CN112439059B - 重组人乳头瘤病毒疫苗组合物及其用途 - Google Patents

重组人乳头瘤病毒疫苗组合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组人乳头瘤病毒疫苗组合物及其用途。本发明提供的新型疫苗组合物，相较其他抗原及佐剂的组合，具有更有益的免疫效果，减少免疫次数、减少抗原免疫剂量、降低免疫成本、有利于提高免疫覆盖率。从而使得本发明的疫苗组合物成为新一代的人乳头瘤病毒疫苗。

Description

重组人乳头瘤病毒疫苗组合物及其用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体而言，本发明涉及一种重组人乳头瘤病毒疫苗组合物和用途。
背景技术
乳头瘤病毒（Papillomavirus，PV）是一种能感染脊椎动物的病原体，目前发现已有300多种。可以感染人类的有200多种，称为人乳头状瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV），其中有40多种可以导致人类疾病。HPV的衣壳是由主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2组成。HPV主要感染皮肤和粘膜组织，在大多数情况下HPV感染无明显临床症状。但某些HPV持续性感染可引发皮肤粘膜上皮增生，甚至癌变。临床上则表现为不同类型的上皮疣，宫颈癌、肛门癌和阴道癌等恶性肿瘤。根据与癌症发生的关系，这40多种HPV可以分为高危型和低危型，其中HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58及59为高危型，其他的为低危型，其中HPV 6和HPV 11感染引起生殖器疣与复发性呼吸道乳头瘤病的比率超过90%。
世界范围内，宫颈癌在女性高发恶性肿瘤中排名第三，而在15-44岁女性排名第二，据估计2018年全球约有56.9万女性新发宫颈癌，年龄调整发病率为13.1/10万，31.1万女性死于宫颈癌。国际癌症研究机构评估报告显示宫颈癌在中国年龄调整发病率为10.7/10万。据估计2018年中国宫颈癌新发约10.6万例，占全球18.7%，死亡约4.8万例，占全球15.3%。宫颈癌是中国女性第六大常见癌症，而在15～44岁女性中跃居为第三常见癌症，仅次于乳腺癌和甲状腺癌，中国宫颈癌防控形势仍然严峻和面临巨大挑战，宫颈癌患者的疾病经济负担十分严重，尤其是在农村地区。现已知几乎所有的宫颈癌和HPV感染相关，其中70%宫颈癌和HPV 16、18感染相关，20%左右宫颈癌与HPV 31、33、45、52及58感染相关。
接种预防性HPV疫苗是预防宫颈癌有效可行的预防手段，是宫颈癌的一级预防措施；宫颈癌的二级预防的主要措施包括对所有适龄妇女定期开展宫颈癌的筛查，对确定为宫颈癌前病变患者及早进行治疗；宫颈癌三级预防的主要措施是根据临床分期开展适宜的手术、放疗、化疗和姑息疗法。目前，全球已上市了3种预防性HPV疫苗，分别为葛兰素史克 2价HPV疫苗Cervarix、默沙东4价HPV疫苗Gardasil和9价HPV疫苗Gardasil 9。这三个已上市疫苗都是基于HPV 主要衣壳蛋白L1形成的病毒样颗粒（Virus-like particle，VLP）为抗原的疫苗，通过基因重组表达的L1蛋白可在一定条件下形成类似病毒的 VLP。Cervarix的佐剂为氢氧化铝佐剂加MPL，Gardasil和Gardasil 9的佐剂为磷酸铝佐剂。
