CN115947872B - 新冠病毒三聚体嵌合疫苗及其用途 - Google Patents

新冠病毒三聚体嵌合疫苗及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种新型冠状病毒异源三聚体化嵌合抗原肽，编码其的多核苷酸或与该多核苷酸相关的核酸产品，基于前述抗原肽或多核苷酸的疫苗或免疫原性组合物，以及前述各项产品在新冠病毒疫苗中的应用。基于该嵌合抗原肽或其编码核酸的重组蛋白疫苗或各类核酸疫苗(特别是后者)能够高效地激发针对新冠病毒原始毒株和多种变异株(特别是Omicron变异株各亚型)的强烈免疫反应，具有广谱且较强的免疫原性。

Description

新冠病毒三聚体嵌合疫苗及其用途
交叉引用
本申请要求于2022年6月28日提交的、申请号为202210739619.9、发明名称为“新冠病毒三聚体嵌合疫苗及其用途”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种新型冠状病毒异源三聚体化嵌合抗原肽、其编码核酸及其在新冠病毒疫苗制备中的应用。
背景技术
新出现的新冠病毒变异株中S蛋白或RBD序列存在很多突变，导致现有的基于新冠病毒原型株(Prototype)设计和开发的疫苗所激发的免疫反应在面对变异株(如Omicron变异株)时的效力大大下降，这种变异株突破疫苗、抗体保护的现象称为免疫逃逸。免疫逃逸的现象在Omicron变异株多种亚型上表现得尤为明显。为了解决新冠病毒变异株的免疫逃逸问题，需要开发新型疫苗以使其适应新出现的变异株，使其对当前的流行株具有较强保护效果；同时，由于目前存在多种变异株(特别是Omicron变异株的多种亚型)同时流行的现象，新开发的新冠疫苗需要能够诱导广谱的免疫反应，以尽可能地同时防范多种新冠病毒毒株。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
为克服上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种新型冠状病毒异源三聚体化嵌合抗原肽，编码其的多核苷酸，与该多核苷酸相关的核酸产品，基于前述抗原肽或多核苷酸的疫苗或免疫原性组合物，以及前述各项产品在新冠病毒疫苗制备中的应用。基于该嵌合抗原肽或其编码核酸的重组蛋白疫苗或各类核酸疫苗(特别是后者)能够高效地激发针对新冠病毒原始毒株和多种变异株的强烈免疫反应，具有广谱且较强的免疫原性。
具体地，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种新型冠状病毒的重组嵌合抗原肽，其特征在于，所述重组嵌合抗原具有如式(I)所示结构的氨基酸序列：
(A-B)-C1-(A-B’)-C2-(A-B”)
(I)
式(I)中：
A-B表示新型冠状病毒Delta变异株S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
A-B’表示新型冠状病毒Omicron变异株BA.2亚型S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
A-B”表示新型冠状病毒Omicron变异株BA.4/BA.5亚型S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
C1和C2相同或不同，各自独立地表示连接子(GGS)n；其中，n＝0,1,2,3,4或5。
对于上述重组嵌合抗原肽，优选地，所述新型冠状病毒Delta变异株S蛋白RBD结构域的一部分为其全部氨基酸序列的至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％；
和/或，所述新型冠状病毒Omicron变异株BA.2亚型S蛋白RBD结构域的一部分为其全部氨基酸序列的至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％；
和/或，所述新型冠状病毒Omicron变异株BA.4/BA.5亚型S蛋白RBD结构域的一部分为其全部氨基酸序列的至少70％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％；
和/或，n＝0,1,2或3。
在一些优选的具体实施方案中，所述新型冠状病毒Delta变异株S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
和/或，所述新型冠状病毒Omicron变异株BA.2亚型S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
和/或，所述新型冠状病毒Omicron变异株BA.4/BA.5亚型S蛋白RBD结构域或其一部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，或者如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
和/或，n＝0,1或2。
在进一步优选的具体实施方案中，A-B表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，A-B’表示如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，A-B”表示如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
进一步优选地，所述重组嵌合抗原肽具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供了一种多核苷酸，其编码如上述第一方面所述的重组嵌合抗原。
所述多核苷酸为经人源密码子优化的核苷酸序列，可以为DNA或mRNA；
