MX2012013419A - Vacuna marcadora para la fiebre porcina clasica. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una vacuna marcadora para el tratamiento profiláctico de la fiebre porcina clásica que comprende el virus vivo modificado atenuado de la fiebre porcina clásica. La secuencia viral de aminoácidos del epítope TAV de la proteína E2 comprende una secuencia diferente de la de un virus de tipo silvestre de la fiebre porcina clásica. La invención se refiere a composiciones farmacéuticas de la vacuna marcadora. La invención también se refiere a un procedimiento para fabricar las vacunas marcadoras para la prevención de la fiebre porcina clásica usando presión selectiva de anticuerpos.

Description

VACUNA MARCADORA PARA LA FIEBRE PORCINA CLÁSICA Campo de la Invención La invención se refiere a una vacuna marcadora para el tratamiento profiláctico de la fiebre porcina clásica que comprende el virus vivo modificado atenuado de la fiebre porcina clásica. En una realización de la invención la vacuna marcadora se caracteriza porque la secuencia de nucleótidos viral, que codifica el epitope TAV, y/o la secuencia de aminoácidos del epitope TAV, comprende una secuencia diferente de la de un virus de la fiebre porcina asociado con la enfermedad, de tal manera que, con la vacuna marcadora de la presente invención, mediante procedimientos serológicos y/o genómicos analíticos, los sujetos que presentan infección con un virus de la fiebre porcina asociado con la enfermedad, pueden diferenciarse de los sujetos vacunados.

Antecedentes de la invención La fiebre porcina clásica (FPC) es una enfermedad epizoótica en animales que se produce en todo el mundo y que tiene una importancia política y económica significativa (Vandeputte y Chappuis, 1999) . La Fiebre Porcina Clásica, conocida también como cólera porcino o plaga del cerdo, es una de las enfermedades que, tras la aparición en cualquier estado miembro, debe notificarse a nivel Nacional, de modo legal a los EU, así como a la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) en París. La fiebre porcina clásica está producida por un virus de ARN pequeño con envoltura del género Pestivirus de la familia Flaviviridae . Los huéspedes naturales del virus de la fiebre porcina son exclusivamente especies porcinas domésticas y salvajes (jabalí europeo) .

Dentro de la Unión Europea Se han realizado intentos para erradicar la FPC a través de rigurosas medidas sin vacunación profiláctica, prohibida desde el año 1990. A pesar de la prohibición, la vacunación representa una opción legalmente autorizada como una vacunación de urgencia en casos en los que aparezca la fiebre porcina. En tal caso la vacunación debe producirse mediante uno de los planes de vacunación de urgencia, ratificados por la Unión Europea (véase el Artículo 19 del Consejo Directivo 2001/89/EC) . Hasta ahora, Rumania ha sido el único país en el que se ha realización un vacunación de urgencia. Las razones de dicha aplicación limitada están basadas en limitaciones técnicas de las vacunas marcadoras disponibles actualmente, tales como restricciones en cuanto a la eficacia de la vacuna, además de las barreras comerciales relacionadas con animales vacunados de manera convencional (limitación en cuanto a la comercialización nacional). La eficacia de las vacunas marcadoras autorizadas no puede compararse con la de las vacunas vivas modificadas, que presentan ventajas significativas, y tales vacunas o vacunas subunitarias inactivadas no son de ninguna manera adecuadas para la vacunación urgente debido a la aparición de inmunidad posterior y a la necesidad de revacunaciones.

Considerando la expansión de la Unión Europea hacia países en la Europa del Este e incluso el aumento de la globalización, se han tratado nuevas estrategias para una posible vacunación de urgencia, que desempeñará un papel evitando el sacrificio de animales a gran escala y pérdidas económicas asociadas (Leifer y col., 2009). Por lo tanto hay una demanda significativa de una vacuna que sea muy eficaz, que permita una diferenciación serológica entre animales vacunados y no vacunados y que adicionalmente presente todas las ventajas de las vacunas vivas modificadas tradicionales.

Dado que la primera generación de vacunas marcadoras, que estaban basadas en la glicoproteina E2 del virus de la FPC, solo tenían una disponibilidad limitada y graves desventajas, como condiciones de conservación, coste, eficacia, existe una gran demanda de nuevas vacunas marcadoras. Se han investigado diversos candidatos para tales vacunas, tales como vacunas de ADN, vacunas de péptidos inmunogénicos , de vectores, virus de la fiebre mutantes por deleción y quiméricos (Beer y col., 2007; Dong y Chen, 2007) . La mayoría de estos candidatos de vacunas marcadoras presentan la desventaja de que se producen mediante procedimientos modernos de modificación genética. Debido a un temor significativo de los consumidores de los productos modificados genéticamente, además de los procedimientos de admisión complicados, las vacunas modificadas genéticamente presentan desventajas significativas.

Las vacunas tradicionales dirigidas contra el VFPC incluyen vacunas vivas modificadas. Dichas vacunas son muy eficaces después de una sola aplicación pero no permiten la diferenciación entre animales vacunados e infectados de acuerdo con un perfil serológico. Muchas de estas vacunas se basan en la cepa "C" viral clásica o un derivado de la misma (denominadas "vacunas de la cepa C") . Adicionalmente, existen vacunas basadas en la cepa viral Japonesa "guinea pig exultation-" (GPE-) , la cepa "Thiverval" y la cepa PAV Mejicana", todas ellas utilizadas en entornos regionales e internacionales (Blome y col, 2006; Greiser-Wilke & Moennig, 2004; van Oirschot, 2003). Existen abundantes datos con respecto al uso de las vacunas basadas en la cepa C. Se sabe que cuatro días después de la aplicación de la vacuna, puede demostrarse una protección completa de los animales contra la infección virulenta a la exposición del VFPC . Adicionalmente, siete días después de la vacunación, se proporciona una protección completa a partir de transmisión vertical de exposición al virus en animales portadores (de Smit y col., 2001).

La desventaja significativa de las vacunas vivas modificadas conocidas es la absoluta incapacidad para discriminar serológicamente entre animales vacunados e infectados. A la vista de esto, un cometido de la presente invención es proporcionar una vacuna viva modificada que permita la discriminación entre animales vacunados e infectados .

En el campo de las vacunas marcadoras, en la técnica anterior se conocían las vacunas denominadas subunitarias, que se basaban en la glicoproteína E2 recombinante del VFPC. El ensayo de discriminación para dichas vacunas es el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) , en el que para detectar indirectamente infecciones por el virus de la FPC se usan anticuerpos dirigidos contra la glicoproteína Ems. Hasta ahora, solo una vacuna subunitaria basada en E2 se encuentra disponible en el mercado, sin embargo, la autorización se suspendió hace algunos meses (véase informe EMA sobre las vacunas subunitarias basadas en E2).

Independientemente de la imposibilidad de comercializar tales productos, tales sistemas presentan graves desventajas biológicas. Una desventaja de este tipo es que antes de transmitir una protección completa, se requieren al menos dos inmunizaciones parentales, lo que hace que tales vacunas sean completamente incompatibles con "vacunaciones cebo", en las que a los animales se les proporciona una sola dosis de cebos de vacuna. Además, las campañas de vacunación de urgencia son solo razonables cuando no se consigue una protección contra el VFPC de tipo silvestre en diversos experimentos que utilizan vacunas subunitarias basadas en E2, protección completa a partir de transmisión vertical. Una desventaja adicional de dichos sistemas es que para la diferenciación serológica se usan anticuerpos dirigidos contra la glicoproteína Ems y la sensibilidad y especificidad de dichos sistemas de ensayo solo fue siempre moderada (Floegel-Niesmann, 2003) .