多项严格随机临床研究证明了在9-14岁女性中接种2剂HPV疫苗免疫原性非劣于接种3剂HPV疫苗，2017年WHO立场文件中推荐在9-14岁人群中使用2剂免疫程序（0、6月），这对于在成人女性中减少免疫剂次（2剂）提供很好的借鉴和指导意义。此外，接种1剂Cervarix后产生的抗体滴度7年后仍然可达到自然感染水平的9倍以上，同样在一项印度的临床研究中观察到870名接种1剂Gardasil的10-18岁人群中平均随访4.7年未发生HPV16和18型持续性感染。尽管这两项研究都是非严格随机和评估单剂HPV疫苗的保护效力为主要目标的临床研究，这些研究结果为单剂HPV疫苗提供了概念的基础和未来实现的可能性。目前WHO呼吁全球消灭宫颈癌，业界认为实现这个目标，需要高效、便利的9价HPV疫苗。目前已上市的三种HPV疫苗，只有Cervarix使用了复合佐剂（氢氧化铝和MPL），表现出较高的免疫原性，但这款疫苗是2价HPV疫苗。而目前在市场上的9价HPV疫苗在不同年龄阶段的接种程序均为3剂免疫（0、2、6月），因此开发一款使用简化免疫程序（1针或2针）的新型9价HPV疫苗，有助于实现全球消灭宫颈癌，同时将大大缓解因产能不足和接种完成率低而带来的压力，从而尽快减少全球尤其是发展中国家的宫颈癌的发病率和死亡率，从而助力全球消除宫颈癌的计划，也可产生良好的经济效益与社会效益。
有研究认为Cervarix相较于Gardasil能产出更高抗体滴度可能是由于Cervarix双佐剂中的TLR4激动剂MPL增强了免疫激活的结果，这也可能是Cervarix能够长期地维持在较高的抗体水平重要原因。因此，选择合适的复合佐剂来开发上述简化免疫程序的新型九价HPV疫苗至关重要。葛兰素史克的Cervarix的双佐剂包含MPL和氢氧化铝佐剂，但目前MPL为经化学处理“减毒”的沙门菌脂多糖，工艺复杂且成本高昂，产能容易受MPL的来源限制。另外，该产品在国内规模化生产条件不成熟，无法满足后续临床使用需求。我们选择铝佐剂联合CpG ODN的复合佐剂系统，首先是因为CpG ODN可通过化学合成大规模生产，易于质控；其次CpG ODN是Toll样受体9（toll-like receptor 9，TLR9）的激动剂，可以刺激表达TLR9的细胞并激活下游天然免疫反应通路，一方面诱导I型干扰素和炎症因子表达，另一方面使浆细胞样树突状细胞成熟，从而增强体液免疫和细胞免疫反应。铝佐剂是迄今为止使用最为广泛的人用疫苗佐剂，与其他佐剂组成的联合佐剂也有着广泛的应用。CpG ODN类佐剂是除铝佐剂外最新被批准在上市疫苗中使用的新型佐剂（Dynavax 的乙肝疫苗产品）。另外许多在开发中的疫苗，也在临床试验中均使用了铝佐剂和CpG ODN的复合佐剂如乙肝和疟疾预防性疫苗。我们希望通过加入CpG ODN佐剂使新型九价HPV疫苗比传统单独铝佐剂疫苗有更好的免疫原性和免疫持久性，从而提高免疫预防效果，比如可以减少免疫次数、缩短免疫间隔、减少抗原免疫剂量。
尽管世界现有技术中已经开发了一些HPV预防性疫苗，然而还存在因免疫针次较多而造成的接种完成率低等问题。因此，本领域还有必要开发改进的HPV疫苗产品。且从策略上来说，总是需要具有改进的免疫原性的新组合物疫苗，例如从佐剂或制剂组合方面进行尝试和改进以提高免疫应答、减少免疫次数、缩短免疫间隔、减少抗原免疫剂量。
发明内容
本发明的一方面在于提供一种重组人乳头瘤病毒疫苗，该疫苗中包含针对人乳头瘤病毒（HPV）的抗原。更具体地，上述抗原可为HPV各型L1 VLP蛋白（HPV 16L1、18L1、6L1、11L1、31L1、33L1、45L1、52L1、58L1）。
本发明所述之HPV为双链DNA病毒，其基因组含有大约8000个碱基对，按照其相对的表达时间可以分为早期区（Early Region，编码早期基因E1、E2、E4、E5、E6和E7），晚期区（Late Region，编码晚期基因L1和L2）以及上游调控区（Upstream Regulatory Region，URR，不编码蛋白，调控基因的转录），HPV的衣壳是由主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2组成。已上市疫苗都是基于HPV L1病毒样颗粒（Virus-like particle，VLP）为抗原的疫苗，通过基因重组表达的L1蛋白可在一定条件下形成类似病毒的颗粒，有着较好的免疫原性。