在一些实施方案中，所述多核苷酸为DNA分子，优选地，所述DNA分子具有如SEQ IDNO:5所示的DNA序列。
在另一些实施方案中，所述多核苷酸为mRNA分子，优选地，所述mRNA分子具有如SEQ ID NO:6所示的mRNA序列。
第三方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含如上述第二方面所述的多核苷酸，以及任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。
第四方面，本发明提供了一种表达载体，其包含如上述第三方面所述的核酸构建体。
第五方面，本发明提供了一种宿主细胞，其中转化或转染有如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体或如上述第四方面所述的表达载体。
第六方面，本发明提供了如上述第一方面所述的重组嵌合抗原肽、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒感染的疫苗中的应用。
优选地，所述新型冠状病毒为选自以下的一种或多种：SARS-CoV-2原始毒株，SARS-CoV-2变异毒株Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Kappa(B.1.617.1)、Delta(B.1.617.2)、Omicron亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4、BA.5。
优选地，所述疫苗用于单独免疫或者与其他类型的新型冠状病毒疫苗进行序贯免疫；进一步优选地，所述其他类型的新型冠状病毒疫苗为灭活疫苗。
第七方面，本发明提供了一种疫苗或免疫原性组合物，其包含如上述第一方面所述的重组嵌合抗原肽、如上述第二方面所述的多核苷酸、如上述第三方面所述的核酸构建体、如上述第四方面所述的表达载体或如上述第五方面所述的宿主细胞，以及生理学可接受的媒介物、佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂。
在一个优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为新型冠状病毒重组蛋白疫苗，其包括如上述第一方面所述的重组嵌合抗原肽和佐剂；
可选地，所述佐剂为选自以下佐剂中的一种或多种：铝佐剂、MF59佐剂和类MF59佐剂。
在另一个优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为新型冠状病毒DNA疫苗，其包括：
(1)真核表达载体；和
(2)构建入所述真核表达载体中的、编码如上述第一方面所述的重组嵌合抗原肽的DNA序列，优选为如SEQ ID NO:5所示的DNA序列；
可选地，所述真核表达载体选自pGX0001、pVAX1、pCAGGS和pcDNA系列载体。
在另一个优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为新型冠状病毒mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包括：
(I)编码如上述第一方面所述的重组嵌合抗原肽的mRNA序列，优选为如SEQ IDNO:6所示的mRNA序列；和
(II)脂质纳米颗粒。
在另一个优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为新型冠状病毒-病毒载体疫苗，其包括：
(1)病毒骨架载体；和
(2)构建入所述病毒骨架载体中的、编码如上述第一方面所述的重组嵌合抗原肽的DNA序列，优选为如SEQ ID NO:5所示的DNA序列；
可选地，所述病毒骨架载体选自以下病毒载体中的一种或几种：腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体、腺相关病毒载体。
在可行的实现方式中，所述疫苗或免疫原性组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂；
优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。
第八方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括如上述第七方面所述的疫苗或免疫原性组合物，以及任选地其他类型的新型冠状病毒疫苗，所述疫苗或免疫原性组合物与所述其他类型的新型冠状病毒疫苗单独包装；
优选地，所述其他类型的新型冠状病毒疫苗为新型冠状病毒灭活疫苗。
有益效果
本发明提供了一种新型冠状病毒Delta变异株、Omicron变异株BA.2亚型和Omicron变异株BA.4/BA.5亚型受体结合结构域的重组嵌合抗原肽、编码其的多核苷酸以及基于该嵌合抗原肽或其多核苷酸的各类型疫苗产品；基于该嵌合抗原肽或其编码核酸的重组蛋白疫苗或各类核酸疫苗(特别是后者)能够高效地激发针对新冠病毒原始毒株和多种变异株的强烈免疫反应，具有广谱且较强的免疫原性。
