CN117417903A - 一种寨卡病毒减毒株及其在制备寨卡病毒疫苗中的应用 - Google Patents

一种寨卡病毒减毒株及其在制备寨卡病毒疫苗中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117417903A
CN117417903A CN202311405950.8A CN202311405950A CN117417903A CN 117417903 A CN117417903 A CN 117417903A CN 202311405950 A CN202311405950 A CN 202311405950A CN 117417903 A CN117417903 A CN 117417903A
Authority
CN
China
Prior art keywords
recombinant
zika virus
virus
cdna
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311405950.8A
Other languages
English (en)
Inventor
高福
宋豪
李世华
许晓莹
施一
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Microbiology of CAS
Original Assignee
Institute of Microbiology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Microbiology of CAS filed Critical Institute of Microbiology of CAS
Priority to CN202311405950.8A priority Critical patent/CN117417903A/zh
Publication of CN117417903A publication Critical patent/CN117417903A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/24162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering

Abstract

本发明提供一种重组寨卡病毒减毒株、其相关产品及其在制备寨卡病毒疫苗中的应用。所述重组寨卡病毒减毒株相比于野生型寨卡病毒至少包括非结构蛋白1中第123位苯丙氨酸的突变(例如，F123A)；与野生型病毒相比，其毒力大大降低，可诱导针对寨卡病毒的、高水平的体液及细胞免疫反应，能够保护实验动物免受致死剂量的寨卡病毒的攻击，并且，其具有较好的遗传稳定性，回复为野生型病毒的可能性极低，其携带的病毒基因组无整合到宿主细胞基因组中的风险，因此，本发明的重组寨卡病毒减毒株作为减毒活疫苗用于预防寨卡病毒感染具有极好的应用前景。

Description

一种寨卡病毒减毒株及其在制备寨卡病毒疫苗中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种寨卡病毒减毒株、其相关产品及其在制备寨卡病毒疫苗中的应用。
背景技术
寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)属于黄病毒科，黄病毒属，主要通过伊蚊叮咬进行传播，另外有研究表明其也可以通过性接触方式进行传播。寨卡病毒的基因组是长度约为11kb单股正链RNA，包括5′和3′的非编码区及单一开放读码框，该读码框编码3种结构蛋白：衣壳蛋白(C)、膜蛋白前体/膜蛋白(PrM/M)和包膜糖蛋白(E)及7种非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。
寨卡病毒病是由寨卡病毒感染引起的一种急性自限性疾病，感染者中只有20％会有轻微症状，临床表现一般为轻微的发热，皮疹、结膜炎、肌肉和关节疼痛、不适或头痛，症状通常持续2-7天，因此起初并未引起人们的足够重视。然而，寨卡病毒感染孕妇可能会导致胎儿异常及新生儿小头症(Microcephaly)(Lucchese and Kanduc,2016；Mlakar etal.,2016)。此外，孕妇感染寨卡病毒可导致婴儿出生时患有小头畸形和其他先天性畸形，称为先天性寨卡综合征。寨卡病毒感染还与其他妊娠并发症有关，包括早产和流产。此外，研究显示，成人感染寨卡病毒可能会导致神经系统疾病格林-巴利综合征。寨卡疫情持续扩大，根据WHO公布的最新数据，截至2017年3月10日，有84个国家或地区发生蚊媒传播的寨卡病毒感染，31个国家或地区存在与寨卡病毒感染相关的新生儿小头畸形，23个国家或地区存在与寨卡病毒感染相关的GBS病例数增加。寨卡病毒的迅速扩散以及引起新生儿小头症引起国际社会的广泛关注。虽然现阶段寨卡病毒的流行势头变弱，但是依然有再次爆发的可能性。然而目前，针对寨卡病毒尚无批准的有效疫苗和治疗手段。
疫苗是行之有效的针对病毒性传染病的预防手段。为了防控寨卡病毒，在过去的几年间，全世界不同国家地区的研究者开发了多种不同类型的寨卡病毒候选疫苗，包括核酸疫苗(DNA/RNA)、亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗、病毒载体疫苗、灭活疫苗以及减毒活疫苗。
