CN116036259B - 猴痘病毒多抗原mRNA疫苗及其应用 - Google Patents
猴痘病毒多抗原mRNA疫苗及其应用Info
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Abstract
本发明涉及一种猴痘病毒多抗原mRNA疫苗及其应用；所述猴痘病毒多抗原mRNA疫苗包括mRNA免疫原性组合物，所述mRNA免疫原性组合物包括：(1)编码猴痘病毒抗原M1的抗原性多肽或其抗原性片段或其适当变体的mRNA，以及(2)编码猴痘病毒抗原H3、A29、A35、B6、E8的抗原性多肽或其抗原性片段或其适当变体的mRNA中的至少一种。本发明的包含M1‑mRNA疫苗的痘病毒多抗原mRNA疫苗可以高效地激发针对包括猴痘病毒在内的痘病毒的免疫保护效应，因而可有效地预防和/或治疗包括猴痘病毒在内的痘病毒感染，具有较好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种mRNA免疫原性组合物、与所述mRNA免疫原性组合物生物材料、RNA-脂质复合物、用于预防或治疗痘病毒感染的RNA疫苗、药物组合物、制备mRNA疫苗的方法、及它们在制备痘病毒疫苗中的应用，以及它们在制备预防或痘病毒的药物中的应用。
背景技术
疫苗是遏制病毒传播的有效干预措施，由于猴痘病毒与天花病毒均属于痘病毒科的正痘病毒属，接种天花疫苗会对猴痘提供一定程度的交叉保护作用，有效率可达85％以上，并可改善感染的临床表现。
当前猴痘病毒的测序工作已经完成，猴痘病毒的基因组序列分析显示本轮猴痘病毒属于西非支系。猴痘病毒作为目前发现的最大、最复杂的病毒之一，主要有两种感染颗粒即胞外包膜病毒(EV)和胞内成熟毒粒(MV)，EV是病毒在细胞内获得一层外膜形成的，是病毒在宿主细胞间传播的主要形式，MV在环境中稳定，是病毒在宿主间传播的主要形式。
包括猴痘在内痘病毒特异性受体尚未发现，但在天花疫苗免疫人群中鉴定出了多种中和抗体识别的抗原，它们表达在两种感染形式病毒颗粒表面与病毒吸附、膜融合、病毒入胞等有关，混合不同的特异性中和抗体可实现对不同痘病毒有效的交叉保护。新冠大流行之前国内外痘病毒疫苗的研发主要集中在减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗等方面。
基于脂质纳米颗粒(LNP)递送的mRNA疫苗在新冠大流行中展示了强大的效力以及快速开发的能力，良好的安全性和有效性在广泛真实世界的应用中获得有效验证。当前并无猴痘mRNA疫苗问世，常规多抗原/多价mRNA疫苗制备是将每种抗原模板线性化后需要单独进行体外转录、加帽、纯化和包封等步骤，再将所有抗原混合后制备成多抗原/多价mRNA疫苗。如此繁杂的步骤，将意味着随着抗原的增多，生产上的投入增大，设备的使用增多及生产效率的降低。
发明内容
发明目的
本发明的目的在于提供一种mRNA免疫原性组合物、与所述mRNA免疫原性组合物相关的生物材料、mRNA-脂质复合物、用于预防或治疗痘病毒感染的mRNA疫苗、药物组合物、制备mRNA疫苗的方法以及前述mRNA免疫原性组合物及其相关产品在制备预防和/或治疗痘病毒的药物中的应用。
基于所述mRNA免疫原性组合物的本发明痘病毒多抗原mRNA疫苗可以高效地激发针对包括猴痘病毒在内的痘病毒的免疫保护效应，包括较高的体液免疫水平和较高的细胞免疫水平，从而可有效地预防和/或治疗包括猴痘病毒在内的痘病毒感染。
此外，本发明还优化了制备流程，通过将所有抗原的转录模板质粒按照特定比例混合后再进行mRNA转录、纯化和包装，以生产多抗原疫苗(例如，四抗原疫苗Rmix4、六抗原疫苗Rmix6)，由此改善多抗原mRNA疫苗的制备工艺。此举措将大幅提高多价mRNA疫苗的生产能力，虽然不同抗原的序列差异导致转录效率有所区别，但最终优化后的疫苗可以起到有效保护。
解决方案
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种mRNA免疫原性组合物，其包含：
i)编码猴痘病毒抗原蛋白M1或其抗原性片段、或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列的mRNA；以及，
以下ii)～vi)中的至少一种mRNA：
ii)编码猴痘病毒抗原蛋白A29或其抗原性片段、或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列的mRNA；
iii)编码猴痘病毒抗原蛋白A35或其抗原性片段、或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列的mRNA；
iv)编码猴痘病毒抗原蛋白B6或其抗原性片段、或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列的mRNA；
v)编码猴痘病毒抗原蛋白H3或其抗原性片段、或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列的mRNA序列；
vi)编码猴痘病毒抗原蛋白E8或其抗原性片段、或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列的mRNA序列。
上述mRNA免疫原性组合物中，可选地，所述猴痘病毒抗原蛋白M1、A29、A35、B6、H3、E8的抗原性片段为其蛋白全长的至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％。
上述mRNA免疫原性组合物中：
作为优选，所述猴痘病毒抗原蛋白M1或其抗原性片段具有如SEQ ID NO:1或SEQID NO:13所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:13所示序列具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
作为优选，所述猴痘病毒抗原蛋白A29或其抗原性片段具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2所示序列具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
作为优选，所述猴痘病毒抗原蛋白A35或其抗原性片段具有如SEQ ID NO:3或SEQID NO:14所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:14所示序列具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
作为优选，所述猴痘病毒抗原蛋白B6或其抗原性片段具有如SEQ ID NO:4或SEQIDNO:15所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:15所示序列具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
作为优选，所述猴痘病毒抗原蛋白H3或其抗原性片段具有如SEQ ID NO:5或SEQID NO:16所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:16所示序列具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
作为优选，所述猴痘病毒抗原蛋白E8或其抗原性片段具有如SEQ ID NO:6或SEQIDNO:17所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:17所示序列具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列。
上述mRNA免疫原性组合物中：
进一步优选地，所述i)编码猴痘病毒抗原蛋白M1或其抗原性片段、或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列的mRNA序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:18所示；
和/或，所述ii)编码猴痘病毒抗原蛋白A29或其抗原性片段、或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列的mRNA序列如SEQ ID NO:8所示；
和/或，所述iii)编码猴痘病毒抗原蛋白A35或其抗原性片段、或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列的mRNA序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:19所示；
