CN117305329A - 一种猴痘病毒核酸疫苗及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种编码痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原的多核苷酸，其相关核酸产品及其在制备用于预防和/或治疗痘病毒(特别是猴痘病毒)感染的疫苗中的用途。由所述多核苷酸编码的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原包含两种免疫原：猴痘病毒A35R蛋白或其抗原性片段(或它们的适当变体)和猴痘病毒M1R蛋白或其抗原性片段(或它们的适当变体)；基于所述多核苷酸的嵌合或混合核酸疫苗免疫原成分清晰，且能够高效地激发针对痘病毒(特别是猴痘病毒)的特异性免疫反应(例如，产生保护性抗体)，可用于痘病毒(特别是猴痘病毒)的预防和/或治疗，具有极大的临床应用前景。

Description

一种猴痘病毒核酸疫苗及其用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种猴痘病毒核酸疫苗及其用途。
背景技术
以猴痘病毒为代表的痘病毒是一类核质大DNA病毒，其病毒基因组约为130-375kbp，能够编码多达200种病毒蛋白。除编码病毒蛋白繁复外，痘病毒的病毒颗粒也较为复杂，其具有两种形态不同的感染性病毒颗粒，称为细胞内成熟病毒(IMV)和细胞外包膜病毒(EEV)。其中IMV具有一层囊膜，其相较于EEV具有更高的稳定性，主要参与病毒在宿主间传播。而EEV则具有一层特殊的外膜结构，主要参与病毒在宿主体内的扩散。由于IMV和EEV具有不同的膜结构、膜组份和细胞感染机制，其表面中和抗原也截然不同。
猴痘病毒(MPXV)属于痘病毒，与天花病毒高度同源，自1958年被发现以来，长期在非洲中西部局部传播，并演化出多个毒株。然而，2022年，MPXV出现全球流行趋势，至7月23日，已传播至75个国家，感染逾1.5万人，被世界卫生组织宣布为“国际关注的突发公共卫生事件”。虽然目前的疫苗具备对猴痘病毒的防御能力，但值得警惕的是，近期发现MPXV出现变异频率加快的趋势，有产生逃逸突变株的可能。
全球只有2款疫苗可用于预防猴痘病毒感染，分别是安卡拉-巴伐利亚北欧公司(Bavarian Nordic)公司生产的JYNNEOSTM疫苗(也称为Imvamune或Imvanex)和赛诺菲公司生产(Sanofi Pasteur)的这两种疫苗均为原本用于预防天花的弱毒活疫苗，其中，/>为第二代疫苗，在人体内具有复制能力，接种后有发生脑炎、心肌炎、进行性牛痘感染等的风险，同时不适宜幼儿、孕妇和免疫功能低下或受损人群的接种；而JYNNEOSTM为第三代疫苗，由于其不能在人体内复制，相较于第一代和第二代疫苗，安全性上有所提升，但免疫效果也出现了一定程度的降低。
活病毒疫苗存在以下共性缺点：(1)病毒来自活的病毒，经减毒、弱化培养获得，其完整保留了病毒的抗原，但存在弱化不完全，或经变异后毒力恢复的可能；(2)疫苗包含病毒的所有抗原，成分复杂，具有较高引起副作用的可能；(3)疫苗中有效免疫原成分占比较低，相同剂量接种产生的免疫原性较弱；(4)病毒的部分成分可能具有抑制宿主免疫的功能，会起到反作用，降低疫苗的免疫原性。成分清晰的疫苗(mRNA疫苗/重组蛋白疫苗等)可以解决以上问题。但是，对于痘病毒这类复杂的病毒，找到关键的成分作为免疫原是一个主要的技术瓶颈。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为克服上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种编码痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原的多核苷酸，其相关核酸产品及其在制备用于预防和/或治疗痘病毒(特别是猴痘病毒)感染的疫苗中的用途；由所述多核苷酸编码的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原包含两种免疫原：猴痘病毒A35R蛋白或其抗原性片段(或它们的适当变体)和猴痘病毒M1R蛋白或其抗原性片段(或它们的适当变体)；基于所述多核苷酸的嵌合或混合核酸疫苗，其免疫原成分清晰，且能够高效地激发针对痘病毒(特别是猴痘病毒)的特异性免疫反应(例如，产生保护性抗体)，可用于痘病毒(特别是猴痘病毒)的预防和/或治疗。
具体地，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种多核苷酸，其编码痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原，其特征在于，所述嵌合或混合抗原包含：
免疫原I：猴痘病毒A35R蛋白或其抗原性片段，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；和
免疫原II：猴痘病毒M1R蛋白或其抗原性片段，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列。
在可行的实施方案中，所述A35R蛋白的抗原性片段为该蛋白的胞外段或其一部分，优选为具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列加上由其向A35R蛋白的N端延伸1-30个氨基酸的片段的氨基酸序列、优选如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的肽段；
和/或，所述M1R蛋白的抗原性片段为该蛋白的胞外段或其一部分，优选为具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的肽段。
在一些具体实施方案中，所述多核苷酸编码痘病毒多免疫原混合抗原，所述混合抗原为免疫原I、II的混合物；
优选地，其中，所述免疫原I具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
和/或，所述免疫原II具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
优选地，所述混合物中，所述免疫原I、II的质量比为1：1。
进一步优选地，所述多核苷酸为多核苷酸组，包括：
I)序列如SEQ ID NO:4或5所示的DNA分子，和/或其相应的mRNA分子，其序列分别如SEQ ID NO:6或7所示；和
II)序列如SEQ ID NO:8所示的DNA分子，和/或其相应的mRNA分子，其序列如SEQIDNO:9所示。
在另一些具体实施方案中，所述多核苷酸编码痘病毒多免疫原嵌合抗原，所述嵌合抗原为一个或多个免疫原I、II以串联方式形成的单链；
优选地，所述嵌合抗原具有如式(I)所示结构：
A1-C1-M1-C2-A2-C3-M2
(I)
式(I)中：
A1表示猴痘病毒A35R蛋白或其抗原性片段I，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，
A2表示猴痘病毒A35R蛋白或其抗原性片段II，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，
M1表示猴痘病毒M1R蛋白或其抗原性片段I，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，
M2表示猴痘病毒M1R蛋白或其抗原性片段II，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
C1、C2、C3各自独立地为无，或者连接序列(GGGGS)n，其中，n为1-10之间的任意整数；
其中，
A1与A2相同或不同，
M1与M2相同或不同。
在可行的实施方案中，所述A35R蛋白的抗原性片段I或II为该蛋白的胞外段或其一部分；