En la técnica se conocen vacunas vivas atenuadas contra la FPC pero hasta ahora se han restringido por diversas desventajas. La mayoría de las vacunas desveladas en la técnica anterior comprendían ADN extraño y se generaban usando procedimientos de ingeniería genética, conocidos de otra manera como tecnología de ADN recombinante, asociando por tanto problemas graves de evaluación de riesgo ambiental con el producto. Se conocen otras variantes del VFPC en las que los aminoácidos están sustituidos o delecionados del epítope TAV de tipo silvestre (documento WO 2010/074575 A2) . Sin embargo, los restos aminoacídicos y/o nucleótidos que están modificados en la presente invención ni se desvelan ni se sugieren en la técnica anterior.

Para generar variantes de virus, que pueden usarse como vacunas, también se ha usado la realización de pases múltiples, aunque anteriormente no se ha aplicado presión con anticuerpos. La realización de pases múltiples de cultivos infectados por virus para generar variantes, como se desvela en la técnica anterior, está por lo tanto limitada, teniendo que realizar una gran cantidad de pases de cultivo y también por una falta de control sobre el epitope que debe modificarse (Hulst y col) .

Kortekaas y col describen una vacuna contra la FPC viva atenuada, genéticamente estable, que permite la diferenciación serológica de animales vacunados de infectados. Para introducir deleciones en la proteina E2 del VFPC se modificó genéticamente una cepa C mutada usando una estrategia establecida, mediante la cual se usó tecnología de ADN recombinante . Posteriormente, para crear cepas que presentasen una proliferación potenciada, se adquirieron mutaciones adicionales en diversos lugares dentro del genoma del virus realizando pases múltiples. Las cepas desveladas por Kortekaas y col son virus modificados por ingeniería genética, lo que es una desventaja significativa a la luz de los complicados procesos de admisión para la liberación en el entorno de productos modificados genéticamente.

Holinka y col desvelan una doble cepa del VFPC viva atenuada marcadora antigénica "FlagT4vn" que se obtuvo combinando dos determinantes de atenuación genéticos. FlagT4v aloja un marcador antigénico positivo, un epitope Flag sintético, introducido mediante una inserción de 19 oligómeros en la glicoproteína El; y un marcador negativo resultante de mutaciones del sitio de unión del epitope del anticuerpo monoclonal WH303 (mAb H303) en la glucoproteína E2. La administración intranasal o intramuscular de FlagT4v protegía a los cerdos contra la cepa virulenta Brescia del VFPC en un tiempo de postinoculación temprana (2 o 3 días) y tardía (28 días) . La respuesta de anticuerpos inducida por FlagT4v en cerdos reaccionó fuertemente contra el epítope Flag pero no inhibió la unión del mAb H303 con un péptido sintético que representaba el epítope WH303. La vacuna desvelada por Holinka se refiere a un virus modificado por ingeniería genética que presenta ADN extraño dentro de su genoma (secuencia Flag-Tag además de la secuencia vector asociada y marcadores) . Esto representa una desventaja significativa en comparación con la presente invención, que no presenta ADN extraño o recombinante .

El documento WO 2007/143442 A2 describe los efectos de mutaciones dentro del epítope WH303 de la proteína E2 del VFPC, que cambia progresivamente la secuencia de aminoácidos de la cepa virulenta Brescia del VFPC hacia la secuencia homologa de aminoácidos de la cepa NADL del VDVB (virus de la diarrea vírica bovina) . Los animales infectados con mutantes del virus se protegieron cuando se expusieron al virus de la cepa virulenta Brescia a los 3 y 21 días después de la vacunación. La modificación en este sitio dentro del epítope WH303 también permite el desarrollo de un ensayo de diagnóstico para diferenciar animales vacunados de infectados. A pesar de estos efectos, las mutaciones se introdujeron usando ingeniería genética, introduciendo por lo tanto material genético extraño en la vacuna viral.

El estado de la técnica mencionado anteriormente desvela vacunas que se han modificado por ingeniería genética mediante tecnología genética recombinante para producir las cepas de virus. Como se ha descrito anteriormente, las vacunas modificadas por ingeniería genética son objeto de problemas de seguridad ambiental y por lo tanto se restringen por protocolos de admisión complicados y temor entre el público en general, proporcionando por lo tanto una desventaja significativa para su uso.

Sumario de la invención A la luz de la técnica anterior el problema técnico subyacente de la presente invención es proporcionar una vacuna marcadora para cerdos domésticos y salvajes que proporcione protección contra el virus de la fiebre porcina clásica, que permita la diferenciación entre animales vacunados e infectados, producida preferentemente por tecnología convencional. En una realización preferida la vacuna marcadora no se produce mediante tecnología por modificación genética recombinante .

Este problema se resuelve mediante las características de las reivindicaciones independientes. Las realizaciones preferidas de la presente invención se proporcionan mediante las reivindicaciones dependientes.

La invención por lo tanto se refiere a una vacuna marcadora para el tratamiento profiláctico de la fiebre porcina clásica que comprende el virus de la fiebre porcina clásica atenuado vivo modificado.

En una realización preferida la invención se refiere adicionalmente a una vacuna marcadora para el tratamiento profiláctico de la fiebre porcina clásica que comprende el virus vivo atenuado modificado de la fiebre porcina clásica, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos viral del epítope TAV de la proteína E2 comprende una secuencia diferente de la de un virus de tipo silvestre de la fiebre porcina clásica, por lo cual la secuencia de aminoácidos viral presenta al menos una de las siguientes sustituciones: - sustitución del aminoácido 830 por valina; - sustitución del aminoácido 833 por serina; - sustitución del aminoácido 839 por glicina.

En una realización preferida la vacuna marcadora de la presente invención se caracteriza porque el virus modificado no presenta secuencias de ácido nucleico recombinante .

En una realización preferida la vacuna marcadora de la presente invención se caracteriza porque la secuencia de nucleótidos viral presenta una o más de las siguientes sustituciones : - sustitución en la posición del nucleótido 2862 por T, - sustitución en la posición del nucleótido 2870 por T, - sustitución en la posición del nucleótido 2889 por G.

En una realización preferida la vacuna marcadora de la presente invención se caracteriza porque la secuencia de aminoácidos viral presenta una o más de las siguientes sustituciones: - en la proteina ERNS, sustitución del aminoácido 426 por valina, - en la proteina El, sustitución del aminoácido 576 por histidina, - en la proteina El, sustitución del aminoácido 583 por ácido glutámico, - en la proteina E2, sustitución del aminoácido 951 por isoleucina .

En una realización preferida la vacuna marcadora de la presente invención se caracteriza porque la secuencia de nucleótidos viral presenta una o más de las siguientes sustituciones : - sustitución en la posición del nucleótido 1649 por G, - sustitución en la posición del nucleótido 2099 por C, - sustitución en la posición del nucleótido 2122 por G, - sustitución en la posición del nucleótido 3225 por T.

En una realización preferida la vacuna marcadora de la presente invención se caracteriza porque la secuencia de aminoácidos viral del epítope TAV comprende la secuencia de acuerdo con la SEC ID N°: 3 o SEC ID N°: 4.

En una realización preferida la vacuna marcadora de la presente invención se caracteriza porque la secuencia de nucleótidos viral comprende la secuencia de acuerdo con la SEC ID N°: 1.

En otra realización la vacuna marcadora de la presente invención se caracteriza porque los sujetos tratados con la vacuna, como se describe en el presente documento, pueden diferenciarse de sujetos infectados con el virus de la fiebre porcina asociado con la enfermedad mediante análisis de muestras biológicas obtenidas de dichos sujetos usando procedimientos analíticos serológicos y/o genómicos.

En otra realización la vacuna marcadora de la presente invención se caracteriza porque el procedimiento analítico genómico se basa en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), preferentemente PCR en tiempo real, en la que se usan cebadores y/o sondas que reconocen la secuencia de nucleótidos viral asociada con la enfermedad.

En otra realización la vacuna marcadora de la presente invención se caracteriza porque el procedimiento serológico analítico se basa en un inmunoensayo enzimático (EIA) , preferentemente un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), en el que se usan anticuerpos que se unen específicamente al epitope TAV asociado con la enfermedad y/o modificado .