特别是，基于该嵌合抗原肽的编码核酸的各类核酸疫苗(包括DNA疫苗、mRNA疫苗、病毒载体疫苗)针对多种新冠病毒毒株特别是当前流行的Omicron变异株一系列亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4、BA.5均可提供较强的免疫保护效力，并且，在与其他类型疫苗(如灭活疫苗)进行序贯免疫时可诱导针对新冠病毒各型毒株的(即，广谱的)、显著增高的免疫反应水平，非常适用于当前复杂的疫情防控，具有潜在的临床应用价值和前景。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1是本发明实施例1中构建的新冠病毒原型株RBD三聚体mRNA疫苗(简称PPPmRNA疫苗，作为对照疫苗)，由新冠病毒Delta变异株RBD、Omicron变异株BA.2亚型RBD和Omicron变异株BA.4/BA.5亚型RBD串联连接形成的嵌合RBD三聚体mRNA疫苗(简称DOO mRNA疫苗，代表本发明疫苗)的结构示意图；图上标注了mRNA疫苗的各个区段，其中，5’UTR表示5’端非翻译区，3’UTR表示3’端非翻译区，SP表示信号肽序列，Poly(A)表示多聚腺苷酸尾，Protype RBD表示原型株的RBD序列，Delta RBD表示Delta变异株的RBD序列，Omicron(BA.2)RBD表示Omicron变异株BA.2亚型的RBD序列，Omicron(BA.4/5)RBD表示Omicron变异株BA.4/BA.5亚型的RBD序列。
图2显示本发明实施例1中记载的，通过Western Blot检测所构建的mRNA在细胞内的免疫原表达效果。
图3是显示本发明实施例3中记载的，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测PPP或DOO mRNA疫苗免疫小鼠后第14天采集的血清分别针对新冠病毒原型株、Delta变异株、Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.4/5的RBD抗原的结合抗体滴度水平的柱形图。
图4是显示本发明实施例4中记载的，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测PPP或DOO mRNA疫苗免疫小鼠后第28天采集的血清分别针对新冠病毒原型株、Delta变异株、Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.3、BA.4/5的RBD抗原的结合抗体滴度水平的柱形图。
图5显示了在用mRNA疫苗免疫小鼠后第14天所采集的血清在假病毒中和实验中中和新冠病毒原型株、Delta变异株、Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4/5的假病毒的NT50值，如实施例6中所记载的；其中，上图为柱形图，横坐标显示的是疫苗类型，分别为PPP疫苗、DOO疫苗以及阴性对照LNP，纵坐标显示的是pVNT50滴度的log10值；下图为基于该柱形图中各实验组的GMT值(即，几何平均滴度)制作的雷达图。
图6显示了在用mRNA疫苗免疫小鼠后第28天所采集的血清在假病毒中和实验中中和新冠病毒原型株、Delta变异株、Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.3、BA.4/5的假病毒的NT50值，如实施例7中所记载的；其中，上图为柱形图，横坐标显示的是疫苗类型，分别为PPP疫苗、DOO疫苗以及阴性对照LNP，纵坐标显示的是pVNT50滴度的log10值；下图为基于该柱形图中各实验组的GMT值(即，几何平均滴度)制作的雷达图。
图7显示了本发明实施例8中记载的，通过酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测PPP或DOO mRNA疫苗免疫小鼠后第21天采集的小鼠脾脏细胞在分别被新冠病毒原型株、Delta变异株、Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4/5RBD构建的肽库刺激后所产生的IFNγ+细胞数量的柱形图(上图)以及雷达图(下图)；其中，柱形图中，横坐标显示的是疫苗类型，纵坐标显示的是每3×105个脾脏细胞的SFU(Spot-forming Unit，其代表IFNγ+细胞数量)的log10值；下面的雷达图是基于该柱形图中各实验组的SFU的平均值制作的。
图8显示了在用灭活疫苗与mRNA疫苗序贯免疫小鼠后第56天所采集的血清在假病毒中和实验中中和新冠病毒原型株、Delta变异株、Omicron变异株BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4/5亚型的假病毒的NT50值，如实施例10中所记载的；其中，上图为柱形图，横坐标显示的是用于与灭活疫苗序贯免疫的mRNA疫苗类型，分别为PPP、DOO mRNA疫苗以及阴性对照LNP，纵坐标显示的是pVNT50滴度的log10值；下图为基于该柱形图中各实验组的GMT值(即，几何平均滴度)制作的雷达图。
图9显示了本发明实施例11中记载的，通过酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测在用灭活疫苗与mRNA疫苗序贯免疫小鼠后第56天所采集的小鼠脾脏细胞在分别被新冠病毒原型株、Delta变异株、Omicron变异株BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4/5亚型RBD构建的肽库刺激后所产生的IFNγ+细胞数量的柱形图(上图)以及雷达图(下图)；其中，柱形图中，横坐标显示的是用于与灭活疫苗序贯免疫的mRNA疫苗类型，纵坐标显示的是每3×105个脾脏细胞的SFU(Spot-forming Unit，其代表IFNγ+细胞数量)的log10值；下面的雷达图是基于该柱形图中各实验组的SFU的平均值制作的。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1：新冠病毒原型株RBD三聚体mRNA疫苗(简称PPP mRNA疫苗，作为对照)以及Delta变异株、Omicron变异株BA.2亚型和Omicron变异株BA.4/BA.5亚型的嵌合RBD三聚体mRNA疫苗(简称DOO mRNA疫苗，代表本发明的mRNA疫苗)的构建、体外制备与包装
