CN116855514A - 编码寨卡病毒抗原肽的mRNA、基于其的mRNA疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种编码寨卡病毒抗原肽的mRNA、编码寨卡病毒抗原肽的mRNA构建体、生产该mRNA的重组表达质粒以及基于该mRNA的针对寨卡病毒的mRNA疫苗及其制备方法；本发明的针对寨卡病毒的mRNA疫苗不仅能够避免FL表位抗体的诱导产生，从而可显著降低或者消除ADE效应，还能够产生高于其他疫苗载体平台的、高水平的中和抗体，从而可有效地预防或治疗寨卡病毒感染性疾病，具有较好的临床应用价值和前景。

Description

编码寨卡病毒抗原肽的mRNA、基于其的mRNA疫苗及其制备 方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及编码寨卡病毒抗原肽的mRNA、基于其的mRNA疫苗及其制备方法。
背景技术
寨卡热(Zika fever)是由寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)引起的经蚊媒传播的一种病毒性疾病。1947年在乌干达的恒河猴血清中发现了ZIKV，1952年乌干达及坦桑尼亚出现人感染寨卡病毒的病例。孕妇怀孕期间感染ZIKV会影响胎盘功能，导致小头畸形、流产等。成人感染寨卡病毒会引发格林-巴利综合征。2015-2016年，巴西发生寨卡热大流行，相继造成44-150万人感染ZIKV，WHO已将该病毒感染列为国际紧急卫生事件。
ZIKV是一种虫媒病毒，属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，为单股正链RNA病毒。ZIKV基因组约10.7kb,编码3423个氨基酸。黄病毒属病毒可诱导免疫交叉反应，具有相似的免疫原表位。这种交叉反应有些是有益的，会引起交叉保护。然而，有些抗体交叉反应可通过非中和或者亚中和抗体介导感染增强效应(即，ADE效应)，从而加重疾病。引起ADE反应的抗体主要是由病毒的囊膜蛋白(Envelope，E)蛋白的融合肽(fusionloop，FL)在病毒感染过程中，诱导免疫细胞产生的针对FL的抗体。ZIKV和登革病毒(DENV)具有相似的遗传组成和抗原特性，ZIKV感染后产生的抗体会引发对DENV的ADE效应，给疫苗开发带来了严峻的挑战。
目前处于I/II期临床试验的候选ZIKV疫苗包括灭活病毒疫苗、病毒载体疫苗，亚单位蛋白疫苗、核酸DNA-RNA疫苗，以及基于蚊子唾液抗体的疫苗，但迄今尚无开发消除ZIKV的ADE表位的疫苗进入临床实验研究开发的报道。
前期我们开发了消除ZIKV的FL表位的腺病毒载体疫苗，其能够有效预防ZIKV感染，同时没有产生对DENV的ADE反应。在COVID-19大流行情况下，多平台疫苗途径得到快速发展。数据显示，牛津大学/阿斯利康腺病毒载体疫苗ChAdOx1-S对COVID-19保护效率为70％，BioNTech的mRNA疫苗(BNT162b2)和Moderna的mRNA疫苗(mRNA-1273)对COVID-19保护效率为94％左右。mRNA疫苗是一种新型疫苗平台，仅需要病毒基因序列信息就能开发应用，是对抗大流行病和其他传染病的一种重要新工具。mRNA疫苗的作用机理是将病毒mRNA片段插入人体细胞中，通过重编程产生病原体抗原，然后激发针对病原体的适应性免疫反应；mRNA分子通常被固定在脂质纳米颗粒等药物输送载体中，以保护脆弱的mRNA分子，并帮助其被人体细胞吸收。与传统蛋白疫苗相比，RNA疫苗的优势在于生产速度快、成本低，可诱导细胞免疫以及体液免疫，但需要冷链配送和低温储存。因此，本领域急需开发一种使用mRNA技术路线的、能够消除对DENV的ADE反应的新型寨卡病毒疫苗。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为克服上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种编码寨卡病毒抗原肽的mRNA，其mRNA构建体、重组表达质粒，及其在制备用于预防或/或治疗寨卡病毒感染性疾病的疫苗、优选mRNA疫苗中的应用，以及基于前述mRNA或mRNA构建体的针对寨卡病毒的mRNA疫苗及其制备方法。
具体地，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种编码寨卡病毒抗原肽的mRNA，所述mRNA具有如SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示的mRNA序列，或者，其由如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的DNA转录而成。
换句话说，如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的mRNA序列可由如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的DNA转录而成。