相比其他类型疫苗，减毒活疫苗具有单剂量、快速免疫和持久保护的优势。例如，黄热病17D减毒活疫苗(YF17D)是有史以来最出色的人类疫苗之一，它可以诱导广泛的先天性体液和细胞介导的免疫反应，单次接种疫苗后可能产生终身保护。再如，减毒乙型脑炎病毒SA14-14-2是一种有良好的安全性和显着的疗效。然而，它们都是通过将亲本病毒连续传代到细胞或动物中进行减毒而凭经验开发的，具有耗时长、不确定性以及减毒机制不清晰等缺陷。如今，基于分子病毒学的发展和对病毒发病机制的了解，可以通过对病毒基因组的人工操作，例如通过在病毒基因组中引入突变或缺失来合理设计减毒活病毒。本领域急需开发一种能够切实有效地预防寨卡病毒感染的寨卡病毒减毒活疫苗，以应对未来可能的寨卡病毒感染。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
发明目的
针对上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种重组寨卡病毒减毒株、其相关产品及其在制备用于预防和/或治疗寨卡病毒感染的药物(特别是疫苗)中的应用。
解决方案
为实现本发明目的，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种重组寨卡病毒减毒株，所述重组寨卡病毒减毒株相比于Genebank登录号为KU963796的野生型寨卡病毒(其基因组RNA所对应的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)至少包括以下非同义突变：非结构蛋白1(NS1)中第123位的苯丙氨酸突变为丙氨酸或其它非极性氨基酸。
作为优选，所述重组寨卡病毒减毒株相比于Genebank登录号为KU963796的野生型寨卡病毒具有以下突变：非结构蛋白1中第123位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；
进一步优选地，所述重组寨卡病毒减毒株的基因组RNA所对应的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
所述重组寨卡病毒减毒株可通过以下方法获得：
通过本领域技术人员所熟知的反向遗传学操作技术，基于Genebank序列号为KU963796的野生型寨卡病毒的全长感染性克隆，向其中引入有关突变(例如，导致NS1蛋白中第123位的苯丙氨酸突变为丙氨酸的核苷酸突变)，通过体外转录以及RNA细胞转染，并最终获得重组突变病毒。
第二方面，本发明提供了一种重组寨卡病毒cDNA，所述重组寨卡病毒cDNA为Genebank登录号为KU963796的野生型寨卡病毒的基因组RNA所对应的cDNA且在其上引入突变，使得所编码蛋白中至少包括以下非同义突变：非结构蛋白1中第123位的苯丙氨酸突变为丙氨酸或其它非极性氨基酸。
作为优选，所述重组寨卡病毒cDNA为Genebank登录号为KU963796的野生型寨卡病毒的基因组RNA所对应的cDNA且在其上引入突变，使得所编码的非结构蛋白1中第123位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；
进一步优选地，所述重组寨卡病毒cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
第三方面，本发明提供了一种重组寨卡病毒表达蛋白，其为如权利要求1或2所述的重组寨卡病毒减毒株所表达的蛋白，或者，其为如权利要求3或4所述的重组寨卡病毒cDNA所翻译的蛋白。
第四方面，本发明提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体包含如上述第二方面所述的重组寨卡病毒cDNA，以及任选地，与之可操作地连接的至少一个表达调控元件。
第五方面，本发明提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体插入有可用于表达如上述第三方面所述的重组寨卡病毒表达蛋白的基因，或者，所述重组表达载体插入有如上述第二方面所述的重组寨卡病毒cDNA。
第六方面，本发明提供了一种宿主细胞，其中转化或转染有如上述第二方面所述的重组寨卡病毒cDNA、如上述第四方面所述的核酸构建体或如上述第五方面所述的重组表达载体。
第七方面，本发明提供了一种重组寨卡病毒疫苗，所述疫苗的活性成分包括：如上述第一方面所述的重组寨卡病毒减毒株，或者如上述第二方面所述的重组寨卡病毒cDNA，或者如上述第三方面所述的重组寨卡病毒表达蛋白，或者如上述第四方面所述的核酸构建体，或者如上述第五方面所述的重组表达载体，或者如上述第六方面所述的宿主细胞。
第八方面，本发明提供了如上述第一方面所述的重组寨卡病毒减毒株，或者如上述第二方面所述的重组寨卡病毒cDNA，或者如上述第三方面所述的重组寨卡病毒表达蛋白，或者如上述第四方面所述的核酸构建体，或者如上述第五方面所述的重组表达载体，或者如上述第六方面所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗寨卡病毒感染的药物中的应用；
优选地，所述药物为疫苗，进一步优选为减毒活疫苗；
进一步优选地，所述疫苗为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
更进一步优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
更进一步优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂；
更进一步优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。