在NCBI 数据库中，已有许多现有的HPV各型L1 VLP蛋白（HPV 16L1、18L1、6L1、11L1、31L1、33L1、45L1、52L1、58L1）序列可供本领域技术人员进行选择，这些序列均可以作为抗原蛋白的理想选择基础。为了开发本发明的目的，在本发明的实施例中，发明人大部分采用了从现有技术中具有高度的保守性的序列，具体情况如下：HPV 6L1的氨基酸序列已于1995年在NCBI数据库中收录，登录号为AAA74218；HPV 11L1的氨基酸序列已于1994年在NCBI数据库中收录，登录号为AAA46935；HPV 16L1的氨基酸序列已于1998年在NCBI数据库中收录，登录号为AAC09292.1；HPV 18L1蛋白的氨基酸序列已于2003年在NCBI数据库中收录，登录号为AAQ92369.1；HPV 31L1蛋白的氨基酸序列已于1994年在NCBI数据库中收录，登录号为AAA46956；HPV 33L1蛋白的氨基酸序列已于2009年在NCBI数据库中收录，登录号为ACL12333.1；HPV 45L1蛋白的氨基酸序列已于2009年在NCBI数据库中收录，登录号为ABP99831.1（截短了N端26个氨基酸，上述26个氨基酸为疏水区，疏水区可能影响L1蛋白形成VLP，故而截短）；HPV52 L1蛋白的氨基酸序列已于2005年在NCBI数据库中收录，登录号为CAA52590.1（截短了N端27个氨基酸，上述27个氨基酸为疏水区，疏水区可能影响L1蛋白形成VLP，故而截短）；HPV 58L1蛋白的氨基酸序列已于2009年在NCBI数据库中收录，登录号为CAX48979.1。
利用现代分子生物的常规技术手段可轻易地获得上述抗原，典型的方法包括：在毕赤酵母中表达上述HPV各型L1 VLP蛋白的方法，包括下述步骤：
(1) 将本发明的HPV各型L1蛋白基因（经密码子优化）克隆入表达载体中；
(2) 将步骤(1)所得的表达载体转化至毕赤酵母宿主菌中；
(3) 通过菌株筛选，获得稳定表达HPV各型L1蛋白的菌株；
(4) 使用步骤(3)所得的菌株进行表达，获得HPV各型L1蛋白。
将上述获得的蛋白，经常规的处理方式，例如疏水层析、阴离子交换层析、羟基磷灰石层析等可获得较纯的抗原蛋白。
需要说明的是，使用毕赤酵母表达系统稳定表达HPV各型L1蛋白的方法是本领域众所周知的方法，具体可参照《分子克隆试验指南》及其他一些文献。本领域技术人员也可以选择例如大肠杆菌、酿酒酵母、汉逊酵母、CHO细胞、昆虫细胞等在内的其他表达方式获得HPV各型L1蛋白。
在优选的实施方式中，所述疫苗组合物进一步包含药学上可接受的载体（佐剂）。在一个优选的实施方式中，所述药学上可接受的载体为铝佐剂联合CpG ODN的复合佐剂。本发明的发明人发现，上述两种佐剂和HPV各型L1蛋白的联合将显示出大大增强的免疫活性，从而使得本发明的疫苗制剂组合物成为新一代的重组人乳头瘤病毒疫苗。
本发明所述之铝佐剂是目前在疫苗中应用最为广泛的一类佐剂，有着80多年的应用历史和数百亿人次的使用记录，一度也是被美国食品和药品监督管理局（FDA)批准用于人类疫苗的唯一佐剂。目前已经有非常多将铝佐剂用于疫苗的研究，比较系统的研究可见于例如《Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach》一书（ISBN:0-306-44867-X）中的例如第八章《铝化合物及钙化合物的佐剂特性》以及第九章《铝佐剂的结构及特性》，或者《Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols》一书（ISBN: 1-59259-083-7）中的例如第四章《铝化合物作为疫苗佐剂的使用》。目前已有一些商业化的铝佐剂可供使用于疫苗中，包括但不限于Alhydrogel®（氢氧化铝）以及Adju-Phos®（磷酸铝）。前述研究中也已经说明了如何制备铝佐剂的制备方式，本领域技术人员可根据需要制备所需的铝佐剂应用于疫苗制剂中。