按照图1所示的DOO、PPP mRNA疫苗的结构示意图，根据下述程序进行mRNA疫苗的构建、体外制备与包装：
1)mRNA疫苗的体外转录和加帽
本实施例中，用于体外转录mRNA疫苗的基础质粒为pUC57，由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。
在基础质粒pUC57上，通过常规分子生物学手段引入mRNA疫苗的DNA表达元件，包括：(1)T7启动子，(2)mRNA疫苗的DNA编码区(DOO mRNA疫苗的DNA编码序列如SEQ ID NO:5所示，作为对照的PPP mRNA疫苗的DNA编码序列如SEQ ID NO:7所示)，(3)在编码区上游的5’端UTR序列(两种mRNA疫苗的5’端UTR序列相同，均为如SEQ ID NO:8所示序列)，(4)信号肽编码序列(即SP，PPP疫苗和DOO疫苗的信号肽编码序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示)，和(5)下游的3’端UTR序列(两种mRNA疫苗的3’端UTR序列相同，均为如SEQ ID NO:11所示序列)，和多聚腺苷酸尾(Poly-A-tail)。
首先，使用限制性内切酶BamHI对上述体外转录质粒进行酶切，将其线性化；使用常规DNA纯化方法进行纯化，获得体外转录的模板；然后，基于该模板，使用T7RNA体外转录试剂盒(E131-01A，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)进行体外转录，获得体外转录的mRNA；最后，使用氯化锂回收试剂盒(S125，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)，通过氯化锂沉淀法对mRNA进行纯化，获得提纯的体外转录mRNA。
然后，使用加帽酶试剂盒Cap1加帽酶试剂盒(M082-01B，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)，对上述提纯的体外转录mRNA进行5’端Cap1加帽，使其满足在真核细胞内被翻译的条件；其后，使用与上述相同的氯化锂沉淀法对mRNA进行再次纯化，获得纯化的经5’端加帽修饰的mRNA。
2)mRNA的细胞内表达效果检验
对于由上述步骤1)获得的DOO和PPP mRNA，通过如下程序检验了其在细胞内的表达情况：
(1)mRNA转染
在12孔板中铺HEK293T细胞，使第二天细胞密度至50％左右；分别将1μgDOO或PPPmRNA与TransIT-mRNA试剂(2μl)和增强试剂(2μl)一起加入100μl无血清Opti-MEM中，孵育3分钟，然后滴加到12孔板中；转染后36小时，收集上清液。
(2)Western Blot
将步骤(1)所得上清液样品与含有二硫苏糖醇(DTT)的loading buffer混合，通过10％SDS-PAGE分离；分离完成后进行转膜，将蛋白转移到PVDF膜上；然后，用5％脱脂牛奶稀中封闭膜，用SARS-CoV-2Spike/RBD一抗(Sino Biological)和山羊抗兔IgG-HRP(EASYBio)二抗先后孵育PVDF膜各1小时；最后，使用Beyotime Beyo ECL Plus显色液显色。
Western Blot结果如图2所示，图2显示了DOO或PPP mRNA在细胞内的表达情况；由图2可知，DOO mRNA在细胞内表达结果只有单一条带，且与PPP mRNA疫苗大小相当；这些结果提示，DOOmRNA疫苗在细胞内表达正常，为单一免疫原。
3)脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticle,LNP)包装mRNA
将阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG脂质按照50：10：38.5：1.5的比例进行混合，然后使用Precision Nano Systems公司生产的Nanoassemblr Benchtop纳米脂质体包装仪，将其与上述步骤1)所制得的5’端加帽修饰的mRNA进行混合、包装。包装完成后，使用离心或透析的方法更换缓冲溶液为PBS。完成包装后，使用Thermo Fisher公司的Quan-iTRibogreen RNA reagent试剂盒，对mRNA包装效率进行鉴定，包装效率符合mRNA疫苗的标准。
实施例2：实验动物免疫和样品采集
本实施例中，使用6-8周龄的BALB/c品系的雌性小鼠(购自维通利华)进行动物实验；实验组分为mRNA疫苗免疫组和阴性对照组，其中，mRNA疫苗免疫组包括PPP mRNA疫苗免疫组和DOO mRNA疫苗免疫组，所述阴性对照组为LNP免疫组。mRNA疫苗免疫组的所有小鼠在第0天和第14天分别免疫接种同一种设计的mRNA疫苗(即，PPP或DOO mRNA疫苗)，阴性对照组的小鼠在同样的时间、注射相同量的空的LNP。接种方法均为肌肉注射，接种剂量为每只小鼠每次10μg mRNA疫苗或空LNP；在第14天、第28天分别采集小鼠血清样本，用于检验免疫血清的结合抗体滴度和假病毒中和抗体滴度；在第21天采集小鼠脾脏样本，用于检验T细胞免疫。
实施例3：小鼠血清抗体滴度的检验(一)
本实施例中，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)，检测上述实施例2中的各实验组小鼠在免疫程序的第14天所采集的血清分别针对新冠病毒原型株、Delta变异株、Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.4/5的RBD抗原的特异性结合抗体滴度水平。