和/或，所述iv)编码猴痘病毒抗原蛋白B6或其抗原性片段、或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列的mRNA序列如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:20所示；
和/或，所述v)编码猴痘病毒抗原蛋白H3或其抗原性片段、或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列的mRNA序列如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:21所示；
和/或，所述iv)编码猴痘病毒抗原蛋白E8或其抗原性片段、或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列的mRNA序列如SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:22所示。
在一些优选的实施方案中，所述mRNA免疫原性组合物包含以下i)～iv)中的四种mRNA：
i)序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:18所示的mRNA；
ii)序列如SEQ ID NO:8所示的mRNA；
iii)序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:19所示的mRNA；
iv)序列如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:20所示的mRNA；
进一步优选地，所述mRNA免疫原性组合物中，i)：ii)：iii)：iv)的mRNA的质量比为1:0.2～5:0.2～5:0.2～5。
在另一些优选的实施方案中，所述mRNA免疫原性组合物包含以下五种mRNA：
i)序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:18所示的mRNA；
ii)序列如SEQ ID NO:8所示的mRNA；
iii)序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:19所示的mRNA；
iv)序列如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:20所示的mRNA；以及
v)序列如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:21所示的mRNA，或者vi)序列如SEQ IDNO:12或SEQ ID NO:22所示的mRNA；
优选地，所述mRNA免疫原性组合物中，i)：ii)：iii)：iv)：v)或者i)：ii)：iii)：iv)：vi)的mRNA的质量比为1:(0.2～5):(0.2～5):(0.2～5):(0.2～5)。
在又一些优选的实施方案中，所述mRNA免疫原性组合物包含以下六种mRNA：
i)序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:18所示的mRNA；
ii)序列如SEQ ID NO:8所示的mRNA；
iii)序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:19所示的mRNA；
iv)序列如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:20所示的mRNA；
v)序列如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:21所示的mRNA；以及，
vi)序列如SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:22所示的mRNA；
优选地，所述mRNA免疫原性组合物中，i)：ii)：iii)：iv)：v)：vi)的mRNA的质量比为1:(0.2～5):(0.2～5):(0.2～5):(0.2～5):(0.2～5)。
所述mRNA免疫原性组合物中，如SEQ ID NO:1所示的M1抗原蛋白的氨基酸序列(标黑部分的前183个氨基酸的序列为如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列)如下：
所述mRNA免疫原性组合物中，如SEQ ID NO:7所示的编码M1抗原蛋白的核苷酸酸序列(标黑部分的前549个核苷酸的序列为如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列)如下：
所述mRNA免疫原性组合物中，如SEQ ID NO:2所示的A29抗原蛋白的氨基酸序列如下：
MDGTLFPGDDDLAIPATEFFSTKAAKNPETKREAIVKAYGDDNEETLKQRLTNLEKKITNITTKFEQIEKCCKRNDEVLFRLENHAETLRAAMISLAKKIDVQTGRHPYE
所述mRNA免疫原性组合物中，如SEQ ID NO:8所示的编码A29抗原蛋白的核苷酸酸序列如下：
所述mRNA免疫原性组合物中，如SEQ ID NO:3所示的A35抗原蛋白的氨基酸序列(标黑部分的后124个氨基酸的序列为如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列)如下：
所述mRNA免疫原性组合物中，如SEQ ID NO:9所示的编码A35抗原蛋白的核苷酸酸序列(标黑部分的后372个核苷酸的序列为如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列)如下：
所述mRNA免疫原性组合物中，如SEQ ID NO:4所示的B6抗原蛋白的氨基酸序列(标黑部分的前259个氨基酸的序列为如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列)如下：
所述mRNA免疫原性组合物中，如SEQ ID NO:10所示的编码B6抗原蛋白的核苷酸酸序列(标黑部分的前777个核苷酸的序列为如SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列)如下：
所述mRNA免疫原性组合物中，如SEQ ID NO:5所示的H3抗原蛋白的氨基酸序列(标黑部分的前269个氨基酸的序列为如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列)如下：
所述mRNA免疫原性组合物中，如SEQ ID NO:11所示的编码H3抗原蛋白的核苷酸酸序列(标黑部分的前807个核苷酸的序列为如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列)如下：
所述mRNA免疫原性组合物中，如SEQ ID NO:6所示的E8抗原蛋白的氨基酸序列(标黑部分的前274个氨基酸的序列为如SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列)如下：
所述mRNA免疫原性组合物中，如SEQ ID NO:12所示的编码E8抗原蛋白的核苷酸酸序列(标黑部分的前822个核苷酸的序列为如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列)如下：
对于上述mRNA免疫原性组合物：
可选地，其中的每种mRNA还包括位于5’端的编码信号肽的mRNA序列和/或5’UUR序列；进一步可选地，信号肽具有如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，并且优选由如SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28所示的mRNA序列编码。
如SEQ ID NO:23所示的信号肽的氨基酸序列为：METDTLLLWVLLLWVPGSTGD。
如SEQ ID NO:26所示的信号肽的核苷酸序列为：
auggagacagacaccuugcuacucugggugcugcuucugugggucccuggcagcacuggagau.
如SEQ ID NO:24所示的信号肽的氨基酸序列为：MGWSCIILFLVATATGVHS。
如SEQ ID NO:27所示的信号肽的核苷酸序列为：
augggcuggagcugcaucauucucuuccugguggcuacagccaccggaguccacucc.