CpG ODN佐剂为一类已知具有佐剂特性的免疫刺激性寡聚核苷酸，能激活B细胞、NK、DC树突状等细胞，诱导释放IL-12、IFN-γ，从而诱导强Th1型应答和细胞免疫。该种佐剂也是本领域技术人员所熟知的，已经在现有技术，例如国际申请已经在例如WO 96/02555、WO 99/33488 中描述过。目前已有一些商业化的CpG ODN佐剂，例如CpG 7909（Coley公司）或CpG 1018（Dynavax公司）。
本发明所提供的疫苗制剂的具体制备方式可参考例如《Vaccine Design: TheSubunit and Adjuvant Approach》一书（ISBN:0-306-44867-X）。作为最常规的方式之一，本发明所提供的制备方法为将本发明前述之抗原蛋白与前述药学上可接受的载体佐剂相混合。作为更具体的举例，在优选的一个实施例中，HPV各型L1蛋白的VLP吸附至铝佐剂上，以保持VLP 稳定性和增强其免疫原性。
疫苗制剂抗原剂量选择的原则是，每一剂疫苗的量应能够在受接种者体内引起免疫保护性反应同时没有显著的毒性副作用。一般而言，不同抗原蛋白的剂量均略有不同，可通过观察抗体滴度和受试者的其他反应来确定某一特定疫苗的最适剂量。本发明所提供的疫苗制剂，其抗原HPV各型L1 VLP蛋白的含量都在2-60μg之间，具体亚型HPV 16L1、18L1、6L1、11L1、31L1、33L1、45L1、52L1、58L1的蛋白含量分别在6-60μg、4-40μg、3-30μg、4-40μg、2-20μg、2-20μg、2-20μg、2-20μg、2-20μg之间，铝佐剂的含量约在225-1000μg之间，更优选地，该含量为500μg，CpG ODN佐剂的含量约在250-1000μg之间，更优选地，该含量在500-1000μg之间。
在本发明的第二方面，在于提供前述疫苗组合物的用途，用于预防或治疗人乳头瘤病毒感染相关疾病或病症。
本发明的第三方面，在于提供一种供试疫苗包装盒，包含疫苗给予装置，包括但不限制于针头装置、液体喷射装置、粉末装置和喷雾装置。装置的选择主要基于不同的给药方式，常见的给药方式包括肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射，或口腔/消化道、呼吸道和泌尿生殖道粘膜给药。本发明的疫苗常见的可通过肌肉注射的方式，常见的给予装置则是针头装置。常见地，可以单剂给药，其组分也可以同时或不同时联合施用。
具体地，本发明提供了如下具体实施方案：
1. 一种重组人乳头瘤病毒(HPV)疫苗制剂组合物，其特征在于，所述重组人乳头瘤病毒疫苗制剂组合物包含至少如下九个HPV型别的主要衣壳蛋白L1组装成的VLP：HPV16L1、18L1、6L1、11L1、31L1、33L1、45L1、52L1、58L1，和药学上可接受的复合佐剂载体。
2. 如实施方案1所述的疫苗制剂组合物，其特征在于，所述药学上可接受的复合佐剂载体为铝佐剂加CpG类佐剂的复合佐剂。
3. 如实施方案1或2所述的疫苗制剂组合物，其特征在于，所述每个HPV型别的L1组装成的VLP的含量在2-60μg之间。
4. 如实施方案3所述的疫苗制剂组合物，其特征在于，HPV 16L1、18L1、6L1、11L1、31L1、33L1、45L1、52L1、58L1组装成的VLP的含量分别在6-60μg、4-40μg、3-30μg、4-40μg、2-20μg、2-20μg、2-20μg、2-20μg、2-20μg之间。
5. 如实施方案2所述的疫苗制剂组合物，其中所述铝佐剂选自氢氧化铝和磷酸铝类铝佐剂。
6. 如实施方案5所述的疫苗制剂组合物，其特征在于，所述铝佐剂为磷酸铝类铝佐剂。