具体地，分别用新冠病毒原型株(SEQ ID NO:12)、Delta变异株(SEQ ID NO:13)、Omicron变异株亚型BA.1(SEQ ID NO:14)、BA.1.1(SEQ ID NO:15)、BA.2(SEQ ID NO:16)、BA.2.12.1(SEQ ID NO:17)、BA.4/5(SEQ ID NO:18)的RBD抗原蛋白(0.2μg/ml)包被ELISA板，将包被好的ELISA板在5％脱脂牛奶中封闭1小时；然后，将实施例2中的、由各实验组小鼠在免疫程序第14天采集的血清在56℃孵育30分钟，进行灭活；将经过灭活的血清样本从1:200或1:1000开始进行三倍梯度稀释，然后将稀释液加入每个孔，随后将ELISA板在37℃下孵育1小时；将山羊抗小鼠IgG-HRP抗体(购自柏奥易杰(EASYBio)添加到板中作为二抗，并在37℃下再次孵育1小时；最后，用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物进行显色，显色完成后用2M盐酸终止反应，使用酶标仪(PerkinElmer)测量450nm和630nm处的吸光度。通过从同一孔的450nm处的吸光度减去630nm处的吸光度，来计算吸光度值。终点滴度定义为：血清产生的吸光度(如上所述，450nm的吸光度减去630nm的吸光度)大于背景值2.1倍时对应的血清稀释倍数。低于检测限的抗体滴度定义为检测限的三分之一。
各实验组小鼠在免疫程序的第14天所采集的血清针对新冠病毒原型株、Delta变异株、Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.4/5的RBD抗原的结合抗体滴度水平如图3所示。
由图3可以看出：本发明的DOO mRNA疫苗免疫组小鼠在免疫程序的第14天所采集的血清针对新冠病毒Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.4/5的RBD抗原蛋白所产生的特异性抗体滴度水平均较PPP mRNA疫苗明显提高，而对新冠病毒原型株、Delta变异株的RBD抗原蛋白所产生的特异性抗体滴度水平则与PPP mRNA疫苗相当，均在较高的水平。
这些结果表明：整体上，本发明的DOO mRNA疫苗较PPP mRNA疫苗可诱导更高的体液免疫水平，特别是，其针对新冠病毒Omicron变异株各亚型均产生比PPP mRNA疫苗明显更高的体液免疫水平。
实施例4：小鼠血清抗体滴度的检验(二)
本实施例中，采用与实施例3相同的方法，进一步检测了上述实施例2中的各免疫组小鼠在免疫程序的第28天所采集的血清分别针对新冠病毒原型株、Delta变异株、Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.3、BA.4/5的RBD抗原的特异性结合抗体滴度水平；实验程序中所采用的Omicron变异株亚型BA.2.75、BA.3的RBD抗原蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:27、28所示。
各实验组小鼠在免疫程序的第28天所采集的血清针对新冠病毒原型株、Delta变异株、Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.3、BA.4/5的RBD抗原的结合抗体滴度水平如图4所示。
由图4可以看出：在免疫程序的第28天(即，两针免疫完成后14天)，本发明的DOOmRNA疫苗免疫组小鼠血清针对新冠病毒Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.3、BA.4/5的RBD抗原蛋白所产生的特异性抗体滴度水平均较PPPmRNA疫苗明显提高；并且，针对新冠病毒原型株、Delta变异株的RBD抗原蛋白所产生的特异性抗体滴度也均在较高的水平，表明其也可用于这些病毒株的预防和/或治疗。
这些结果表明：本发明的DOO mRNA疫苗较PPP mRNA疫苗可诱导更高的体液免疫水平，特别是，其针对新冠病毒Omicron变异株各亚型均产生比PPP mRNA疫苗明显更高的体液免疫水平。
实施例5：新冠病毒毒株假病毒的包装
一、制备截短的新冠病毒S蛋白的表达质粒
分别将编码新冠病毒原型株、Delta变异株和Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4/5、BA.2.75的S蛋白的后18位氨基酸的核苷酸去掉，所得核苷酸分别命名为WT-S-del18、Delta-S-del18、BA.1-S-del18、BA.1.1-S-del18、BA.2-S-del18、BA.2.12.1-S-del18、BA.3-S-del18、BA.4/5-S-del18、BA.2.75-S-del18，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19～26、29所示，由苏州金唯智公司进行合成；然后，将这些核苷酸序列各自克隆到pCAGGS表达载体上，分别得到表达质粒pCAGGS-WT-S-del18、pCAGGS-Delta-S-del18、pCAGGS-BA.1-S-del18、pCAGGS-BA.1.1-S-del18、pCAGGS-BA.2-S-del18、pCAGGS-BA.2.12.1-S-del18、pCAGGS-BA.3-S-del18、pCAGGS-BA.4/5-S-del18、pCAGGS-BA.2.75-S-del18。
二、新冠病毒原型株和各型变异株的假病毒的包装
1)在10cm细胞培养皿中铺HEK293T细胞，使第二天细胞密度至80％左右。培养液为含10％ FBS的DMEM培养基。
2)将上文所制备的截短的、新冠病毒各型株的S蛋白的表达质粒，用PEI转染培养皿中的细胞(30μg/10cm细胞培养皿)。目的质粒与PEI按1:3比例混匀后转染，4-6h换培养液(含10％FBS的DMEM培养基)，37℃培养24h。