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una vacuna marcadora, preferentemente como se describe en el presente documento, que puede obtenerse por la generación de variantes de escape virales de cepas virales de la fiebre porcina asociadas con la enfermedad u otras conocidas mediante la aplicación de presión de anticuerpos.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un procedimiento para fabricar una cepa de la vacuna del virus atenuado vivo modificado de la fiebre porcina clásica, preferentemente como se describe en el presente documento, que comprende la generación de variantes de escape de cepas virales de la fiebre porcina asociadas con la enfermedad u otras conocidas mediante la aplicación de presión de anticuerpos .

En una realización preferida el procedimiento de preparación, como se describe en el presente documento, se caracteriza porque el procedimiento comprende; la realización de pases múltiple de células, preferentemente células renales embrionarias de lechón, infectadas con el virus de la fiebre porcina asociado con la enfermedad en cultivo celular, y - la aplicación simultánea de anticuerpos dirigidos contra el epitope TAV de la proteína E2 del virus de la fiebre porcina asociado con la enfermedad y/o suero policlonal de conejo inmunizado con el péptido CTAVSPTTLRTEWK .

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende la vacuna marcadora como se describe en el presente documento junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una vacuna marcadora como se describe en el presente documento para su uso como un medicamento en el tratamiento profiláctico (vacunación) , preferentemente mediante inyección intramuscular o aplicación oral, de la fiebre porcina clásica .

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un procedimiento para el tratamiento profiláctico (vacunación) de la fiebre porcina clásica que comprende administrar a un sujeto, preferentemente a un cerdo, la vacuna marcadora como se describe en el presente documento, preferentemente mediante inyección intramuscular o aplicación oral .

Otra situación común en la que la fiebre porcina clásica requiere vacunación se produce en respuesta a la detección de infección del virus en el campo en poblaciones de cerdos. Cuando se produce la infección de cerdos, de tal manera que el virus de la fiebre porcina clásica está presente en cerdos silvestres o domésticos, se requiere una vacunación de urgencia de las poblaciones de cerdos circundantes o colindantes. Posteriormente se realizan las vacunaciones de todos los cerdos, tanto salvajes como domésticos, durante hasta 1 a 2 años, en la región circundante, para evitar el brote o la infección a gran escala del virus de la fiebre porcina. En caso de brote o detección de fiebre porcina, la vacuna marcadora de la presente invención se ajusta perfectamente a una vacunación de urgencia. La vacuna marcadora facilita una administración rápida y eficaz por vía oral, además de mediante inyección y permite la discriminación entre animales infectados con el virus (asociado con fiebre) en el campo y los vacunados.

Breve descripción de las figuras de la invención La Figura 1, se refiere a comparaciones de secuencias.

La Figura 2, muestra el Análisis indirecto con inmunofluorescencia .

La Figura 3, se refiere a VNT (ensayo de neutralización de virus, Virus Neutralisation Test) con la cepa Rósrath del VFPC.

La Figura 4, muestra un ELISA con Idexx para E2 con suero de cerdo del estudio en animales del 06/10.

Descripción detallada de la invención El desarrollo de la vacuna de acuerdo con la presente invención no se basa en procedimientos de modificación genética si no en el principio de que un virus se modificará, en si mismo, de una manera adaptativa cuando se coloca bajo presión selectiva de anticuerpos. Por lo tanto, la presente invención se refiere a una vacuna viva no modificada genéticamente que proporciona protección contra el VFPC virulento, que presenta todos los requisitos de una vacuna marcadora (serológica y genéticamente diferente) . La vacuna marcadora se diseñó aplicando presión selectiva de anticuerpos a diferentes cepas C en cultivos celulares. Las variantes generadas poseían preferentemente tres cambios de aminoácidos en el epítope TAV de E2 y dos cambios compensatorios en la proteína El. La estabilidad de estas variantes se demostró mediante más de diez de pases de cultivo celular en tambores rotativos y, por ejemplo, la vacunación intramuscular de cerdos condujo a una protección completa contra una cepa de exposición altamente virulenta. Adicionalmente, la DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated Animáis, diferenciación de los animales infectados de los vacunados, ) directa es posible mediante técnicas serológicas y/o genéticas, por ejemplo, mediante diferentes sistemas de tinción con inmunofluorescencia y de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (rRT-PCR). Además, la DIVA indirecta podría conseguirse optimizando ensayos de tipo ELISA para E2 (cambiando, por ejemplo, los valores limite) o desarrollando sistemas de ensayo de tipo ELISA con péptidos específicos de TAV. Por tanto, se presenta una vacuna marcadora viva no modificada genéticamente contra el VFPC.

La producción de la vacuna de acuerdo con la presente invención se realiza de la siguiente manera: Se seleccionan variantes de escape "Riems" de la cepa C, de aparición natural, en un sistema de cultivo celular (células embrionarias renales de lechón con IFN) mediante pases de virus de la cepa C durante la aplicación de anticuerpos específicos de TAV E2 y suero de conejo inmunizado con el péptido CTAVSPTTLRTEWK policlonal.

Los anticuerpos aplicados, además de los anticuerpos contenidos en el suero de conejo policlonal tratado con el péptido, reconocen específicamente el epítope TAV en la proteína E2 del virus de la FPC y a través de la unión a este epítope neutralizan eL virus (cepa C) de la FPC. El VFPC presenta una tasa mutación elevada debido a la naturaleza de su ARN. Bajo la presión selectiva de proporcionar anticuerpos neutralizantes, se seleccionan virus, que experimentan mutación en el epitope al cual se unen los anticuerpos (en este caso, el epitope TAV) , por lo cual los virus de tipo silvestre inalterados se neutralizan. Mediante pases múltiples a diversas concentraciones y mezclas de anticuerpos y suero de conejo, pueden seleccionarse diversos aislados de virus mutados .

Primero se seleccionaron virus con una sustitución el epitope TAV. A través de pases posteriores de estos virus con diversos tipos de presión de anticuerpos , se seleccionó un aislado, que presentaba dos sustituciones en el epitope TAV y una sola sustitución compensatoria en la proteina El (la interacción entre El y E2 es importante para la estructura del virus) . Estos virus se colocaron bajo presión de anticuerpos adicional, lo que condujo al aislamiento de virus con tres sustituciones en el epitope TAV además de dos sustituciones compensatorias en la proteina El. Los virus resultantes (Q7 "Riems" cepa C, S10 "Riems" cepa C y 011 "Riems" cepa C) presentaron sustituciones en la proteina E2 en las posiciones 2862, 2870 y 2889, 3225, además de cambios en la proteina El en las posiciones 2099 y 2122, además de una sustitución en la proteina ERNS en la posición 1649.

Tabla 1: Información adicional para las variantes de escape TAV un sistema de RT-PCR en tiempo real, que puede diferenciar entre las variantes (Q7, S10, 011) en los aislados de campo.

Los cambios en la secuencia de aminoácidos posibilitan la diferenciación entre las variantes (Q7, S10, 011) y los aislados de campo en base a la unión de anticuerpos, por lo cual los anticuerpos usados para la neutralización (anticuerpos A18) ya no se unen a las variantes sino que se unen a todos los aislados de campo debido al epitope TAV altamente conservado en el VFPC. También pueden usarse anticuerpos generados contra la secuencia peptidica de TAV modificada (que presenta mutaciones de la presente invención) para diferenciar entre virus infeccioso y vacuna, por lo cual los anticuerpos dirigidos contra las variantes se unirán a la vacuna de virus modificada de la presente invención y proporcionarán identificación positiva de animales vacunados, pero no se unirán a los aislados de campo.

Tabla 2: Secuencias de la presente invención: La presente invención se refiere a un virus de la fiebre porcina modificado que puede comprender cualquiera o todas las combinaciones de mutaciones y sustituciones posibles desveladas en el presente documento. Los ejemplos y el respaldo experimental proporcionados en el presente documento demuestran que se generaron cepas virales que solo presentaban un subconjunto de todas las sustituciones indicadas en la Tabla 1. Estas cepas virales presentan un efector protector además de poder usarse como marcadores, cumpliendo por lo tanto con el objetivo de la presente invención. Las cepas preferidas de la presente invención se refieren a cepas que comprenden subconjuntos de las sustituciones desveladas, además de aquellas cepas que presentan todas las sustituciones desveladas.