第二方面，本发明提供了一种编码寨卡病毒抗原肽的mRNA构建体，所述mRNA构建体包含如上述第一方面所述的mRNA，以及选自以下的一种或多种元件：5’端UTR区、3’端UTR区、5’末端帽结构、3’末端PolyA尾和信号肽序列。
在优选的具体实施方案中，所述5’端UTR区具有如SEQ ID NO:5所示序列；
在优选的具体实施方案中，所述3’端UTR区具有如SEQ ID NO:6所示序列；
在优选的具体实施方案中，所述5’末端帽结构为m7G(5’)ppp；
在优选的具体实施方案中，所述3’末端PolyA尾为80～200个A；
在优选的具体实施方案中，所述信号肽序列如SEQ ID NO:7所示。
第三方面，本发明提供了一种生产如上述第一方面所述的mRNA的重组表达质粒，所述重组表达质粒包括质粒骨架序列和编码寨卡病毒抗原肽的DNA序列。
作为优选，所述编码寨卡病毒抗原肽的DNA序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示；
作为优选，所述质粒骨架序列包括T7启动子序列、5’端UTR区、信号肽序列、3’端UTR区、5’末端帽结构和3’末端PolyA尾；
在优选的具体实施方案中，所述5’端UTR区具有如SEQ ID NO:5所示序列；
在优选的具体实施方案中，所述3’端UTR区具有如SEQ ID NO:6所示序列；
在优选的具体实施方案中，所述5’末端帽结构为m7G(5’)ppp；
在优选的具体实施方案中，所述3’末端PolyA尾为80～200个A；
在优选的具体实施方案中，所述信号肽序列如SEQ ID NO:7所示。
第四方面，本发明提供了如上述第一方面所述的mRNA、如上述第二方面所述的mRNA构建体或者如上述第三方面所述的重组表达质粒在制备用于预防和/或治疗寨卡病毒感染性疾病的疫苗、优选mRNA疫苗中的应用。
第五方面，本发明提供了一种针对寨卡病毒的mRNA疫苗，其包括如上述第一方面所述的mRNA或者如上述第二方面所述的mRNA构建体，和脂质组分。
在优选的实施方案中，如上述第一方面所述的mRNA或者如上述第二方面所述的mRNA构建体与脂质组分的质量比为1：(10～30)，优选1：20；
在优选的实施方案中，所述脂质组分包含阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG脂质，或由其组成；进一步优选地，所述脂质组分中，阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG脂质的摩尔比为(40-60)：(5-15)：(30-45)：(1-2)，优选为(45-55)：(8-12)：(35-40)：(1-2)，更优选为50：10：38.5：1.5。
在优选的实施方案中，所述mRNA疫苗为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
进一步优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
进一步优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂；
进一步优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。
第六方面，本发明提供了如上述第五方面所述的mRNA疫苗的制备方法，其包括：
(1)将所述mRNA或mRNA构建体溶解于水性溶液中，作为水相；
(2)将脂质组分溶解于有机溶剂中，作为有机相；
(3)混合水相与有机相，自组装得到所述mRNA疫苗；
优选地，所述水性溶液为乙酸钠缓冲液；
优选地，所述有机溶剂为无水乙醇；
优选地，通过纳米脂质体包装仪进行自组装。
第七方面，本发明提供了一种预防或治疗寨卡病毒感染性疾病的方法，其包括：向有需要的受试者施用预防或治疗有效量的、如上述第五方面所述的mRNA疫苗。
所述“预防或治疗有效量”可根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。
有益效果
本发明的发明人开发了一种编码寨卡病毒抗原肽的mRNA以及基于该mRNA的针对寨卡病毒的mRNA疫苗；本发明的针对寨卡病毒的mRNA疫苗不仅能够避免FL表位抗体的诱导产生，从而可降低或者消除ADE效应，还能够产生高于其他疫苗载体平台的、高水平的中和抗体，从而可有效地预防或治疗寨卡病毒感染性疾病；鉴于上述，本发明的针对寨卡病毒的mRNA疫苗具有较好的临床应用价值和产业化前景。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1是本发明实施例1中构建的寨卡病毒野生型mRNA疫苗M/E-WT、基于FL突变的mRNA疫苗M/E-MutB和M/E-MutC的结构示意图；其上标注了mRNA疫苗的各个区段，其中，5’UTR表示5’端非翻译区，3’UTR表示3’端非翻译区，SP表示信号肽序列，Poly(A)表示多聚腺苷酸尾。
图2是本发明实施例2中记载的mRNA疫苗免疫小鼠及采样流程示意图。
图3是mRNA疫苗M/E-WT、M/E-MutB和M/E-MutC免疫BalB/C小鼠的体液免疫实验结果；其中，图3A和图3B分别显示用mRNA疫苗免疫小鼠后第21天(即，初次免疫后)、第42天(即，二次免疫后)所采集的血清分别针对寨卡病毒野生型E抗原的结合抗体滴度水平；图3C和图3D分别显示用mRNA疫苗免疫小鼠后第21天(即，初次免疫后)、第42天(即，二次免疫后)所采集的血清分别针对寨卡病毒野生型E抗原的中和抗体滴度。