3)将假病毒包装骨架病毒G*VSV-delG(武汉枢密脑科学技术有限公司)加入上述转染后的HEK293T细胞，37℃孵育2h，换培养液(含10％FBS的DMEM培养基)，并加入VSV-G抗体(表达该抗体杂交瘤细胞购自ATCC细胞库)，在培养箱中继续培养30h。
4)收上清，3000rpm离心10min，在超净工作台中经0.45μm无菌滤器过滤，去除细胞碎片，分装，-80℃冰箱冻存。
通过上述步骤，分别得到新冠病毒原型株、Delta变异株和Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4/5、BA.2.75的假病毒。
实施例6：免疫小鼠血清对假病毒抑制效果的评价(一)
本实施例中，分别检测上述实施例2中的、于免疫程序第14天所采集的免疫小鼠血清对新冠病毒原型株、Delta变异株、Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4/5的假病毒的50％假病毒中和滴度(pVNT50)；具体检测方法如下：
将实施例2中的、于第14天采集的各实验组小鼠血清在56℃孵育30分钟，进行灭活；将灭活后的血清样本进行稀释，从1:80开始进行2倍梯度稀释。然后，将每种假病毒与等体积的稀释后血清混合，在37℃下孵育1小时。取100μl病毒-血清混合物加入到96孔板中预铺板的Vero细胞上。孵育15小时后，使用CQ1共聚焦图像细胞仪，检测转导单位(TU)数，从而计算免疫小鼠血清对上述新冠病毒原型株、Delta变异株和Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4/5的假病毒的中和能力。
结果如图5所示；如图5的附图说明中所述，图5的上面的柱形图显示了各免疫组血清中和新冠病毒原型株、Delta变异株和Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4/5的假病毒的pVNT50(即，50％假病毒中和滴度)水平(以其log10表示)，每个柱上方的数字代表该实验组所有样品的几何平均滴度(GMT)，下面的雷达图为基于上面的柱形图中各实验组的GMT值所制作。
由图5可以看出：本发明的DOO mRNA疫苗针对Omicron变异株的各亚型所诱导的血清中和抗体滴度水平均远远高于PPP mRNA疫苗；具体地，针对BA.1亚型所诱导的中和抗体滴度水平，DOO mRNA疫苗比PPP mRNA疫苗高达75倍；针对BA.1.1亚型所诱导的中和抗体滴度水平，DOO mRNA疫苗比PPP mRNA疫苗高达72倍以上；针对BA.2亚型所诱导的中和抗体滴度水平，DOO mRNA疫苗比PPP mRNA疫苗高达66.7倍；针对BA.2.12.1亚型所诱导的中和抗体滴度水平，DOO mRNA疫苗比PPP mRNA疫苗高达56.5倍；针对BA.3亚型所诱导的中和抗体滴度水平，DOO mRNA疫苗比PPP mRNA疫苗高达43.8倍；针对BA.4/5亚型所诱导的中和抗体滴度水平，DOO mRNA疫苗比PPP mRNA疫苗高达33.5倍；而针对Delta变异株所诱导的中和抗体滴度水平，DOO mRNA疫苗比PPP mRNA疫苗高达将近2倍。这些结果表明：本发明的DOO mRNA疫苗针对新冠病毒各型毒株(特别是针对Delta变异株、Omicron变异株各亚型)均可诱导出明显更高的中和抗体滴度水平，说明其针对新冠病毒各型毒株(特别是针对Delta变异株、Omicron变异株各亚型)都将具有明显更高的免疫保护效力，即，本发明的DOO mRNA疫苗具有广谱的、明显增强的免疫原性。
实施例7：免疫小鼠血清对假病毒抑制效果的评价(二)
本实施例中，分别检测上述实施例2中的、于免疫程序第28天所采集的免疫小鼠血清对新冠病毒原型株、Delta变异株、Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.3、BA.4/5的假病毒的50％假病毒中和滴度(pVNT50)；具体检测方法同实施例6。
第28天所采集的免疫小鼠血清针对各型新冠病毒株假病毒的中和滴度结果如图6所示。
如图6的附图说明中所述，图6的上面的柱形图显示了各免疫组血清中和新冠病毒原型株、Delta变异株和Omicron变异株亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.3、BA.4/5的假病毒的pVNT50(即，50％假病毒中和滴度)水平(以其log10表示)，柱形图中，每个柱上方的数字代表该实验组所有样品的几何平均滴度(GMT)；下面的雷达图为基于上面的柱形图中各实验组的GMT值所制作的。
由图6可以看出：本发明的DOO mRNA疫苗在完成两针免疫后，针对Omicron变异株的各亚型所诱导的血清中和抗体滴度水平均远远高于PPP mRNA疫苗；具体地，与PPP mRNA疫苗相比，DOO mRNA疫苗针对BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75、BA.3、BA.4/5亚型所诱导的中和抗体滴度水平分别提高达4倍、19倍、13倍、24倍、16倍、19倍和90倍。这些结果表明：本发明的DOO mRNA疫苗针对新冠病毒各型毒株(特别是针对Delta变异株、Omicron变异株各亚型)均可诱导出明显更高的中和抗体滴度水平，说明其针对新冠病毒各型毒株(特别是针对Delta变异株、Omicron变异株各亚型)都将具有明显更高的免疫保护效力，即，本发明的DOO mRNA疫苗具有广谱的、明显增强的免疫原性。
实施例8：mRNA疫苗诱导细胞免疫水平的评价
本实施例中，采用实施例2中的、于第21天采集的各实验组小鼠的脾脏样本，检测mRNA疫苗诱导的细胞免疫水平。具体方法如下：
1)小鼠脾脏样品处理