7. 如实施方案5所述的疫苗制剂组合物，其中所述磷酸铝类铝佐剂具有在5-9.5之间的PI值。
8. 如实施方案2所述的疫苗制剂组合物，其特征在于，所述铝佐剂的含量约在225-1000μg之间。
9. 如实施方案8所述的疫苗制剂组合物，其特征在于，所述铝佐剂的含量约为500μg。
10. 如实施方案2所述的疫苗制剂组合物，其特征在于，所述CpG类佐剂的含量约在200-1500μg之间。
11. 如实施方案10所述的疫苗制剂组合物，其特征在于，所述CpG类佐剂的含量约在250-1000μg之间。
12. 如实施方案2所述的疫苗制剂组合物，其特征在于，HPV 16L1、18L1、6L1、11L1、31L1、33L1、45L1、52L1、58L1组装成的VLP的含量分别在6-60μg、4-40μg、3-30μg、4-40μg、2-20μg、2-20μg、2-20μg、2-20μg、2-20μg之间，所述铝佐剂的含量约在225-1000μg之间，所述CpG类佐剂的含量约在250-1000μg之间。
13. 如实施方案12所述的疫苗制剂组合物，其特征在于，HPV 16L1、18L1、6L1、11L1、31L1、33L1、45L1、52L1、58L1组装成的VLP的含量分别在6-60μg、4-40μg、3-30μg、4-40μg、2-20μg、2-20μg、2-20μg、2-20μg、2-20μg之间，所述铝佐剂的含量约为500μg，所述CpG类佐剂的含量约在500-1000μg之间。
14. 如实施方案1-13中任一项所述的疫苗制剂组合物在制备用于预防或治疗人乳头瘤病毒感染相关疾病的药物中的用途，其中所述药物通过一次或两次免疫接种施用。
15. 一种供试疫苗包装盒，其包含实施方案1-13中任一项所述的疫苗制剂组合物，其特征在于，所述试剂盒包含疫苗给予装置，所述给予装置选自针头装置、液体喷射装置、粉末装置和喷雾装置。
本发明的发明人发现，上述两种佐剂和HPV各型L1 VLP蛋白的联合将显示出令人惊奇的高免疫活性，甚至可以减少免疫次数、缩短免疫间隔、减少抗原免疫剂量。从而使得本发明的疫苗组合物成为新一代的人乳头瘤病毒疫苗。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施方式
实施例1：含有HPV各型L1 VLP抗原蛋白的疫苗组合物的制备
为了研究本发明所提供的疫苗制剂组合物之技术效果。本发明的发明人制成了以下多种疫苗制剂组合物（0.5ml/剂），每种制剂组合物均含有HPV各型L1 VLP蛋白（HPV16L1、18L1、6L1、11L1、31L1、33L1、45L1、52L1、58L1）、铝佐剂以及CpG ODN佐剂。具体配制方法为：先将HPV各型L1 VLP抗原原液吸附到铝佐剂（磷酸铝佐剂AP，购自泽润生物科技有限公司）上，制备成不同比例的HPV各型L1 VLP抗原/铝佐剂（w/w）比例的吸附样品（此处的铝佐剂含量实质铝元素的含量）；然后向该抗原/铝吸附样品中加入不同浓度的CpG ODN样品（CpG 7909或CpG 1018，均购自广州瑞博瑞博科技有限公司）。上述制剂充分混合后，如果不立即施用，则储存于4℃，具体比例如下：
表1
Figure 402720DEST_PATH_IMAGE001
注：编号1、2、4和5疫苗所含CpG ODN为CpG 7909，编号6和7疫苗所含CpG ODN为CpG1018。
实施例2：
针对获得实施例1中待评价的重组人乳头瘤病毒疫苗制剂组合物。发明人以BALB/c小鼠为动物模型开展了免疫原性研究。以HPV各型L1 VLP蛋白为抗原，以铝佐剂和CpG ODN为佐剂研究通过本发明提供的疫苗制剂组合物之免疫原性。选择6-8周龄BALB/雌性小鼠随机分组，每组10只小鼠，肌肉注射用HPV各型L1 VLP蛋白联合佐剂制备的疫苗（表1），注射体积为0.05ml（即1/10剂），设置自制疫苗组、上市疫苗Gardsail 9组和佐剂对照组，其中一针组0天免疫，第35天采血，两针组0、21天免疫，第35、56天采血，三针组0、21、42天免疫，第56天采血。采用假病毒中和实验法（Pseudovirion-Based Neutralization Assay，PBNA）检测血清中的抗HPV各型L1 VLP蛋白的中和抗体滴度，并计算抗体几何平均滴度（GMT）。