图4是mRNA疫苗M/E-WT、M/E-MutB和M/E-MutC免疫BALB/C小鼠的细胞免疫实验结果；其中，图4A显示ELISpot检验mRNA疫苗免疫小鼠后第42天所收集的脾脏细胞在被寨卡病毒野生型E多肽库刺激后产生的IFN-γ+和IL-2+细胞数量，图4B显示ICS检验mRNA疫苗免疫小鼠后第42天所收集的脾脏细胞在被寨卡病毒野生型E多肽库刺激后产生的IFN-γ+、TNF-α+、IL-4+和IL-2+细胞数量。
图5是mRNA疫苗M/E-WT、M/E-MutB和M/E-MutC免疫Ifnar1-/-小鼠的体液免疫实验结果；其中，图5A和5B分别显示用mRNA疫苗免疫小鼠后第21天(即，初次免疫后)、第42天(即，二次免疫后)所采集的血清分别针对寨卡病毒野生型E抗原的结合抗体滴度水平；图5C和图5D分别显示用mRNA疫苗免疫小鼠后第21天(即，初次免疫后)、第42天(即，二次免疫后)所采集的血清分别针对寨卡病毒野生型E抗原的中和抗体滴度。
图6是经mRNA疫苗M/E-WT、M/E-MutB和M/E-MutC免疫的Ifnar1-/-小鼠在ZIKV-PRVABC59病毒攻毒后的体重变化曲线(A)和死亡率结果(B)。
图7显示了经mRNA疫苗M/E-WT、M/E-MutB和M/E-MutC免疫的Ifnar1-/-小鼠在抵抗ZIKV-PRVABC59病毒感染引起的病毒血症方面的实验结果。
图8显示了经mRNA疫苗M/E-WT、M/E-MutB和M/E-MutC免疫的Ifnar1-/-小鼠在抵抗ZIKV-PRVABC59病毒攻毒后对组织器官的感染方面的实验结果。
图9显示了经mRNA疫苗M/E-WT、M/E-MutB和M/E-MutC免疫的Ifnar1-/-小鼠被ZIKV-PRVABC59病毒攻毒前、后血清中的中和抗体滴度变化的结果。
图10显示了经mRNA疫苗M/E-WT、M/E-MutB和M/E-MutC免疫的BALB/c小鼠的血清对ZIKV、DENV1、DENV2、DENV3、DENV4感染K562细胞的ADE效应实验结果。
图11显示了经mRNA疫苗M/E-WT、M/E-MutB和GFP免疫的BALB/c小鼠的血清被动转移至AG6小鼠后，对DENV2感染的ADE效应实验结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1：mRNA构建体和mRNA疫苗的制备与鉴定
按照图1所示的mRNA构建体的结构示意图，发明人构建了本发明的突变型mRNA构建体ZIKV-M/E-mutB和ZIKV-M/E-mutC(以下也分别简称为M/E-mutB和M/E-mutC)，以及作为对照的野生型mRNA构建体ZIKV-M/E-WT(以下也简称为M/E-WT)。
具体方案如下：
1)三种mRNA构建体的mRNA编码区的序列设计
首先，根据ZIKV FSS13025病毒株(GenBank:JN860885.1)，获得野生型M/E抗原(即，M/E-WT)序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
然后，参考Dai et al，Nature immunology，2021，Aug；22(8):958-968，获得ZIKV-M/E-MutB/C的抗原序列；ZIKV-M/E-MutB来源于CFAV(Cell fusing agent virus，GenBank:NC_001564.2)，突变位点为D98N、N103T、G106F、L107K和F108W；ZIKV-M/E-MutC来源于NAKV(Nakiwogo virus，GenBank:NC_030400.1)，突变位点为D98N、N103T、G106L、L107E和F108W；鉴于此，M/E-mutB和M/E-mutC的抗原序列分别如SEQ ID NO：9、10所示。
对SEQ ID NO：8、9、10所示的抗原序列分别进行密码子优化，获得M/E-WT、M/E-mutB和M/E-mutC抗原的DNA编码序列，分别如SEQ ID NO:11、3、4所示。
2)表达质粒构建、线性化、体外转录和构建
首先，选择pcDNA3.1作为质粒载体，通过常规分子生物学手段引入mRNA疫苗的抗原编码序列和其他DNA表达元件，按照从上游到下游的顺序依次包括：(1)T7启动子，(2)在编码区上游的5’端UTR序列(几种mRNA疫苗的5’端UTR序列相同，均为如SEQ ID NO:5所示序列)，(3)信号肽编码序列(即SP，如SEQ ID NO:7所示)，(4)疫苗抗原的DNA编码序列(M/E-WT、M/E-mutB和M/E-mutC mRNA疫苗抗原的DNA编码序列分别如SEQ ID NO:11、3、4所示)，(5)下游的3’端UTR序列(几种mRNA疫苗的3’端UTR序列相同，均为如SEQ ID NO:6所示序列)，(6)和多聚腺苷酸尾(Poly-A-tail)。最终得到pcDNA3.1-ZIKV-ME-WT、pcDNA3.1-ZIKV-ME-mutB、pcDNA3.1-ZIKV-ME-mutC三种寨卡病毒mRNA疫苗的表达质粒。