Fue del todo sorprendente que las combinaciones de una o más de las modificaciones genéticas especificas (obtenidas mediante procesos naturales como resultado de la presión de anticuerpos) conducirían a las propiedades beneficiosas de la vacuna marcadora como se describe en el presente documento. La técnica anterior revela algunas modificaciones similares, pero ninguna conocida en la técnica sugeriría que los restos modificados en particular en la presente invención proporcionarían una protección particularmente eficaz de la infección por el VFPC. Sus combinaciones exclusivas conducen al conjunto de propiedades descritas que permiten que la invención actúe como una vacuna capaz de diferenciar entre animales infectados y vacunados.

Se desconocía que tal presión selectiva, como se aplica en la presente solicitud, mediante tratamiento con anticuerpos, conduciría a la modificación exacta descrita en el presente documento. Las combinaciones de las modificaciones genéticas, como se describe en el presente documento, funcionan juntas, proporcionando el efecto sinérgico de mutaciones compensatorias que conservan la estructura de la proteína, permitiendo al mismo tiempo que los restos TAV muten y por tanto proporcionando las características marcadoras requeridas por el cometido de la presente invención.

La expresión modificación por ingeniería genética se refiere a modificación o manipulación genética del genoma de un organismo, por ejemplo introduciendo material de ácido nucleico extraño, tal como ADN o ARN, o secuencias sintéticas de ácido nucleico en el genoma del huésped. Esta tecnología se conoce también como tecnología de ADN recombinante .

La expresión virus atenuado se refiere a virus que se ha modificado, en cualquiera manera de formas, de tal manera que el virus es menos dañino y/o menos virulento en comparación con el virus de tipo silvestre (asociado con la enfermedad) . Por ejemplo, en sujetos infectados con virus atenuados aparecen síntomas asociados con la enfermedad de la fiebre porcina en comparación con los virus de tipo silvestre.

La expresión presión de anticuerpos o presión selectiva de anticuerpos, en términos de la presente invención, se refiere a la aplicación de anticuerpos durante el cultivo celular, preferentemente durante pases múltiples, que se dirigen a uno o más epítopes específicos de los virus. Dichos anticuerpos pueden ser cualquier tipo de anticuerpos conocidos en la técnica, tanto monoclonales como policlonales , o puede estar contenidos en el suero de los animales tratados con un péptido de interés, por ejemplo el epítope diana. Dichos anticuerpos con frecuencia se denominan anticuerpos neutralizantes. Bajo la presión selectiva de proporcionar anticuerpos neutralizantes, debido a su crecimiento ventajoso, se seleccionan virus que experimentan mutación en el epítope al cual se unen los anticuerpos (en este caso, el epítope TAV) , de modo que los anticuerpos ya no se unen a dicho epítope y por lo tanto ya no proporcionan un efecto limitante o neutralizante, por lo cual los virus de tipo silvestre inalterados neutralizados por los anticuerpos están posteriormente desfavorecidos de manera selectiva en el cultivo .

Aquellos virus, que experimentan mutación en el epitope al cual se unen los anticuerpos (en este caso, el epitope TAV) , se denominan comúnmente variantes escape. Estas variantes son materia objeto de la presente invención y son genética y serológicamente distintas de los virus de tipo silvestre .

La expresión realización de pases múltiples se refiere a la práctica de realizar pases de los cultivos celulares (conocidos también como subcultivos o células en división) durante varias veces, de manera que un pequeño número de células se transfiere a un nuevo recipiente, preferentemente con medios recién preparados, o por dilución de cultivos celulares en los nuevos medios, durante varias veces de manera que se deja que los cultivos celulares sigan creciendo sin los efectos de alta densidad celular asociados en cultivos .

A la luz de la vacuna marcadora, la invención también puede referirse a un grupo de invenciones unificadas que se combinan por un solo concepto inventivo. La vacuna marcadora, el virus en si mismo y composiciones farmacéuticas de los mismos, su uso en el tratamiento de animales para la vacunación y los procedimientos para producir los virus se encuentran bajo un concepto inventivo general. La novedosa e inventiva vacuna marcadora descrita en el presente documento, permite y unifica todos los aspectos de la presente invención, de manera que las diversas realizaciones descritas en el presente documento se encuentran dentro de una sola invención unificadora.

Cuando en la presente solicitud se proporcionan secuencias de nucleótidos, los listados de secuencias pretenden incluir las secuencias tanto de ADN como de ADN correspondientes. Sin embargo algunas secuencias de nucleótidos se proporcionan como secuencias de ADN, pretendiendo incluir en la presente invención las secuencias de ARN correspondientes (por ejemplo, cuando el genoma del virus presente una molécula de ARN) . Las secuencias de nucleótidos de la presente invención también incluyen las secuencias que son complementarias a las indicadas, por ejemplo, la secuencia complementaria que podría unirse, mediante el emparejamiento de bases de Watson-Crick, a la secuencia indicada. Las secuencias de ARN y/o de ADN complementarias correspondientes no requieren esfuerzos inventivos para trasformar una en otra y un experto en la materia puede obtenerlas fácilmente.

El procedimiento de administración de la vacuna viral de la presente invención, composiciones de la invención, tales como composiciones farmacéuticas, inmunológicas , antigénicas o vacunales o composiciones terapéuticas, puede realizarse por vía parenteral, tal como por procedimientos de aplicación intradérmica, intramuscular o subcutánea. Tal administración permite una respuesta inmunitaria sistémica o respuestas inmunitarias humorales o mediadas por células. La vacuna de acuerdo con la presente invención, también puede administrarse por vía oral, tal como incorporarse en la comida del animal, permitiendo una inmunización sencilla y eficaz de grandes poblaciones, por ejemplo, de jabalí europeo .

Los procedimientos de aplicación preferidos están relacionados con la aplicación subcutánea o la aplicación intramuscular , preferentemente por inyección, y aplicación oral .

Más generalmente, las composiciones de vacuna viral o composiciones terapéuticas de la invención pueden prepararse de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica farmacéutica veterinaria.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de dichas composiciones puede administrarse en dosificaciones y mediante técnicas bien conocidas por los expertos en las técnica médica o veterinaria teniendo considerando factores tales como la edad, sexo, peso, especie y estado del sujeto en particular y la vía de administración. Las composiciones pueden administrarse en solitario o pueden administrarse conjunta o secuencialmente con composiciones, por ejemplo, con "otras" composiciones inmunológicas, antigénicas o vacunales o composiciones terapéuticas, proporcionando de este modo composiciones multivalentes o "cóctel" o de combinación de la invención y procedimientos que las emplean. De nuevo, los principios y la forma de administración (administración secuencial o conjunta), asi como las dosificaciones, pueden determinarse considerando factores tales como la edad, sexo, peso, especie y estado del sujeto en particular y la vía de administración.

Los ejemplos de composiciones de la invención incluyen preparaciones liquidas para la administración a través de orificios, por ejemplo, administración oral, nasal, anal, vaginal, peroral, intragástrica, etc., tales como suspensiones, jarabes o elixires; y preparaciones para administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa (por ejemplo administración inyectable) tal como suspensiones o emulsiones estériles.

En tales composiciones las variantes del VFPC pueden mezclarse con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa o similar. Las composiciones también pueden liofilizarse . Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes de pH, adyuvantes, gelificantes o aditivos potenciadores de viscosidad, conservantes, agentes saporíferos, colorantes y similares, dependiendo de la vía de administración y de la preparación deseada .

EJEMPLOS Diseño experimental y procedimientos Inmunización de conejos usando el péptido TAV De acuerdo con el siguiente esquema se inmunizaron dos conejos de 8-10 semanas de vida (crotales 304 y 305), usando un péptido CTAVSPTTLRTEWK conjugado con hemocianina de lapa californiana (KLH, Keyhole Limpet Hemocyanin) para generar el suero neutralizante de la cepa C policlonal. La inmunización se realizó después de tres revacunaciones, produciéndose cada una aproximadamente a intervalos mensuales.