免疫原性的评价方法为本领域的行规技术手段，作为举例，假病毒中和实验法更具体的操作方式如下：
（1）取生长状态良好的293FT细胞，用0.25% Trypsin-EDTA消化成单个细胞，用DMEM完全培养基将细胞稀释至合适浓度；以细胞计数仪计数；
（2）根据细胞计数结果，以DMEM完全培养基将293FT细胞稀释至1.5×105/ml的密度，预铺于96孔细胞培养板中，每孔加细胞液100μl，于37℃ 5% CO2培养箱中培养至细胞贴壁；
（3）将灭活的血清样品用DMEM完全培养基稀释到合适的起始稀释度，再进行连续对倍稀释若干梯度，每个稀释度设双复孔；
（4）用DMEM完全培养基将假病毒液稀释至log（TCID50/0.1ml）=3.2±0.5，混匀；
（5）取血清稀释液，加入相同体积假病毒稀释液，混匀，室温孵育60分钟，同时设置阳性对照孔，每孔为DMEM完全培养基加入等体积假病毒稀释液；设置空白对照孔，每孔为DMEM完全培养基；
（6）孵育结束后，准确吸取血清-假病毒混合液100μl，缓慢小心加入预铺的96孔细胞板中；
（7）于5% CO2培养箱中37℃培养72小时，用荧光显微镜观察或斑点分析仪读取结果，并分析处理。
研究结果如下表2~5所示：
如表2所示，在仅含铝佐剂的传统九价HPV疫苗中添加CpG ODN佐剂，可以显著提高免疫小鼠血清中的中和抗体滴度，GMT提高2.64~13.93倍。
表2各疫苗免疫一针后35天小鼠血清中和抗体滴度GMT比较
Figure 336041DEST_PATH_IMAGE002
注：编号1和3疫苗配方详见表1，编号3疫苗不含CpG ODN，其他成份含量与编号1疫苗一致；每组10只小鼠。
如表3所示，含复合佐剂的编号1疫苗免疫一针后35天的中和抗体水平与上市疫苗Gardasil 9 (Merck)免疫两针后14天相比，HPV16、6、11、和52型的GMT基本与Gardasil 9相当，其他五个型别的GMT要优于Gardasil 9。
表3 新型九价HPV疫苗免疫一针后35天和Gardasil 9免疫两针后14天小鼠血清中和抗体滴度GMT比较
Figure 739340DEST_PATH_IMAGE003
注：编号1疫苗配方详见表1；上市疫苗Gardasil 9不含CpG ODN，抗原剂量与编号1疫苗一致，即Gardasil 9抗原剂量和本发明中的1X抗原剂量一样；每组10只小鼠。
如表4所示，含复合佐剂的编号1疫苗免疫两针后35天的中和抗体水平与上市疫苗Gardasil 9免疫三针后14天相比，HPV 6、11、31和52型的GMT基本与Gardasil 9相当，其他五个型别的GMT要优于Gardasil 9。结合表3中一针与两针比较数据，以上结果表明含复合佐剂的新型九价HPV疫苗即使减少免疫针次，仍然有着较好的免疫原性。
表4 新型九价HPV疫苗免疫两针后和Gardasil 9免疫三针后小鼠血清中和抗体滴度GMT比较
Figure 467125DEST_PATH_IMAGE004
注：编号1疫苗配方详见表1；上市疫苗Gardasil 9不含CpG ODN，抗原剂量与编号1疫苗一致，即Gardasil 9抗原剂量和本发明中的1X抗原剂量一样；每组10只小鼠。
如表5所示，含复合佐剂的编号1疫苗免疫一针后35天的中和抗体水平与上市疫苗Gardasil 9免疫两针后14天相比，HPV16、6和52型的GMT基本与Gardasil 9相当，其他六个型别的GMT要优于Gardasil 9。