第九方面，本发明提供了一种制备寨卡病毒减毒活疫苗的方法，所述方法包括：
通过本领域技术人员所熟知的反向遗传学操作技术，基于Genebank序列号为KU963796的野生型寨卡病毒的全长感染性克隆，向其中引入有关突变(例如，导致NS1蛋白中第123位的苯丙氨酸突变为丙氨酸的核苷酸突变)，通过体外转录以及RNA细胞转染，并最终获得重组突变病毒。
第十方面，本发明提供了一种预防和/或治疗寨卡病毒感染所致疾病的方法，其包括：向有此需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的如上述第一方面所述的重组寨卡病毒减毒株，或者如上述第二方面所述的重组寨卡病毒cDNA，或者如上述第三方面所述的重组寨卡病毒表达蛋白，或者如上述第四方面所述的核酸构建体，或者如上述第五方面所述的重组表达载体，或者如上述第六方面所述的宿主细胞，或者如上述第七方面所述的重组寨卡病毒疫苗。
所述“预防和/或治疗有效量”可根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。
有益效果
本申请的发明人通过将野生型寨卡病毒的NS1蛋白的第123位的苯丙氨酸进行非同义突变(例如，突变为丙氨酸)，构建了一种重组寨卡病毒减毒株。所述重组寨卡病毒减毒株具有如下优势效果：
(1)减毒充分；相比野生型病毒，其毒力大大降低，因此，具有极高的安全性；
(2)特征稳定，遗传稳定性好，因此，回复为野生型病毒的可能性极低；
(3)只在细胞质中复制(即，RNA病毒基因组的复制、病毒的组装、成熟释放等过程均在细胞质中进行)，其携带的病毒基因组无整合到宿主细胞基因组中的危险；
(4)其能诱导产生针对寨卡病毒的特异性的、高水平的体液及细胞免疫反应；
(5)能够在动物模型中保护动物免受致死剂量的外源寨卡病毒的攻击。
鉴于上述，本发明的重组寨卡病毒减毒株作为寨卡减毒活疫苗用于预防寨卡病毒感染具有良好的应用前景。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1为本发明实施例1中记载的一系列寨卡病毒突变株的构建示意图。
图2显示如本发明实施例2中所检测的、各寨卡病毒突变株的空斑试验结果。
图3显示如本发明实施例3中所检测的、各寨卡病毒突变株在Vero细胞中的一步生长曲线。
图4显示如本发明实施例4中所记载的、各寨卡病毒突变株在转染Vero细胞后第72h、96h时转染细胞中病毒E蛋白的IFA检测结果。
图5显示如本发明实施例5中所检测的、各寨卡病毒突变株对干扰素的敏感性测定结果；其中，横坐标显示的是IFN-β的处理浓度，纵坐标显示的是Vero细胞的感染率(％)。
图6显示如本发明实施例6中所检测的、各寨卡病毒突变株在感染A129小鼠后小鼠的体重变化曲线(A)和生存率曲线(B)；A、B图中，横坐标显示的是感染后天数，纵坐标分别显示了小鼠的体重百分比(％，即后续体重与原始体重的比率)和存活百分比(％)。
图7显示如本发明实施例6中所记载的、寨卡F123A突变病毒在A129小鼠中的毒力检测结果；其中，A图为F123A突变病毒感染A129小鼠后第3天、第6天血清中的病毒滴度，B图为F123A突变病毒感染A129小鼠后第6天肝、脾、肺、肾、脑和睾丸组织中的病毒滴度。
图8显示如本发明实施例7中所记载的、寨卡F123A突变病毒在小鼠中诱导的血清中和抗体水平。
图9显示如本发明实施例7中所记载的、寨卡F123A突变病毒在小鼠中诱导的细胞免疫反应水平。
图10显示如本发明实施例8中所记载的、寨卡F123A突变病毒在小鼠中的免疫保护性。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1.重组寨卡病毒突变株的构建与鉴定
本实施例以Genebank登录号为KU963796的野生型寨卡病毒毒株ZIKV WIV01的全长感染性克隆为基础，构建了NS1-Y122A突变、NS1-F123A突变、NS1-V124A突变、NS1-Y122A/F123A/V124A突变(下文简称NS1-AAA)、NS1-Y122G/F123G/V124G突变(下文简称NS1-GGG)的寨卡病毒突变株，并对其进行鉴定；各寨卡病毒突变株的构建示意图如图1所示。
其中，野生型寨卡病毒WIV01毒株的基因组RNA对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，SEQ ID NO:1中：自5′端第1位-107位为5′UTR；第108-473位为衣壳蛋白C的编码基因(C)；第474-2489位为prM-E蛋白的编码基因(prM-E)；第2490位-3545位为非结构蛋白NS1的编码基因(NS1)；第3546-4613位为非结构蛋白NS2的编码基因(NS2)；第4614-6464为非结构蛋白NS3的编码基因(NS3)；第6465-7667位为非结构蛋白NS4的编码基因(NS4)；第7668-10379位为非结构蛋白NS5的编码基因(NS5)；第10380-10808位为3′UTR。
为构建上述寨卡病毒突变株，首先，构建寨卡病毒ZIKV WIV01的全长感染性克隆pACYC177-ZIKV；然后，基于该克隆，构建含上述点突变的寨卡病毒突变株的全长感染性cDNA克隆；具体步骤如下：
1、寨卡病毒全长感染性克隆pACYC177-ZIKV的构建
通过基因合成的方式，合成ZIKV病毒WIV01株的全基因组cDNA，然后插入到pACYC177载体(北京庄盟国际生物基因科技有限公司，货号ZK119)中，获得感染性克隆pACYC177-ZIKV。