Aislamiento de variantes de escape de E2 del virus "Riems" de la cepa C Para crear presión de anticuerpos con la que generar mutaciones del virus "Riems" de la cepa C en la glicoproteína E2, el virus se trató con diversos anticuerpos dirigidos contra el epítope TAV de la proteína E2, usando diversas concentraciones. Posteriormente las células infectadas se incubaron y se realizaron pases varias veces. Los anticuerpos aplicados en los experimentos de la presente invención eran anticuerpos monoclonales específicos para E2 , disponibles en el mercado para el ensayo de tipo ELISA específico para E2 del VFPC.

Anticuerpos : A18I (IDEXX) A18B (Bommeli) A18C (Ceditest) HC34 ( CRL, Hannover) WH303 y WH 211 (Weybridge, Gran Bretaña) .

La incubación de los cultivos virales se realizó de acuerdo con lo siguiente. Se aplicaron diversas concentraciones y mezclas de anticuerpos con diversas cantidades de virus. La incubación se produjo durante 2-6 horas a temperatura ambiente. La suspensión de virus-anticuerpo se proporcionó a placas de cultivo celular con crecimiento celular hasta confluencia y posteriormente se incubó. Durante este tiempo, las células (células PK15) absorbieron el virus durante 1-2 horas a 37 °C. Finalmente se añadió el medio de cultivo celular y las placas se incubaron durante 72 horas a 37 °C y 5% de COT .

Después de 72 horas los sobrenadantes del cultivo celular se separaron individualmente y se conservaron. Después, las placas se fijaron y se tiñeron usando tinción con inmunofluorescencia y un anticuerpo C16 (específico para la proteína NS3 del VFPC) . Después, los pocilios positivos débiles del sobrenadante del cultivo celular se hicieron pasar bajo presión de anticuerpo adicional, como se ha descrito anteriormente. Después, los sobrenadantes del cultivo celular de los pocilios solo con células positivas o solo placas de células teñidas se hicieron pasar bajo presión de anticuerpo muy débil o sin presión de anticuerpo para aumentar la titulación del virus durante 1-2 pases. Para la secuenciación en las regiones El y E2 se seleccionaron diversos sobrenadantes de cultivo celular.

El control de virus de variantes de escape se realizó usando tinción con inmunofluorescencia con un anticuerpo C16 o se usó el anticuerpo A18 para producir las variantes de escape. Las variantes de virus que presentaban un cambio en el epitope TAV ya no pudieron teñirse usando el anticuerpo A18.

Historial de pases Tabla 3: Historial de pases de los virus de escape "Riems" de la cepa C Caracterización de las variantes de escape B5/2, 116, Ql, SIO y 011 Las variantes de escape aisladas se secuenciaron en la región de las proteínas El y E2. Se realizaron diversas tinciones de inmunofluorescencia usando los anticuerpos A18-idexx, A18-bommeli, Al8-ceditest y el anticuerpo C16. Se realizaron pases de las variantes de escape en frascos de cultivo celular (todos) además de en cultivos rotativos (Q7, S10, 011) y posteriormente se secuenciaron, se tiñeron de un modo diferente y se titularon.

RT-PCR en tiempo real específica para Q 7 Para someter a ensayo las características genéticas de los virus, y por lo tanto someter a ensayo una de las propiedades marcadoras de la vacuna, se realizó la detección de ARN viral después de inmunización con las variantes de escape usando cebadores y una sonda, que fueron capaces de diferenciar las variantes de escape de los aislados de campo del VFPC y "Riems" de la cepa C original.

Estudio con animales del 27/09 - Ensayo de la respuesta inmune de los mutantes Riems B5/2-P6 e I16-P2 de la cepa C En los estudios con animales de la presente invención, cada uno de los tres lechones se inmunizó con 2 mi de suspensión de virus (sobrenadante de cultivo celular) mediante aplicación intramuscular. La formación de grupos de los animales se realizó de la siguiente manera; grupo A (B5/2) , grupo B (116) y el grupo de control con la cepa C Riems (vacuna Riemser de la fiebre porcina) . Para cada grupo se realizó un ensayo serológico de la respuesta inmune.

Estudio con animales del 06/10 - Ensayo de las variantes de escape Q7, S10 y 011 Para analizar que variantes de escape eran las más prometedoras en cerdos receptores, en cuanto a la ausencia de un efecto peligroso y eficacia después de aplicación intramuscular, se realizaron los siguientes estudios con animales .

En este estudio se usaron 21 lechones de 8-9 semanas de vida (de un tamaño aproximado de 15-20 kg) . Cada lechón se inmunizó con 2 x 105'0 KIDso/ml, por via i.m.

Se ensayaron 5 grupos: Grupo 1 (5 cerdos) mutantes de las variantes Q7-P7 de la cepa C (105,0 KID50/ml) Grupo 2 (5 cerdos) mutantes de las variantes S10-P8 de la cepa C (105,0 KID50/ml) Grupo 3 (5 cerdos) mutantes de las variantes 011-P8 de la cepa C (105'° KID50/ml) Grupo 4 (3 cerdos) Vacuna Riemser de la fiebre porcina (virus en bruto) Grupo 5 (3 cerdos) grupo de control no inmunizado Inmunización y muestreo de sangre: Odpv Muestreo de sangre (EDTA y Suero) , inmunización 7dpv Muestreo de sangre (EDTA) 14dpv Muestreo de sangre (EDTA y Suero) 21dpv Muestreo de sangre (EDTA y Suero) Diariamente se obtuvieron datos en cuanto a temperatura corporal y síntomas clínicos.

Exposición: 28dpv Muestreo de sangre (EDTA y Suero) , Frotis nasal Infección por exposición con la cepa Koslov altamente virulenta del VFPC (lx 106'5 KID50) 4dpi Muestreo de sangre (EDTA y Suero) , Frotis nasal 7dpi Muestreo de sangre (EDTA y Suero) , Frotis nasal 10dpi Muestreo de sangre (EDTA y Suero) , Frotis nasal 14dpi Muestreo de sangre (EDTA y Suero), Frotis nasal 21dpi Muestreo de sangre (EDTA y Suero) , Frotis nasal 28dpi Muestreo de sangre (EDTA y Suero) , Frotis nasal Estudio con animales del 24/10 - Ensayo de las variantes de escape S10 y 011: protección después de inmunización oral Para someter a ensayo la eficacia de la aplicación oral, se realizó el siguiente estudio con animales. Se usaron 15 lechones como animales de ensayo, que tenían de 8 a 10 semanas de vida (aproximadamente 15-20 kg) .

Grupo 1 (6 cerdos) : variante S10 de la cepa C mutantes A Grupo 2 (6 cerdos) : variante Olí cepa la C mutantes B Grupo 3 (3 cerdos) : control infeccioso (no vacunado) Inmunización y muestreo de sangre : 0 dpv Muestreo de sangre (EDTA y Suero) , Frotis nasal 14 dpv Muestreo de sangre 28 dpv Muestreo de sangre (EDTA y Suero) , Frotis nasal 4 dpi Muestreo de sangre (EDTA y Suero) , Frotis nasal 7 dpi Muestreo de sangre (EDTA y Suero) , Frotis nasal 10 dpi Muestreo de sangre (EDTA y Suero) , Frotis nasal 14 dpi Muestreo de sangre (EDTA y Suero) , Frotis nasal 21 dpi Muestreo de sangre 28 dpi Muestreo de sangre Diariamente se obtuvieron datos en cuanto a temperatura corporal y síntomas clínicos.