如表5所示，在仅含铝佐剂的传统九价HPV疫苗中添加CpG ODN佐剂，即使将HPV抗原含量降低到Gardasil 9的1/10剂量，九个HPV型别的中和抗体水平仍与Gardasil 9相当。
表5 各疫苗免疫一针后35天小鼠血清中和抗体滴度GMT比较
Figure 955875DEST_PATH_IMAGE005
注：编号5疫苗配方详见表1，上市疫苗Gardasil 9不含CpG ODN，铝佐剂含量与编号5疫苗一致，九个HPV型别的剂量为编号5疫苗的10倍，即Gardasil 9抗原剂量和本发明中的1X抗原剂量一样。
实施例3：
发明人也研究了不同CpG ODN含量（如500~1000μg）的新型九价HPV疫苗的免疫原性，以及含不同CpG ODN类型（如CpG7909和CpG1018）的新型九价HPV疫苗的免疫原性，结果表明各种制剂配方的新型九价HPV疫苗均有着较好的免疫原性。小鼠实验程序和中和抗体检测方法与实施例2相同，研究结果如下表6所示。
表6 各疫苗免疫两针后14天小鼠血清中和抗体滴度GMT
Figure 896149DEST_PATH_IMAGE006
注：编号2、4、6和7疫苗配方详见表1，小鼠肌肉免疫剂量均为1/10剂量，免疫体积为0.05ml。
从表2-6中可知，根据本发明所提供的特定组分及比例制备而得的疫苗组合物，具有良好的免疫活性，尤其是当HPV各型L1 VLP蛋白（HPV 16L1、18L1、6L1、11L1、31L1、33L1、45L1、52L1、58L1）的含量分别在6-60μg、4-40μg、3-30μg、4-40μg、2-20μg、2-20μg、2-20μg、2-20μg、2-20μg之间，铝佐剂的含量为500μg，CpG ODN佐剂的含量在500-1000μg之间时，都具有优异的免疫效果，可作为新一代疫苗制剂组合物，指导制剂中抗原剂量和复合佐剂剂量选择范围。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种重组人乳头瘤病毒疫苗制剂组合物，其特征在于，所述重组人乳头瘤病毒疫苗制剂组合物包含至少如下九个HPV型别的主要衣壳蛋白L1组装成的VLP：HPV16L1、18L1、6L1、11L1、31L1、33L1、45L1、52L1、58L1，和药学上可接受的复合佐剂载体；
所述药学上可接受的复合佐剂载体为铝佐剂加CpG类佐剂的复合佐剂；
HPV16L1、18L1、6L1、11L1、31L1、33L1、45L1、52L1、58L1组装成的VLP的含量分别在6-60μg、4-40μg、3-30μg、4-40μg、2-20μg、2-20μg、2-20μg、2-20μg、2-20μg之间；
所述铝佐剂的含量在225-1000μg之间；所述CpG类佐剂的含量在250-1500μg之间。
2.如权利要求1所述的疫苗制剂组合物，其中所述铝佐剂选自氢氧化铝和磷酸铝类铝佐剂。
3.如权利要求1所述的疫苗制剂组合物，其特征在于，所述铝佐剂为磷酸铝类铝佐剂。
4.如权利要求3所述的疫苗制剂组合物，其中所述磷酸铝类铝佐剂具有在5-9.5之间的PI值。
5.如权利要求1所述的疫苗制剂组合物，其特征在于，所述铝佐剂的含量为500μg。
6.如权利要求1所述的疫苗制剂组合物，其特征在于，所述CpG类佐剂的含量在250-1000μg之间。
7.如权利要求1所述的疫苗制剂组合物，其特征在于，所述铝佐剂的含量为500μg，所述CpG类佐剂的含量在500-1000μg之间。
8.如权利要求1-7中任一项所述的疫苗制剂组合物在制备用于预防或治疗人乳头瘤病毒感染相关疾病的药物中的用途，其中所述药物在施用过程中的施用次数为一次或两次。
9.一种供试疫苗包装盒，其 特征在于，其包含权利要求1-7中任一项所述的疫苗制剂组合物，所述包装盒包含疫苗给予装置，所述给予装置选自针头装置、液体喷射装置、粉末装置或喷雾装置。
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