如SEQ ID NO:25所示的信号肽的氨基酸序列为：MKTISVVTLLCVLPAVVYS。
如SEQ ID NO:28所示的信号肽的核苷酸序列为：
augaagaccaucucuguggucacccugcugugcgugcugccugcugucgucuacagc。
可选地，其中的每种mRNA还包括位于3’端的编码标签的mRNA序列和/或3’UTR序列和多聚腺苷酸序列；进一步可选地，所述标签选自Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签、SUMO标签中的至少一种；优选地标签为His标签。
在可选的具体实施方案中，上述mRNA免疫原性组合物中，每种mRNA序列从5’端到3’端依次包括：5’UTR序列、编码信号肽的mRNA序列、编码猴痘病毒抗原蛋白的序列、编码标签的mRNA序列、3’UTR序列和多聚腺苷酸序列；
和/或，每种mRNA序列均包括5’端加帽修饰；
和/或，所述mRNA中的一个或多个核苷酸各自独立替换为天然存在的核苷酸类似物或人工合成的核苷酸类似物，其中所述天然存在的核苷酸类似物选自假尿苷(pseudouridine)、2-硫尿苷(2-thiouridine)、5-甲基尿苷(5-methyluridine)，5-甲基胞苷(5-methylcytidine)和N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine)中的至少一种，所述人工合成的核苷酸类似物选自N1-甲基假尿苷(N1-methylpseudouridine)和5-乙炔基尿苷(5-ethynyluridine)中的至少一种；可选地，至少一种mRNA中的一个或多个尿苷三磷酸(UTP)各自独立替换为假尿苷三磷酸(pseudo-UTP)、1-甲基-假尿苷三磷酸(N1-methyl-pseudo-UTP)或5-乙炔基尿苷三磷酸(5-ethynyl-UTP)，和/或一个或多个胞苷三磷酸(CTP)替换为5-甲基胞苷三磷酸(5-methyl-CTP)；可选地，每种mRNA中的尿苷三磷酸至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％替换为甲基假尿苷三磷酸修饰。
第二方面，本发明提供了一种与上述第一方面所述mRNA免疫原性组合物相关的生物材料，所述生物材料为B1)至B5)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述RNA免疫原性组合物的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；可选地，所述表达盒还包含与所述核酸分子可操作地连接的至少一个表达调控元件。
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体，或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物，或含有B2)所述表达盒的重组微生物，或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因细胞系。
第三方面，本发明提供了一种mRNA-脂质复合物，所述mRNA-脂质复合物包含递送载体以及如上述第一方面所述的mRNA免疫原性组合物；
可选地，所述递送载体包括可离子化脂质体、可离子化蛋白、可离子化聚合物、磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇脂质、可离子化胶束和可离子化脂质纳米粒中的至少一种；可选地，所述，所述可离子化脂质体为阳离子脂质体；可选地，所述递送载体包括阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇脂质；
可选地，阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇脂质的摩尔比为50:5～15:35～45:1～2，可选地摩尔比为50:10:38.5:1.5。
第四方面，本发明提供了一种用于预防或治疗痘病毒感染的mRNA疫苗，所述疫苗的活性成分包含如上述第一方面所述的mRNA免疫原性组合物、如上述第二方面所述的生物材料或如上述第三方面所述的mRNA-脂质复合物；可选地，所述痘病毒为正痘病毒，优选选自：猴痘病毒、牛痘病毒、天花病毒或痘苗病毒。
本发明的mRNA疫苗可以通过传统的多抗原mRNA疫苗制备工艺(即，将各个mRNA分别进行脂质体纳米颗粒包封，再将包封后的mRNA按比例混合)制成，也可通过本文下述的方法制成。
第五方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物的活性成分包含如上述第一方面所述的mRNA免疫原性组合物、如上述第二方面所述的生物材料或如上述第三方面所述的mRNA-脂质复合物或如上述第四方面所述的mRNA疫苗。
第六方面，本发明提供了一种制备mRNA疫苗的方法，所述方法包括：将离子化脂质、磷脂酰胆碱、聚乙二醇化脂质、胆固醇、mRNA水溶液混合，形成包裹mRNA的脂质纳米颗粒；
其中，所述mRNA水溶液包括如上述第一方面所述的mRNA免疫原性组合物；
可选地，所述mRNA水溶液为将编码上述第一方面所述的mRNA免疫原性组合物的DNA模板混合后转录获得；
可选地，阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇脂质的摩尔比为50:(5～15):(35～45):(1～2)，可选地摩尔比为50:10:38.5:1.5。
第七方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如上述第一方面所述的mRNA免疫原性组合物、如上述第二方面所述的生物材料、如上述第三方面所述的mRNA-脂质复合物、如上述第四方面所述的mRNA疫苗、如上述第五方面所述的药物组合物或由如上述第六方面所述的方法制备的mRNA疫苗。
第八方面，提供一种如上述第一方面所述的mRNA免疫原性组合物、如上述第二方面所述的生物材料、如上述第三方面所述的mRNA-脂质复合物、如上述第四方面所述的mRNA疫苗、如上述第五方面所述的药物组合物、由如上述第六方面所述的方法制备的mRNA疫苗、或如上述第七方面所述的试剂盒在制备用于预防和/或治疗痘病毒感染的药物中的应用。
可选地，所述痘病毒为正痘病毒，优选选自：猴痘病毒、牛痘病毒、天花病毒或痘苗病毒；
优选地，所述药物为疫苗；进一步优选地，所述疫苗用于单独免疫或者与其他类型的痘病毒疫苗进行序贯免疫。
有益效果
本发明的发明人通过选取适当类型的猴痘病毒抗原mRNA，并将其以适当的比例组合在一起，形成了本发明的mRNA免疫原性组合物；基于该mRNA免疫原性组合物的疫苗可产生针对包括猴痘病毒在内的痘病毒的高水平的免疫保护效应，表现在：较高的体液免疫水平和细胞免疫水平，以及针对活病毒攻击的免疫保护效应，因此，在临床上具有广阔的应用前景。
此外，本发明还优化了多抗原mRNA疫苗的制备工艺，即，通过将将所有抗原mRNA按照特定比例混合后再将混合物进行包装，以生产多价疫苗(例如，四价疫苗Rmix4、六价疫苗Rmix6)，由此改善多价mRNA疫苗的制备工艺。此举措将大幅提高多价mRNA疫苗的生产能力，虽然不同抗原的序列差异导致转录效率有所区别，但最终优化后的疫苗可以起到有效保护。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1是本发明实施例1、2中所记载的猴痘病毒(MPOX)多抗原mRNA疫苗的制备流程示意图。
图2显示了本发明实施例3中所记载的MPOX多抗原mRNA疫苗的抗原表达检测结果。
图3是本发明实施例4中记载的、荧光定量PCR法检测本发明方法所制备的多抗原mRNA疫苗vs传统方法制备的多抗原mRNA疫苗中每种mRNA含量的扇形统计图；其中，Lmix4、Lmix6分别表示传统方法制备的四抗原mRNA疫苗(M1、A35、B6、A29)和六抗原mRNA疫苗(H3、M1、A35、B6、E8、A29)的检测结果，Rmix4-1～Rmix4-3、Rmix6-1～Rmix6-3分别表示按本发明方法制备的四价mRNA疫苗(M1、A35、B6、A29)和六价mRNA疫苗(H3、M1、A35、B6、E8、A29)的三次检测结果。
图4显示了本发明实施例4中记载的、荧光定量PCR法检测根据本发明方法所制备的多抗原mRNA疫苗所制备的多抗原mRNA疫苗中各mRNA成分的百分比数据；其中，上图显示的是根据本发明方法所制备的六抗原mRNA疫苗(H3、M1、A35、B6、E8、A29)的三批次的检测结果RM1-1、RM1-2、RM1-3，下图显示的是根据本发明方法所制备的四抗原mRNA疫苗(M1、A35、B6、A29)的三批次的检测结果RM3-1、RM3-2、RM3-3。
图5显示了本发明实施例6中记载的、ELISA法检测多抗原mRNA疫苗免疫后的小鼠血清针对猴痘病毒抗原的结合抗体滴度；其中，左图显示的是一免后的数据，右图显示的是加强免疫(即，二免)后的数据；并且，其中，横坐标显示了所免疫的mRNA疫苗类型以及免疫剂量，纵坐标显示的是免疫血清针对猴痘病毒抗原的结合抗体滴度的Log值。
图6显示了本发明实施例7中记载的ELISA检测M1-mRNA疫苗免疫后小鼠血清针对猴痘抗原的结合抗体滴度。
图7显示了本发明实施例8中记载的、通过噬斑中和实验检测多抗原mRNA疫苗免疫后的小鼠血清对于VACV活病毒的中和效价；其中，横坐标显示了所免疫的mRNA疫苗类型以及免疫剂量，纵坐标显示的是免疫血清针对VACV活病毒的中和抗体滴度(PRNT50)。
图8是本发明实施例9中记载的噬斑中和实验检测M1-mRNA疫苗免疫后小鼠血清中和效价(PRNT90)。
图9是本发明实施例10中记载的、通过彗星尾抑制实验检测各mRNA疫苗免疫后的小鼠血清抑制VACV EV传播能力的结果图。
图10是本发明实施例11中记载的、通过酶联免疫斑点(ELISPOT)实验检测各mRNA疫苗诱导的细胞免疫反应水平。
图11是本发明实施例12中记载的、VACV活病毒攻击各免疫小鼠后小鼠的体重变化。
图12是本发明实施例12中记载的、VACV活病毒攻击各免疫小鼠后小鼠的生存率变化。
图13是本发明实施例13中记载的高通量单细胞测序建库数据汇总。
图14是本发明实施例13中记载的M1疫苗诱导的抗体库轻重链可变区基因座谱系使用频率图。
图15显示了本发明实施例13中记载的M1疫苗诱导的抗体库中最高频的20个抗体特性。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
以下，对本发明进行详述。
本发明术语“聚乙二醇脂质”是指包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。
本发明术语“脂质纳米颗粒”(Lipid nanoparticles，LNP)是指具有至少一个纳米量级尺寸的颗粒，其包含至少一种脂质。
本发明术语“疫苗”是指适合于应用于动物(包括人)的组合物，在施用后诱导免疫应答，其强度足以最低限度地帮助预防、改善或治愈起因于由微生物感染的临床疾病。
本发明以下实施例中所使用的试剂、酶、培养基等化学材料均为市售产品。
一些常用的生物材料，如HEK293T细胞、BSC-1细胞、BLAB/c小鼠、抗小鼠IFN-γAb或抗小鼠IL-2抗体等也为市售产品。
一些合成类生物材料，例如各抗原的DNA序列等需要人工合成的材料，均委托合成公司完成。
实施例1：mRNA制备以及纯化
本实施例中，分别以传统工艺和本发明工艺，制备猴痘病毒多种抗原mRNA的混合物：四抗原mRNA(M1、A29、A35、B6)的混合物，以及，六抗原mRNA(H3、M1、A29、A35、B6、E8)的混合物；所制备的四抗原或六抗原mRNA混合物用于后续的多抗原mRNA疫苗的制备。以传统工艺制备单抗原M1-mRNA疫苗。
以下按传统工艺和本发明工艺所制备的四价mRNA疫苗、六价mRNA疫苗以及M1-mRNA疫苗分别命名如下：
Lmix 4：M1、A29、A35、B6；
Lmix 6：H3、M1、A29、A35、B6、E8；
Rmix4：M1、A29、A35、B6；
Rmix 6：H3、M1、A29、A35、B6、E8。
M1-mRNA疫苗：M1。
mRNA制备的一般性流程：
以编码猴痘病毒各抗原的线性化质粒为模板，通过mRNA体外转录(IVT)合成目的mRNA序列，转录过程中使用甲基假尿苷替换未修饰的三磷酸尿苷。
具体到本实施例，按照图1所示流程，对于传统工艺而言，分别以多抗原疫苗所涉及的带有各抗原序列的线性化质粒(线性化质粒的获得方法参考CN 113151312 A)为模板，各自进行体外转录，然后将所获得的各抗原mRNA按等质量比进行混合，用于后续脂质纳米颗粒的包封；而对于本发明工艺而言，则将多抗原疫苗所涉及的各抗原的线性化质粒的混合物(等质量混合)为模板进行体外转录，从而获得各抗原mRNA的混合物。
上述工艺中，所合成的H3/M1/A29/A35/B6/E8抗原mRNA序列按从5’到3’的方向依次包括以下元件：5’帽子结构、5’UTR序列、单个MPOX抗原编码序列、3’UTR序列、多聚腺苷酸序列；其中，5’UTR序列、3’UTR序列可以根据需求进行常规选择；单个MPOX抗原编码序列按照从5’到3’的方向依次包括：信号肽编码序列(可以如SEQ ID NO:26～28任一所示，其中，抗原M1、A29、A35、E8的信号肽氨基酸序列可以选择如SEQ ID NO:23所示的序列(编码序列如SEQ ID NO:26所示的序列)，抗原H3的信号肽氨基酸序列可以选择如SEQ ID NO:24所示的序列(编码序列如SEQ ID NO:27所示的序列)，抗原B6的信号肽氨基酸序列可以选择如SEQ ID NO:25所示(编码序列如SEQ ID NO:28所示的序列))，各抗原的编码序列如下表1。
表1、各MPOX抗原的序列信息
| 抗原 | 氨基酸序列 | mRNA序列 |
| M1 | SEQ ID NO:1 | SEQ ID NO:7 |
| A29 | SEQ ID NO:2 | SEQ ID NO:8 |
| A35 | SEQ ID NO:3 | SEQ ID NO:9 |
| B6 | SEQ ID NO:4 | SEQ ID NO:10 |
| H3 | SEQ ID NO:5 | SEQ ID NO:11 |
| E8 | SEQ ID NO:6 | SEQ ID NO:12 |
将上述合成的mRNA加入氯化锂，-20℃过夜沉淀，随后15000×g离心，50min，4℃。用-20℃预冷的70％乙醇清洗三次，15000×g离心，1min，4℃，以进行纯化；将纯化后的mRNA在无RNA酶的水中溶解，随后放在-80℃冻存。