然后，使用限制性内切酶EcoR321I对上述体外转录质粒进行酶切，将其线性化；使用常规DNA纯化方法进行纯化，获得体外转录的模板；
接下来，基于该模板，使用T7RNA体外转录试剂盒(E131-01A，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)进行体外转录，获得体外转录mRNA；然后，使用氯化锂回收试剂盒(S125，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)，通过氯化锂沉淀法对mRNA进行纯化以获得提纯的体外转录mRNA。
最后，使用加帽酶试剂盒Cap1加帽酶试剂盒(M082-01B，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)，对上述提纯的体外转录mRNA进行5’端Cap1加帽，使其满足在真核细胞内被翻译的条件；其后，使用与上述相同的氯化锂沉淀法对mRNA进行再次纯化，获得纯化的、经5’端加帽修饰的mRNA。
3)脂质体包装mRNA
将阳离子脂质Dlin-MC3-DMA、二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC、胆固醇和PEG化脂质DMPE按照50：10：38.5：1.5的摩尔比进行混合，然后使用迈安纳公司生产的纳米药物生产系统INanoTME，将其与上述5’端加帽修饰的mRNA进行混合、包装。
包装完成后，使用离心或透析的方法更换缓冲溶液为D-PBS。
最后，使用Thermo Fisher公司的Quan-iT Ribogreen RNAreagent试剂盒，对mRNA包装效率进行鉴定，使得包装效率符合mRNA疫苗的标准。
以ZIKV-M/E-WT及其突变型ZIKV-M/E-mutB/C抗原构建的7型重组黑猩猩腺病毒载体疫苗AdC7-ME能够激发较高水平的体液免疫，基本能够实现攻毒后的清除性免疫，具有良好的保护效果。因此，以下实施例中，使用重组腺病毒载体疫苗AdC7-ZIKV-M/E-mutB作为实验的一个对照。
实施例2：实验动物免疫和样品采集
本实施例中，使用6-8周龄的BALB/c品系的雌性小鼠(购自维通利华)进行动物实验。
实验组分为：mRNA疫苗免疫组、腺病毒载体疫苗对照组和阴性对照组，其中，mRNA疫苗免疫组包括M/E-WT mRNA疫苗免疫组、M/E-mutB mRNA疫苗免疫组和M/E-mutC mRNA疫苗免疫组，腺病毒载体疫苗对照组选择AdC7-M/E-mutB(其制备可参考专利申请CN202011243025.6)，所述阴性对照组为GFP mRNA免疫组。mRNA疫苗免疫组的所有小鼠在第0天和第28天分别免疫接种同一种设计的mRNA疫苗(即，M/E-WT、M/E-mutB或M/E-mutC疫苗)，阴性对照组小鼠的免疫流程与注射剂量与疫苗组相同，腺病毒载体疫苗仅在第0天单针免疫接种。接种方法均为肌肉注射，mRNA疫苗组设置两个接种剂量，分别为2μg mRNA和10μgmRNA/每只小鼠，分别在第21天和第42天采集小鼠血清样本。腺病毒载体疫苗AdC7-M/E-mutB在第0天接种1.6×1011vp，同样在第21天和第42天采集小鼠血清样本，将所有采集的血清在56℃孵育30分钟进行灭活，随后冻存于-80℃冰箱，用于检验免疫血清的结合抗体滴度和假病毒中和抗体滴度。此外，还在第42天采集小鼠脾脏样本，用于检验细胞免疫应答。
mRNA疫苗免疫小鼠及采样程序如图2所示。
实施例3：mRNA疫苗诱导Bal B/C小鼠体液免疫水平的评价
本实施例中，通过检测实施例2获得的免疫小鼠血清中的结合抗体水平和中和抗体水平，来检测mRNA疫苗诱导小鼠的体液免疫水平。
首先，通过ELISA实验方法检测免疫小鼠血清中的结合抗体滴度，具体方法为：将ZIKV-E蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示)用ELISA包被液(碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH 9.6)稀释至3μg/ml，向96孔的ELISA板中每孔加入100μl，4℃放置过夜。第二天倒掉包被液，使用PBS配置的5％脱脂牛奶封闭ELISA板，室温放置1小时。将实施例2中的来自各实验组小鼠的血清样本在96圆孔板中从1:20开始进行四倍梯度稀释，然后将稀释液转入ELISA板中，随后将ELISA板在37℃下孵育1.5小时；倒掉封闭液，使用PBST洗4遍。之后加入使用封闭液1:2000稀释的GoatAnti-Mouse HRP二抗(购自金普来)，37℃孵育1.5小时，PBST洗5遍。然后，加入60μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物进行显色，10分钟后加入60μl 2M盐酸终止反应，在酶标仪(PerkinElmer)上检测OD450读值。终点滴度定义为：血清产生的吸光度大于背景值2.5倍时对应的血清稀释倍数。低于检测限的抗体滴度定义为检测限的二分之一。
各免疫小鼠血清中，针对ZIKV-E蛋白抗原的结合抗体滴度如图3A(初次免疫血清)和3B(二次免疫血清)所示。