用细胞匀浆器在1ml无血清DMEM中将小鼠脾脏细胞制备成单细胞匀浆，用40μm细胞过滤器过滤，用红细胞裂解缓冲液(北京索莱宝科技有限公司，R1010)裂解红细胞；然后，细胞经过清洗液(PBS+0.5％ FBS)清洗后，用0.4％台盼蓝溶液(Gibco，15250061)染色，使用CelldropFL自动细胞计数器进行计数。
2)ELISpot检验
将10μg/ml anti-mouse IFN-γ抗体(购自BD公司)在平底96孔板中在4℃过夜孵育，以包被该平底96孔板，第二天，在室温下封闭2小时。将新鲜的小鼠脾脏单细胞悬液(4×105/孔)加入上述抗体包被的96孔板，并分别用新冠病毒原型株、Delta变异株、Omicron变异株BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4/5亚型的RBD构建的肽库(每条多肽2μg/ml)刺激20小时；所述肽库采用网站https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/PEPTGEN/peptgen.html上的软件PeptGen Peptide Generator进行设计，设计的关键参数包括：短肽的长度在18-20个氨基酸，重叠氨基酸片段在10个氨基酸作用等；设计好的肽库由中科亚光生物科技有限公司合成。阳性对照孔用植物血凝素(PMA)刺激以产生非特异细胞免疫反应，阴性对照孔不用肽库刺激。然后，丢弃细胞，并用生物素化的IFNγ抗体、链霉亲和素-HRP抗体和显色底物先后孵育96孔板。当板底显现斑点后，用去离子水彻底冲洗样品，停止显色。最后，使用ImmunoCapture6.5.0拍照并对斑点数量进行计数。
结果如图7所示；图7中，上面的柱形图显示了各免疫组小鼠每3×105个脾脏细胞的SFU(Spot-forming Unit，其代表IFNγ+细胞数量)的log10值；下面的雷达图是基于该柱形图中各实验组的SFU的平均值制作的。
由图7可知，在分别使用上述八种新冠病毒RBD肽库刺激后，DOO mRNA疫苗免疫组小鼠的脾脏细胞所产生的IFN-γ+细胞的数量均高于PPP mRNA疫苗免疫组，这表明：DOOmRNA疫苗不仅能有效激发细胞免疫应答，并且其所激发的细胞免疫水平要高于PPPmRNA疫苗。
实施例9：mRNA疫苗与灭活疫苗的序贯免疫
本实施例中，使用6-8周龄的BALB/c品系的雌性小鼠(购自维通利华)进行动物实验，所用灭活疫苗来自国药中生BBBIP-CorV。
实验分组如下：三次灭活疫苗免疫组(简称“IV”组)、两次灭活疫苗+PPP mRNA疫苗免疫组(即，PPP序贯免疫组，简称“PPP”组)、两次灭活疫苗+DOO mRNA疫苗免疫组(即，DOO序贯免疫组，简称“DOO”组)和两次灭活疫苗佐剂+LNP免疫组(即，LNP序贯免疫组，简称“LNP”组，作为阴性对照组)。
“IV”组：所有小鼠在第0天、第21天和第42天分别接种一剂灭活疫苗；
“PPP序贯免疫”组、“DOO序贯免疫”组：所有小鼠在第0天、第21天分别接种一剂灭活疫苗，然后在第42天接种一剂各mRNA疫苗；
“LNP序贯免疫”组：所有小鼠在第0天、第21天分别接种灭活疫苗的佐剂——Al佐剂，然后在第42天接种空的LNP。
上述各疫苗的接种方法均为肌肉注射，其中，灭活疫苗的接种剂量为每只小鼠每次2.6U(为人用剂量的0.4剂)，各mRNA疫苗或空的LNP的接种剂量为每只小鼠每次10μg。
在第56天采集小鼠血清样本和小鼠脾脏样本，分别用于检验免疫血清的结合抗体滴度和假病毒中和抗体滴度，以及检验T细胞免疫水平。
实施例10：序贯免疫小鼠血清对新冠病毒各毒株的假病毒的抑制效果的评价
本实施例中，使用实施例5中包装的假病毒，采用实施例6中记载的方法，检测了实施例9中在第56天所采集的各免疫组小鼠血清针对新冠病毒原型株、Delta变异株、Omicron变异株BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4/5亚型的假病毒的中和抗体滴度。
结果如图8所示，图8显示：
(I)与PPP mRNA疫苗序贯免疫组相比，DOO mRNA疫苗序贯免疫组针对Delta变异株、Omicron变异株BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4/5亚型的假病毒所诱导的中和抗体滴度水平均显著高于PPP mRNA疫苗；DOO mRNA疫苗序贯免疫组针对新冠病毒原型株所诱导的中和抗体滴度水平与PPP mRNA疫苗相当，均在较高的水平，表明其也可用于原型株的预防和/或治疗。
(II)与三次灭活疫苗免疫组(即“IV”组)相比，DOO mRNA疫苗序贯免疫组针对新冠病毒原型株、Delta变异株、Omicron变异株BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4/5亚型的假病毒所诱导的中和抗体滴度水平均显著高于灭活疫苗。
实施例11：序贯免疫所诱导的细胞免疫水平的评价
本实施例中，采用实施例8中所记载的方法和实施例9中在第56天所采集的各免疫组小鼠的脾脏样本，检测了mRNA疫苗序贯免疫所诱导的细胞免疫水平。
结果如图9所示，由图9可知，在使用上述八种新冠病毒株RBD肽库刺激后，DOOmRNA疫苗序贯免疫组小鼠的脾脏细胞所产生的IFN-γ+细胞的数量均高于PPP mRNA疫苗序贯免疫组和IV疫苗免疫组，这表明：DOO mRNA疫苗不仅能有效激发细胞免疫应答，并且其所激发的细胞免疫水平要高于PPP mRNA疫苗和灭活疫苗，显示了本发明DOO mRNA疫苗的较高的细胞免疫水平。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (26)