2、寨卡病毒F123A等点突变病毒的构建与鉴定
2.1对pACYC177-ZIKV上NS1的122-124位氨基酸进行了定点突变，最终获得ZIKV-NS1-Y122A、ZIKV-NS1-F123A、ZIKV-NS1-V124A、ZIKV-NS1-AAA和ZIKV-NS1-GGG突变病毒。具体实验步骤如下：
①克隆构建：
以ZIKV-WT表达质粒pACYC177-ZIKV为模板，通过融合PCR将NS1突变位点引入；融合PCR中，首先以以下引物扩增出A、B片段：
A片段：
P1：ZIKV-E-1465-F CGAGGTTACGCCTAATTCACC(SEQ ID NO:3)
P2：突变位点下游引物(见以下表1)；
B片段：
P3：突变位点上游引物(见以下表1)；
P4：ZIKV-NS2A-3867-R GCCAGCAGCATGCTTTCACG(SEQ ID NO:4)
表1、突变位点上、下游引物
然后，以回收获得的A片段和B片段作为模板，进行最后一轮融合PCR：分别以P1和P4为上、下游引物，通过PCR得到全长融合片段；所得融合PCR片段与pACYC177-ZIKV质粒均用EcoR I/Pml I双酶切，之后连接、转化大肠杆菌，次日提取质粒鉴定并进行测序。
②感染性转录体制备：
a.通过XhoI酶切，将上述测序正确的病毒突变株质粒进行线性化；
b.通过酚氯仿抽提，纯化上述线性化的病毒突变株质粒；
c.使用体外转录试剂盒进行体外转录，得到相应的病毒RNA转录体。
③RNA转染细胞以拯救病毒
转染前一天，将约2.5×104个Vero细胞接种于35mm培养皿；次日，待细胞汇合度为70％～90％时，进行RNA转染。具体地，取1μg上述体外转录的RNA转染Vero细胞，待出现细胞病变效应(CPE)时，收取上清中的病毒。结果显示，构建的一系列突变株中，只有ZIKV-NS1-Y122A、ZIKV-NS1-F123A、ZIKV-NS1-V124A三个病毒突变株转染的细胞出现了CPE，而ZIKV-NS1-AAA和ZIKV-NS1-GGG突变株并未出现CPE。然后，将细胞上清病毒分装，之后冻于-80℃保存。
由上述结果可知，基于ZIKV病毒的全长感染性克隆，成功构建并拯救了三株突变株，分别为ZIKV-NS1-Y122A、ZIKV-NS1-F123A、ZIKV-NS1-V124A；而ZIKV-NS1-AAA和ZIKV-NS1-GGG未拯救成功，说明：三点同时突变对病毒具有致死效应。
2.2寨卡病毒点突变拯救病毒的RNA检测
通过如下步骤，检测拯救获得的点突变病毒的RNA序列是否与预期得到的病毒人工序列一致：
1、寨卡点突变病毒全长cDNA的制备
用RNeasy mini kit提取寨卡突变病毒种子液的病毒RNA，并制备其cDNA。
2、点突变拯救病毒RNA中NS1序列的检测
以点突变拯救病毒cDNA为模板，扩增ZIKV-NS1-Y122A、ZIKV-NS1-F123A、ZIKV-NS1-V124A点突变病毒的NS1非结构蛋白编码区段，并对目的片段进行测序。扩增结果显示，扩增出了与预期大小一致的特异性片段；测序结果表明：拯救病毒ZIKV-NS1-Y122A的第2853-2855位的核苷酸由TAC突变为GCT；ZIKV-NS1-F123A的第2856-2858位的核苷酸由TTC突变为GCA；ZIKV-NS1-V124A第2859-2861位的核苷酸由GTC突变为GCT，与预期一致。
上述结果表明，寨卡病毒NS1-Y122A，F123A和V124A点突变拯救病毒的RNA序列与预期一致。
实施例2.重组寨卡病毒突变株的空斑形态特征
为了观察点突变病毒的空斑形态特征，本实施例中，将寨卡点突变病毒Y122A、F123A、V124A分别以10倍进行倍比稀释，获得10-1、10-2、10-3、10-4，10-5、10-6和10-7的稀释度；将各病毒稀释液以500μl/孔接种于铺于6孔板的单层BHK-21细胞；吸附1-2h后，弃去病毒液，添加含有DMEM培养基(2％ FBS)的1％的琼脂盖，室温凝固之后，置于37℃、5％ CO2的孵箱中培养。3天后，用4％的甲醛室温固定1h，弃琼脂盖，每孔加入2ml 0.5％的结晶紫染色液染色30min。观察空斑形态，并计算空斑形成单位(PFU)。与此同时，以相同方法对寨卡病毒野生型的空斑进行测定和分析。
空斑试验结果如图2所示；图2结果显示，寨卡病毒亲本野生型形成的空斑较大，而Y122A，F123A和V124A点突变病毒形成的空斑较小，其中尤以F123A突变病毒的空斑最小而且较为模糊。上述结果表明，点突变病毒Y122A，F123A和V124A的空斑直径明显小于寨卡病毒亲本株，因此其具有显著的小斑特征，表明其对细胞的侵染能力变弱，有利于作为减毒活疫苗使用。
实施例3.重组寨卡病毒突变株在哺乳动物细胞中的复制动力学
为了观察寨卡病毒突变株在哺乳动物细胞系中的增殖特征，本实施例中，分别将寨卡突变病毒和野生亲本株病毒均以MOI＝0.01接种至24孔板中的Vero细胞(购自ATCC，产品目录号为CCL-81)，然后，置于37℃、5％ CO2的培养箱中吸附1h后，弃去病毒液，补加2％FBS的DMEM，置于37℃、5％ CO2的培养箱培养。于接种后第24、48、72和96h，收取细胞上清液，用空斑滴定法测定病毒滴度，绘制一步生长曲线。
一步生长曲线的结果如图3所示，其显示，Y122A和F123A突变病毒在Vero细胞系中的复制能力均弱于亲本强毒株，但V124A增殖特性与野生型相近；这表明：点突变病毒Y122A和F123A可在Vero细胞系中有效复制，但是复制效率略低于野生亲本株，从而有利于作为减毒活疫苗使用。