由图3A和3B可见，在初次免疫后，不同剂量、不同免疫原的mRNA疫苗(M/E-WT、M/E-mutB、M/E-mutC)均产生了与腺病毒载体疫苗AdC7-M/E-mutB水平相当的结合抗体滴度，除M/E-mutB 10μg免疫剂量时的结合抗体滴度显著高于AdC7-M/E-mutB免疫组，整体未表现出显著性差异。然而，在二次免疫后，不同免疫原的mRNA疫苗的结合抗体滴度均显著高于AdC7-M/E-mutB免疫组，并显示出剂量依赖的特征。这些结果提示：mRNA疫苗在加强免疫后可诱导出更高水平的抗体滴度，说明其具有更优的免疫保护效力。
然后，通过微量中和实验来检测免疫小鼠血清中的中和抗体滴度，具体方法为：将VERO细胞提前一天铺96孔板，第二天待细胞汇合度为约90％时，用含1％FBS(Gibco，10270-106)的DMEM培养基(Invitrogen，C11995500BT)在96孔板中梯度稀释免疫小鼠血清(具体地，从10倍稀释度开始，按3倍梯度进行倍比稀释，共得10个稀释度)，病毒也用含1％FBS的DMEM培养基稀释至6×103FFU/mL；之后，把85μL各稀释度的免疫小鼠血清稀释液和85μL病毒稀释液在圆底96孔板中混匀，置于37℃孵育2小时。然后，将汇合度约为90％的VERO细胞板移除上清培养基，加入上述制备的血清和病毒的混合物，培养2小时后补加含10％FBS的DMEM。细胞在37℃培养箱中培养4天。4天后，取出细胞培养板，弃去所有上清，用PBS洗一遍，加入150μl的甲醇进行固定，置于-20℃冰箱18分钟，之后用PBS洗2遍。使用PBS配置的3％脱脂牛奶作为封闭液进行封闭，室温放置30分钟，然后加入一抗(一抗为结合ZIKV E蛋白的Z6抗体，如CN 106589116 B中所记载的，用封闭液稀释到5μg/mL的工作浓度)，37℃孵育1.5小时。之后，倒掉一抗，用PBST洗3遍，再加入二抗(二抗是偶联HRP的羊抗人抗体(Proteintech，SA00001-17)，用封闭液稀释1500倍)，室温孵育2小时。之后，倒掉二抗，用PBST洗4遍。加60μl TMB显色液(碧云天，P0209)，室温孵育约20分钟，观察颜色变化，待PBS孔由无色变微弱的浅蓝色，加入60μl 2M盐酸终止反应，在酶标仪上读取OD450吸光值。使用GraphPad Prism软件对OD450数据进行非线性拟合，以计算中和50％的细胞感染时相应的血清稀释倍数，即为中和抗体滴度值(MN50)。当最低稀释倍数的血清仍无法中和50％的细胞感染时，定义该样品的MN50为最低稀释倍数的一半。
各免疫小鼠血清的微量中和实验结果如图3C(初次免疫血清)和3D(二次免疫血清)所示；由图3C和3D可见，阴性对照组(图中以Sham表示)的免疫血清中几乎检测不到中和抗体；初次免疫后，mRNA疫苗免疫组与AdC7-M/E-mutB疫苗免疫组的小鼠都能检测到中和抗体，统计分析结果显示各疫苗免疫组间没有显著性差异。加强免疫后，mRNA疫苗组的中和抗体水平显著高于AdC7-M/E-mutB疫苗组，显示出更高的免疫保护效力。
实施例4：mRNA疫苗诱导细胞免疫水平的评价
本实施例中，采用实施例2中于第42天采集的各实验组小鼠的脾脏样本，检测mRNA疫苗诱导的细胞免疫水平。具体方法如下：
1)小鼠脾脏样品处理
用细胞匀浆器在含有1％双抗、不含血清的1640培养基中将小鼠脾脏细胞制备成单细胞匀浆，用40μm细胞过滤器过滤，用红细胞裂解缓冲液(北京索莱宝科技有限公司，R1010)裂解红细胞；然后，细胞经过清洗液(PBS+0.5％FBS)清洗后，用AO/PI染料染色，使用Cell drop FL自动细胞计数器进行计数。
此外，用含有1％双抗和10％胎牛血清的1640培养基将小鼠脾脏细胞重悬，制备单细胞悬液(所制备细胞悬液的浓度为1×107cells/mL)，供后续实验使用。
2)ELISpot检验
实验前一天，将ELISpot板的PVDF膜用35％的乙醇预湿，每孔加入30μL 35％乙醇处理膜以使其亲水。用去离子水洗涤，200μL/孔，洗涤5次，除去乙醇；将anti-mouse IFN-γ、anti-mouse IL-2抗体(均购自BD公司)用PBS稀释到15μg/mL，用该稀释好的抗体分别包被ELISpot板，100μL/孔，4℃过夜孵育。次日，倾倒包被液，用含10％FBS的1640培养基洗涤2次。每孔加入200μL含10％FBS的1640培养基，室温孵育1小时。将上述新鲜制备的小鼠脾脏单细胞悬液按5×105/孔加入抗体预包被的96孔板，并用寨卡病毒野生型E蛋白构建的肽库刺激24小时；所述肽库设计的关键参数包括：短肽的长度在18-20个氨基酸，重叠氨基酸片段在10个氨基酸左右等；设计好的肽库由中科亚光生物科技有限公司合成。阳性对照孔用植物血凝素(PMA)刺激以产生非特异细胞免疫反应，阴性对照孔不用肽库刺激。然后，弃除细胞，并依次用生物素化的IFN-γ抗体、链霉亲和素-ALP抗体和显色底物先后孵育96孔板，间隔时均洗涤5次。当板底显现斑点后，用去离子水彻底冲洗样品来停止显色。最后，使用Immuno Capture 6.5.0拍照并对斑点数量进行计数。