根据上述流程，分别获得以传统工艺和本发明工艺制备的四抗原mRNA(M1、A29、A35、B6)和六抗原mRNA(H3、M1、A29、A35、B6、E8)。
实施例2：mRNA的脂质纳米颗粒包封
脂质纳米颗粒的包封方法：
1)将实施例1获得的mRNA混合物稀释成终浓度为100ug/ml的水溶液，pH＝4.0；
2)制备脂质混合溶液，其包括阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇脂质，其摩尔比为50:10:38.5:1.5；
3)通过nanoassembly Ignite仪器，将mRNA水溶液溶液与脂质混合溶液快速混合，形成包裹mRNA的脂质纳米颗粒，即为mRNA疫苗样品；将其用磷酸缓冲盐水(PBS)稀释，并用超离心过滤装置(Millipore)浓缩到所需浓度；最后，用定量RiboGreen RNA检测试剂盒测定mRNA的浓度和包封率。将制备的mRNA疫苗样品储存在4℃，以备后用。
按照图1所示流程进行包封。
对于传统工艺而言：将实施例1中按照传统工艺获得的编码MPOX抗原H3、M1、A29、A35、B6、E8的mRNA序列分别进行脂质纳米颗粒包封，测定包封后的mRNA浓度；取包封后的6种抗原(H3、M1、A29、A35、B6、E8)按照1:1:1:1:1:1的质量比例进行混合，制备六价mRNA疫苗Lmix6；取包封后的4种抗原(M1、A29、A35、B6)按照1:1:1:1:1:1的比例进行混合，制备四价mRNA疫苗Lmix4；取包封后的M1抗原制备单价mRNA疫苗M1-mRNA
对于本发明的工艺而言：将6种抗原(H3、M1、A29、A35、B6、E8)和4种抗原(M1、A29、A35、B6)的线性化模板分别等质量比混合后进行整体mRNA转录和mRNA脂质纳米颗粒包封，分别获得六价mRNA疫苗Rmix6和四价mRNA疫苗Rmix4。
实施例3：mRNA转染以及抗原表达检测
转染前一天，将HEK293T细胞接种于含DMEM培养基(10％FBS血清)的12孔板，每孔3x105个细胞；待细胞长至90％汇合度，按照TransITmRNA(Mirus Bio)转染试剂盒说明书的指示，每孔转染1μg mRNA(分别转染H3 mRNA、M1 mRNA、A29 mRNA、A35 mRNA、B6 mRNA、E8mRNA、实施例1所制备的Rmix6、Rmix4 mRNA混合物)；具体地，将1μg mRNA、2μL TransIT-mRNA regent和2μL boost试剂混合在100μl无血清DMEM培养基中，孵育15分钟，然后滴加到12孔板中；继续培养24小时后，收集HEK293T细胞。
细胞收集后，使用BD Cytoperm固定/渗透溶液(BD Biosciences)对细胞进行固定和渗透，冰上20min，用200μl wash buffer清洗3次，800g，5min；然后，分别用针对每种抗原的单克隆抗体(纯化方式参考文献Shi,R.,Shan,C.,Duan,X.et al.A human neutralizingantibody targets the receptor-binding site of SARS-CoV-2.Nature 584,120–124(2020).)与表达各组抗原(即，H3、M1、A29、A35、B6、E8、Rmix6、Rmix4抗原)的HEK293T细胞进行孵育，冰上30min，然后用200μl wash buffer清洗3次；随后，使用Alexa 488山羊抗小鼠IgG(H+L)孵育细胞，冰上30min，然后用200μl wash buffer清洗3次；最后，用PBS重悬HEK293T细胞，在BD FACSCanto流式细胞仪(BD Biosciences)上采集数据，并用FlowJo10.6.2进行分析。
Lmix6、Lmix4、Rmix4/6转染细胞后在细胞内的各抗原表达情况如图2所示，图2表明，Lmix4/6、Rmix6、Rmix4中各组分抗原蛋白均有较强的表达，其中Lmix4/6中的抗原表达依据上述H3、M1、A29、A35、B6、E8抗原的分别表达情况进行评价，故Lmix4中的四种抗原的抗原表达情况与Lmix6对应的四种抗原的表达情况相同。
实施例4：本发明工艺与传统工艺制备的多价mRNA疫苗的评价
本实施例中，对于实施例2中通过传统工艺制备的Lmix4、Lmix 6mRNA疫苗与通过本发明工艺制备的Rmix4、Rmix6 mRNA疫苗，通过荧光定量PCR分别检测其中每种抗原的含量，结果如图3所示。
此外，用HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green Kit，按照说明书的指示，检测Rmix4/6mRNA疫苗中不同抗原成分的比例和批次间的稳定性。每种抗原质粒按10倍比例稀释，制作标准曲线(R2>0.99，90％<扩增效率<105％)，以估计相应的mRNA拷贝数。由于Lmix中的每种抗原成分的mRNA质量相等，因此，可以作为校准样品，计算Rmix与Lmix相比每个抗原的相对值，然后，每个抗原的相对值/所有抗原的相对值即为Rmix mRNA疫苗中不同抗原成分的比例，结果如图4所示。
图3，图4结果显示，与Lmix相比，Rmix4/6中不同抗原的比例略有变化。MPOX B6抗原在Rmix4和Rmix6中比例最高，而A35所占比例最低，但三批Rmix4/6mRNA疫苗在不同抗原mRNA的比例上无显著差异；这说明：按照本发明工艺制备的多价mRNA疫苗的批间重复性不受影响。由此，形成一种多价mRNA疫苗生产策略，以大幅提高生产的便捷性及生产效率。
实施例5：mRNA疫苗免疫小鼠实验
本实施例中，分别以前述实施例制备的多价mRNA疫苗和单价M1-mRNA疫苗免疫小鼠，以评价各疫苗的免疫原性及免疫保护效应。
具体免疫程序如下：
对于8周龄的雌性BLAB/c小鼠，分别通过肌肉注射接种实施例2所制备的Lmix4、Lmix6、Rmix4或者Rmix6 mRNA 1μg或5μg，或者注射M1-mRNA疫苗5μg，间隔14天，进行第二次接种(剂量与第一次接种相同)，此外，采用PBS免疫作为阴性对照；在接种程序的第13天和第28天分别收集血清样本。此外，用低剂量痘苗病毒(VACV,病毒获得的方法参考文献Gu,X.；Zhang,Y.et al.Protective Human Anti-Poxvirus Monoclonal Antibodies AreGenerated from Rare Memory B Cells Isolated by Multicolor AntigenTetramers.Vaccines 2022,10,1084)感染后14天的小鼠血清作为阳性对照(PC)。
实施例6：酶联免疫吸附试验(ELISA)检测免疫多抗原疫苗后小鼠血清中的结合抗体滴度
将纯化的MPOX抗原(纯化的B6、A35、A29、E8、M1和H3抗原蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、13～17所示)等质量比例混合溶于50mM碳酸盐-碳酸氢盐缓冲(pH9.6)包被液，在96孔透明聚苯乙烯微孔板中加入每孔200ng抗原，4℃过夜。弃掉包被液，每孔加入5％脱脂乳封闭液将微孔板在37℃下封闭1h后弃掉封闭液。加入100μL两倍梯度稀释的小鼠血清，在37℃孵育1h。用PBST洗涤微孔板3次，加入羊抗鼠HRP二抗，37℃孵育1小时后，PBST清洗三次，加入TMB显色液显示，并用2M盐酸终止，在酶标仪上用OD450读值。终点抗体效价定义为：血清产生比本底值高2.1倍的光吸收值(OD450)的最高稀释倍数。结果如图5所示。
图5结果显示，Lmix4、Lmix6、Rmix4或者Rmix6疫苗初次免疫小鼠后其血清抗体均为阳性，第二次免疫后，各组的血清抗体滴度均显著提高；相同剂量下，Lmix4、Lmix6、Rmix4或者Rmix6疫苗所诱导的抗体滴度无显著差异。此外，各mRNA疫苗所诱导的抗体滴度呈剂量依赖性，高剂量(5μg)组小鼠的抗体滴度显著高于低剂量(1μg)组。
实施例7：酶联免疫吸附试验(ELISA)检测免疫M1-mRNA疫苗后小鼠血清中的结合抗体滴度
将纯化的MPOX抗原M1(如氨基酸序列分别如SEQ ID NO:13所示)溶于50mM碳酸盐-碳酸氢盐缓冲(pH 9.6)包被液，在96孔透明聚苯乙烯微孔板中加入每孔200ng抗原M1，4℃过夜。弃掉包被液，每孔加入5％脱脂乳封闭液将微孔板在37℃下封闭1h后弃掉封闭液。加入100μL两倍梯度稀释的小鼠血清，在37℃孵育1h。用PBST洗涤微孔板3次，加入羊抗鼠HRP二抗，37℃孵育1小时后，PBST清洗三次，加入TMB显色液显示，并用2M盐酸终止，在酶标仪上用OD450读值。终点抗体效价定义为：血清产生比本底值高2.1倍的光吸收值(OD450)的最高稀释倍数。结果如图6所示。
图6结果显示，M1-mRNA疫苗初次免疫小鼠后其血清抗体均为阳性，第二次免疫后，血清抗体滴度均显著提高；而PBS组全部为阴性。
实施例8：通过噬斑中和实验，检测多抗原疫苗免疫后小鼠血清对于痘苗病毒(VACV)活病毒的中和效价
使用12孔板提前一天铺好BSC-1细胞，每孔1x105个细胞；使用含2.5％FBS的1640培养基在96孔板中稀释免疫小鼠血清(实施例5中第28天所采集的)，起始倍数为5倍，连续2倍倍比稀释11个梯度。使用100PFU的痘苗病毒(VACV)(病毒获得的方法参考文献Gu,X.；Zhang,Y.et al.Protective Human Anti-Poxvirus Monoclonal Antibodies AreGenerated from Rare Memory B Cells Isolated by Multicolor AntigenTetramers.Vaccines 2022,10,1084)与稀释后的免疫小鼠血清等体积混合，37℃孵育1h。弃掉细胞培养上清，12孔板前11孔作为实验组，加入血清-病毒混合液100ul，并补加300μl1640培养基(2.5％FBS)，12孔板最后1孔不加血清，只加病毒作为阳性对照，37℃孵育1h。然后，弃去上清，PBS漂洗1次，使用羧甲基纤维素钠和2X DMEM的体积比1：1混合物以1ml/孔覆盖细胞，37℃培养48h；添加4％多聚甲醛室温固定3h，弃去混合液。使用结晶紫染色15min显示斑块，并计数。统计使斑点减少50％的血清最高稀释倍数，作为50％空斑减少滴度(PRNT50)。结果如图7所示。
图7结果显示，高剂量组(5μg)小鼠血清的PRNT50滴度显著高于低剂量组(1μg)；其中，高剂量组与低剂量组的PRNT50滴度如下：Lmix6疫苗免疫组分别为850、201，Lmix4疫苗免疫组分别为629、246，Rmix6疫苗免疫组分别为502、287，Rmix4疫苗免疫组分别为803、357。除高剂量组Lmix6显著高于PC外，其余Lmix4、Rmix4、Rmix6与PC均无显著差异。表明：经MPOX多抗原mRNA疫苗诱导的血清中和抗体成功抵御了VACV MV病毒粒子对细胞的感染。
实施例9：通过噬斑中和实验，检测M1-mRNA疫苗免疫小鼠血清对于痘苗病毒(VACV)活病毒的中和效价
使用12孔板提前一天铺好BSC-1细胞，每孔1x105个细胞；使用含2.5％FBS的1640培养基在96孔板中稀释免疫M1-mRNA疫苗小鼠血清(实施例5中第28天所采集的)，起始倍数为5倍，连续2倍倍比稀释11个梯度。使用100PFU的痘苗病毒(VACV)与稀释后的免疫小鼠血清等体积混合，37℃孵育1h。弃掉细胞培养上清，12孔板前11孔作为实验组，加入血清-病毒混合液100ul，并补加300μl 1640培养基(2.5％FBS)，12孔板最后1孔不加血清，只加病毒作为阳性对照，37℃孵育1h。然后，弃去上清，PBS漂洗1次，使用羧甲基纤维素钠和2X DMEM的体积比1：1混合物以1ml/孔覆盖细胞，37℃培养48h；添加4％多聚甲醛室温固定3h，弃去混合液。使用结晶紫染色15min显示斑块，并计数。统计使斑点减少90％的血清最高稀释倍数，作为90％空斑减少滴度(PRNT90)。结果如图8所示。
图8结果显示，小鼠血清PRNT90滴度为：550，显著高于PBS组。表明：经MPOX单抗原M1-mRNA疫苗诱导的血清中和抗体成功抵御了VACV MV病毒粒子对细胞的感染。
实施例10：通过彗星尾抑制试验，检测免疫小鼠血清抑制VACV EV的传播能力
使用6孔板提前一天铺好BSC-1细胞。弃掉培养基，使用含2.5％FBS的1640培养基稀释VACV病毒(加入60PFU的VACV病毒)，总体积0.5ml，37℃孵育1h。弃掉含病毒培养基，添加1.5ml稀释40倍后的免疫小鼠血清(实施例5中第28天所采集的)，37℃培养3-5d。4％多聚甲醛室温固定3h，结晶紫染色。斑点计数并拍照留存。结果如图9所示。
图9结果表明，在彗星尾抑制试验中，所有接种了多抗原mRNA疫苗的小鼠和阳性对照的血清都抑制了VACV彗星尾的形成，PBS组形成了明显彗星尾，这说明：经MPOX多抗原mRNA疫苗免疫的小鼠血清明显抑制了VACV EV颗粒的形成，表明各mRNA疫苗均可抑制VACVEV病毒粒子传播。
实施例11：免疫小鼠血清的细胞免疫水平检测
本实施例中，通过酶联免疫斑点(ELISPOT)实验，检测MPOX多抗原mRNA疫苗诱导的细胞免疫应答水平。
具体地，对于8周龄的雌性C57BL/6小鼠，分别通过肌肉注射接种Lmix4、Lmix6、Rmix4或者Rmix6疫苗5μg，间隔14天，进行第二次接种(剂量与第一次接种相同)，此外，采用PBS免疫作为阴性对照；在接种程序的第28天,取小鼠脾脏，分离脾细胞。
用10μg/ml抗小鼠IFN-γAb或抗小鼠IL-2抗体(BD Biosciences,USA)预包被96孔平板，并在4℃保存过夜；然后，加入含10％ FBS的RPMI 1640培养基200μl/孔，室温下孵育2h，封孔。将0.1MOI的VACV病毒用含10％胎牛血清的RPMI 1640稀释后，加入100μl/孔的ELISPOT板微孔；同时，制备脾细胞悬液，浓度为1×107cells/ml；每孔加入100μl细胞悬液，置于37℃、5％ CO2培养箱中孵育。孵育24h后，去除细胞，依次用生物素化IFN-γ或IL-2检测抗体(BD Biosciences,USA)、链霉亲和素-hrp偶联物(BD Biosciences,USA)和AEC底物(BD Biosciences,USA)处理平板。等待15分钟后，将盘子用去离子水清洗干净并晾干。使用全自动ELISPOT阅读器和图像分析软件(Cellular Technology Ltd)对ELISPOT平板微孔进行拍照，计数斑点数量。结果如图10所示。
图10的ELISPOT结果显示，Lmix6和Rmix6 mRNA疫苗诱导的分泌IFN-γ和IL-2的T细胞数量最多，且显著高于Lmix4、Rmix4和PBS免疫组；此外，Lmix4和Rmix4疫苗诱导的分泌IFN-γ和IL-2的T细胞数量显著高于PBS组；这些结果表明：MPOX多抗原mRNA疫苗能够诱导强烈的细胞免疫应答。
实施例12：VACV攻毒保护实验
为了评价MPOX多抗原mRNA疫苗对小鼠致死性VACV病毒感染的交叉保护效果，将BALB/c小鼠(n＝6)分别接种Lmix6、Lmix4、Rmix6、Rmix4候选疫苗1μg、5μg，以及M1-mRNA 5μg，间隔14天接种2剂，另一组接种PBS作为阴性对照。第二针疫苗接种后14天，对所有组小鼠通过腹腔内(i.p)途径注射致死剂量(5×106PFU，该剂量通过预实验获得)的VACV活病毒，并在感染后14天内每天记录每只小鼠的体重变化和是否存活。结果如图11、12所示。
图11、12结果显示：接种PBS的小鼠中有83.3％(5/6)死亡，唯一存活的一只小鼠体重也相比感染前下降了约10％；相比之下，所有接种了mRNA疫苗的小鼠都存活了下来，并维持了感染前水平的体重，这表明：MPOX多抗原mRNA疫苗对致命的VACV感染提供了有效的交叉保护。
实施例13：M1抗原疫苗诱导小鼠抗体库特征
本实施例系统分析了M1抗原疫苗在小鼠体内诱导产生的特异性抗体库，BALB/c小鼠在4周内完成M1 mRNA疫苗2针免疫，两周后，小鼠脾脏抗原特异性记忆B细胞经流式细胞术分选。首先使用EasySepTMCD19微珠(STEMCELL)进行阳性选择，获得cd19阳性细胞后，HIS标记蛋白作为诱饵孵育30分钟，然后染色7AAD-Percp、CD93-APC和HIS-PE。门控为7AAD-，CD93-，HIS+，获得抗原特异性记忆B细胞，放入10×Genomics进行高通量单细胞V(D)J测序。合成一定数目抗体库中出现频率靠前的抗体，使其覆盖M1抗体库的60％以上，从而对M1抗原诱导的抗体库具有代表性意义。利用Octet检测抗体表达、结合和竞争特性。用斑块减少中和(PRNT)法测定各单抗表达细胞上清的中和活性。使用AMC探针捕获细胞上清中的鼠源抗体，若探针捕获信号上升证明抗体正常表达。结合实验使用AMC探针捕获抗体300s，然后移动到最终浓度为100nM的M1抗原蛋白中结合300s，若有偏移信号产生证明抗体可以和抗原特异性结合。将可与抗原MI结合的抗体进行噬斑中和实验:使用12孔板提前一天铺好BSC-1细胞，每孔1x105 cell，使用等体积100PFU的痘苗病毒(VACV)与抗体上清混合，37℃孵育1h；弃掉细胞培养上清，12孔板前11孔分别加入血清-病毒混合液100ul作为实验组，最后1孔加病毒不加血清作为阳性对照；补加300ul 1640培养基(2.5％FBS)，37℃孵育1h。弃去上清，PBS漂洗1次，使用羧甲基纤维素钠和2X DMEM 1：1混合1ml/孔覆盖细胞，37℃培养48h；添加4％多聚甲醛室温固定3h，弃去混合液。使用结晶紫染色15min显示斑块，并计数。统计每个抗体相对阳性对照的空斑减少比例。评价所有具有中和活性M1抗体的表位特点，与已有的L1抗体7D11的抗体进行竞争实验，M1蛋白首先固定在NTA传感器上，然后移动到第一个抗体(简称抗体1)上，结合600s直到饱和，然后第二个抗体(简称抗体2)。以M1-抗体1-抗体2的结合顺序为第一组，M1-pbst-抗体2的结合顺序为第二组，M1-抗体1(不结合抗体2)为对照组，判断依据：当抗体2达到饱和时，第一组的信号上升强度小于第二组的20％意味着完全竞争。
结果发现，在M1抗体库中能够检测到抗体序列的细胞有4001个，共测得3612条重链可变区(VH)序列和4045条轻链可变区(VL)序列，轻链重链可配对的细胞3499个，来源于716个原始克隆。M1抗原疫苗诱导的抗体库中基因座的使用表现出较强的富集。最高频的重链基因座和轻链基因座比例分别高达75％和40％，使用频率最高的前20对抗体覆盖抗体库68.05％，分别命名M1-1至M1-20，除M1-3,M1-19和M1-20不表达外，其余17株抗体均能表达，16株抗体能够与M1抗原蛋白特异性结合，11株抗体可以中和VACV。所有具有中和活性的抗体均与L1抗体7D11完全竞争，表明在M1诱导的抗体库中，所有高频的中和抗体都针对同一个表位。(图13，14，15)。表明单抗原M1疫苗虽然可诱导较强的体液免疫应答，但其诱导的中和抗体表位单一，应对病毒逃逸的能力较弱。
综上，本发明代表性的4抗原(Lmix4、Rmix4)与6抗原(Lmix6、Rmix6)多价mRNA疫苗在免疫小鼠后均产生强大的体液免疫和细胞免疫水平；特别是，6抗原在4抗原的基础上额外增加了两个抗原(E8、H3)，使得细胞免疫水平进一步显著提高；并且，所有疫苗均完全保护了小鼠免受致死剂量的VACV感染。
此外，本发明还对传统的多抗原mRNA制备工艺进行了优化，即，将所有抗原的线性化质粒混匀制成混合模板，然后按照传统单抗原/价mRNA疫苗的制备方式进行生产，以此可以改善多抗原/价mRNA疫苗制备工艺，此举措将大幅提高多抗原/价mRNA疫苗的生产能力，虽然不同抗原的序列差异导致转录效率有所区别，但最终优化后的疫苗仍然可以起到有效保护。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (28)
1. 一种mRNA免疫原性组合物，其包含以下i）~ iv）中的四种mRNA或以下i）~ vi）六种mRNA：
i）编码猴痘病毒抗原蛋白M1或其抗原性片段的mRNA，其mRNA序列如SEQ ID NO:7或SEQID NO:18所示；
ii）编码猴痘病毒抗原蛋白A29或其抗原性片段的mRNA，其mRNA序列如SEQ ID NO:8所示；
iii）编码猴痘病毒抗原蛋白A35或其抗原性片段的mRNA，其mRNA序列如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:19所示；
iv）编码猴痘病毒抗原蛋白B6或其抗原性片段的mRNA，其mRNA序列如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:20所示；
v）编码猴痘病毒抗原蛋白H3或其抗原性片段的mRNA，其mRNA序列如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:21所示；
vi）编码猴痘病毒抗原蛋白E8或其抗原性片段的mRNA序列，其mRNA序列如SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:22所示。
2.根据权利要求1所述的mRNA免疫原性组合物，其特征在于，所述mRNA免疫原性组合物中，其包含i）~ iv）中的四种mRNA，i）：ii）：iii）：iv）的mRNA的质量比为1:（0.2~5）: （0.2~5）: （0.2~5）。
3.根据权利要求1所述的mRNA免疫原性组合物，其特征在于，其包含i）~ vi）六种mRNA，i）：ii）：iii）：iv）：v）：vi）的mRNA的质量比为1:（0.2~5）: （0.2~5）: （0.2~5）: （0.2~5）:（0.2~5）。
4.根据权利要求1至3任一项所述的mRNA免疫原性组合物，其特征在于，每种mRNA还包括位于5’端的编码信号肽的mRNA序列和/或5’UTR序列。
5.根据权利要求1至3任一项所述的mRNA免疫原性组合物，其特征在于，每种mRNA还连接有位于3’端的编码标签的mRNA序列和/或3’UTR序列和多聚腺苷酸序列。
6.根据权利要求4所述的mRNA免疫原性组合物，其特征在于，信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25所示。
7.根据权利要求6所述的mRNA免疫原性组合物，其特征在于，编码信号肽的mRNA序列如SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28所示。
8.根据权利要求5所述的mRNA免疫原性组合物，其特征在于，所述标签选自Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签、SUMO标签中的至少一种。
9.根据权利要求5所述的mRNA免疫原性组合物，其特征在于，标签为His标签。
10.根据权利要求4所述的mRNA免疫原性组合物，其特征在于，每种mRNA序列从5’端到3’端依次包括：5’UTR序列、编码信号肽的mRNA序列、编码猴痘病毒抗原蛋白的序列、编码标签的mRNA序列、3’UTR序列和多聚腺苷酸序列。
11.根据权利要求4所述的mRNA免疫原性组合物，其特征在于，每种mRNA序列均包括5’端加帽修饰。
12.与权利要求1至11任一项所述mRNA免疫原性组合物相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为B1)至B5)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述RNA免疫原性组合物的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体，或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物，或含有B2)所述表达盒的重组微生物，或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因细胞系。
13.一种mRNA-脂质复合物，其特征在于，所述mRNA-脂质复合物包含递送载体以及权利要求1至11任一项所述的mRNA免疫原性组合物。
14.根据权利要求13所述的mRNA-脂质复合物，其特征在于，所述递送载体包括可离子化脂质体、可离子化蛋白、可离子化聚合物、磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇脂质、可离子化胶束和可离子化脂质纳米粒中的至少一种。
15.根据权利要求14所述的mRNA-脂质复合物，其特征在于，所述可离子化脂质体为阳离子脂质。
16.根据权利要求14所述的mRNA-脂质复合物，其特征在于，所述递送载体包括阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇脂质。
17.根据权利要求16所述的mRNA-脂质复合物，其特征在于，阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇脂质的摩尔比为50:5~15:35~45:1~2。
18.根据权利要求14所述的mRNA-脂质复合物，其特征在于，阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇脂质的摩尔比为50:10:38.5:1.5。
19.用于预防或治疗痘病毒感染的mRNA疫苗，其特征在于，所述疫苗的活性成分包含如权利要求1至11任一项所述的mRNA免疫原性组合物、如权利要求12所述的生物材料或如权利要求13至18任一所述的mRNA-脂质复合物，所述痘病毒为猴痘病毒或痘苗病毒。
20.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的活性成分包含如权利要求1至11任一项所述的mRNA免疫原性组合物、如权利要求12所述的生物材料、如权利要求13至18任一所述的RNA-脂质复合物或权利要求19所述的mRNA疫苗。
21.一种制备mRNA疫苗的方法，所述方法包括：将可离子化脂质体、磷脂酰胆碱、聚乙二醇化脂质、胆固醇、mRNA水溶液混合，形成包裹mRNA的脂质纳米颗粒；
其中，所述mRNA水溶液包括如权利要求1至11任一项所述的mRNA免疫原性组合物。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述mRNA水溶液为将编码权利要求1至11任一项所述的mRNA免疫原性组合物的DNA模板混合后转录获得。
23.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，可离子化脂质体为阳离子脂质，其中，阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇脂质的摩尔比为50:（5~15）:（35~45）:（1~2）。
24.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述可离子化脂质体为阳离子脂质，其中，阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇脂质的摩尔比为50:10:38.5:1.5。
25.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如如权利要求1至11任一项所述的mRNA免疫原性组合物、如权利要求12所述的生物材料、如权利要求13至18任一所述的mRNA-脂质复合物、如权利要求19所述的mRNA疫苗、如权利要求20所述的药物组合物或由如权利要求21至24任一所述的方法制备的mRNA疫苗。
26.一种权利要求1至11任一项所述的mRNA免疫原性组合物、权利要求12所述的生物材料或权利要求13至18任一所述的mRNA-脂质复合物、权利要求19所述的mRNA疫苗、权利要求20所述的药物组合物、由如权利要求21至24任一所述的方法制备的mRNA疫苗或如权利要25所述的试剂盒在制备用于预防和/或治疗痘病毒感染的药物中的应用；所述痘病毒为猴痘病毒或痘苗病毒。
27.根据权利要求26所述的应用，其特征在于，所述药物为疫苗。
28.根据权利要求27所述的应用，其特征在于，所述疫苗用于单独免疫或者与其他类型的痘病毒疫苗进行序贯免疫。
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| CN113151312A (zh) * | 2020-03-02 | 2021-07-23 | 中国科学院微生物研究所 | 新型冠状病毒SARS-CoV-2 mRNA疫苗及其制备方法和应用 |
| CN113337481A (zh) * | 2021-06-02 | 2021-09-03 | 中国医学科学院病原生物学研究所 | 一种基于痘苗病毒天坛株的新型冠状病毒疫苗 |
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