实施例4.重组寨卡病毒突变株转染细胞中病毒蛋白的表达检测
为了检测不同病毒突变株在细胞中的病毒E蛋白表达随时间的变化，本实施例中，利用间接免疫荧光实验(IFA)，检测病毒E蛋白在转染细胞中的表达情况。
具体程序如下：在Vero细胞传代的细胞培养皿中同时加入1cm2盖玻片(一个35mm细胞培养皿可以放置4张盖玻片)，使得部分细胞贴壁生长在玻片上；次日，待细胞汇合度为70％-90％时开始实验。具体地，使用等量的病毒RNA转染细胞，按时间点(24h、48h、72h、96h、120h)收取盖玻片，用于IFA实验。IFA实验步骤如下：
①用-20℃保存的丙酮固定玻片15min。
②PBST洗3遍，每次洗5min。
③用含1％ BSA的PBST作为封闭液，封闭1h。
④孵育一抗，一抗为抗ZIKV E蛋白的鼠抗4G2，孵育1h。
⑤PBST洗3遍，每次洗5min。
⑥孵育二抗，二抗为FITC山羊抗鼠IgG，孵育1h。
⑦PBST洗3遍，每次洗5min。
IFA实验结果如图4所示；根据图4，在同一时间点，V124A转染的Vero细胞中E蛋白的表达情况与野生型亲本株的相当，而Y122A和F123A转染的Vero细胞中E蛋白的表达比野生型亲本株低。这表明：Y122A和F123A突变病毒在细胞中增殖和感染较慢。
实施例5.重组寨卡病毒突变株对干扰素的敏感性测定
干扰素在同种细胞中具有广谱抗病毒作用，通过细胞表面受体使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制多种病毒的复制。干扰素还可以促进NK细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞的活性，从而发挥免疫调节的作用，增强人体抗病毒的能力。重组突变株如果对干扰素更加敏感的话，可以使其在体内的减毒效果更加明显，也更加安全。因此，本实施例检测了本申请重组寨卡病毒突变株对干扰素的敏感性。
通过以下步骤，测定上述重组寨卡病毒突变株对干扰素的敏感性：
将Vero细胞接种于24孔细胞板中，待其长至单层，分别用寨卡病毒野生型和F123A点突变病毒感染VERO细胞，感染系数为0.01。将培养板在37℃孵箱孵育1h，然后除去病毒上清，用PBS洗三次，然后分别加入不同剂量(0.005,0.01,0.05ng/ml)of IFN-β(Sigma,USA)，继续置于37℃孵箱孵育48h。收集细胞上清后用蚀斑测定法测定上清液中的病毒滴度。
结果如图5所示；图5显示，在0.005,0.01,0.05ng/ml的IFN-β处理下，干扰素对F123A病毒的抑制率均高于寨卡病毒野生型毒株，具有统计学差异。这说明：相比野生型病毒，F123A突变病毒对干扰素更加敏感，使其更适于作为减毒活疫苗。
实施例6.重组寨卡病毒突变株在A129小鼠中的毒力测定
本实施例中，使用的动物模型为Ⅰ型干扰素受体缺陷鼠(即Ifnar1-/-鼠，购自中国疾病预防控制中心动物中心)，小鼠为3周龄左右；将待测病毒的滴度稀释为2×104PFU/ml，每只小鼠攻毒200μl，即，感染剂量为4000PFU/只，感染途径为腹腔注射。每组有5只小鼠，记录每只小鼠的原始体重。攻毒之后每天监测小鼠的体重变化以及生存率，并绘制体重变化曲线和生存率曲线，结果如图6A(体重变化曲线)和6B(生存率曲线)所示。此外，死亡的小鼠立刻取脑、肝、脾以及肾组织提取RNA测序，未死亡的小鼠攻毒16天之后处死。
图6A和6B的结果显示：在攻毒第五天之后，WT组和V124A组小鼠体重开始下降；攻毒后第七天，WT组小鼠有3只死亡，第八天时小鼠全部死亡；与此类似，V124A组小鼠攻毒后第七天有2只死亡，第八天时全部死亡；Y122A组的小鼠在攻毒后第七天体重开始下降，第十天和第十一天时各死了一只小鼠，剩余的3只小鼠则存活了下来；相比之下，F123A组小鼠并未出现任何体重下降以及死亡等现象。
这些数据表明，在NS1“spike”三个氨基酸中，ZIKV NS1 F123位点对于病毒的复制具有最重要的作用，当该位点突变之后，病毒几乎完全失去了毒力。Y122位点也在病毒的复制过程中具有一定的作用，虽然该组有2只小鼠死亡，但剩余3只均存活，这说明与WT组以及V124组相比，Y122A突变之后，病毒毒力在一定程度上也有所减弱。
为了进一步检测F123A突变病毒在Ifnar1-/-小鼠中的毒力，接下来，分别用4000PFU的WT和F123A突变病毒腹腔注射感染3周龄Ifnar1-/-小鼠，每组有5只小鼠；分别在感染后第3天和第6天取血，血液于4℃静置3h后，离心收取血清，用空斑法测定血清中的病毒滴度结果如图7A所示；在感染后第6天取肝、脾、肺、肾、脑和睾丸组织，将组织研磨均质化后，用空斑法检测病毒滴度，结果如图7B所示。上述空斑法检测病毒滴度的检测程序同实施例2中的空斑形态检测程序，二者的区别在于实施例2中观察的是空斑大小，此处观察的是空斑数目。
图7A和7B的结果显示，在病毒感染后第3天、第6天，WT感染小鼠的血清中可以检测到较高滴度的病毒(即，产生了“病毒血症”)，而F123A感染的小鼠血清中仅检测到极低量的病毒，即，没有产生病毒血症；另外，WT感染小鼠的脏器中可以检测到较高的病毒滴度，而F123A突变株感染的小鼠各脏器中均没有检测到病毒。
这些结果表明，F123A点突变病毒在A129小鼠中高度减毒。
实施例7.重组寨卡病毒突变株在小鼠中的免疫原性测定
本实施例中，选用免疫缺陷鼠Ifnar1-/-小鼠作为ZIKV的感染模型，通过以下步骤，评价F123A点突变病毒株在Ifnar1-/-小鼠中的免疫原性。
1)寨卡病毒F123A突变病毒经腹部皮下注射免疫Ifnar1-/-小鼠
