JP7464924B2 - 重症熱性血小板減少症候群(sfts)ウイルス感染疾患の予防または治療用ワクチン組成物 - Google Patents
重症熱性血小板減少症候群(sfts)ウイルス感染疾患の予防または治療用ワクチン組成物 Download PDFInfo
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Description
配列番号287で表されるアミノ酸配列を含むか、配列番号286で表される塩基配列を含む組換えの第1DNAによってコーディングされる組換えの第1ペプチド;
配列番号289で表されるアミノ酸配列を含むか、配列番号288で表される塩基配列を含む組換えの第2DNAによってコーディングされる組換えの第2ペプチド;
配列番号291で表されるアミノ酸配列を含むか、配列番号290で表される塩基配列を含む組換えの第3DNAによってコーディングされる組換えの第3ペプチド;
配列番号293で表されるアミノ酸配列を含むか、配列番号292で表される塩基配列を含む組換えの第4DNAによってコーディングされる組換えの第4ペプチド;および
配列番号295で表されるアミノ酸配列を含むか、配列番号294で表される塩基配列を含む組換えの第5DNAによってコーディングされる組換えの第5ペプチドからなる群より選択されたいずれか1つ以上の組換えペプチドを有効成分として含む抗原用組成物を提供する。
配列番号287で表されるアミノ酸配列を含むか、配列番号286で表される塩基配列を含む組換えの第1DNAによってコーディングされる組換えの第1ペプチド;
配列番号289で表されるアミノ酸配列を含むか、配列番号288で表される塩基配列を含む組換えの第2DNAによってコーディングされる組換えの第2ペプチド;
配列番号291で表されるアミノ酸配列を含むか、配列番号290で表される塩基配列を含む組換えの第3DNAによってコーディングされる組換えの第3ペプチド;
配列番号293で表されるアミノ酸配列を含むか、配列番号292で表される塩基配列を含む組換えの第4DNAによってコーディングされる組換えの第4ペプチド;および
配列番号295で表されるアミノ酸配列を含むか、配列番号294で表される塩基配列を含む組換えの第5DNAによってコーディングされる組換えの第5ペプチドからなる群より選択されたいずれか1つ以上を含む組換えペプチドを有効成分として含むワクチンを提供する。
配列番号286で表される塩基配列を含む組換えの第1DNA;
配列番号288で表される塩基配列を含む組換えの第2DNA;
配列番号290で表される塩基配列を含む組換えの第3DNA;
配列番号292で表される塩基配列を含む組換えの第4DNA;および
配列番号294で表される塩基配列を含む組換えの第5DNAからなる群より選択されたいずれか1つ以上の組換えDNAを含む発現ベクターを提供する。
目的遺伝子(SFTSV抗原または免疫増強剤遺伝子)5’末端にIgEリーダーおよびコザック(kozak)配列を挿入し、3’末端に終止コドンを挿入した。最終的に、遺伝子の両端に制限酵素配列(5’BamHIと3’NotI)を挿入した後、遺伝子の合成を進行させた。
挿入遺伝子の合成を完了した後、BamHIとNotIに切断し、同じ制限酵素で切断された高効率バックボーンプラスミド(pGX0001)に挿入して、候補物質プラスミドを作製した(図33~図39参照)。遺伝子の合成およびクローニング結果は塩基配列分析により確認した。
最適な抗原5種として、Gc(glycoprotein C)、Gn(glycoprotein N)、NP(nucleocapsid protein)、NS(non-structural protein)、RdRp(RNA dependent RNA polymerase)と、最適な免疫増強剤2種として、IL-7およびIL-33を選定した。前記抗原5種について、韓国人、中国人及び日本人から分離されたSFTSウイルス菌株27~32個から導出された共通配列を確保した。共通配列は、多様なSFTSウイルスサブタイプおよび変種ウイルスの共通した抗原のアミノ酸配列を用いて交差免疫能がある汎用抗原配列にデザインした。In silico免疫情報学手法を活用して、多様なサブタイプおよび変種SFTSウイルスに存在するヒトの主要MHCクラスIおよびIIエピトープを発掘し、これを抗原に含むように配列をデザインした。以後、最適化されたSFTSウイルス抗原のアミノ酸配列に基づいてDNAワクチンのための塩基配列を最終的に導出した。
目的遺伝子(SFTSV抗原または免疫増強剤遺伝子)5’末端にIgEリーダー配列とコザック配列を挿入し、3’末端にストップコドンを挿入した。最終的に、遺伝子の両端に制限酵素配列(5’BamHIと3’NotI)を挿入した後、遺伝子の合成を進行させた。挿入遺伝子の合成を完了した後、BamHIとNotIに切断し、同じ制限酵素で切断された高効率バックボーンプラスミド(pGX0001)に挿入して、候補物質プラスミドを作製した。遺伝子の合成およびクローニング結果は塩基配列分析により確認した。
免疫原性評価用OLP(overlapping peptide)プールを作製した。具体的には、SFTSウイルスの抗原5種に対する免疫原性を評価すべく、各抗原の配列を8個のアミノ酸が重複するようにして15merのペプチドに断片化した。各ペプチドは、作製過程でいずれも高性能液体クロマトグラフィーとエレクトロスプレー質量分析器を用いて定性、定量して純度を確認した。この過程によりGn抗原から計76個のペプチドを確保し、このペプチドを38個ずつ混合して、Gnに対するOLP1、およびOLP2(各ペプチド25ug/ml)を製造し(表1)、Gc抗原からは計76個のペプチドを作製して、このペプチドを38個ずつ混合して、OLP3、およびOLP4を製造した(表2)。NP抗原からは計34個のペプチドを確保し、これを混合してOLP5を製造し(表3)、NS抗原からは計41個のペプチドを得て、これを混合してOLP6を製造し(表4)、RdRp抗原からは計58個のペプチドを29個ずつ混合して、OLP7、およびOLP8を製造した(表5)。
BALB/cマウスを用いて、ナイーブグループ、DNAワクチンを筋肉内注射したグループ、DNAワクチンの筋肉内注射後に電気穿孔法を実施したグループ、DNAワクチンとIL-7免疫増強剤を筋肉内注射後に電気穿孔法を実施したグループ、DNAワクチンとIL-33免疫増強剤を筋肉内注射後に電気穿孔法を実施したグループ、の計5種のグループに分けて、各グループあたり6匹ずつ接種を進行させた。ナイーブグループの各マウスには、SFTSウイルスの遺伝子が挿入されていないプラスミドを200ug接種し、他の4つのグループのマウスには、SFTSウイルス抗原発現DNA5種(Gn、Gc、NP、NS、およびRdRpのDNA配列、それぞれのDNA配列番号は286、288、290、292、および294であり、アミノ酸配列はそれぞれ287、289、291、293、および295である。)を各40ugずつ計200ugとなるように接種した。また、IL-7とIL-33免疫増強剤を接種するグループのマウスには、追加的にDNA接種とともに各免疫増強剤を50ugずつ接種した。ナイーブグループとDNAワクチンを筋肉内注射したグループを除いた3つのグループのマウスには、筋肉内注射直後、接種部位に電気穿孔機を用いて0.2Aで電気穿孔法を実施した。1回目接種21日後に同量で2回目接種を進行させ、2回目接種21日後にマウスを犠牲にして脾臓と鼠径リンパ節を分離して免疫原性評価に使用した。
SFTSウイルスに特異的なT細胞反応を測定するために、ELISpot分析を進行させた(図1)。96ウェルフィルタープレートにPBSで希釈した抗ヒトIFN-γ抗体(2μg/ml;endogen)を各ウェルあたり100ulずつ分注し、4℃で一晩インキュベーションした後、マウスの脾臓細胞(5×105cells/well)をSFTSウイルスのペプチドから作製した8種のOLPで刺激を与え、37℃で24時間インキュベーションを実施した。この後、プレートを洗浄してPBS/Tween20/1%BSAで希釈したビオチニル化された抗ヒトIFN-γ抗体(0.5μg/ml;endogen)を各ウェルあたり100ulずつ分注し、4℃で一晩インキュベーションした。4回の洗浄後、PBS/Tween20/1%BSAで5000:1に希釈したストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ(BD)を各ウェルあたり100ulずつ分注し、37℃で1時間インキュベーションした。AP接合基質キット(AP conjugate substrate kit、BIO-RAD社)を用いて10分間反応させてから、洗浄して反応を止めた後、ImmunoSpot(Cellular Technology Limited)によりSFTSウイルス抗原によるSFTSウイルスに特異的なT細胞のIFN-γの生成を観察した。これによって、DNAワクチン接種後、マウスモデルにおいてSFTSウイルスに特異的なT細胞の免疫反応が成功裏に誘導されたことを確認した。このような免疫反応は、DNAワクチンの筋肉内注射後に電気穿孔法を実施したグループと、追加的にIL-33免疫増強剤をともに注射したグループで明確に観察することができ、特にIL-33免疫増強剤をSFTSウイルス抗原発現DNAワクチンとともに注射したグループで確実にT細胞の免疫反応が増加することを確認した(図2A~図2E)。
ワクチン接種済みのネズミから得た脾臓細胞にSFTSウイルスOLP刺激を与えた後、多色FACSを用いた細胞内サイトカイン染色法(intracellular cytokine staining;ICS)で分析した。
FACSデータに基づいて各グループでT細胞の多機能性を分析した。FACSでの結果に基づいて、免疫反応が最も強く誘導されるOLP6で刺激されたCD8+T細胞の多機能性をグループごとにまとめて結果を得た。IMグループに比べてIMEPグループが多機能T細胞の割合がより高く、電気穿孔法とともに、免疫増強剤としてIL-33を用いたグループでその割合が最も高くなる結果を示した。これは、ワクチンによって誘導されたT細胞免疫反応が、電気穿孔法とIL-33を用いる場合に質的にもより良くなることを意味する。このような傾向は、全体作動T細胞中の多機能性T細胞の割合においても類似することが明らかになった(図4)。また、CD4+T細胞の場合、多機能性において大差がなかった。
(ワクチンによって誘導されたSFTSV特異的抗体生成反応検証)
SFTSVワクチンによって誘導されるSFTSウイルスに特異的な抗体生成反応を測定するために、ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)アッセイ手法を実施した。組換えSFTSV NP抗原タンパク質に対するELISA手法を確立するために、ワクチンにより免疫原性を備えたと評価されていたマウスの血清を用いて実験を進行させた。上記のように、ELISAアッセイ手法を利用して、ワクチンによって誘導された抗体免疫反応を定量的に確認した。図5A~図5Fに示すように、筋肉注射+電気穿孔法(IMEP)グループのマウスにおいて、他のグループに比べて強い抗体免疫反応が生成されたことを確認した。図5A~図5Fにて、CrMNは、クロム前駆体(chromium precursor)を用いてMN(微細針)表面を処理して微細針の表面にナノパターンを形成させた微細針を用いた。
DNAワクチン候補物質と多様な免疫増強剤によってマウスで産生された33個の抗体の中和抗体力価をPRNT50方法で測定した。
SFTSVワクチンの感染抑制効能を検証するための新しい動物モデルを開発した。中型動物にSFTS患者から分離したSFTSVを感染させた結果、血液内ウイルスが検出され、感染8日まで血小板数が減少し続けることが観察された(図7)。また、体温が4日目に2℃以上増加し、このような症状が持続するにつれ、感染後9日前と後で感染した個体がすべて死亡することを確認した。この結果は、患者の臨床経過とも非常に類似していた。SFTSV感染後、回復期に入らなければ、約10日ほど後には死亡する様相を見せた。本発明者らによって確立された中型動物モデルは、SFTSV感染時、高熱、ウイルス数値(viral load)増加、血小板および血液内構成成分の変化などSFTS患者と非常に類似の臨床的所見を見せているため、ワクチン効能検証のためのSFTSV感染動物モデルとして優れた適合性を示すものと判断した。
