度至1×104/孔，作为靶细胞。
(3)CTL活性测定
采用96孔圆底塑料培养板进行，每个样至少设3个复孔。
分组加样：①实验组每孔加靶细胞悬液和效应细胞悬液各100ul。效应细胞与靶细胞的比率(效∶靶比)取100∶1；②最大释放组每孔加靶细胞悬液和1％Txiton X-100水溶液各100ul。这样可使靶细胞完全破坏，胞内LDH全部释放；③自发释放组每孔加靶细胞悬液和培养液各100ul。
微孔塑料板经800r/min离心5min。置37℃、5％CO2培养箱中培养5h。取出微孔板，以2000r/min离心5min。从每孔中取出50ul上清液用于CTL的杀伤活性检测。
检测方法用乳酸脱氢酶(LDH)法。参照Cyto Tox 96 Non-RadioactiveCytotoxicity Assay试剂盒说明书进行。
计算方法：Cytotoxicity(％)＝(实验释放-效自发释放-靶自发释放)/(靶最大释放-靶自发释放)×100％
所述乙肝表面抗原以及重组(酵母)乙型肝炎疫苗由深圳康泰生物制品有限公司馈赠。
所述低分子量乙酰硫酸肝素购自山东福瑞达生物化工有限公司。
所述蛋白检测微孔试剂盒购自晶美公司。
所述Cyto Tox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒购自Promega公司。
所述HBsAg CTL表位S28-39(IPQSLDSWWTSL)由Invitrogen公司合成。
所述IL-2、ConA、丝裂霉素购自Sigma公司。
动物实验结果如下(用SPSS 11.0软件分析实验结果，两组之间差异比较采用配对t检验，结果采用几何平均值±标准误)：
在初次免疫后4、8、16、24、32周，疫苗组诱导的抗-HBs IgG水平分别为420±32、631±59、1036±87、1472±83、1235±67；对照组诱导的抗-HBsIgG水平分别为518+49、716±68、1125±46、1357±65、1064±52；而空白组诱导的抗-HBs IgG水平则很低，接近于0(见图1)。在以上各个时间点，疫苗组、对照组诱导的抗-HBs IgG水平均显著高于空白组(P＜0.01)，而疫苗组与对照组诱导的抗-HBs IgG水平则无显著性差异(P＞0.05)。说明低分子量乙酰硫酸肝素与乙肝表面抗原的联合疫苗组诱导的抗体水平达到了含铝佐剂的乙肝疫苗组的免疫效果，提示低分子量乙酰硫酸肝素具有铝佐剂的佐剂效应。
在初次免疫后4、8、16、25周，疫苗组诱导的CTL活性均显著高于对照组和空白组(P＜0.01)，而对照组诱导的CTL活性与空白组无显著差异(P＞0.05)，见表1。研究结果说明，低分子量乙酰硫酸肝素能够显著增强乙肝表面抗原的细胞免疫应答，这一点显著优于铝佐剂。
表1 低分子量乙酰硫酸肝素与乙肝表面抗原免疫诱导的CTL活性(％)
| 4周 | 8周 | 16周 | 25周 | |
| 疫苗组 | 46.8±14.2 | 58.7±15.3 | 50.8±12.7 | 65.4+15.3 |
| 对照组 | 8.2+1.4 | 10.8±1.7 | 9.3±1.2 | 10.4±2.3 |
| 空白组 | 2.3±0.5 | 3.4±0.9 | 4.1±1.1 | 3.7±0.8 |
实施例2
A、免疫
BALB/c小鼠分为疫苗组、对照组、空白组，每组25只。疫苗组注射低分子量乙酰硫酸肝素与乙肝表面抗原混合物，剂量为每只小鼠250μg低分子量乙酰硫酸肝素和5ug乙肝表面抗原；对照组，注射重组(酵母)乙型肝炎疫苗(含铝佐剂)，剂量为每只小鼠0.4mg Al(OH)3吸附5ug乙肝表面抗原；空白组，仅注射生理盐水，100μL/只。
免疫方案：共免疫3次，分别在0、1、6月皮下注射BALB/c小鼠。
B、ELISA检测血清抗-HBs IgG水平
在初次免疫后4、8、16、24、32周采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗-HBs IgG水平，按蛋白微孔试剂盒方法进行检测，具体方法是：40μL HBsAg溶于10ml 1×包被稀释液，混匀，包被96孔酶标板，100ul/孔；酶标板放于湿盒，4℃过夜；掉孔内液体，拍净板子；加入1×BSA，200ul/孔，酶标板在37℃湿盒放置1h；倒掉孔内液体，拍净板子；血清经倍比系列稀释后，加入酶标板，100ul/孔，37℃湿盒放置1h；用试剂盒配制的洗液洗板4次，每次5min，末次拍净酶标板；加入试剂盒配制的二抗(peroxidase结合的羊抗鼠IgG)，100ul/孔，37℃湿盒放置1h；用洗液洗板4次，每次5min，末次拍净酶标板；加入试剂盒配制的显色液，100ul/孔，避光显色10-25min。加终止液，每孔100ul；酶标板放入酶标仪，在405nm处读板。
C、乳酸脱氢酶法检测细胞毒活性
在初次免疫后4、8、16、25周，检测疫苗组、对照组、空白组诱导的细胞免疫水平(CTL反应)。
(1)效应细胞制备
眼球取血后，快速取出小鼠脾脏，制成细胞悬液，用含10％小牛血清的RPMI 1640培养基调细胞浓度到107/mL。培养1天后，加入5mg/L HBsAgCTL表位、1×106U/L rmIL-2及5mg/L ConA，隔日半量换液，同时添加半量HBsAg CTL表位、rmIL-2及5mg/L ConA。第5天时，收集细胞、计数，调整细胞密度至1×106/mL，作为效应细胞。
(2)靶细胞制备
取对数生长期的P815细胞(P815传代后生长1d)，用含10mg/L HBsAgCTL表位的RPMI 1640培养液培养过夜，加入丝裂霉素至25mg/L，45min后收集细胞，调整细胞密度至1×104/孔，作为靶细胞。
(3)CTL活性测定
采用96孔圆底塑料培养板进行，每个样至少设3个复孔。
分组加样：①实验组每孔加靶细胞悬液和效应细胞悬液各100ul。效应细胞与靶细胞的比率(效∶靶比)取100∶1；②最大释放组每孔加靶细胞悬液和1％Txiton X-100水溶液各100ul。这样可使靶细胞完全破坏，胞内LDH全部释放；③自发释放组每孔加靶细胞悬液和培养液各100ul。
微孔塑料板经800r/min离心5min。置37℃、5％CO2培养箱中培养5h。取出微孔板，以2000r/min离心5min。从每孔中取出50ul上清液用于CTL的杀伤活性检测。
检测方法用乳酸脱氢酶(LDH)法。参照Cyto Tox 96 Non-RadioactiveCytotoxicity Assay试剂盒说明书进行。
计算方法：Cytotoxicity(％)＝(实验释放-效自发释放-靶自发释放)/(靶最大释放-靶自发释放)×100％。
Claims (6)
1、低分子量乙酰硫酸肝素在制备疫苗的佐剂方面的应用。
2、按照权利要求1所述的低分子量乙酰硫酸肝素在制备疫苗的佐剂方面的应用，尤其是低分子量乙酰硫酸肝素在制备乙肝疫苗的佐剂的应用。
3、按照权利要求1所述的低分子量乙酰硫酸肝素在制备疫苗的佐剂方面的应用，所述低分子量乙酰硫酸肝素指分子量为0.45～1万的乙酰硫酸肝素。
4、按照权利要求1所述的低分子量乙酰硫酸肝素在制备疫苗的佐剂方面的应用，所述由低分子量乙酰硫酸肝素制备的佐剂诱导的免疫反应以细胞免疫为主。
5、按照权利要求1所述的低分子量乙酰硫酸肝素在制备疫苗的佐剂方面的应用，所述低分子量乙酰硫酸肝素在人体中的剂量推荐为：1.5～3mg。
6、按照权利要求1所述的低分子量乙酰硫酸肝素在制备疫苗的佐剂方面的应用，所述低分子量乙酰硫酸肝素和乙肝表面抗原混合物在动物试验中的注射量为：每只小鼠50～250μg低分子量乙酰硫酸肝素和5ug乙肝表面抗原。
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|---|---|---|---|---|
| CN104056266A (zh) * | 2014-07-03 | 2014-09-24 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 新喋呤佐剂及含新喋呤佐剂的疫苗 |
| CN107496916A (zh) * | 2017-10-11 | 2017-12-22 | 浙江海洋大学 | 一种牙鮃分子疫苗佐剂 |
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2006
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| CN104056266A (zh) * | 2014-07-03 | 2014-09-24 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 新喋呤佐剂及含新喋呤佐剂的疫苗 |
| CN104056266B (zh) * | 2014-07-03 | 2016-06-29 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 新喋呤佐剂及含新喋呤佐剂的疫苗 |
| CN107496916A (zh) * | 2017-10-11 | 2017-12-22 | 浙江海洋大学 | 一种牙鮃分子疫苗佐剂 |
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