首先，使用103PFU的突变病毒皮下接种4周龄雌性Ifnar1-/-小鼠(购自中国疾病预防控制中心实验动物中心)，每组5只小鼠，同时，以PBS注射作为阴性对照。分别于免疫后第14天和28天尾静脉取血。将血液于4℃静置3h后离心以收取血清，将收取的血清于56℃灭活30min，-20℃冻存待用。
2)免疫小鼠血清中，寨卡病毒特异性中和抗体效价的测定
采用微量中和实验方法测定免疫小鼠血清中的中和抗体效价。方法如下：
将Vero细胞提前一天铺96孔板，1个15cm盘的细胞长满可以铺6个左右96孔板，第二天长满；使用圆底96孔板，用1％ FBS的DMEM稀释血清，从10倍开始按照3倍梯度稀释；病毒也用1％ FBS的DMEM稀释10000倍，将75μl的前述稀释血清与75μl的前述稀释病毒混匀，置于37℃孵育2小时。病毒量的使用需要考虑到PFU，一般是每个孔最终加入100PFU。同时，设置对照，MOCK组是不感染病毒的对照(不加血清也不加病毒)，NC组是感染病毒的对照(加等量病毒但不加血清)。细胞移除培养基，不需要用PBS洗，直接加入150μl病毒-血清混合物或相应的对照，培养2-3h后补加60μl 10％ FBSDMEM。细胞在培养箱中培养4天。
在需要染色的前一天，将纯的甲醇和乙醇在-20℃预冷。在上述培养4天后，将细胞从培养箱取出，弃去所有上清，用PBS洗一遍，加入150μl的甲醇和乙醇1:1混合物进行固定，置于-20℃冰箱15-20分钟，之后用PBS洗2遍。使用PBS配置的5％脱脂牛奶(封闭液)进行封闭，室温封闭30分钟，之后不用洗，直接加入一抗。一抗采用抗ZIKV的Z6抗体(如CN106589116 B中所记载的)，使用封闭液将其稀释到4μg/mL工作浓度，注意将抗体充分稀释混匀，加入一抗后室温孵育2小时。之后，用PBST洗3遍，加入二抗。二抗采用偶联HRP的羊抗人抗体(购自Solarbio，货号为SE101)，用封闭液将其稀释1500倍，加入二抗后室温孵育1.5小时，之后用PBST洗4遍。加TMB显色液50μl，室温孵育，反应时间约20分钟，观察颜色变化，加入50μl 2M盐酸终止反应，在酶标仪上读取OD450吸光度。使用GraphPad Prism软件对数据进行非线性拟合，计算中和50％的细胞感染时相应的血清稀释倍数，即为中和滴度值(MN50)。当最低稀释倍数(检测限)的血清仍无法中和50％的细胞感染时，定义该样品的MN50为检测限的一半。
结果如图8所示；图8显示，F123A突变病毒免疫能诱发小鼠产生效价大于1：10000的中和抗体；此外，高水平的中和抗体能维持4周以上。
上述数据表明，F123A点突变病毒能有效诱发小鼠产生高水平的、针对寨卡病毒的特异性中和抗体。
3)F123A突变病毒诱导小鼠产生的T细胞免疫反应
按上述程序免疫小鼠后第4周，取小鼠脾脏，放置于预冷的1640培养基中。把40μm筛网放在50ml离心管上，使用5ml注射器推头研磨脾脏，然后向研磨物中加入1640培养基使细胞通过40μm筛网滴进50ml管中，以过滤掉杂质及大的细胞团。把所有细胞转移到15ml离心管中，室温2000rpm离心收集细胞，再加入12ml的1640培养基洗一遍，再次离心收集细胞。加入4ml的红细胞裂解液，悬浮室温放置5-10分钟，再加入8ml的1640培养基，离心收集细胞；加入12ml 1640培养基洗一遍，再次离心收集细胞。向细胞中加入10ml的1640培养基以悬浮细胞，使用计数板计算细胞总数。再次离心收集细胞，向细胞中加入一定体积的10％FSB的1640培养基，使细胞浓度为1×107个细胞/ml。
然后，用流式细胞仪检测小鼠脾细胞中针对ZIKV病毒的特异性T细胞：在圆底96孔板中，每孔加入1×106个小鼠脾脏细胞，然后加入浓度为2μg/ml寨卡病毒E蛋白肽库或者全肽库(肽库设计主要使用IEDB(Immune Epitope Database)生物信息学工具预测，筛选目标为寨卡病毒E蛋白或全长编码区蛋白中可以结合Ⅰ类主要组织相容性复合体(MHC Class I)H2-Kb和H2-Db、长度为8-9mer的多肽，筛选出的每个MHC的多肽列表，以一致性百分比排名从低到高排序，阈值为0.8；肽库合成由北京中科亚光生物科技有限公司完成)刺激细胞，不加任何刺激物的组为阴性对照组；刺激4小时后，加入GolgiStop(购自GB公司，货号554715)，接着在细胞培养箱中孵育14小时；然后离心以收集细胞，进行APC-Cy7-CD8抗体(购自BD公司)染色，然后细胞经过固定和通透，再用APC标记的IFN-γ抗体进行染色。其中操作步骤完全按照BD公司Cytofix/CytopermTMFixation/Permeabilization Kit说明书操作；之后，在FACSCanton流式细胞仪上检测细胞荧光。我们利用流式细胞仪分析，来检测脾脏细胞在多肽库的刺激下分泌γ干扰素(IFN-γ)的能力，以此来评价重组突变病毒诱导小鼠细胞免疫反应的强度，结果如图9B所示，在F1233A免疫的小鼠脾脏细胞，在经过检病毒E蛋白多肽以及全肽的刺激下，可以产生大量的CD8+IFN-γ+T细胞，但是Sham对照组中则没有产生CD8+IFN-γ+T细胞。