结果如图4A所示；图4A显示，在使用寨卡E蛋白肽库刺激后，10μg剂量的M/E-WT和M/E-mutB mRNA疫苗免疫小鼠的脾脏细胞所产生的IFN-γ+细胞的数量显著高于AdC7-M/E-mutB，而AdC7-M/E-mutB显著高于sham组；2μg剂量和10μg剂量的M/E-WT、M/E-mutB和M/E-mutC mRNA疫苗免疫小鼠的脾脏细胞所产生的IL-2+细胞的数量整体高于AdC7-M/E-mutB，但无显著性差异。这些结果说明：M/E-WT、M/E-mutB和M/E-mutC mRNA疫苗均能有效激发细胞免疫应答。
2)ICS检验
将本实施例中步骤1)所得细胞悬液铺圆底96孔板，每孔200μL细胞悬液中含2×106个脾脏细胞；此外，用含有10％FBS的1640培养基稀释寨卡病毒E蛋白的肽库(包含53条多肽，其序列如SEQ ID NO:12～64所示)，使得所述肽库中每条多肽的工作浓度为10μg/mL；向上述细胞孔中加入20μL经上述稀释的E蛋白肽库溶液，同时加入高尔基体阻断剂(购自BD公司，货号51-2301kz)，每孔1μL。12小时后，将细胞转移至V底96孔板中，室温下以2000rpm离心5min，弃除上清后用PBS洗1遍(洗涤时，200μL PBS/孔)，收集细胞备用。
然后，用含2％FBS的PBS稀释anti-mouse CD16/CD32抗体(Bio X Cell公司，货号BE0307)，向每个上述细胞孔中加入100μL上述稀释的抗体，冰上避光5min，然后2000rpm离心5分钟，弃上清后直接进行细胞外染色。将anti-CD3，anti-CD4，anti-CD8三种抗体(均购自Neta Scientific)各1μL加入47μL的含2％FBS的PBS中(共得50μL)，混匀，用此混合液重悬细胞，冰上避光孵育20min，用含2％FBS的PBS清洗细胞后每孔加入100μL FP solution(Invitrogen eBioscience，货号：88-8824-00)以通透细胞，冰上避光孵育20min；空白对照组不做染色，仅做通透；通透后的细胞用1x wash Buffer洗涤一次，随后进行胞内染色，具体地，将anti-IL-2，anti-IL-4，anti-IFN-γ，anti-TNF-α四种抗体(均购自CiteAb)各1μL加入46μL的1x wash Buffer(共得50μL)，混匀，用此混合液重悬细胞，冰上避光孵育20min，PMA处理组(阳性对照)做通透和染色。每孔细胞用200μL stainbuffer重悬，转移到流式管中，用流式细胞仪检测样品中阳性细胞的比例，结果如图4B所示。
图4B结果显示，mRNA疫苗免疫组分泌IFN-γ，IL-2,TNF-α细胞因子的CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例相对于阴性对照组显著增加，mRNA疫苗比AdC7-M/E-mutB腺病毒载体疫苗刺激了更多的细胞因子分泌；而分泌IL-4细胞因子的CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例在各免疫组之间无显著差异。因此，这些数据表明，mRNA疫苗诱导了Th1偏向细胞因子的产生。
实施例5：检测ZIKV mRNA疫苗在Ifnar1-/-小鼠中的免疫原性
由于ZIKV感染BALB/c小鼠后不会引起小鼠死亡和出现明显的疾病症状，为了更好的验证疫苗的效果，我们选取了免疫缺陷鼠Ifnar1-/-小鼠作为ZIKV的感染模型(Lazear,Helen M et al.(2016),vol.19,5:720-30.)，以评价mRNA疫苗诱导Ifnar1-/-小鼠的体液免疫水平。
具体地，将Ifnar1-/-小鼠随机分成4组，其中，3组通过肌肉注射方式分别接种M/E-WT、M/E-mutB或M/E-mutC mRNA疫苗，免疫接种的剂量是10μg，1组小鼠免疫PBS作为阴性对照(即，Sham组)。免疫程序与实施例2所述相同。即，在第0天、28天进行免疫，在第21天、42天采血分离血清，使用ELISA方法检测Ifnar1-/-小鼠血清中的结合抗体滴度，使用微量中和实验检测Ifnar1-/-小鼠血清中的中和ZIKV抗体的滴度水平，结果如图5所示。
图5A、B分别是在初次免疫和加强免疫后，三种mRNA疫苗诱导产生的结合抗体滴度，结果显示：初次免疫后的Log endpoint titer平均值在2-3之间，加强免疫后的Logendpoint titer平均值在5以上。
图5C、D分别是在初次免疫和加强免疫后，三种mRNA疫苗诱导产生的中和ZIKV抗体的滴度水平，结果显示：初次免疫后，三种mRNA疫苗并没有产生显著的中和抗体应答，然而在二次免疫后，中和抗体水平显著提升，但M/E-mutC低于M/E-WT和M/E-mutB。
实施例6：检测mRNA疫苗在Ifnar1-/-小鼠免疫后攻毒保护
将实施例5中的Ifnar1-/-小鼠在二次免疫后第30天进行ZIKV-PRVABC59病毒攻毒实验。
具体地，通过腹腔注射3X105/只的FFU ZIKV-PRVABC59病毒，之后每天观察小鼠生存状态和监测体重变化，实验结果见图6，其中，图6A显示ZIKV-PRVABC59病毒攻毒后的体重变化曲线，图6B显示ZIKV-PRVABC59病毒攻毒后的死亡率结果。