Resultados experimentales Inmunización de conejos con el péptido TAV Después del tratamiento con tres revacunaciones (aproximadamente 12 semanas después de la primera inmunización), los sueros de ambos conejos (304 y 305) fueron positivos en el ensayo de ELISA para E2 disponible en el mercado. En el ensayo de neutralización de virus ambos sueros fueron positivos aproximadamente tres semanas después de la tercera revacunación. En el ensayo de neutralización las titulaciones fueron bajas y se redujeron posteriormente después de la 4a - 6a revacunación.

Tabla 4: Caracterización del suero de los conejos 304 y 305 después de inmunización con el péptido TAV Aislamiento de las variantes de escape de E2 del virus Riems de la cepa C La incubación del virus Riems de la cepa C con anticuerpos específicos contra E2 condujo, solo después de algunos pases, al aislamiento de variantes de escape que presentaron una sustitución en la región E2 en la posición 2870. Para el aislamiento de variantes adicionales fue importante que también se produjese un cambio compensatorio en la proteína El en la posición 2122, por ejemplo como en el aislado 16P1. Si los dos cambios se producían simultáneamente, solo eran necesarios algunos pases bajo la presión de anticuerpo y suero para aislar otras variantes que adicionalmente presentaron una sustitución en la posición 2889 en la proteina E2. Algunas de estas variantes de escape también mostraron un cambio en la posición 3225 en la proteina E2. Un ejemplo de una variante de escape de este tipo es el aislado B5/2.

Representación esquemática del epitope TAV de la variante B5/2: Cepa C de tipo silvestre: CTAVSPTTLRTEVVK utante B5/2: CTAVSSTTLRTGVVK La realización de pases posteriores del aislado B5/2 bajo presión de anticuerpo condujo al aislamiento del aislado CB32. Este aislado también presentó otra sustitución en la proteina E2 (nucleótido 2862) , además de una sustitución compensatoria en la proteina El en la posición 2899. El aislado CB32 se obtuvo a partir de una mezcla de las variantes B5/2 y una nueva variante con la sustitución adicional. Para aislar las nuevas variantes que presentaban las sustituciones adicionales, se realizaron pases múltiples del aislado CB32 bajo presión de anticuerpos. A partir de un pase posterior y añadido de H15, se aislaron los aislados Q7, S10 y 011.

Una comparación de secuencia del epitope TAV de los mutantes S10, 011 y Q7 se puede apreciar en la Figura 1, la cual muestra una comparación de secuencias; A) Comparación de la secuencia de nucleótidos de la región del epitope TAV entre las variantes Q7, S10, 011 y el aislado de campo de la cepa C; y B) Comparación de la secuencia de aminoácidos de la región del epitope TAV entre las variantes Q7, S10, 011 y el aislado de campo de la cepa C.

Para una revisión de las sustituciones de nucleótidos y aminoácidos en las variantes de escape aisladas véase la Tabla 1 Caracterización de las variantes de escape B5/2, 116, Q7, S10 y 011 El ensayo de las variantes de escape en cuanto a la unión de los diversos anticuerpos específicos de E2 se realizó usando inmunofluorescencia .

Tabla 5: Tinción indirecta con inmunofluorescencia de las variantes de escape de E2 seleccionadas con una sustitución en la proteína E2 En la mayoría de los casos, cuando se usaba inmunofluorescencia con el anticuerpo A18Bommeli, fue suficiente una sola sustitución de aminoácido en el epítope TAV para proporcionar una señal negativa. Las variantes de escape con dos mutaciones en TAV (tal como B5/2) también mostraron resultados negativos con los dos anticuerpos, A18Bommeli y A18C, como se muestra en la Figura 2, la cual se refiere al análisis indirecto con inmunofluorescencia de A) Análisis del Pase 2 de los mutantes de escape de E2, B5/2 (virus precursor para Q7, S10 y 011, que solo presenta 2 sustituciones en el epítope TAV) y B) Análisis del virus de la cepa C.

Tabla 7: Tinción con inmunofluorescencia de pases particulares de diversas variantes de escape de E2, presentando tres sustituciones en el epítope TAV.

Todos los aislados sometidos a ensayo mostraron señales negativas para los pases seleccionados para las tinciones con A18. Sin embargo, en el 8o pase del aislado S10, usando el anticuerpo H303, pudo obtenerse una pequeña colonia. Esto mantiene una alta estabilidad de sustituciones en el epitope TAV. Se realizaron otros ensayos de estabilidad para los aislados Q7, S10 y 011 usando cultivos rotativos durante 10 pases adicionales.

Tabla 8: Tinción diferencial de pases seleccionados con los anticuerpos A18 (idexx y bommeli) y WH303 (V%A) . Como control se usó el anticuerpo C16 especifico contra NS3 (EURL) .

EZ = algunas células individuales En el 10° pase, no hubo ninguna variante del virus que mostrase una reversión, de tal manera que la tinción solo fue posible con C16. La variante Q7 fue negativa para todas las tinciones hasta el 14° pase, por lo que en el 16° pase tampoco pudo detectarse con el anticuerpo C16. Estos resultados se confirmaron usando RT-PCR además de protocolos de secuenciación con PCR. Por lo tanto es obvio que en el 16° pase no hay virus, de tal manera que también puede excluirse error en la realización de pases. Sin embargo, usando el anticuerpo A18 (idexx), pudieron teñirse algunas células en los pases 14° y 16° del aislado S10. Para el mutante 011, usando los anticuerpos A18 (bommeli) y WH303, se realizaron 16 pases antes de que algunas células individuales pudiesen teñirse Estos resultados demuestran la alta estabilidad de las características serológicas de las vacunas virales como se describe en el presente documento.

Caracterización de las variantes de escape por secuenciación de El y E2 Tabla 9: Secuenciación de aislados previos que presentan un sustituto en el epítope TAV de la proteína E2 La sustitución en la posición 2870 se mantuvo en todos los aislados después de 10 pases, lo que parece ser muy estable. Esto refuerza la conclusión de que esta sustitución particular no tiene gran efecto sobre la Estructura de la proteina, de tal manera que una reversión con respecto a la secuencia de tipo silvestre no proporciona ventajas.

Tabla 10: Secuenciación de aislados con 3 sustituciones en el Los cambios en la secuencia en los aislados 011, S10 y Q7 fueron estables para todos los pases sometidos a ensayo (14-17) .

Tabla 11: Secuenciación de los aislados Q7, S10 y 011 después de diversos pases en cultivos rotativos Todos los pases de los virus secuenciádos de las tres variantes contenían las sustituciones en las proteínas El y E2 que se habían inducido por presión inmunitaria . El pase 16° de Q7 no pudo secuenciarse, probablemente debido a que no quedaba ningún virus en el sobrenadante de cultivo celular (véase anteriormente) . En el caso en que no aparezcan virus revertientes, que en base a las diversas tinciones indicadas en la Figura 2 no puede excluirse, estos solo son detectables por secuenciación de un determinado porcentaje.

Sin embargo, la enorme mayoría de los virus no revirtió y permaneció sustituida. Por secuenciación no pudieron detectarse virus revertidos individuales sencillos.

RT-PCR en tiempo real específica de Q7 Para diferenciar entre animales vacunados e infectados, se aplicó un sistema de RT-PCR. Dado que el epítope TAV está muy conservado en todos los virus de la FPC, en el ensayo de PCR en tiempo real se usaron las sustituciones en el epítope TAV como una base para cebadores y sondas.

Tabla 13: Para controlar la carga viral se usó RT-PCR en tiempo real. Se aplicó el siguiente sistema de PCR: Mezcla 1 FPC (especifica del VFPC, reconoce todas las cepas) , mezcla Q7-TAV (especifica para las variantes) y mezcla Cepa C-TAV (la cepa C de tipo silvestre también puede detectarse con una sensibilidad mucho más baja) . Los resultados se proporcionan como valores de Ct (umbral de ciclo, Cycle threshold) .

La carga viral se determinó usando RT-PCR en tiempo real. El sistema de mezcla 1 FPC reconoció todas las cepas del VFPC y no diferenció entre la cepa C de tipo silvestre y las nuevas variantes de escape. El sistema Q7-TAV reconoció específicamente las tres variantes de escape. El sistema cepa C-TAV solo reconoció la cepa C de tipo silvestre (ninguna de las variantes de escape) con un valor de Ct de aproximadamente 14.