MHC四聚体检测技术是在单细胞水平上标记目标T细胞，并通过流式细胞术对细胞进行分析，是一种快速、简便的检测抗原特异性T细胞(antigen-specific T cells)的定性及定量分析方法。我们利用该方法进一步检测ZIKV的特异性T细胞。步骤如下：在圆底96孔板中，每孔加入1×106个小鼠脾脏细胞；使用来源于ZIKV的E蛋白的E294–302(IGVSNRDFV)多肽制备的H-2b限制性的四聚体(北京孚博生物科技有限公司)，对小鼠脾脏细胞进行染色，染色的操作步骤完全按照BD公司Cytofix/CytopermTMFixation/Permeabilization Kit说明书操作；之后，在FACSCanton流式细胞仪上检测细胞荧光。结果如图9A所示，在F1233A免疫的小鼠中可以检测到大量的CD8+E294–302四聚体+T细胞，但是Sham对照组中则没有产生这种T细胞，表明：F1233A免疫小鼠产生了针对病毒抗原MHC四聚体的特异性的T细胞反应。
由图9可以看出，ZIKV的全肽库、E多肽库都能刺激F123A突变病毒免疫小鼠的T细胞分泌IFN-γ，其与PBS免疫对照组具有显著性差异。此外，ZIKV E294–302四聚体也可以诱导特异性的CD8+T细胞反应。
实施例8.重组寨卡病毒突变株对小鼠免受寨卡病毒感染的免疫保护性测定
本实施例中，通过以下步骤，评价F123A点突变病毒对于小鼠免受寨卡病毒感染的免疫保护性。
用寨卡病毒F123A点突变病毒对Ifnar1-/-小鼠(雌性，4周龄，购自中国疾病预防控制中心实验动物中心)进行免疫后4周，分别用完全致死剂量5×106PFU(其由预实验确定)的寨卡病毒流行株SMGC-1(本实验室保存)腹腔感染小鼠，然后对F123A点突变病毒的免疫保护性进行评价。对照组为PBS免疫的小鼠，攻毒剂量与实验组相同。攻毒后每日观察小鼠的存活状况。
结果如图10所示；图10显示：PBS免疫组的小鼠分别在感染后9天内全部死亡，而点突变病毒免疫组的小鼠在感染后第21天依然全部存活，保护率为100％。同时，F123A免疫组小鼠与对照组相比，体重也没有显著下降。这表明，该重组突变病毒免疫小鼠可以对小鼠针对野生型寨卡病毒提供完全的保护，该突变病毒具有良好的免疫保护性。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种重组寨卡病毒减毒株，其特征在于，所述重组寨卡病毒减毒株相比于Genebank登录号为KU963796的野生型寨卡病毒至少包括以下非同义突变：非结构蛋白1中第123位的苯丙氨酸突变为丙氨酸或其它非极性氨基酸。
2.根据权利要求1所述的重组寨卡病毒减毒株，其特征在于，所述重组寨卡病毒减毒株相比于Genebank登录号为KU963796的野生型寨卡病毒具有以下突变：非结构蛋白1中第123位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；
优选地，所述重组寨卡病毒减毒株的基因组RNA所对应的cDNA的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
3.一种重组寨卡病毒cDNA，其特征在于，所述重组寨卡病毒cDNA为Genebank登录号为KU963796的野生型寨卡病毒的基因组RNA所对应的cDNA且在其上引入突变，使得所编码蛋白中至少包括以下非同义突变：非结构蛋白1中第123位的苯丙氨酸突变为丙氨酸或其它非极性氨基酸。
4.根据权利要求3所述的重组寨卡病毒cDNA，其特征在于，所述重组寨卡病毒cDNA为Genebank登录号为KU963796的野生型寨卡病毒的基因组RNA所对应的cDNA且在其上引入突变，使得所编码的非结构蛋白1中第123位的苯丙氨酸突变为丙氨酸；
优选地，所述重组寨卡病毒cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.一种重组寨卡病毒表达蛋白，其特征在于，其为如权利要求1或2所述的重组寨卡病毒减毒株所表达的蛋白，或者，其为如权利要求3或4所述的重组寨卡病毒cDNA所翻译的蛋白。
6.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包含如权利要求3或4所述的重组寨卡病毒cDNA，以及任选地，与之可操作地连接的至少一个表达调控元件。
7.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体插入有可用于表达如权利要求5所述的重组寨卡病毒表达蛋白的基因，或者，所述重组表达载体插入有如权利要求3或4所述的重组寨卡病毒cDNA。
8.一种宿主细胞，其中转化或转染有如权利要求3或4所述的重组寨卡病毒cDNA、如权利要求6所述的核酸构建体或如权利要求7所述的重组表达载体。
9.一种重组寨卡病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗的活性成分包括：如权利要求1或2所述的重组寨卡病毒减毒株，或者如权利要求3或4所述的重组寨卡病毒cDNA，或者如权利要求5所述的重组寨卡病毒表达蛋白，或者如权利要求6所述的核酸构建体，或者如权利要求7所述的重组表达载体，或者如权利要求8所述的宿主细胞。
10.如权利要求1或2所述的重组寨卡病毒减毒株，或者如权利要求3或4所述的重组寨卡病毒cDNA，或者如权利要求5所述的重组寨卡病毒表达蛋白，或者如权利要求6所述的核酸构建体，或者如权利要求7所述的重组表达载体，或者如权利要求8所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗寨卡病毒感染的药物中的应用；
优选地，所述药物为疫苗，进一步优选为减毒活疫苗；
进一步优选地，所述疫苗为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
更进一步优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