和/或，所述M1R蛋白的抗原性片段I或II为该蛋白的胞外段或其一部分。
优选地，所述A1表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
和/或，所述A2表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列加上由其向A35R蛋白的N端延伸1-30个氨基酸的片段的氨基酸序列、优选如SEQID NO:2所示的氨基酸序列，或者由上述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
和/或，所述M1与M2相同，表示如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或者如SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
在编码式(I)所示嵌合抗原的多核苷酸的优选的具体实施方案中，所述A1表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述A2表示如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述M1与M2相同，表示如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
优选地，所述C1、C2、C3均为无；
进一步优选地，所述嵌合抗原包含如SEQ ID NO:10或11所示的氨基酸序列；
可选地，所述嵌合抗原为单链二聚体结构。
在进一步优选的具体实施方案中，编码式(I)所示嵌合抗原的多核苷酸为DNA分子和/或其相应的mRNA分子；
优选地，所述DNA分子具有如SEQ ID NO:12或13所示的DNA序列，其相应的mRNA分子具有如SEQ ID NO:14或15所示的mRNA序列。
第二方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含如上述第一方面所述的多核苷酸，以及任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。
第三方面，本发明提供了一种表达载体，其包含如上述第二方面所述的核酸构建体。
第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其中转化或转染有如上述第一方面所述的多核苷酸、如上述第二方面所述的核酸构建体或如上述第三方面所述的表达载体。
第五方面，本发明提供了如上述第一方面所述的多核苷酸、如上述第二方面所述的核酸构建体、如上述第三方面所述的表达载体或如上述第四方面所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗痘病毒感染的药物中的应用；
优选地，所述痘病毒选自：猴痘病毒、天花病毒、牛痘病毒和/或痘苗病毒；
可选地，所述药物为疫苗，优选为mRNA疫苗；
可选地，所述疫苗为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、颗粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂和膏剂；进一步优选地，所述片剂为舌下片；进一步优选地，所述颗粒剂为细粒剂；进一步优选地，所述粉末剂为散剂；进一步优选地，所述丸剂为小丸剂；
优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射制剂；进一步优选地，所述可注射制剂为可推注制剂。
第六方面，本发明提供了一种核酸疫苗或免疫原性组合物，其包含如上述第一方面所述的多核苷酸、如上述第二方面所述的核酸构建体、如上述第三方面所述的表达载体或如上述第四方面所述的宿主细胞，以及生理学可接受的媒介物、佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂。
在一些优选的具体实施方案中，所述核酸疫苗或免疫原性组合物为痘病毒DNA疫苗，所述DNA疫苗包括：
(i)真核表达载体；和
(ii)构建入所述真核表达载体中的、如上述第一方面所述的多核苷酸的DNA序列；
优选地，所述真核表达载体选自pGX0001、pVAX1、pCAGGS和pcDNA系列载体。
在另一些优选的具体实施方案中，所述核酸疫苗或免疫原性组合物为痘病毒mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包括：
(I)如上述第一方面所述的多核苷酸的mRNA序列；和
(II)脂质纳米颗粒。
在另一些优选的具体实施方案中，所述核酸疫苗或免疫原性组合物为痘病毒-病毒载体疫苗，其包括：
(1)病毒骨架载体；和
(2)构建入所述病毒骨架载体中的、如上述第一方面所述的多核苷酸的DNA序列；
优选地，所述病毒骨架载体选自以下病毒载体中的一种或几种：腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体、腺相关病毒载体。
在可行的实现方式中，所述核酸疫苗或免疫原性组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、颗粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂和膏剂；
进一步优选地，所述片剂为舌下片；
进一步优选地，所述颗粒剂为细粒剂；
进一步优选地，所述粉末剂为散剂；
进一步优选地，所述丸剂为小丸剂；
优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射制剂；进一步优选地，所述可注射制剂为可推注制剂。
第七方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括如上述第一方面所述的多核苷酸、如上述第二方面所述的核酸构建体、如上述第三方面所述的表达载体、如上述第四方面所述的宿主细胞或者如上述第六方面所述的核酸疫苗或免疫原性组合物。
第八方面，本发明提供了一种预防和/或治疗痘病毒感染的方法，所述方法包括：向有需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的以下物质：如上述第一方面所述的多核苷酸、如上述第二方面所述的核酸构建体、如上述第三方面所述的表达载体、如上述第四方面所述的宿主细胞和/或如上述第六方面所述的核酸疫苗或免疫原性组合物。
所述“预防和/或治疗有效量”可根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。
有益效果
本发明提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原，所述嵌合或混合抗原包含：猴痘病毒A35R蛋白或其抗原性片段(或它们的适当变体)；和，猴痘病毒M1R蛋白或其抗原性片段(或它们的适当变体)。基于该多核苷酸的嵌合或混合核酸疫苗相较于现有技术疫苗具有以下优势：
1)克服了现有的弱毒活病毒疫苗的安全性问题；经实验验证，本发明的痘病毒核酸疫苗具有良好的有效性、安全性和快速响应性；
2)对于猴痘病毒具有较高的特异性；现有的活病毒疫苗基本上均是以痘苗病毒为基础开发而成的，痘苗病毒虽与猴痘病毒同属痘病毒科，但二者的中和抗原序列仍存在一定差异，因此，其对猴痘病毒的保护效果尚待明确，而本发明的痘病毒核酸疫苗是基于猴痘病毒的抗原表位开发的，因此，其对猴痘病毒的防治具有较高的特异性；
3)猴痘病毒中的蛋白种类繁多，其中绝大多数蛋白不能激发有效的抗病毒免疫反应，即为无效成分，此外，还有一些病毒蛋白具有免疫抑制作用；现有的活病毒疫苗无法去除上述无效和有害成分，因此存在接种风险和不确定性，而本发明的痘病毒核酸疫苗去除了原始免疫原中对激发宿主有效免疫反应无用和有害的成分，避免了减毒疫苗固有的安全性问题，并且，实验数据表明，本发明的仅包含上述两种免疫原的嵌合或混合核酸疫苗即可在小鼠模型中展现完全的保护效应。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1是本发明实施例2中所采用的疫苗免疫小鼠程序和采样程序示意图。
图2显示了如本发明实施例3中所检测的免疫小鼠血清针对A35R、M1R抗原的特异性结合抗体滴度检测结果，其中，图2a为第13天采集的免疫小鼠血清对于A35R、M1R抗原的结合抗体滴度，图2b为第27天采集的小鼠血清对于A35R、M1R抗原的结合抗体滴度。
图3显示了本发明实施例4中所检测的免疫小鼠血清的蚀斑中和结果。
图4显示了本发明实施例5中所检测的本发明嵌合mRNA疫苗DAM对于VACV-WR病毒滴鼻攻击BALB/c小鼠的保护效应，其中，横坐标显示的是攻毒后天数，纵坐标显示的是小鼠的体重变化百分比(a)和存活百分率(b)。
图5显示了本发明实施例5中所检测的本发明混合mRNA疫苗“A/M”对于VACV-WR病毒滴鼻攻击BALB/c小鼠的保护效应，其中，横坐标显示的是攻毒后天数，纵坐标显示的是小鼠的体重变化百分比(a)和存活百分率(b)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1：痘病毒多免疫原嵌合或混合mRNA疫苗的抗原设计、体外制备与脂质纳米颗粒包装
mRNA疫苗的抗原设计：
作为本发明的嵌合mRNA疫苗的代表性实例，本实施例中，按照从N端到C端依次为A35R-M1R-A35R-M1R的排布方式，构建了以(A35R-M1R)二聚体(以下简称DAM)为免疫原的mRNA疫苗。
上述DAM免疫原中，从N端起第一个A35R肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，第二个A35R肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；两个M1R的氨基酸序列相同，均如SEQ IDNO:3所示；
另外，本实施例中还设计并制备了A35R和M1R mRNA疫苗的混合苗(以下简称“A/M”)，即，分别制备并包装A35R、M1R单一免疫原的mRNA疫苗，并将二者按1：1的质量比混和而得；其中，所述A35R、M1R单一免疫原分别为如SEQ ID NO:1所示的A35R肽段以及如SEQ IDNO:3所示的M1R肽段。
体外制备与脂质纳米颗粒包装：
1)mRNA疫苗的体外转录和加帽
本实施例中，用于体外转录mRNA疫苗的基础质粒为pUC57，由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。
在基础质粒pUC57上，通过常规分子生物学手段引入mRNA疫苗的DNA表达元件，包括：(1)T7启动子，(2)mRNA疫苗的DNA编码区(DAM嵌合mRNA疫苗的DNA编码序列如SEQ IDNO:13所示，“A35R”、“M1R”单一mRNA疫苗的DNA编码序列分别如SEQ ID NO:4、8所示)，(3)在编码区上游的5’端UTR序列(如SEQ ID NO:16所示)，(4)信号肽(即SP，如SEQ ID NO:17所示)的编码序列(如SEQ ID NO:18所示)，和(5)下游的3’端UTR序列(如SEQ ID NO:19所示)，和多聚腺苷酸尾(Poly-A-tail)。
首先，使用限制性内切酶BamHI对上述体外转录质粒进行酶切，将其线性化；使用常规DNA纯化方法进行纯化，获得体外转录的模板；然后，基于该模板，使用T7RNA体外转录试剂盒(E131-01A，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)进行体外转录，获得体外转录的mRNA；最后，使用氯化锂回收试剂盒(S125，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)，通过氯化锂沉淀法对mRNA进行纯化，获得提纯的体外转录mRNA。
然后，使用加帽酶试剂盒Cap1加帽酶试剂盒(M082-01B，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)，对上述提纯的体外转录mRNA进行5’端Cap1加帽，使其满足在真核细胞内被翻译的条件；其后，使用与上述相同的氯化锂沉淀法对mRNA进行再次纯化，获得纯化的经5’端加帽修饰的mRNA。
2)脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticle,LNP)包装mRNA
将阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG脂质按照50：10：38.5：1.5的比例进行混合，然后使用Precision Nano Systems公司生产的Nanoassemblr Benchtop纳米脂质体包装仪，将其与上述5’端加帽修饰的mRNA(包括“DAM”mRNA，以及“A35R”、“M1R”单一mRNA)分别进行混合、包装。包装完成后，使用离心或透析的方法更换缓冲溶液为PBS。完成包装后，使用Thermo Fisher公司的Quan-iT Ribogreen RNA reagent试剂盒，对mRNA包装效率进行鉴定，包装效率符合mRNA疫苗的标准。
为制备A35R和M1R的mRNA混合苗“A/M”，将通过上述方法制备和包装的“A35R”、“M1R”单一mRNA疫苗按1：1的质量比进行混和。
实施例2：实验动物免疫和样品采集
本实施例中，使用6-8周龄的BALB/c品系的雌性小鼠(购自维通利华)进行动物实验；实验组分为mRNA疫苗免疫组和阴性对照组，其中，mRNA疫苗免疫组包括：嵌合mRNA疫苗DAM免疫组，以及混合mRNA疫苗“A/M”免疫组，所述阴性对照组为LNP免疫组。
mRNA疫苗免疫组的所有小鼠在第0天和第14天分别免疫接种一剂实施例1中所制备的嵌合mRNA疫苗DAM，或者实施例1中所制备的混合mRNA疫苗“A/M”；阴性对照组的小鼠则在同样的时间、注射相同量的空的LNP。接种方法均为肌肉注射，接种剂量为每只小鼠每次7.5μg mRNA疫苗或空LNP。分别在第13天和第27天采集小鼠血清样本，用于检验免疫血清的结合抗体滴度和中和抗体滴度。此外，还在第21天采集小鼠脾脏样本，用于检验T细胞免疫。
mRNA疫苗免疫小鼠及采样程序如图1所示。
实施例3：痘病毒嵌合mRNA疫苗免疫小鼠血清的特异性结合抗体滴度检测
用猴痘病毒A35R和M1R抗原蛋白(其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、3所示)分别包被ELISA板，将包被好的ELISA板在5％脱脂牛奶中封闭1小时；然后，将实施例2中的、由各实验组小鼠采集的血清在56℃孵育30分钟，进行灭活；将经过灭活的血清样本从1:200或1:1000开始进行三倍梯度稀释，然后将稀释液加入每个孔，随后将ELISA板在37℃下孵育1小时；将山羊抗小鼠IgG-HRP抗体(购自柏奥易杰(EASYBio))添加到板中作为二抗，并在37℃下再次孵育1小时；最后，用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物进行显色，显色完成后用2M盐酸终止反应，使用酶标仪(PerkinElmer)测量450nm和630nm处的吸光度。通过从同一孔的450nm处的吸光度减去630nm处的吸光度，来计算吸光度值。终点滴度定义为：血清产生的吸光度(如上所述，450nm的吸光度减去630nm的吸光度)大于背景值2.1倍时对应的血清稀释倍数。低于检测限的抗体滴度定义为检测限的三分之一。
免疫小鼠血清的抗体滴度检测结果如图2所示，其中图2a为免疫程序第13天所采集的血清的抗体滴度检测结果，图2b为免疫程序第27天所采集的血清的抗体滴度检测结果；由图2可知：DAM mRNA疫苗一免后(即，图2a)和二免后(即，图2b)的血清均含有可结合A35R和M1R抗原蛋白的特异性抗体，其中二免后的血清相比一免后血清的抗体滴度提升1～2个数量级。这说明：DAM mRNA疫苗可诱导针对A35R和M1R抗原蛋白的高水平的特异性结合抗体。
实施例4：免疫小鼠血清蚀斑中和实验
痘苗病毒(Vacciniavirus,VACV)是一种可在生物安全二级实验室操作的正痘病毒，也是正痘病毒属的模式病毒。鉴于VACV与其他正痘病毒种间差异较小，国际上常用VACV评价正痘病毒疫苗的细胞和动物水平。因此，我们采用国际上经常使用的痘苗病毒小鼠适应株Western Reserve(VACV-WR)，检测mRNA疫苗在细胞水平的活病毒中和能力。
具体地，在12孔板中铺好Vero细胞，一天后，用2％FBS DMEM培养基在深孔板中稀释实施例2中于免疫程序第27天所采集的DAM疫苗免疫小鼠血清，连续2倍比稀释，共10个稀释度。使用等体积100PFU的VACV病毒与稀释后血清混合，37℃孵育1h。弃掉细胞培养上清，加入血清-病毒混合液，37℃孵育2h。弃去上清，PBS漂洗1次，使用羧甲基纤维素钠与2xDMEM的1：1混合物覆盖细胞，37℃培养48h。添加4％多聚甲醛，室温固定3h，弃去混合液。使用结晶紫染色120min，使用ELISpot计数设备对显示的斑点计数，根据不同血清稀释梯度下的斑点相比阳性对照减少的比例绘制抑制率曲线，以该曲线的IC50(半抑制浓度)值作为该血清样品的PRNT50Titer值。
结果如图3所示，由图3可知：DAM疫苗能诱导产生针对猴痘病毒的高水平的中和抗体，其GMT(几何平均滴度)为1160。
实施例5：攻毒保护实验
基于发明人前期的实验数据，在VACV-WR攻毒量为1.9×105PFU时，小鼠在感染后7天全部死亡，因此，本实施例中采用该病毒量作为动物实验的攻毒剂量。
本实施例中，分别对实施例2中的嵌合mRNA疫苗(DAM)免疫组、混合mRNA疫苗(“A/M”)免疫组和LNP免疫组小鼠进行VACV-WR滴鼻攻毒，攻毒时间为第一次免疫后第29天，攻毒剂量为1.9×105PFU。通过观察mRNA疫苗免疫组和阴性对照组小鼠的存活率及体重变化，评价DAM或“A/M”mRNA疫苗对小鼠的活病毒攻毒保护效果。
结果如图4和5所示，
图4显示：本发明的DAM mRNA疫苗能对VACV-WR感染小鼠起到100％的保护效果，且小鼠体重初始下降后迅速回升，与之相比，LNP免疫组小鼠在7天内体重持续下降，直至全部死亡。
图5显示：本发明的A35R肽段和M1R肽段的mRNA混合疫苗(即，“A/M”)能对VACV-WR感染小鼠起到100％的保护效果，且小鼠体重初始下降后迅速回升，与之相比，LNP免疫组小鼠在4天内体重持续下降，直至全部死亡。
综上，本发明的多抗原嵌合或混合核酸疫苗可以高效激发针对痘病毒(特别是猴痘病毒)的特异性免疫反应，因而，有望被开发成痘病毒(特别是猴痘病毒)的预防和/或治疗性疫苗产品，具有极大的临床应用前景。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明技术方案的精神和范围。
本文中所涉及的序列：
SEQ ID NO:1——A35R抗原性片段I的氨基酸序列(S89-T180)
STTQYDHKESCNGLYYQGSCYILHSDYKSFEDAKANCAAESSTLPNKSDVLTTWLIDYVEDTWGSDGNPIT
KTTSDYQDSDVSQEVRKYFCT
SEQ ID NO:2——A35R抗原性片段II的氨基酸序列(S63-T180)
SANKAAITDSAVAVAAASSTHRKVVSSTTQYDHKESCNGLYYQGSCYILHSDYKSFEDAKANCAAESSTLP
NKSDVLTTWLIDYVEDTWGSDGNPITKTTSDYQDSDVSQEVRKYFCT
SEQ ID NO:3——M1R抗原性片段的氨基酸序列
AAASIQTTVNTLSERISSKLEQEANASAQTKCDIEIGNFYIRQNHGCNITVKNMCSADADAQLDAVLSAAT
ETYSGLTPEQKAYVPAMFTAALNIQTSVNTVVRDFENYVKQTCNSSAVVDNKLKIQNVIIDECYGAPGSPT
NLEFINTGSSKGNCAIKALMQLTTKATTQIAPRQVAG
SEQ ID NO:4——编码如SEQ ID NO:1所示的A35R抗原性片段I的DNA序列
AGCACCACCCAGTACGACCACAAAGAGAGCTGCAACGGCCTGTACTACCAAGGCTCTTGTTACATCCTGCA
CAGCGACTATAAGAGCTTCGAGGATGCTAAGGCCAATTGCGCCGCCGAGAGCAGCACACTGCCTAACAAGT
CCGACGTGCTGACCACCTGGCTGATCGACTACGTGGAAGATACATGGGGAAGCGACGGCAACCCCATCACA
AAAACCACAAGCGATTATCAGGACAGCGACGTGTCTCAGGAGGTTAGAAAGTACTTTTGCACC
SEQ ID NO:5——编码如SEQ ID NO:2所示的A35R抗原性片段II的DNA序列
TCCGCCAATAAGGCAGCCATCACCGACTCTGCCGTGGCAGTGGCAGCAGCCAGCTCCACACACCGCAAGGT
GGTGTCTAGCACCACACAGTACGATCACAAGGAATCCTGTAATGGCCTGTACTATCAGGGCTCCTGTTACA
TCCTGCACTCTGACTATAAGAGCTTTGAGGATGCCAAGGCCAACTGTGCCGCCGAGTCCTCTACCCTGCCA
AATAAGAGCGACGTGCTGACCACATGGCTGATCGACTATGTGGAGGATACCTGGGGCTCTGATGGCAACCC
CATCACAAAGACCACATCTGATTACCAGGACAGCGACGTGAGCCAGGAGGTGCGGAAGTATTTCTGCACC
SEQ ID NO:6——编码如SEQ ID NO:1所示的A35R抗原性片段I的mRNA序列
AGCACCACCCAGUACGACCACAAAGAGAGCUGCAACGGCCUGUACUACCAAGGCUCUUGUUACAUCCUGCA
CAGCGACUAUAAGAGCUUCGAGGAUGCUAAGGCCAAUUGCGCCGCCGAGAGCAGCACACUGCCUAACAAGU
CCGACGUGCUGACCACCUGGCUGAUCGACUACGUGGAAGAUACAUGGGGAAGCGACGGCAACCCCAUCACA
AAAACCACAAGCGAUUAUCAGGACAGCGACGUGUCUCAGGAGGUUAGAAAGUACUUUUGCACC
SEQ ID NO:7——编码如SEQ ID NO:2所示的A35R抗原性片段II的mRNA序列
UCCGCCAAUAAGGCAGCCAUCACCGACUCUGCCGUGGCAGUGGCAGCAGCCAGCUCCACACACCGCAAGGU
GGUGUCUAGCACCACACAGUACGAUCACAAGGAAUCCUGUAAUGGCCUGUACUAUCAGGGCUCCUGUUACA
UCCUGCACUCUGACUAUAAGAGCUUUGAGGAUGCCAAGGCCAACUGUGCCGCCGAGUCCUCUACCCUGCCA
AAUAAGAGCGACGUGCUGACCACAUGGCUGAUCGACUAUGUGGAGGAUACCUGGGGCUCUGAUGGCAACCC
CAUCACAAAGACCACAUCUGAUUACCAGGACAGCGACGUGAGCCAGGAGGUGCGGAAGUAUUUCUGCACC
SEQ ID NO:8——编码如SEQ ID NO:3所示的M1R抗原性片段的DNA序列
GCCGCCGCCTCTATCCAGACCACAGTGAACACCCTGAGCGAGCGGATCAGCTCCAAGCTGGAGCAGGAGGC
AAACGCAAGCGCCCAGACAAAGTGCGACATCGAGATCGGCAATTTCTACATCAGACAGAACCACGGCTGCA
ATATCACCGTGAAGAATATGTGCTCCGCCGACGCAGATGCACAGCTGGATGCCGTGCTGTCCGCCGCAACC
GAGACATACTCTGGCCTGACCCCTGAGCAGAAGGCCTATGTGCCAGCCATGTTCACAGCCGCCCTGAACAT
CCAGACCAGCGTGAATACAGTGGTGCGGGACTTTGAGAACTACGTGAAGCAGACCTGCAATTCTAGCGCCG
TGGTGGACAACAAGCTGAAGATCCAGAATGTGATCATCGATGAGTGTTATGGAGCACCAGGCTCCCCTACC
AACCTGGAGTTCATCAATACAGGCTCCTCTAAGGGCAACTGCGCCATCAAGGCCCTGATGCAGCTGACCAC
AAAGGCCACCACACAGATCGCACCTAGGCAGGTGGCAGGC
SEQ ID NO:9——编码如SEQ ID NO:3所示的M1R抗原性片段的mRNA序列
GCCGCCGCCUCUAUCCAGACCACAGUGAACACCCUGAGCGAGCGGAUCAGCUCCAAGCUGGAGCAGGAGGC
AAACGCAAGCGCCCAGACAAAGUGCGACAUCGAGAUCGGCAAUUUCUACAUCAGACAGAACCACGGCUGCA
AUAUCACCGUGAAGAAUAUGUGCUCCGCCGACGCAGAUGCACAGCUGGAUGCCGUGCUGUCCGCCGCAACC
GAGACAUACUCUGGCCUGACCCCUGAGCAGAAGGCCUAUGUGCCAGCCAUGUUCACAGCCGCCCUGAACAU
CCAGACCAGCGUGAAUACAGUGGUGCGGGACUUUGAGAACUACGUGAAGCAGACCUGCAAUUCUAGCGCCG
UGGUGGACAACAAGCUGAAGAUCCAGAAUGUGAUCAUCGAUGAGUGUUAUGGAGCACCAGGCUCCCCUACC
AACCUGGAGUUCAUCAAUACAGGCUCCUCUAAGGGCAACUGCGCCAUCAAGGCCCUGAUGCAGCUGACCAC
AAAGGCCACCACACAGAUCGCACCUAGGCAGGUGGCAGGC
SEQ ID NO:10——DAM(A1与A2相同，均为SEQ ID NO:1)的氨基酸序列
STTQYDHKESCNGLYYQGSCYILHSDYKSFEDAKANCAAESSTLPNKSDVLTTWLIDYVEDTWGSDGNPIT
KTTSDYQDSDVSQEVRKYFCTAAASIQTTVNTLSERISSKLEQEANASAQTKCDIEIGNFYIRQNHGCNIT
VKNMCSADADAQLDAVLSAATETYSGLTPEQKAYVPAMFTAALNIQTSVNTVVRDFENYVKQTCNSSAVVD
NKLKIQNVIIDECYGAPGSPTNLEFINTGSSKGNCAIKALMQLTTKATTQIAPRQVAGSTTQYDHKESCNG
LYYQGSCYILHSDYKSFEDAKANCAAESSTLPNKSDVLTTWLIDYVEDTWGSDGNPITKTTSDYQDSDVSQ
EVRKYFCTAAASIQTTVNTLSERISSKLEQEANASAQTKCDIEIGNFYIRQNHGCNITVKNMCSADADAQL
DAVLSAATETYSGLTPEQKAYVPAMFTAALNIQTSVNTVVRDFENYVKQTCNSSAVVDNKLKIQNVIIDEC
YGAPGSPTNLEFINTGSSKGNCAIKALMQLTTKATTQIAPRQVAG
SEQ ID NO:11——DAM(A1与A2不同)的氨基酸序列
STTQYDHKESCNGLYYQGSCYILHSDYKSFEDAKANCAAESSTLPNKSDVLTTWLIDYVEDTWGSDGNPIT
KTTSDYQDSDVSQEVRKYFCTAAASIQTTVNTLSERISSKLEQEANASAQTKCDIEIGNFYIRQNHGCNIT
VKNMCSADADAQLDAVLSAATETYSGLTPEQKAYVPAMFTAALNIQTSVNTVVRDFENYVKQTCNSSAVVD
NKLKIQNVIIDECYGAPGSPTNLEFINTGSSKGNCAIKALMQLTTKATTQIAPRQVAGSANKAAITDSAVA
VAAASSTHRKVVSSTTQYDHKESCNGLYYQGSCYILHSDYKSFEDAKANCAAESSTLPNKSDVLTTWLIDY
VEDTWGSDGNPITKTTSDYQDSDVSQEVRKYFCTAAASIQTTVNTLSERISSKLEQEANASAQTKCDIEIG
NFYIRQNHGCNITVKNMCSADADAQLDAVLSAATETYSGLTPEQKAYVPAMFTAALNIQTSVNTVVRDFEN
YVKQTCNSSAVVDNKLKIQNVIIDECYGAPGSPTNLEFINTGSSKGNCAIKALMQLTTKATTQIAPRQVAG
SEQ ID NO:12——编码DAM(A1与A2相同，均为SEQ ID NO:1)的DNA序列
AGCACCACCCAGTACGACCACAAAGAGAGCTGCAACGGCCTGTACTACCAAGGCTCTTGTTACATCCTGCA
CAGCGACTATAAGAGCTTCGAGGATGCTAAGGCCAATTGCGCCGCCGAGAGCAGCACACTGCCTAACAAGT
CCGACGTGCTGACCACCTGGCTGATCGACTACGTGGAAGATACATGGGGAAGCGACGGCAACCCCATCACA
AAAACCACAAGCGATTATCAGGACAGCGACGTGTCTCAGGAGGTTAGAAAGTACTTTTGCACCGCCGCCGC
CTCTATCCAGACCACAGTGAACACCCTGAGCGAGCGGATCAGCTCCAAGCTGGAGCAGGAGGCAAACGCAA
GCGCCCAGACAAAGTGCGACATCGAGATCGGCAATTTCTACATCAGACAGAACCACGGCTGCAATATCACC
GTGAAGAATATGTGCTCCGCCGACGCAGATGCACAGCTGGATGCCGTGCTGTCCGCCGCAACCGAGACATA
CTCTGGCCTGACCCCTGAGCAGAAGGCCTATGTGCCAGCCATGTTCACAGCCGCCCTGAACATCCAGACCA
GCGTGAATACAGTGGTGCGGGACTTTGAGAACTACGTGAAGCAGACCTGCAATTCTAGCGCCGTGGTGGAC
AACAAGCTGAAGATCCAGAATGTGATCATCGATGAGTGTTATGGAGCACCAGGCTCCCCTACCAACCTGGA
GTTCATCAATACAGGCTCCTCTAAGGGCAACTGCGCCATCAAGGCCCTGATGCAGCTGACCACAAAGGCCA
CCACACAGATCGCACCTAGGCAGGTGGCAGGCAGCACCACACAGTACGATCACAAGGAATCCTGTAATGGC
CTGTACTATCAGGGCTCCTGTTACATCCTGCACTCTGACTATAAGAGCTTTGAGGATGCCAAGGCCAACTG
TGCCGCCGAGTCCTCTACCCTGCCAAATAAGAGCGACGTGCTGACCACATGGCTGATCGACTATGTGGAGG
ATACCTGGGGCTCTGATGGCAACCCCATCACAAAGACCACATCTGATTACCAGGACAGCGACGTGAGCCAG
GAGGTGCGGAAGTATTTCTGCACCGCTGCTGCTTCCATCCAGACCACAGTGAATACACTGAGCGAGAGAAT
CAGCTCCAAACTGGAGCAGGAGGCCAACGCCTCTGCCCAGACCAAGTGTGACATCGAGATCGGCAACTTCT
ACATCAGGCAGAATCATGGATGTAATATCACCGTGAAGAACATGTGCTCCGCCGATGCCGACGCCCAGCTG
GACGCCGTGCTGAGCGCCGCCACTGAGACATACTCCGGCCTGACCCCCGAACAGAAAGCCTATGTGCCTGC
TATGTTTACCGCCGCCCTGAACATTCAGACCAGCGTCAACACAGTGGTGCGCGATTTCGAAAATTATGTCA
AACAGACTTGTAATTCTAGCGCCGTCGTCGATAACAAGCTGAAGATTCAGAATGTGATTATTGACGAATGC
TACGGAGCACCAGGCTCCCCAACCAACCTGGAGTTTATCAACACCGGCTCCTCTAAGGGCAATTGTGCCAT
CAAGGCCCTGATGCAACTGACTACCAAAGCTACCACACAGATCGCACCAAGGCAGGTGGCAGGA
SEQ ID NO:13——编码DAM(A1与A2不同)的DNA序列
AGCACCACCCAGTACGACCACAAAGAGAGCTGCAACGGCCTGTACTACCAAGGCTCTTGTTACATCCTGCA
CAGCGACTATAAGAGCTTCGAGGATGCTAAGGCCAATTGCGCCGCCGAGAGCAGCACACTGCCTAACAAGT
CCGACGTGCTGACCACCTGGCTGATCGACTACGTGGAAGATACATGGGGAAGCGACGGCAACCCCATCACA
AAAACCACAAGCGATTATCAGGACAGCGACGTGTCTCAGGAGGTTAGAAAGTACTTTTGCACCGCCGCCGC
CTCTATCCAGACCACAGTGAACACCCTGAGCGAGCGGATCAGCTCCAAGCTGGAGCAGGAGGCAAACGCAA
GCGCCCAGACAAAGTGCGACATCGAGATCGGCAATTTCTACATCAGACAGAACCACGGCTGCAATATCACC
GTGAAGAATATGTGCTCCGCCGACGCAGATGCACAGCTGGATGCCGTGCTGTCCGCCGCAACCGAGACATA
CTCTGGCCTGACCCCTGAGCAGAAGGCCTATGTGCCAGCCATGTTCACAGCCGCCCTGAACATCCAGACCA
GCGTGAATACAGTGGTGCGGGACTTTGAGAACTACGTGAAGCAGACCTGCAATTCTAGCGCCGTGGTGGAC
AACAAGCTGAAGATCCAGAATGTGATCATCGATGAGTGTTATGGAGCACCAGGCTCCCCTACCAACCTGGA
GTTCATCAATACAGGCTCCTCTAAGGGCAACTGCGCCATCAAGGCCCTGATGCAGCTGACCACAAAGGCCA
CCACACAGATCGCACCTAGGCAGGTGGCAGGCTCCGCCAATAAGGCAGCCATCACCGACTCTGCCGTGGCA
GTGGCAGCAGCCAGCTCCACACACCGCAAGGTGGTGTCTAGCACCACACAGTACGATCACAAGGAATCCTG
TAATGGCCTGTACTATCAGGGCTCCTGTTACATCCTGCACTCTGACTATAAGAGCTTTGAGGATGCCAAGG
CCAACTGTGCCGCCGAGTCCTCTACCCTGCCAAATAAGAGCGACGTGCTGACCACATGGCTGATCGACTAT
GTGGAGGATACCTGGGGCTCTGATGGCAACCCCATCACAAAGACCACATCTGATTACCAGGACAGCGACGT
GAGCCAGGAGGTGCGGAAGTATTTCTGCACCGCTGCTGCTTCCATCCAGACCACAGTGAATACACTGAGCG
AGAGAATCAGCTCCAAACTGGAGCAGGAGGCCAACGCCTCTGCCCAGACCAAGTGTGACATCGAGATCGGC
AACTTCTACATCAGGCAGAATCATGGATGTAATATCACCGTGAAGAACATGTGCTCCGCCGATGCCGACGC
CCAGCTGGACGCCGTGCTGAGCGCCGCCACTGAGACATACTCCGGCCTGACCCCCGAACAGAAAGCCTATG
TGCCTGCTATGTTTACCGCCGCCCTGAACATTCAGACCAGCGTCAACACAGTGGTGCGCGATTTCGAAAAT
TATGTCAAACAGACTTGTAATTCTAGCGCCGTCGTCGATAACAAGCTGAAGATTCAGAATGTGATTATTGA
CGAATGCTACGGAGCACCAGGCTCCCCAACCAACCTGGAGTTTATCAACACCGGCTCCTCTAAGGGCAATT
GTGCCATCAAGGCCCTGATGCAACTGACTACCAAAGCTACCACACAGATCGCACCAAGGCAGGTGGCAGGA
SEQ ID NO:14——编码DAM(A1与A2相同，均为SEQ ID NO:1)的mRNA序列
AGCACCACCCAGUACGACCACAAAGAGAGCUGCAACGGCCUGUACUACCAAGGCUCUUGUUACAUCCUGCA
CAGCGACUAUAAGAGCUUCGAGGAUGCUAAGGCCAAUUGCGCCGCCGAGAGCAGCACACUGCCUAACAAGU
CCGACGUGCUGACCACCUGGCUGAUCGACUACGUGGAAGAUACAUGGGGAAGCGACGGCAACCCCAUCACA
AAAACCACAAGCGAUUAUCAGGACAGCGACGUGUCUCAGGAGGUUAGAAAGUACUUUUGCACCGCCGCCGC
CUCUAUCCAGACCACAGUGAACACCCUGAGCGAGCGGAUCAGCUCCAAGCUGGAGCAGGAGGCAAACGCAA
GCGCCCAGACAAAGUGCGACAUCGAGAUCGGCAAUUUCUACAUCAGACAGAACCACGGCUGCAAUAUCACC
GUGAAGAAUAUGUGCUCCGCCGACGCAGAUGCACAGCUGGAUGCCGUGCUGUCCGCCGCAACCGAGACAUA
CUCUGGCCUGACCCCUGAGCAGAAGGCCUAUGUGCCAGCCAUGUUCACAGCCGCCCUGAACAUCCAGACCA
GCGUGAAUACAGUGGUGCGGGACUUUGAGAACUACGUGAAGCAGACCUGCAAUUCUAGCGCCGUGGUGGAC
AACAAGCUGAAGAUCCAGAAUGUGAUCAUCGAUGAGUGUUAUGGAGCACCAGGCUCCCCUACCAACCUGGA
GUUCAUCAAUACAGGCUCCUCUAAGGGCAACUGCGCCAUCAAGGCCCUGAUGCAGCUGACCACAAAGGCCA
CCACACAGAUCGCACCUAGGCAGGUGGCAGGCAGCACCACACAGUACGAUCACAAGGAAUCCUGUAAUGGC
CUGUACUAUCAGGGCUCCUGUUACAUCCUGCACUCUGACUAUAAGAGCUUUGAGGAUGCCAAGGCCAACUG
UGCCGCCGAGUCCUCUACCCUGCCAAAUAAGAGCGACGUGCUGACCACAUGGCUGAUCGACUAUGUGGAGG
AUACCUGGGGCUCUGAUGGCAACCCCAUCACAAAGACCACAUCUGAUUACCAGGACAGCGACGUGAGCCAG
GAGGUGCGGAAGUAUUUCUGCACCGCUGCUGCUUCCAUCCAGACCACAGUGAAUACACUGAGCGAGAGAAU