La reducción tan pequeña en la diferencia en los valores de Ct entre el sistema RT-PCR de Q7-TAV y el sistema de la cepa C-TAV con incremento en el número de pases proporciona una fuerte prueba de una cantidad muy pequeña de revertientes después de gran cantidad de pases. En general, una diferencia entre los dos sistemas de valores de Ct de 14 representa una proporción de mutantes con respecto a revertientes de aproximadamente 1:8000, por lo que un valor de Ct de 10 representa una proporción de 1:1000.

Estudio con animales del 27/09 - Examen de la respuesta inmunitaria de los mutantes Riems B5/2-P6 e 116-P2 de la cepa C Se realizó inmunización intramuscular con 3 lechones, mediante la cual cada lechón recibió 2 mi de suspensión de virus (sobrenadante de cultivo celular). El grupo A se trató con B5/2, el grupo B se trató con 116 y el grupo de control se trató con la vacuna Riemser de la fiebre porcina. Estos estudios proporcionan un análisis de la respuesta inmunitaria después de inmunización, ensayo de las propiedades marcadoras de la vacunación después de la respuesta inmunitaria modificada (ELISA) y ensayo de las propiedades del virus en animales vacunados (propiedades de estabilidad y replicación genética) .

Una retrotitulación de los virus aplicados proporcionó los siguientes resultados: B5/2-P6: Titulación de virus 104'25 virus/ml I16-P2: Titulación de virus 104'75 virus/ml Tolerancia de los animales a la vacuna Los cerdos tratados no mostraron síntomas obvios después de inmunización (sin fiebre ni síntomas de enfermedad) . El número de leucocitos no aumentó por encima de lo normal durante los 7 primeros días después de la inmunización.

El virus no pudo aislarse de la sangre. Para el análisis de RT-PCR se usó aislado de ARN de las muestras de sangre 4 y 7 días después de la inmunización. Sin embargo el producto de la PCR no fue adecuado para una secuenciación posterior. Esto demuestra una tasa de replicación muy baja del virus en los animales .

Estudio con animales el 06/10 - Ensayo de las variantes de escape Q7, S10 y 011 La retrotitulación reveló las siguientes concentraciones de virus, que se usaron en los experimentos: Q7-P8 10 '°KID50/ml S10-P8 104'25KID50/ml 011-P7 10 '25KID50/ml cepa-C de la vacuna de la fiebre porcina 102'25KID5o/ml Después de la inmunización, no hubo cambios en la temperatura corporal ni se encontraron síntomas de enfermedad típicos de la fiebre porcina.

Análisis clínico después de infección por exposición La fiebre se definió como una temperatura corporal rectal de >40 °C durante al menos dos días sucesivos.

Se sometieron a ensayo 5 grupos: Grupo 1 (5 mutantes de las variantes Q7-P7 de la cepa C cerdos) (105'° KID50/ml) Grupo 2 (5 mutantes de las variantes S10-P8 de la cepa cerdos) C (105'° KID50/ml) Grupo 3 (5 mutantes de las variantes 011-P8 de la cepa cerdos) C (105,0 KID50/ml) Grupo 4 (3 Vacuna Riemser de la fiebre porcina (virus cerdos ) en bruto) Grupo 5 (3 grupo de control no inmunizado cerdos ) En el grupo 1, las mediciones de temperatura aumentaron esporádicamente entre el 3er y 13er día después de infección por exposición, lo que sin embargo no se relacionó con ninguna otra perturbación visible en la salud de los animales. Únicamente el animal n° 4 presentó fiebre durante 4 días .

El grupo 2 presentó aumentos esporádicos en la temperatura en 3 animales tratados, presentando el animal n° 9 altas temperaturas significativas.

En el grupo 3, solo el animal n° 14 presentó una temperatura corporal aumentada con fiebre 4 y 5 días después de infección por exposición.

Los animales del grupo 4 no presentaron fiebre, aunque en 2 animales tratados se midió un aumento de temperatura esporádico .

Todos los animales del grupo 5 presentaron fiebre entre los días 2° y 7° después de la infección. Debido a síntomas significativos de fiebre porcina todos los animales del grupo 5 se sacrificaron 7 días después de la infección. Los síntomas más comunes fueron efectos en el sistema nervioso central (paresia y ataxia en extremidades posteriores, diarrea, conjuntivitis y somnolencia) . Un animal presentó hematoma de la piel.

El virus no pudo aislarse de los animales inmunizados a partir de frotis nasales, por lo que los animales de control no vacunados presentaron resultado positivo 7 días después de la infección.

Resultados de la RT-PCR con muestras de suero Los resultados de la RT-PCR demostraron que 14 días después de la infección solamente podían obtenerse síntomas muy débiles de los animales inmunizados cuando se ensayaba para detectar la presencia de virus virulentos asociados con la enfermedad. Sin embargo, los animales de control no vacunados mostraron fuertes señales positivas con valores de Ct positivos de 30 o más bajos, 3 días después de la infección. Después de 7 días, los valores de Ct de los animales no vacunados disminuyeron a 17.

Resultados de la RT-PCR de frotis nasales Los resultados de la RT-PCR procedentes de animales inmunizados fueron exclusivamente negativos. Sin embargo, 7 días después de la infección, los animales de control no vacunados, mostraron una fuerte señal positiva con valores de Ct entre 25 y 28.

Ensayo de neutralización de virus con Alfort del VFPC El ensayo de neutralización de virus está relaciona con la determinación de si los animales (tanto vacunados como si no) presentan anticuerpos que son capaces de neutralizar virus virulentos. Todos los grupos inmunizados mostraron anticuerpos neutralizantes 21 días después de la inmunización. Siete (7) días después de la infección la titulación del ensayo de neutralización de virus contra Alfort fue de 640 ND50 o más, en todos los grupos inmunizados. Un animal en el grupo inmunizado con 011 y un animal en el grupo de control de la cepa C presentaron una titulación de 480. Los animales de control inmunizados no presentaron titulación de virus contra Alfort en el VNT .

Ensayo de neutralización de virus (VNT) con Rosrath del VFPC El ensayo de neutralización de virus VNT con la cepa Rosrath del VFPC, se muestra en la Figura 3, la cual se refiere a dicho ensayo, después de tres semanas de la inmunización todos los animales, con la excepción de un animal en el grupo S10 y un animal en el grupo 011, mostraron anticuerpos neutralizantes y siete días después de la infección, en donde los animales inmunizados mostraron una titulación de 640 o mayor en el VNT, (ensayo de neutralización de virus) . La titulación más baja fue de 320, mostrada por un animal dentro del grupo inmunizado con el TAV mutante . Los animales de control no inmunizados no presentaron titulación contra R6srath en el VNT.

Tres semanas después de la inmunización, todos los animales, con la excepción de un animal en el grupo S10 y un animal en el grupo 011, presentaron anticuerpos neutralizantes. Siete (7) días después de la infección los animales inmunizados mostraron en general una titulación de 640 o mayor en el VNT. La titulación más baja fue de 320, mostrada por un animal en el grupo inmunizado con el mutante TAV. Los animales de control inmunizados no presentaron titulación contra Rosrath en el VNT.

Ensayo ELISA para E2 (idexx) El ensayo ELISA para E2 es un kit de ensayo ELISA disponible en el mercado para someter a ensayo la presencia de la fiebre porcina clásica. Por término medio, 21 dias después de la inmunización, los animales inmunizados con la cepa C mostraron resultados positivos en el ensayo ELISA para E2. En el ensayo ELISA para E2 con idexx, los animales inmunizados con los mutantes TAV también presentaron resultados positivos 7 día después. El grupo de control no inmunizado no presentó anticuerpos detectables después de la infección .