1.一种新型冠状病毒的重组嵌合抗原肽，其特征在于，所述重组嵌合抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.一种多核苷酸，其编码如权利要求1所述的重组嵌合抗原肽。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为DNA分子。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述DNA分子的DNA序列如SEQ ID NO:5所示。
5.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为mRNA分子。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，所述mRNA分子的mRNA序列如SEQ IDNO:6所示。
7.一种核酸构建体，其包含如权利要求2-6任一项所述的多核苷酸，以及任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。
8.一种表达载体，其包含如权利要求7所述的核酸构建体。
9.一种宿主细胞，其中转化或转染有如权利要求2-6任一项所述的多核苷酸、如权利要求7所述的核酸构建体或如权利要求8所述的表达载体。
10.如权利要求1所述的重组嵌合抗原肽、如权利要求2-6任一项所述的多核苷酸、如权利要求7所述的核酸构建体、如权利要求8所述的表达载体或如权利要求9所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒感染的疫苗中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述新型冠状病毒为选自以下的一种或多种：SARS-CoV-2原始毒株，SARS-CoV-2变异毒株Alpha、Beta、Gamma、Kappa、Delta、Omicron亚型BA.1、BA.1.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.3、BA.4、BA.5。
12.根据权利要求10或11所述的应用，其特征在于，所述疫苗用于单独免疫或者与其他类型的新型冠状病毒疫苗进行序贯免疫。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述其他类型的新型冠状病毒疫苗为灭活疫苗。
14.一种疫苗或免疫原性组合物，其包含如权利要求1所述的重组嵌合抗原肽、如权利要求2-6任一项所述的多核苷酸、如权利要求7所述的核酸构建体、如权利要求8所述的表达载体或如权利要求9所述的宿主细胞，以及生理学可接受的媒介物、佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂。
15.根据权利要求14所述的疫苗或免疫原性组合物，其为新型冠状病毒重组蛋白疫苗，其包括如权利要求1所述的重组嵌合抗原肽和佐剂。
16.根据权利要求15所述的疫苗或免疫原性组合物，其特征在于，所述佐剂为选自以下佐剂中的一种或多种：铝佐剂、MF59佐剂和类MF59佐剂。
17.根据权利要求14所述的疫苗或免疫原性组合物，其为新型冠状病毒DNA疫苗，所述DNA疫苗包括：
(i)真核表达载体；和
(ii)构建入所述真核表达载体中的、编码如权利要求1所述的重组嵌合抗原肽的DNA序列。
18.根据权利要求17所述的疫苗或免疫原性组合物，其特征在于，所述编码如权利要求1所述的重组嵌合抗原肽的DNA序列为如SEQ ID NO:5所示的DNA序列；
和/或，所述真核表达载体选自pGX0001、pVAX1、pCAGGS和pcDNA系列载体。
19.根据权利要求14所述的疫苗或免疫原性组合物，其为新型冠状病毒mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包括：
(I)编码如权利要求1所述的重组嵌合抗原肽的mRNA序列；和
(II)脂质纳米颗粒。
20.根据权利要求19所述的疫苗或免疫原性组合物，其特征在于，所述编码如权利要求1所述的重组嵌合抗原肽的mRNA序列为如SEQ ID NO:6所示的mRNA序列。
21.根据权利要求14所述的疫苗或免疫原性组合物，其为新型冠状病毒-病毒载体疫苗，其包括：
（1）病毒骨架载体；和
（2）构建入所述病毒骨架载体中的、编码如权利要求1所述的重组嵌合抗原肽的DNA序列。
22.根据权利要求21所述的疫苗或免疫原性组合物，其特征在于，所述编码如权利要求1所述的重组嵌合抗原肽的DNA序列为如SEQ ID NO:5所示的DNA序列；
和/或，所述病毒骨架载体选自以下病毒载体中的一种或几种：腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体、腺相关病毒载体。
23.根据权利要求14-22任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其特征在于，所述疫苗或免疫原性组合物为鼻喷剂或可注射制剂的形式。
24.根据权利要求23所述的疫苗或免疫原性组合物，其特征在于，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
和/或，所述可注射制剂为可推注制剂。
25.一种试剂盒，其包括如权利要求14-24任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，以及任选地其他类型的新型冠状病毒疫苗，所述疫苗或免疫原性组合物与所述其他类型的新型冠状病毒疫苗单独包装。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其特征在于，所述其他类型的新型冠状病毒疫苗为新型冠状病毒灭活疫苗。
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