CAGCUCCAAACUGGAGCAGGAGGCCAACGCCUCUGCCCAGACCAAGUGUGACAUCGAGAUCGGCAACUUCU
ACAUCAGGCAGAAUCAUGGAUGUAAUAUCACCGUGAAGAACAUGUGCUCCGCCGAUGCCGACGCCCAGCUG
GACGCCGUGCUGAGCGCCGCCACUGAGACAUACUCCGGCCUGACCCCCGAACAGAAAGCCUAUGUGCCUGC
UAUGUUUACCGCCGCCCUGAACAUUCAGACCAGCGUCAACACAGUGGUGCGCGAUUUCGAAAAUUAUGUCA
AACAGACUUGUAAUUCUAGCGCCGUCGUCGAUAACAAGCUGAAGAUUCAGAAUGUGAUUAUUGACGAAUGC
UACGGAGCACCAGGCUCCCCAACCAACCUGGAGUUUAUCAACACCGGCUCCUCUAAGGGCAAUUGUGCCAU
CAAGGCCCUGAUGCAACUGACUACCAAAGCUACCACACAGAUCGCACCAAGGCAGGUGGCAGGA
SEQ ID NO:15——编码DAM(A1与A2不同)的mRNA序列
AGCACCACCCAGUACGACCACAAAGAGAGCUGCAACGGCCUGUACUACCAAGGCUCUUGUUACAUCCUGCA
CAGCGACUAUAAGAGCUUCGAGGAUGCUAAGGCCAAUUGCGCCGCCGAGAGCAGCACACUGCCUAACAAGU
CCGACGUGCUGACCACCUGGCUGAUCGACUACGUGGAAGAUACAUGGGGAAGCGACGGCAACCCCAUCACA
AAAACCACAAGCGAUUAUCAGGACAGCGACGUGUCUCAGGAGGUUAGAAAGUACUUUUGCACCGCCGCCGC
CUCUAUCCAGACCACAGUGAACACCCUGAGCGAGCGGAUCAGCUCCAAGCUGGAGCAGGAGGCAAACGCAA
GCGCCCAGACAAAGUGCGACAUCGAGAUCGGCAAUUUCUACAUCAGACAGAACCACGGCUGCAAUAUCACC
GUGAAGAAUAUGUGCUCCGCCGACGCAGAUGCACAGCUGGAUGCCGUGCUGUCCGCCGCAACCGAGACAUA
CUCUGGCCUGACCCCUGAGCAGAAGGCCUAUGUGCCAGCCAUGUUCACAGCCGCCCUGAACAUCCAGACCA
GCGUGAAUACAGUGGUGCGGGACUUUGAGAACUACGUGAAGCAGACCUGCAAUUCUAGCGCCGUGGUGGAC
AACAAGCUGAAGAUCCAGAAUGUGAUCAUCGAUGAGUGUUAUGGAGCACCAGGCUCCCCUACCAACCUGGA
GUUCAUCAAUACAGGCUCCUCUAAGGGCAACUGCGCCAUCAAGGCCCUGAUGCAGCUGACCACAAAGGCCA
CCACACAGAUCGCACCUAGGCAGGUGGCAGGCUCCGCCAAUAAGGCAGCCAUCACCGACUCUGCCGUGGCA
GUGGCAGCAGCCAGCUCCACACACCGCAAGGUGGUGUCUAGCACCACACAGUACGAUCACAAGGAAUCCUG
UAAUGGCCUGUACUAUCAGGGCUCCUGUUACAUCCUGCACUCUGACUAUAAGAGCUUUGAGGAUGCCAAGG
CCAACUGUGCCGCCGAGUCCUCUACCCUGCCAAAUAAGAGCGACGUGCUGACCACAUGGCUGAUCGACUAU
GUGGAGGAUACCUGGGGCUCUGAUGGCAACCCCAUCACAAAGACCACAUCUGAUUACCAGGACAGCGACGU
GAGCCAGGAGGUGCGGAAGUAUUUCUGCACCGCUGCUGCUUCCAUCCAGACCACAGUGAAUACACUGAGCG
AGAGAAUCAGCUCCAAACUGGAGCAGGAGGCCAACGCCUCUGCCCAGACCAAGUGUGACAUCGAGAUCGGC
AACUUCUACAUCAGGCAGAAUCAUGGAUGUAAUAUCACCGUGAAGAACAUGUGCUCCGCCGAUGCCGACGC
CCAGCUGGACGCCGUGCUGAGCGCCGCCACUGAGACAUACUCCGGCCUGACCCCCGAACAGAAAGCCUAUG
UGCCUGCUAUGUUUACCGCCGCCCUGAACAUUCAGACCAGCGUCAACACAGUGGUGCGCGAUUUCGAAAAU
UAUGUCAAACAGACUUGUAAUUCUAGCGCCGUCGUCGAUAACAAGCUGAAGAUUCAGAAUGUGAUUAUUGA
CGAAUGCUACGGAGCACCAGGCUCCCCAACCAACCUGGAGUUUAUCAACACCGGCUCCUCUAAGGGCAAUU
GUGCCAUCAAGGCCCUGAUGCAACUGACUACCAAAGCUACCACACAGAUCGCACCAAGGCAGGUGGCAGGASEQ ID NO:16——5’UTR序列
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC
SEQ ID NO:17——信号肽序列
METDTLLLWVLLLWVPGSTG
SEQ ID NO:18——信号肽的编码序列
ATGGAAACAGACACCCTGCTGCTGTGGGTCCTGCTGCTCTGGGTGCCTGGCAGCACCGGC
SEQ ID NO:19——3’UTR序列
TGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTT
CCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGA。

Claims (18)

1.一种多核苷酸，其编码痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原，其特征在于，所述嵌合或混合抗原包含：
免疫原I：猴痘病毒A35R蛋白或其抗原性片段，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；和
免疫原II：猴痘病毒M1R蛋白或其抗原性片段，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列。
2.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述A35R蛋白的抗原性片段为该蛋白的胞外段或其一部分，优选为具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列加上由其向A35R蛋白的N端延伸1-30个氨基酸的片段的氨基酸序列、优选如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的肽段；
和/或，所述M1R蛋白的抗原性片段为该蛋白的胞外段或其一部分，优选为具有如SEQID NO:3所示的氨基酸序列的肽段。
3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码痘病毒多免疫原混合抗原，所述混合抗原为免疫原I、II的混合物；
优选地，其中，所述免疫原I具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
和/或，所述免疫原II具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
优选地，所述混合物中，所述免疫原I、II的质量比为1：1。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为多核苷酸组，包括：
I)序列如SEQ ID NO:4或5所示的DNA分子，和/或其相应的mRNA分子，其序列分别如SEQID NO:6或7所示；和
II)序列如SEQ ID NO:8所示的DNA分子，和/或其相应的mRNA分子，其序列如SEQ IDNO:9所示。
5.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码痘病毒多免疫原嵌合抗原，所述嵌合抗原为一个或多个免疫原I、II以串联方式形成的单链；
优选地，所述嵌合抗原具有如式(I)所示结构：
A1-C1-M1-C2-A2-C3-M2
(I)
式(I)中：
A1表示猴痘病毒A35R蛋白或其抗原性片段I，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，
A2表示猴痘病毒A35R蛋白或其抗原性片段II，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，
M1表示猴痘病毒M1R蛋白或其抗原性片段I，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，
M2表示猴痘病毒M1R蛋白或其抗原性片段II，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
C1、C2、C3各自独立地为无，或者连接序列(GGGGS)n，其中，n为1-10之间的任意整数；
其中，
A1与A2相同或不同，
M1与M2相同或不同。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述A35R蛋白的抗原性片段I或II为该蛋白的胞外段或其一部分；
和/或，所述M1R蛋白的抗原性片段I或II为该蛋白的胞外段或其一部分。
7.根据权利要求5或6所述的多核苷酸，其特征在于，所述A1表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
和/或，所述A2表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列加上由其向A35R蛋白的N端延伸1-30个氨基酸的片段的氨基酸序列、优选如SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列，或者由上述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
和/或，所述M1与M2相同，表示如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或者如SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
优选地，所述A1表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述A2表示如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述M1与M2相同，表示如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
优选地，所述C1、C2、C3均为无；
进一步优选地，所述嵌合抗原包含如SEQ ID NO:10或11所示的氨基酸序列；
可选地，所述嵌合抗原为单链二聚体结构。
8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为DNA分子和/或其相应的mRNA分子；
优选地，所述DNA分子具有如SEQ ID NO:12或13所示的DNA序列，其相应的mRNA分子具有如SEQ ID NO:14或15所示的mRNA序列。
9.一种核酸构建体，其包含如权利要求1-8任一项所述的多核苷酸，以及任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。
10.一种表达载体，其包含如权利要求9所述的核酸构建体。
11.一种宿主细胞，其中转化或转染有如权利要求1-8任一项所述的多核苷酸、如权利要求9所述的核酸构建体或如权利要求10所述的表达载体。
12.如权利要求1-8任一项所述的多核苷酸、如权利要求9所述的核酸构建体、如权利要求10所述的表达载体或如权利要求11所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗痘病毒感染的药物中的应用；
优选地，所述痘病毒选自：猴痘病毒、天花病毒、牛痘病毒和/或痘苗病毒；
可选地，所述药物为疫苗，优选为mRNA疫苗；
可选地，所述疫苗为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、颗粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂和膏剂；进一步优选地，所述片剂为舌下片；进一步优选地，所述颗粒剂为细粒剂；进一步优选地，所述粉末剂为散剂；进一步优选地，所述丸剂为小丸剂；
优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射制剂；进一步优选地，所述可注射制剂为可推注制剂。
13.一种核酸疫苗或免疫原性组合物，其包含如权利要求1-8任一项所述的多核苷酸、如权利要求9所述的核酸构建体、如权利要求10所述的表达载体或如权利要求11所述的宿主细胞，以及生理学可接受的媒介物、佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂。
14.根据权利要求13所述的核酸疫苗或免疫原性组合物，其为痘病毒DNA疫苗，所述DNA疫苗包括：
(i)真核表达载体；和
(ii)构建入所述真核表达载体中的、如权利要求1-8任一项所述的多核苷酸的DNA序列；
优选地，所述真核表达载体选自pGX0001、pVAX1、pCAGGS和pcDNA系列载体。
15.根据权利要求13所述的核酸疫苗或免疫原性组合物，其为痘病毒mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包括：
(I)如权利要求1-8任一项所述的多核苷酸的mRNA序列；和
(II)脂质纳米颗粒。
16.根据权利要求13所述的核酸疫苗或免疫原性组合物，其为痘病毒-病毒载体疫苗，其包括：
(1)病毒骨架载体；和
(2)构建入所述病毒骨架载体中的、如权利要求1-8任一项所述的多核苷酸的DNA序列；
优选地，所述病毒骨架载体选自以下病毒载体中的一种或几种：腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体、腺相关病毒载体。
17.根据权利要求13-16任一项所述的核酸疫苗或免疫原性组合物，其特征在于，所述核酸疫苗或免疫原性组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、颗粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂和膏剂；
进一步优选地，所述片剂为舌下片；
进一步优选地，所述颗粒剂为细粒剂；
进一步优选地，所述粉末剂为散剂；
进一步优选地，所述丸剂为小丸剂；
优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射制剂；进一步优选地，所述可注射制剂为可推注制剂。
18.一种试剂盒，其包括如权利要求1-8任一项所述的多核苷酸、如权利要求9所述的核酸构建体、如权利要求10所述的表达载体、如权利要求11所述的宿主细胞或者如权利要求13-17任一项所述的核酸疫苗或免疫原性组合物。
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