图6A和6B显示：Sham组小鼠在攻毒后第2天开始体重逐渐降低，在第6天全部死亡；而免疫了M/E-WT、M/E-MutB和M/E-MutC mRNA疫苗的这三组小鼠，在攻毒后没有出现体重下降的现象，三组小鼠在整个实验过程中也都没有出现死亡；这些结果说明：M/E-MutB和M/E-MutC mRNA疫苗能够和野生型的M/E-WT疫苗一样，在小鼠攻毒中起到完全的保护作用。
为了检测mRNA疫苗M/E-MutB和M/E-MutC疫苗能否保护小鼠抵抗病毒感染后引起的病毒血症，在该实验中收集了攻毒后第3天和第6天的小鼠血液，分离血清，然后使用MagaBio Plus病毒RNA试剂盒(博日科技，BSC58S1B)提取RNA，使用FastKing一步法反转录-荧光定量试剂盒(天根生化科技，FP314)对病毒RNA进行定量，定量时，使用的探针和引物序列如表4所示，定量结果如图7所示。
表4、对ZIKV-PRVABC59核酸进行RT-PCR定量使用的探针和引物序列
由图7可知，Sham组小鼠在感染后第3天和第6天均可以检测到较高的病毒载量，而免疫过mRNA疫苗M/E-WT、M/E-MutB和M/E-MutC的小鼠在感染后第3天和第6天的血清里都检测不到病毒，这说明：M/E-MutB和M/E-MutC mRNA疫苗能够和野生型M/E-WT疫苗一样很好地保护小鼠抵抗病毒血症。
实施例7：检测ZIKV mRNA疫苗在Ifnar1-/-小鼠中的清除性免疫效果
本实施例中，进一步设计实验，以检测M/E-MutB和M/E-MutC mRNA疫苗是否能提供清除性免疫，具体步骤如下。
将Ifnar1-/-小鼠随机分成4组，其中，3组通过肌肉注射方式免疫接种3种mRNA疫苗M/E-WT、M/E-MutB和M/E-MutC，剂量为10μg，1组小鼠免疫GFP作为阴性对照(即，Sham组)。免疫后第28天采血分离血清，免疫后第30天通过腹腔途径注射3x105FFU/只的ZIKV-PRVABC59病毒，在ZIKV-PRVABC59攻毒后的第4天解剖小鼠，取其部分眼、脑、脊髓、肾、肝、脾、睾丸和卵巢。将解剖取出的组织器官加入PBS溶液，然后使用研磨器(天根生化科技，OSE-Y30)研磨，离心取出上清，使用MagaBio Plus病毒RNA试剂盒提取RNA，再对ZIKV RNA进行RT-PCR检测(所用引物和探针同上文表4)，结果如图8所示。
由图8可知，Sham组小鼠在7个器官中都检测出一定量的病毒，而免疫过M/E-WT、M/E-MutB和M/E-MutC mRNA疫苗的这3组小鼠的所有组织器官中都没有检测到病毒。
此外，还通过微量中和实验，检测攻毒前2天和攻毒后第6天的血清中中和抗体滴度，结果如图9所示。
由图9可知，攻毒前Sham组检测不到中和抗体，攻毒后第6天Sham组每只鼠都可以检测到较高滴度的中和抗体；而免疫M/E-WT、M/E-MutB和M/E-MutC mRNA疫苗的这三组在攻毒前、后血清中和抗体滴度没有显著差异，维持在几乎相同的水平，这说明：野生型mRNA疫苗M/E-WT和基于FL工程化的mRNA疫苗M/E-MutB、M/E-MutC疫苗均能实现完全的清除性免疫。
实施例8：体外实验检测ZIKV mRNA疫苗免疫BALB/c小鼠的血清对DENV的ADE
由于ZIKV和DENV之间的序列相似性，我们进一步设计实验，以证明M/E-MutB和M/E-MutC mRNA疫苗是否可以减少对DENV的ADE，具体步骤如下：
将实施例2中免疫BALB/c小鼠的血清进行梯度稀释，具体地，从8倍稀释度开始，按4倍梯度进行倍比稀释，共得8个稀释度；然后，取10μL不同稀释度的血清分别与30μL DENV1(滴度为1×106FFU/mL)，DENV2(滴度为1×105FFU/mL)，DENV3(滴度为3×105FFU/mL)和DENV4病毒液(滴度为3×105FFU/mL)混合孵育，再加入3×104个K562细胞，培养4天后，使用FITC标记的Z6抗体(Z6抗体同上文)染色，然后用流式细胞仪检测阳性细胞的比例，结果如图10所示。注意：在没有抗体的介导下，DENV病毒不能感染K562细胞。
由图10可以看出，Sham组的血清由于不含有可以结合DENV的抗体，因此检测的样品感染率为本底水平；M/E-WT组的小鼠血清在一定浓度下可以介导4种血清型的DENV病毒感染K562细胞；而M/E-MutB和M/E-MutC组样品的感染率都显著低于M/E-WT组，表现出对DENV的ADE的减弱甚至消除；这些结果说明：M/E-MutB和M/E-MutC疫苗具有明显的降低ADE的优势。
实施例9：体内实验检测ZIKV mRNA疫苗免疫BALB/c小鼠的血清对DENV的ADE
为了进一步证明在生理条件下M/E-MutB疫苗能否降低对DENV的ADE，我们基于Ifnα/βr-/-Ifnγr-/-小鼠(即，AG6小鼠，可由中国科学院上海巴斯德研究所购买)，验证了M/E-MutB mRNA疫苗对DENV的ADE效应。
首先，将60只BALB/c小鼠随机分成3组，每组20只，分别免疫GFP mRNA(作为阴性对照组，即Sham组)、M/E-WT和M/E-MutB mRNA疫苗，免疫剂量为10μg/只，免疫及取血流程与实施例2相同；采血后分离血清，56℃加热30分钟，将每组的20只小鼠的血清混合在一起分装冻存与-80℃备用。
将AG6小鼠随机分成3组，被动免疫上述混合后的血清，即，通过腹腔途径分别注射M/E-WT、M/E-MutB或GFP mRNA免疫BALB/c鼠的血清，血清使用PBS以1:40的比例稀释，每只鼠注射稀释后的血清200μL。24小时后，通过皮下途径注射DENV2-NGC病毒，每只注射10000FFU，注射之前对每只小鼠进行称重记录。之后每天观察小鼠状态、生存情况和称量体重，结果如图11所示。
由图11可知，与Sham组的小鼠相比，M/E-WT组小鼠整体提前死亡，说明M/E-WT疫苗免疫小鼠的血清增强了DENV的感染，而M/E-MutB组的小鼠死亡时间和趋势与Sham组一致，这说明：对ZIKV E蛋白的突变减弱了能导致对DENV产生ADE效用的抗体的产生，使得M/E-MutB组小鼠的表现与Sham组相似。根据体重的变化趋势也发现，与Sham组相比，M/E-WT组小鼠体重下降更快，而M/E-MutB组的小鼠体重变化趋势与Sham组一致。
这些体内实验结果很好地证明了M/E-MutB疫苗可显著降低野生型疫苗免疫后对DENV的ADE。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种编码寨卡病毒抗原肽的mRNA，其特征在于，所述mRNA具有如SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示的mRNA序列，或者，其由如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的DNA转录而成。
2.一种编码寨卡病毒抗原肽的mRNA构建体，其特征在于，所述mRNA构建体包含如权利要求1所述的mRNA，以及选自以下的一种或多种元件：5’端UTR区、3’端UTR区、5’末端帽结构、3’末端PolyA尾和信号肽编码序列。
3.根据权利要求2所述的mRNA构建体，其特征在于，所述5’端UTR区具有如SEQ ID NO:5所示序列；
和/或，所述3’端UTR区具有如SEQ ID NO:6所示序列；
和/或，所述5’末端帽结构为m7G(5’)ppp；
和/或，所述3’末端PolyA尾为80～200个A；
和/或，所述信号肽编码序列如SEQ ID NO:7所示。
4.一种生产如权利要求1所述的mRNA的重组表达质粒，其特征在于，所述重组表达质粒包括质粒骨架序列和编码寨卡病毒抗原肽的DNA序列。
5.根据权利要求4所述的重组表达质粒，其特征在于，所述编码寨卡病毒抗原肽的DNA序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示；
和/或，所述质粒骨架序列包括T7启动子序列、5’端UTR区、信号肽序列、3’端UTR区、5’末端帽结构和3’末端PolyA尾；
优选地，所述5’端UTR区具有如SEQ ID NO:5所示序列；
优选地，所述3’端UTR区具有如SEQ ID NO:6所示序列；
优选地，所述5’末端帽结构为m7G(5’)ppp；
优选地，所述3’末端PolyA尾为80～200个A；
优选地，所述信号肽序列如SEQ ID NO:7所示。
6.如权利要求1所述的mRNA、如权利要求2或3所述的mRNA构建体或者如权利要求4或5所述的重组表达质粒在制备用于预防和/或治疗寨卡病毒感染性疾病的疫苗、优选mRNA疫苗中的应用。
7.一种针对寨卡病毒的mRNA疫苗，其包括如权利要求1所述的mRNA或者如权利要求2或3所述的mRNA构建体，和脂质组分。
8.根据权利要求7所述的mRNA疫苗，其特征在于，如权利要求1所述的mRNA或者如权利要求2或3所述的mRNA构建体与脂质组分的质量比为1：(10～30)，优选1：20；
优选地，所述脂质组分包含阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG脂质，或由其组成；
进一步优选地，所述脂质组分中，阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG脂质的摩尔比为(40-60)：(5-15)：(30-45)：(1-2)，优选为(45-55)：(8-12)：(35-40)：(1-2)，更优选为50：10：38.5：1.5。
9.根据权利要求7或8所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂；
优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。
10.如权利要求7-9任一项所述的mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
(1)将所述mRNA或mRNA构建体溶解于水性溶液中，作为水相；
(2)将脂质组分溶解于有机溶剂中，作为有机相；
(3)混合水相与有机相，自组装得到所述mRNA疫苗；
优选地，所述水性溶液为乙酸钠缓冲液；
优选地，所述有机溶剂为无水乙醇；
优选地，通过纳米脂质体包装仪进行自组装。
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