La Figura 4, se refiere al ensayo ELISA É2 con Idexx con suero porcino, veintiún (21) días después de la inmunización, los animales inmunizados con la cepa C mostraron resultados positivos en el ELISA para E2 y siete (7) dias después de la infección en donde todos los animales inmunizados mostraron claramente resultados positivos en el ELISA. El grupo de control no inmunizado mostró anticuerpos no detectables después de infección.

En el ensayo ELISA para E2, los resultados para los mutantes TAV antes de la infección fueron positivos, aunque no fuertes, mientras que después de la infección los resultados se hicieron fuertemente positivos, lo que sugiere un fuerte efecto de revacunación. Los animales de control inmunizados con la cepa C fueron fuertemente positivos en ELISA E2 antes de la infección.

Los resultados de los animales inmunizados con los mutantes TAV son comparables con los de los animales inmunizados con el grupo de control inmunizado con la cepa C. El aislamiento de virus después de la infección fue negativo y los resultados de la RT-PCR fueron cuestionables o débilmente positivos, lo que también se demostró en el grupo de control inmunizado con la cepa C. Todos los animales presentaron altas titulaciones en el ensayo de neutralización de virus contra Alfort además de contra Rosrath. Todos los animales inmunizados presentaron protección completa contra la cepa Koslov del virus infeccioso cuatro semanas después de inmunización intramuscular.

Estudio con animales el 24/10 - Ensayo de las variantes de escape S10 y 011; protección después de inmunización oral Para someter a ensayo la eficacia de la aplicación oral, se realizó el siguiente estudio con animales. Se usaron 15 lechones como animales de ensayo, de 8-10 semanas de vida (aproximadamente 15-20 kg) .

Dosis de vacunación y diseño experimental: Grupo 1 (6 variante S10 de la cepa C mutantes A (105 cerdos): KIDso/ml) Grupo 2 (6 variante 011 de la cepa C mutantes B(104 cerdos) : KID50/ml) Grupo 3 (3 control infeccioso (no vacunado) cerdos ) : Grupo 1: Todos los animales de ese grupo estaban completamente protegidos antes de la infección por exposición. No se detectaron síntomas asociados con la enfermedad. Todos los animales mostraron anticuerpos neutralizantes, que fueron detectables mediante los ensayos VNT y ELISA.

Grupo 2: Los animales del Grupo 2 mostraron una mezcla de protección e infección. Dos (2) animales mostraron síntomas de la enfermedad, tal como fiebre alta y otros síntomas típicos de la fiebre porcina. Los animales afectados se sometieron a eutanasia. Los animales protegidos mostraron anticuerpos neutralizantes, que fueron detectables mediante los ensayos VNT y ELISA.

Grupo 3: Todos los animales se infectaron y mostraron síntomas de la enfermedad. Los animales afectados se sometieron a eutanasia.

El estudio de inmunización oral demuestra que la inmunización oral, especialmente usando el mutante S10, conduce a una protección eficaz frente a la infección. El aislado 011 también mostró resultados beneficiosos considerando que la dosis de vacunación se redujo en comparación con la del virus S10 administrado.

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Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Vacuna marcadora para el tratamiento profiláctico de la fiebre porcina clásica que comprende el virus vivo atenuado modificado de la fiebre porcina clásica, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos viral del epitope TAV de la proteina E2 comprende una secuencia diferente de la de un virus de tipo silvestre de la fiebre porcina clásica, por lo cual la secuencia de aminoácidos viral presenta al menos una de las siguientes sustituciones con referencia al virus "Riems" de la cepa C: - sustitución del aminoácido 830 por valina; - sustitución del aminoácido 833 por serina; - sustitución del aminoácido 839 por glicina.

2. La vacuna marcadora de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque el virus modificado no presenta secuencias de ácido nucleico recombinante.

3. La vacuna marcadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos viral presenta una o más de las siguientes sustituciones con referencia al virus "Riems" de la cepa C: - sustitución en la posición del nucleótido 2862 por T, - sustitución en la posición del nucleótido 2870 por T, - sustitución en la posición del nucleótido 2889 por G.

4. La vacuna marcadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos viral presenta una o más de las siguientes sustituciones con referencia al virus "Riems" de la cepa C: - en la proteina ERNS, sustitución del aminoácido 426 por valina, - en la proteina El, sustitución del aminoácido 576 por histidina, - en la proteína El, sustitución del aminoácido 583 por ácido glutámico, - en la proteína E2, sustitución del aminoácido 951 por isoleucina.

5. La vacuna marcadora de acuerdo con una cualquiera de las anteriores , caracterizada porque la secuencia de nucleótidos viral presenta una o más de las siguientes sustituciones con referencia al virus "Riems" de la cepa C: - sustitución en la posición del nucleótido 1649 por G, - sustitución en la posición del nucleótido 2099 por C, - sustitución en la posición del nucleótido 2122 por G, - sustitución en la posición del nucleótido 3225 por T.

6. La vacuna marcadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos viral del epítope TAV comprende la secuencia de acuerdo con la SEC ID N°: 3 o SEC ID N°: 4.

7. La vacuna marcadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos viral comprende la secuencia de acuerdo con la SEC ID N°: 1.

8. La vacuna marcadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque los sujetos tratados con la vacuna pueden diferenciarse de los sujetos infectados con el virus de la fiebre porcina asociado con la enfermedad mediante un análisis de muestras biológicas obtenidas de dichos sujetos usando procedimientos serológicos y/o genómicos analíticos.

9. La vacuna marcadora de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque el procedimiento genómico analítico se basa en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), preferentemente PCR en tiempo real, en la que se usan cebadores y/o sondas que reconocen la secuencia de nucleótidos viral asociada con la enfermedad y/o modificada.

10. La vacuna marcadora de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque el procedimiento serológico analítico se basa en un inmunoensayo enzimático (EIA) , preferentemente un ensayo inmunoabsorbente asociado a enzimas (ELISA) , en el que se usan anticuerpos que se unen específicamente al epítope TAV asociado con la enfermedad y/o modificado.

11. La vacuna marcadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que puede obtenerse por generación de variantes de escape virales de cepas virales de la fiebre porcina asociadas con la enfermedad u otras conocidas mediante la aplicación de presión de anticuerpos.

12. Procedimiento de preparación de una acuna del virus vivo atenuado modificado de la fiebre porcina clásica, preferentemente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 que comprende la generación de variantes de escape de cepas virales de la fiebre porcina asociadas con la enfermedad u otras conocidas mediante la aplicación de presión de anticuerpos.

13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizado porque el procedimiento comprende: - la realización de pases múltiples de células, preferentemente células renales embrionarias de lechón, infectadas con el virus de la fiebre porcina asociado con la enfermedad en cultivo celular, y - la aplicación simultánea de anticuerpos dirigidos contra el epitope TAV de la proteina E2 del virus de la fiebre porcina asociado con la enfermedad y/o suero policlonal de conejo inmunizado con el péptido CTAVSPTTLRTEWK .

14. Composición farmacéutica que comprende la vacuna marcadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 con un vehículo farmacéuticamente aceptable .

15. Vacuna marcadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso como un medicamento en el tratamiento profiláctico (vacunación) , preferentemente mediante inyección intramuscular o aplicación oral, de la fiebre porcina clásica.

16. Procedimiento para el tratamiento profiláctico (vacunación) de la fiebre porcina clásica que comprende administrar a un sujeto, preferentemente a un cerdo, la vacuna marcadora de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, preferentemente mediante inyección intramuscular o aplicación oral. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una vacuna marcadora para el tratamiento profiláctico de la fiebre porcina clásica que comprende el virus vivo modificado atenuado de la fiebre porcina clásica. La secuencia viral de aminoácidos del epitope TAV de la proteina E2 comprende una secuencia diferente de la de un virus de tipo silvestre de la fiebre porcina clásica. La invención se refiere a composiciones farmacéuticas de la vacuna marcadora. La invención también se refiere a un procedimiento para fabricar las vacunas marcadoras para la prevención de la fiebre porcina clásica usando presión selectiva de anticuerpos.