本発明者らは、確立したSFTSV感染中型動物モデルをSFTSVワクチンの感染抑制効能を検証するモデルとして使用した。ワクチン処理群(N=6)には、SFTSウイルス抗原発現DNA5種を各200ugずつ計1mgとなるように混合(表6参照)して、両大腿部位に500ugずつ皮内注射で接種した。対照群には、SFTSウイルスの遺伝子が挿入されていないmockプラスミド(pVax-1由来)1mgを両大腿部位に500ugずつ皮内注射で接種した。2つのグループとも、皮内投与直後に電気穿孔機を用いて0.2Aで電気穿孔法を実施した。ワクチンは2週間隔で計5回投与した(0日目、14日、28日、42日、および56日目に投与)。
ワクチン投与前、2回/4回/5回ワクチン投与各2週後に5mlの血液を採取し、PBMCおよび血清を分離してSFTSV-特異T細胞免疫反応(ELISpotアッセイ)および抗体免疫反応(ELISAおよび中和抗体アッセイ)を測定した。ワクチンによって形成されたSFTSV特異T細胞免疫反応をELISpot分析法により評価した。図8A~図8Dに示すように、SFTSVワクチン候補物質によって中型動物で非常に強いSFTSV特異T細胞免疫反応が誘導されることを確認し、2回投与後に安定した免疫反応が観察されることを確認した。
DNAワクチンによって形成されたSFTSV特異反応抗体の形成をELISA方法で測定評価した。図9に示すように、空ベクターワクチンを接種した6匹のMOCKグループの場合、陰性対照群の血清と類似する程度のELISA値を示して特異抗体が形成されていないと判断された。しかし、他の6匹のSFTSV DNAワクチン接種グループで産生されたSFTSV特異反応抗体が陽性対照群の血清と類似するかより高く現れることを観察した。この結果は、ワクチン候補物質が中型動物で抗体免疫反応を効果的に誘導できることを示す結果である。
ワクチンの防御効能を検証するために、SFTSVワクチンを投与した個体に致死量のSFTSVを感染させた後、生存率、SFTSVウイルス数値、血小板数、体温、体重変化などのような臨床症状を評価した。図11に示すように、生存率を評価した結果、対照群で感染後7日目に2匹、8日目に3匹、9日目に1匹で6匹の対照群の個体がすべてへい死した。これに対し、SFTSVワクチンを投与した個体は6匹とも生存した。
SFTSV DNAワクチン投与後、マウスで形成されたSFTSV中和抗体の交差反応を評価するために、他のSFTSウイルスとのPRNT50テストを実施した。図15Aに示すように、SFTSV/2014ウイルスには中和抗体力価が40~80程度形成されたのに対し、他のウイルスであるSFTSV/2015に対する中和抗体の形成が明確に現れなかった。
上記のように確立したSFTSV感染中型動物モデルを用いてSFTSVワクチンの感染抑制効能を検証した。各ワクチンの防御効能を検証するために、それぞれGnおよびGcが組み合わされたGn/Gc、NP、NS、およびRdRpに対するSFTSVワクチン処理群(それぞれN=4、N=3、N=3、N=3)には、SFTSウイルス抗原発現DNA5種を各200ugずつ計1mgとなるように混合して、両大腿部位に皮内注射で接種した。対照群には、SFTSウイルスの遺伝子が挿入されていないmockプラスミド(pVax-1由来)1mgを両大腿部位に500ugずつ皮内注射で接種した。両グループとも、皮内投与直後に電気穿孔機を用いて0.2Aで電気穿孔法を実施した。ワクチンは2週間隔で計3回投与した(0日目、14日、28日目に投与)。
ワクチン投与前、および3回ワクチン投与各2週後に5mlの血液を採取し、PBMCおよび血清を分離してSFTSV特異T細胞免疫反応(ELISpotアッセイ)および抗体免疫反応(ELISAおよび中和抗体アッセイ)を測定した。ワクチンによって形成されたSFTSV特異T細胞免疫反応をELISpot分析法により評価した。SFTSVワクチン候補物質によって中型動物で接種したワクチンによって各SFTSV抗原に対して非常に強いSFTSV特異T細胞免疫反応が誘導されることを確認した。図16に示すように、Gn/Gc SFTSVワクチン処理群で最も優れたSFTSV特異免疫反応を確認することができた。
DNAワクチンによって誘導された抗体の中和抗体力価をPRNT50方法で測定した。図17に示すように、SFTSV Gn/Gcに対するDNAワクチンを接種した4匹の動物で効果的に中和抗体力価が生成されることを確認した。これに対し、空ベクターワクチンを接種した6匹のワクチングループをはじめとして、それぞれNP、NS、およびRdRpに対するワクチンを接種したグループの個体では中和抗体が全く生成されないことが確認された。この結果は、Gn/Gcに対するDNAワクチン候補物質によってSFTSV-特異中和抗体が効果的に誘導できることを意味する。
各ワクチンの防御効能を検証するために、それぞれGn/Gc、NP、NS、およびRdRpに対するSFTSVワクチンを投与した個体に致死量のSFTSVを感染させた後、生存率、SFTSVウイルス数値、血小板数、体温、体重変化、ALT、およびAST変化などの臨床症状を評価した。図18に示すように、生存率を評価した結果、対照群で感染後6匹の個体とも死亡し、NP、NS、およびRdRpに対するSFTSVワクチンを投与した3つのグループでいずれも、3匹の個体のうち1匹のみが生存した。これに対し、Gn/Gcに対するSFTSVワクチンを投与した個体は4匹とも生存した。
Claims (14)
- (a)配列番号287で表されるアミノ酸配列を含む第1の組換えペプチド;及び、
(b)配列番号289で表されるアミノ酸配列を含む第2の組換えペプチド;を有効成分として含む、抗原用組成物。 - 前記抗原用組成物は、筋肉内、皮内、皮下、表皮下、経皮、または静脈内から選択された経路を通して体内注射される、請求項1に記載の抗原用組成物。
- 前記抗原用組成物は、筋肉内注射により対象体に注入される、請求項1に記載の抗原用組成物。
- 前記抗原用組成物は、皮内注射により対象体に注入される、請求項1に記載の抗原用組成物。
- 前記抗原用組成物は、体内注射時、追加的に電気穿孔法を利用して対象体に注入される、請求項2に記載の抗原用組成物。
- (a)配列番号287で表されるアミノ酸配列を含む第1の組換えペプチド;及び、
(b)配列番号289で表されるアミノ酸配列を含む第1の組換えペプチド;を有効成分として含む、ワクチン。 - 前記ワクチンは、筋肉内、皮内、皮下、表皮下、経皮、または静脈内から選択された経路を通して体内注射される、請求項6に記載のワクチン。
- 前記ワクチンは、筋肉内注射により対象体に注入される、請求項6に記載のワクチン。
- 前記ワクチンは、皮内注射により対象体に注入される、請求項6に記載のワクチン。
- 前記ワクチンは、体内注射時、追加的に電気穿孔法を利用して対象体に注入される、請求項7に記載のワクチン。
- 前記ワクチンは、免疫増強剤を追加的に含む、請求項6に記載のワクチン。
- 前記免疫増強剤は、IL-7、およびIL-33の少なくとも1つである、請求項11に記載のワクチン。
- 配列番号286で表される塩基配列を含む組換えの第1DNA;及び
配列番号288で表される塩基配列を含む組換えの第2DNAを含む、発現ベクター。 - 請求項1~5のいずれか一項に記載の抗原用組成物、または請求項6~12のいずれか一項に記載のワクチン、または請求項13に記載の発現ベクターを有効成分として含む、重症熱性血小板減少症候群(SFTS)ウイルス感染に対する予防または治療用薬学組成物。
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