更进一步优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂；
更进一步优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。
CN202311405950.8A 2023-10-26 2023-10-26 一种寨卡病毒减毒株及其在制备寨卡病毒疫苗中的应用 Pending CN117417903A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311405950.8A CN117417903A (zh) 2023-10-26 2023-10-26 一种寨卡病毒减毒株及其在制备寨卡病毒疫苗中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311405950.8A CN117417903A (zh) 2023-10-26 2023-10-26 一种寨卡病毒减毒株及其在制备寨卡病毒疫苗中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117417903A true CN117417903A (zh) 2024-01-19

Family

ID=89532140

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311405950.8A Pending CN117417903A (zh) 2023-10-26 2023-10-26 一种寨卡病毒减毒株及其在制备寨卡病毒疫苗中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117417903A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101633909B (zh) 预防猪感染猪繁殖与呼吸综合征的减毒活疫苗
CN108085302B (zh) 口蹄疫病毒温度敏感减毒株及其构建方法和用途
EP3763382A1 (en) Dengue tetravalent vaccine containing a common 30 nucleotide deletion in the 3'-utr of dengue types 1, 2, 3, and 4, or antigenic chimeric dengue viruses 1, 2, 3, and 4
Tretyakova et al. Novel vaccine against Venezuelan equine encephalitis combines advantages of DNA immunization and a live attenuated vaccine
KR20180137514A (ko) 어린이 및 젊은 성인에서 뎅기 바이러스에 대한 백신접종 조성물 및 방법
TW201402143A (zh) 抗登革熱病毒疫苗之組成物及投藥方法
US20190225654A1 (en) Methods and compositions for dengue virus vaccines
WO2020258757A1 (zh) 一种突变株3型鸭甲肝病毒ch-p60-117c株及构建方法
KR20180127397A (ko) 생약독화된 지카 바이러스 백신
CN111394367B (zh) 一种塞内卡病毒重组核酸、重组疫苗株及其制备方法和应用
WO2022135425A1 (zh) 一种黄病毒属病毒的减毒病毒及其用途
US11241491B2 (en) Methods and compositions for dengue virus serotype 4 epitopes
CN109476708B (zh) 针对致关节炎甲病毒的疫苗
CN110088273A (zh) 针对正义链rna病毒引起的感染性疾病的疫苗
EP3549604A1 (en) Recombinant bivalent inactivated vaccine for foot-and-mouth disease and preparation method and application thereof
CN117417903A (zh) 一种寨卡病毒减毒株及其在制备寨卡病毒疫苗中的应用
CA2501220C (en) Vaccines against west nile virus
CN103374549A (zh) 一株新型ev71病毒及其应用
JP7232289B2 (ja) デングウイルス弱毒株をバンク化した生ウイルス、及びそれらを抗原とするデングワクチン
EP3939607A1 (en) Dengue virus vaccine
JPH0923880A (ja) 高度に弱毒化された組換え日本脳炎ウイルスを産生する感染性日本脳炎ウイルスｃＤＮＡクローンおよびそのワクチン
CN116769735A (zh) 一种甲病毒减毒株的构建方法及应用
CN116855514A (zh) 编码寨卡病毒抗原肽的mRNA、基于其的mRNA疫苗及其制备方法
CN117230027A (zh) 一种非洲猪瘟病毒减毒毒株、其制备方法及应用
Blaney Jr et al. Stephen S. Whitehead, Barry Falgout, Kathryn A. Hanley

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination