KR20230133437A

KR20230133437A - 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 질환의 예방용 백신 조성물의 제조방법

Info

Publication number: KR20230133437A
Application number: KR1020220030421A
Authority: KR
Inventors: 김현숙
Original assignee: 김현숙
Priority date: 2022-03-11
Filing date: 2022-03-11
Publication date: 2023-09-19

Abstract

본 발명은 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 질환의 예방용 백신 조성물의 제조방법에 관한 것으로서, 글루코오스, 만노오스, L-라이신, 콜라겐, 키토산, 알파-토코페놀, 둘시톨 및 알긴산나트륨을 혼합한 면역 보조제와 약독화된 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스를 혼합하여 항체 형성능이 우수한 백신을 용이하게 제조할 수 있다.

Description

중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 질환의 예방용 백신 조성물의 제조방법 {Manufacturing method of vaccine composition for preventing severe fever with thrombocytopenia syndrome virus diseases}

본 발명은 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 질환의 예방용 백신 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

중증열성혈소판감소증후군 (Severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)는 고열, 구토, 설사, 혈소판 감소, 백혈구감소 및 다발성 장기부전과 같은 증상을 동반하며, 치사율이 6-30%에 이르는 심각한 질환이다. SFTS의 원인병원체는 SFTSV (severe fever thrombocytopenia syndrome virus, 중증열성 혈소판 감소증 바이러스) (HB29 스트레인)이며, 버냐바이러스과(Bunyaviridae)에 속한다. 버냐바이러스과는 세개의 분절을 포함한 음성가닥(negative-strand) RNA 바이러스인데, 오르토버냐바이러스(Orthobunyavirus), 한타바이러스(Hantavirus), 나이로바이러스(Nairovirus), 플레보바이러스(Phlebovirus), 토스포바이러스(Tospovirus)를 포함하는 다섯개의 속(genus)로 이루어져 있다. SFTSV는 플레보바이러스 속(Phlebovirus genus)에 속하며, 여기에 리프트밸리열바이러스(Rift valley fever virus) 등이 속해있다. SFTSV는 2011년에 중국에서 최초로 보고되었고, 중국 뿐 아니라 한국 그리고 일본에서도 지속적으로 발병하고 있는 신 변종 바이러스이다. 또한 직경 80~100nm의 구형 바이러스로, 유전체는 large(L), medium(M), small(S) 세그먼트로 구성되어 있으며, RNA dependent RNA polymerase(RdRp), glycoprotein precursor(M), glycoprotein N(Gn), glycoprotein C(Gc), nucleocapsid protein(NP) 및 non-structural protein(NSs)의 6개의 단백질을 코딩한다. 마이너스 또는 안티센스 가닥 (바이러스 단백질을 코딩하는 센스 또는 플러스 가닥에 대한 안티센스)은 단백질 또는 유전자가 안티센스로서 코딩되며, 유전자의 단백질로의 발현을 위해 센스 또는 플러스 가닥 RNA 생성 후, 이로부터 번역을 수행하여 단백질이 생성된다.

SFTS 바이러스는 작은소참진드기(Haemaphysalis longicornis)를 주로 매개체로 하며, 작은소진드기는 한국에도 널리 퍼져 있다. SFTS 바이러스의 혈청전환 및 바이러스혈증이 염소, 양, 소, 돼지 및 개와 같은 사육동물에서 종종 발견되는데, 이러한 동물도 SFTS 바이러스가 퍼진 지역에서 중간 매개체로 작용하는 것으로 여겨지고 있다. 중증열성혈소판감소증후군 환자의 혈액에는 SFTSV가 검출되며 특히 중증 환자의 혈액에는 SFTSV 농도가 매우 높으므로 혈액을 통해 사람-사람 간 전파가 가능하다. SFTSV에 대한 항바이러스제는 아직 개발되지 않아, SFTS 치료는 수혈, 신대체요법 등 장기부전에 대한 보존요법이 근간을 이룬다. 중국에서는 2012년부터 리바비린 정주를 치료지침에 도입하고 있으나 최근 발표된 치료 결과에서는 리바비린 투여군과 비투여군 간 사망률에 차이는 없었다. 따라서, SFTSV에 대한 백신이 필요하나, 아직 치료효능이 뚜렷한 백신은 개발되지 않은 실정이다. 게다가 바이러스성 질병에 대한 백신은 바이러스 배양 시 감염 위험으로 인한 어려움 등으로도 인해 개발이 쉽지 않다. 이에 소량의 바이러스를 활용하면서도 면역보조제를 이용하면 비교적 적은 양의 항원으로도 면역을 유도할 수 있을 것으로 기대된다. 병원체는 생체에 침입, 증식하면서 병을 일으키는 메카니즘이 병원체의 종에 따라 확연히 차이 나므로, 병원체의 종류에 따라 사용되는 면역보조제의 종류에도 차이가 있다. 따라서 백신을 개발할 때는 목적 병원체에 적합한 최적의 면역보조제의 선택을 위한 연구가 따로 수행되어야하며, 생물종에 따라 사용하는 면역보조제(아쥬반트; adjuvant; 면역증강제)에 의한 부작용(독성)에서도 차이가 날 수 있다.

이에 본 발명자들은 참진드기에 감염된 반려견으로부터 SFTS 바이러스를 채취하여 이를 불활성화하여 면역보조제(아쥬반트)와 함께 제공하여 중증열성혈소판감소증후군에 효과적인 백신 조성물로 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-2097992호 (발명의 명칭 : 신규한 중증열성혈소판감소증후군 바이러스, 출원인 : 아이디바이오 주식회사, 등록일 : 2020년04월01일) 대한민국 등록특허 제10-2075393호 (발명의 명칭 : 중증 열성 혈소판 감소 증후군(SFTS) 바이러스 감염 질환 예방 또는 치료용 백신 조성물, 출원인 : 한국과학기술원 외 1인, 등록일 : 2020년02월04일)

본 발명의 목적은 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 질환의 예방용 백신 조성물의 제조방법을 제공하는 데에 있다.

보다 자세하게는, (제1단계) 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스를 동물세포주에서 배양하는 단계;

(제2단계) 동물세포주의 배양액을 수거하여 포르말린을 처리하여 바이러스를 불활화하는 단계;

(제3단계) 불활화된 바이러스가 포함된 배양액을 한외 여과 및 원심분리하여 바이러스를 농축하는 단계; 및

(제4단계) 농축된 바이러스를 글루코오스, 만노오스, L-라이신, 콜라겐, 키토산, 알파-토코페놀, 둘시톨 및 알긴산나트륨을 혼합한 면역 보조제 조성물이 주입된 백신용기에 주입하는 단계;

를 포함할 수 있다.

상기 동물세포주는 포유동물 또는 조류 세포일 수 있다.

상기 면역 보조제는 글루코오스 1.1~2.5%(w/v), 만노오스 4.3~6.4%(w/v), L-라이신 0.1~1%(w/v), 콜라겐 0.1~0.6%(w/v), 알파-토코페롤 0.05~0.2%(w/v), 둘시톨 0.1~0.5%(w/v), 알긴산나트륨 1~0.4%(w/v) 및 0.05~0.3mM MgCl₂ 수용액 0.1~0.7%(w/v)이 혼합된 조성물일 수 있다.

상기 농축된 바이러스는 8.6-9.8 Log EID50/0.5 ml의 바이러스 수율을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 서열번호 1 내지 3의 유전자를 갖는 중증 열성 혈소판 감소증 바이러스 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는, 중증 열성 혈소판 감소증의 예방 또는 치료용 면역원성 조성물일 수 있다. 상기 면역원성 조성물은 백신일 수 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에서 바이러스의 배양을 위한 동물세포주는 포유동물 또는 조류 세포일 수 있다.

적합한 포유동물 세포는 햄스터, 소, 영장류 (인간 및 원숭이 포함) 및 개 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다양한 세포 유형은 신장 세포, 섬유모세포, 망막 세포 및 폐 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적합한 햄스터 세포의 예로는 명칭이 BHK21 또는 HKCC인 세포주가 있다. 적합한 원숭이 세포로는 예컨대, 아프리카 녹색 원숭이 세포, 예컨대, Vero 세포주에서와 같은 신장 세포가 있다. 적합한 개 세포는 예컨대, CLDK 및 MDCK 세포주에서와 같은 신장 세포가 있다.

추가의 적합한 세포로는 CHO; 293T; BHK; MRC 5; PER.C6; FRhl.2; WI-38 등을 포함하나, 이에 제한되지않는다. 적합한 세포는 예컨대, 아메리칸 타입 셀 컬쳐(American Type Cell Culture: ATCC) 콜렉션으로부터, 코리엘 셀 리포지토리(Coriell Cell Repositories)로부터, 또는 유러피언 콜렉션 오브 셀 컬쳐즈(European Collection of Cell Cultures: ECACC)로부터 널리 이용가능하다. 예를 들어, ATCC는 카탈로그 번호 CCL 81, CCL 81.2, CRL 1586 및 CRL-1587하에 각종의 상이한 Vero 세포를 공급하고, 이는 카탈로그 번호 CCL 34하에 MDCK 세포를 공급한다. PER.C6은 기탁 번호 96022940하에 ECACC로부터 이용가능하다. 추가로, 바람직하게, 세포 배양 숙주는 비제한적으로 ATCC CCL-34, 마딘 다르비 개 신장 (MDCK) 33016 세포주 (DSM ACC 2219), MDCK (ATCC CCL34 MDCK(NBL2)), MDCK 33016 (DSM ACC 2219), DSM ACC3309, ATCC CRL-12042, ATCC PTA-7909, ATCC PTA-7910, ATCC PTA-6500, ATCC PTA-6501, ATCC PTA-6502, ATCC PTA-6503, 'MDCK-S', 'MDCK-SF101', 'MDCK-SF102', 'MDCK-SF103' 및 FERM BP-7449로부터 선택되는 MDCK 세포일 수 있다.

추가로, 바람직하게, 상기 세포주의 배양은 DMEM 또는 최소 필수 배지 (MEM) 중에서 배양될 수 있다. 세포 배양은 37℃±1℃에서 이루어질 수 있다. 감염 전 세포 증식 동안 배지의 pH 값은 pH 6.8 내지 pH 7.6 범위, 및 더욱 바람직하게, pH 7.0 내지 pH 7.4의 값일 수 있다. 추가로, 상기 세포주는 무혈청 또는 단백질 무함유 배지 중에서 배양될 수 있고, 혈청 함유 배지에서도 배양가능하다.

본 발명에서 백신의 최종 제조 후 이를 밀봉하는 데에 사용되는 백신용기는 주사 직전 면역 보조제 조성물과 바이러스의 혼합이 가능한 용기인 것이 바람직하다. 이 용기는 동결 상태에서도 안전한 소재로서 멸균된 유리 또는 플라스틱, 바람직하게는 폴리카르보네이트 일 수 있다.

도 1은 본 발명의 제조예 1의 보조제가 혼합된 백신 조성물을 접종한 기니피그가 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스에 대한 항체가 형성되었음을 ELISA(enzyme-linked immunospecific assay)으로 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 제조예 1의 보조제가 혼합된 백신 조성물을 접종한 기니피그가 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스에 대한 항체가 형성되었음을 면역형광항체법으로 확인한 결과이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 백신 제조용 바이러스 확보 및 유전자 확인>

실시예 1-1

참진드기매개질병 감별진단을 위하여 2019년 7월 26일에 진료를 위하여 내원한 충주 애플동물병원의 반려견 혈청에서 RT-nested PCR 방법을 통하여 SFTS에 확진이 되었고, 반려견의 혈청을 접종시킨 Vero E6 cell line으로부터 SFTS 바이러스 주를 분리하였다.

SFTS 바이러스 분리주의 확인을 위해 감염환견의 SFTS 바이러스 양성 혈청에 감염시킨 Vero E6 세포를 사용하여 IFA에 슬라이드를 제작한 후, 이미 항체 양성이 확인된 멧돼지의 혈청을 이용하여 항체 검사를 실시한 결과 슬라이드가 Vero E6 세포에 감염된 것을 최종 확인하였다. 항체 검사는 시중의 SFTSV 진단키트를 이용하였다.

실시예 1-2

SFTS 항원 검사 결과 양성으로 확인된 혈청 샘플을 준비하여 생물안전작업대(Bio-safety cabinet) 안에서 Vero E6 cell이 자란 T-75 flask에 DMEM 배지(2%, FBS)를 넣어준 후, SFTSV 양성 혈청 샘플을 접종하였다. 이 후 37℃ incubator에서 4~5일 정도 세포병변효과(Cytopathic effect, CPE)가 보일때까지 배양하여 매일 확인하였다. CPE가 보이면 PCR로 SFTSV 항원을 확인하고 일정한 바이러스의 확보를 위해 위와 같은 과정을 3~4번 반복하여 SFTSV의 감염을 확인하였다.

여러 번의 과정으로 SFTS 바이러스의 감염이 확인되면 양성 혈청에 감염된 Vero E6 세포를 사용하여 IFA 슬라이드를 제작한 후 항체 검사를 실시하였다.

위 과정을 통해 바이러스가 확인되면, 바이러스의 수를 1×10⁸cfu/㎖로 맞춘 뒤 바이러스가 포함된 Vero E6 세포의 배양액을 0.2 μm 필터로 여과하여 일부는 실험용으로 두고, 일부는 -80℃ 초저온냉동고에 보관하였다.

실시예 1-3

확보된 바이러스를 이용하여 RACE PCR 방법을 통하여 S, M, L의 segment의 염기서열 분석을 완료하였다. 확보된 바이러스는 하기 서열번호 1 내지 3의 유전자를 갖는 유전자형(Genotype) B의 Subgenotype인 B-3에 속하는 것으로 확인되었다.

서열번호 1 : S segment

총 1,746 bp로써 ORF 1(2~781), ORF 2(836~1,744)가 확인되었다.

서열번호 2 : M segment

총 3,377bp로써 ORF 1(1~3,240)이 확인되었다.

서열번호 3 : L segment

총 6,368bp로써 ORF (2~6,271)가 확인되었다.

<실시예 2. 백신의 제조>

실시예 1-2에서 수거한 Vero E6 세포의 배양액에 포르말린(formalin)을 0.2%(w/v)가 되도록 포르말린 용액을 48시간 처리한 후 바이러스를 불활화하여 약독화하였다. 상기 포르말린 용액의 용매로는 PBS(Phosphate Buffered Saline)를 사용하였다. 이 때, 상기 PBS 대신 정제수, 생리식염수 등이 대신 사용될 수 있다.

이 후 분자량 컷 오프 (MWCO)가 100-500 KDa인 막을 이용하여 한외 여과하여 약독화된 바이러스를 정제하였고, 정제물을 원심분리하여 농축된 약독화된 바이러스들을 얻었다. 이렇게 하여 8.6-9.8 Log EID50/0.5 ml의 바이러스 수율을 얻었다.

이 후 면역보조제(Adjuvant)로서 글루코오스, 만노오스, L-라이신, 콜라겐, 키토산, 알파-토코페놀, 둘시톨 및 알긴산나트륨을 혼합하여 보조제 조성물을 제조하였다.

보조제 조성물은 다음의 표 1의 조건으로 PBS에 혼합하였다. 제조된 각 조성물은 다음의 항체 형성 확인 실험을 위해, 투여 직전에 바이러스 농축액과 1:1의 부피비(예:0.1mL씩 혼합)하여 실험동물에 투여하게 하였다.

	글루 코오 스 % (w/v)	만노 오스 % (w/v)	L- 라이 신 % (w/v)	콜라 겐 % (w/v)	키토 산 % (w/v)	알파- 토코 페롤 % (w/v)	둘시 톨 % (w/v)	알긴 산 나트 륨 % (w/v)	0.1mM MgCl₂ 수용 액 % (w/v)	총합 % (w/v)
제조예 1	2.4	6.5	0.1	0.3	1	0.1	0.1	1	0.5	12
제조예 2	1.1	4.3	1	0.6	1.5	0.05	0.25	2.5	0.7	12
제조예 3	2.5	4.7	0.5	0.1	3	0.2	0.5	0.4	0.1	12

비교 제조예 1	0	9.4	1	1	0	0.1	0	0	0.5	12
비교 제조예 2	5	0	1	4.3	1	0.1	0.2	0	0.4	12
비교 제조예 3	5	2	2	2	0.1	0.1	0.1	0.4	0.3	12
비교 제조예 4	1	0.5	1	5	2	0.1	0.2	1	1.2	12
비교 제조예 5	3	5	0	0	2	0.1	1	0.9	0	12

<실험예 1. 실험동물의 준비 및 백신 투여>

실시예 2에서 보조제 조성물과 혼합하여 제조한 백신 조성물을 1차, 2차, 3차까지 각 그룹별로 5마리씩 귀정맥 투여방법으로 3~4일 간격으로 접종하였다. 최종 면역 후 3주가 되었을 때 기니피그를 대한실험동물학회에서 권고하는 주사마취제를 이용하여 전신마취 한 후, 심장채혈을 통하여 혈액을 채취하였고 채취한 혈액은 4℃에서 24~48시간 정치하여 혈장이 응고되도록 한 후, 8,000rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액 (맑은 혈청)만을 분리하였다. 분리한 혈청은 56℃의 water bath에서 30분간 불활화하여 보체의 활성을 파괴한 후, 적량의 sodium azide 용액을 첨가하고 사용할 때까지 초저온 냉동고(-70℃ 이하)에 보관하였다.

<실험예 2. ELISA(enzyme-linked immunospecific assay)를 통한 항체 형성 능력 확인>

백신이 투여된 기니피그 혈청을 이용하여 ELISA를 수행하였다. 이를 위해, 혈청을 농도별로 0.05M 탄산염완충용액(pH 9.6)에 희석하여 96웰 마이크로플레이트에 코팅한 후 4℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 0.05% Tween 20이 포함된 인산완충용액(PBST)로 2회 세척한 후 3% BSA로 37℃에서 2시간 동안 블로킹을 하였다. 1차 항체를 희석하여 결합 및 세척하고, 2차 항체는 Horse-radish conjugate anti-rat IgG (IgM)를 1:6000으로 희석해 사용하였다. 발색기질용액으로 발색시킨 후 ELISA 판독기로 파장 490nm에서 OD를 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 방법으로 제조한 백신에서 항체 형성이 잘 되는 것으로 나타났고, 실시예 1의 백신 조성물에서 생성된 ELISA 반응 결과물은 도 1(기니피그 개체 2마리)에 예시로서 나타내었다. 각 실험 결과는 다음의 표 2에 항원항체 반응의 여부 (항체반응:o, 항체반응없음:x)로 나타내었다.

	접종 전	3차 접종 후 3주	3차 접종 후 5주	3차 접종 후 7주	3차 접종 후 9주
제조예 1	x	o	o	o	o
제조예 2	x	o	o	o	o
제조예 3	x	o	o	o	o
제조예 4	x	o	o	o	o
제조예 5	x	o	o	o	o

비교 제조예 1	x	x	x	o	o
비교 제조예 2	x	x	x	x	x
비교 제조예 3	x	x	x	o	o
비교 제조예 4	x	x	x	x	x
비교 제조예 5	x	x	x	o	o
비교 제조예 6	x	x	x	x	o
비교 제조예 7	x	x	x	o	o

실험결과, 각 제조예들의 백신 조성물의 3차 접종 이후부터 IgG 면역 항체가 형성되는 것이 확인되었다. 이에 반해 비교제조예들의 백신은 항체 생성 시간이 더 오래걸리거나 접종 효과가 거의 나타나지 않았다. 또는 3차 접종 이후 추가 접종이 더 필요한 것으로 보여졌다.

<실험예 3. 면역형광항체법(immunofluorescence assay, IFA)을 통한 항체 형성 능력 확인>

IFA 실시를 위해 항원 슬라이드를 제조하였다. 이를 위해 80 웰 슬라이드에 약독화된 바이러스 농축액을 농도별로 웰 당 2 ㎕씩 떨어뜨린 후, 37℃ 항원슬라이드 건조배양기에서 건조하고 -20℃에 보관한 차가운 아세톤으로 상온에서 15분간 고정하였다. 이후 항원이 고정된 항원슬라이드는 사용하기 전까지 -70 ~ -80℃ 정도의 초저온 냉동고에 보관하였다.

IFA를 위해 백신이 접종된 기니피그의 혈청을 항원 슬라이드의 각 웰에 항원이 고정된 슬라이드의 각 웰에 2㎕ 씩 떨어뜨린 후, moist chamber에 넣고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이후 PBS (pH 7.6)로 3회 세척하여 항원과 반응하지않은 잔여혈청(비특이적 반응물)을 제거하고 공기 중에서 살짝 건조시켰다. 다음의 2차 항체반응으로 멸균 PBS(pH 7.6)을 이용하여 400배로 희석된 FITC가 결합된 기니피크의 2차 항체를 각 웰 당 2㎕ 씩 떨어뜨린 후, 슬라이드를 moist chamber에 넣고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 다시 PBS (pH 7.6)로 반응시킨 슬라이드를 2회 세척하고 멸균 증류수로 1회 세척하여 항원-항체반응을 하지 않은 잔여 컨쥬게이트(conjugate)를 제거한 후, 공기 중에서 살짝 건조시켰다. Mounting fluid (pH 9.0)를 웰에 떨어뜨리고 커버글래스(cover glass, 22x60 ㎜)를 덮은 후, 형광현미경으로 400배에서 확인하였다.

백신의 효능은 표 3에 나타내었고, 이를 대표하여 도 2에 실시예 1의 백신 조성물의 결과(기니피그 개체 2마리)를 나타내었다.

	접종 전	3차 접종 후 3주	3차 접종 후 5주	3차 접종 후 7주	3차 접종 후 9주
제조예 1	x	o	o	o	o
제조예 2	x	o	o	o	o
제조예 3	x	o	o	o	o
제조예 4	x	o	o	o	o
제조예 5	x	o	o	o	o

비교 제조예 1	x	x	x	o	o
비교 제조예 2	x	x	x	x	o
비교 제조예 3	x	x	x	o	o
비교 제조예 4	x	x	x	x	x
비교 제조예 5	x	x	x	o	o
비교 제조예 6	x	x	x	x	x
비교 제조예 7	x	x	x	x	o

실험결과, 각 제조예들의 백신 조성물의 3차 접종 이후부터 항체형성이 되었음을 나타나 ELISA와 그 결과가 같았다. 이에 반해 비교제조예들의 백신도 역시 ELISA 결과와 유사하게 항체 생성 시간이 더 오래걸리거나 접종 효과가 거의 나타나지 않았다. 또는 3차 접종 이후 추가 접종이 더 필요한 것으로 보여졌다.

이와 같은 면역보조제가 나타낼 수 있는 부스터 효과는 소량의 불활성화된 바이러스 백신을 투여하더라도 빠른 시간 내에 체내 면역화를 이룰 수 있고, 불활성화되었기는 하더라도 각 개체에 따라 다르게 나타날 수 있는 부작용을 최소화 할 수 있는 방법임을 입증한다.

한편, 본 발명은 면역보조제의 특성을 이용한 바이러스의 백신의 제조방법에 목적을 두는 바, 이 외의 , 대학병원 내원 환자 중 중증 열성 혈소판 감소증 증상이 의심 되는 환자의 혈액, 동물 (염소 및 유기견)의 혈액 및 야생 진드기 균질물을 이용하여 real time PCR, PCR 및 ELISA 분석으로 SFTSV (severe fever thrombocytopenia syndrome virus, 중증열성 혈소판 감소증 바이러스)의 양성을 확인하고, 이들로부터 얻은 시료 또는 질병관리본부에서 얻은 임상시료 등의 다른 바이러스 감염 개체로부터 혈청을 얻어 본 발명의 바이러스 백신 제조방법을 동일하게 수행하여 유사한 백신 효능이 나타남을 확인하였다.

<110> KIM, Hyun Sook <120> Manufacturing method of vaccine composition for preventing severe fever with thrombocytopenia syndrome virus diseases <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1725 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> severe fever thrombocytopenia syndrome virus <400> 1 cccccttcat ttggaaacca tgtcgctgag caaatgctcc aacgttgacc tcaagtctgt 60 agcaatgaat gccaacactg ttaggcttga accatctcta ggagagtacc ccactcttag 120 gaaagacctc gttgaatgct cttgtagtgt gttgactcta tcaatggtca agaggatggg 180 caagatgacc aacacagtat ggttatttgg caacccaaaa aatcctcttc accagcttga 240 gcctggactt gagcagctgt tggatatgta ctacaaggac atgaggtgct actcccagag 300 agagctgagt gcccttaggt ggcctagtgg gaagccttct gtatggttcc tacaggcagc 360 tcacatgttc ttttccatca agaacagctg ggcaatggaa accggtagag agaactggcg 420 gggcctcttc cacaggataa caaaaggcaa aaagtatctt tttgaagggg acatgatatt 480 ggattctctt gaagccatag agaagcgaag gctcagactt gggttacctg agatcctaat 540 aactggacta tccccaattc tggatgtggc cctcctccag atagagtcac ttgcaaggct 600 aagaggcatg agcttgaacc accacttatt cacttcttcc tcactgcgta agcctctgtt 660 agattgttgg gacttcttta ttcctatccg caaaaagaag acagatggct catacagtgt 720 tttggatgag gatgatgagc ctggggtcct tcaaggttac ccatatctga tggcacacta 780 tctgaacagg tgcccattcc acaacctcat cagatttgat gaagaactga gaactgcagc 840 cctgaacacc atctggggaa gagattggcc ggccattggt gacctcccga aggaggtcta 900 attttgtcga attggatcaa gaaatttagc ctaattggat atgtcaaata gctgcttaca 960 ggtttctgta agcagcagca gcaacctcag cagctctgct ggggacccca tctgggccaa 1020 ggattccctt ggccttcagc cacttcaccc gaacatcatt gggaaagaag acagagttca 1080 cagcagcatg gaggggatct ctgaaggagt tgtaaacctc tgtcttgctg gctccacgca 1140 tcttcacatt aatagtcttg gtgaaggcat cttgccacag agagtaggcc tccatcaggg 1200 tcttcgttgt ggcttctgat acccctgcag ttggaatcag agacccaaag gccatgcaca 1260 tcatctctgg ggggtaattc tcgaccttca ggttcatgac agctgggccc actgggagat 1320 actcctttaa ggctgctgct gcagcgcatg tccaagtggg aaggctctgt gctaccctca 1380 caggagtgat tgagagcctg gtttctgccc tctcaaccag tccatatttc tcttgaagtg 1440 ccatcaacct cttagaccct gagtttgaca ttttccctga tgccttgacg atcttgttgc 1500 ctcgggtcag ggcaaagaca atgatgaact ttgtatctct cacccaatca tctccacctg 1560 tctccttcag cttcttgatt atcaaggcag gatcaaggcc ttcataggct agctctctcg 1620 cgaaatcctc aagctcagtc aaattgagct gctgctcacc aaactccact gcaatcctgg 1680 accactctga catgatcact cctttgcgtc tttccttttt ggggg 1725 <210> 2 <211> 3361 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> severe fever thrombocytopenia syndrome virus <400> 2 acacagagac ggccaacaat gatgaaagtc atctggttct cctctctgat ctgcttagtc 60 attcaatgca gtggggatac gggcccaatc atatgcgctg ggcccatcca ctcaaacaag 120 agcgccaaca taccccacct gcttggttac tctgagaaaa tttgtcagat agatcggctg 180 atacatgttt cgtcatggct gagaaaccat tcacaatttc agggctacgt gggacagcga 240 ggtggacgct ctcaggtgag ttactaccca gctgaaaact cttactcaag gtggagtgga 300 cttctaagcc cctgtgatgc tgattggctt gggatgcttg tcgtgaagaa ggccaagggg 360 tctgatatga tagttccagg gccttcatac aaagggaaag tcttctttga acggccaact 420 tttgatggat atgtgggctg gggctgtggt agtgggaagt caaggacaga gtcaggtgag 480 ctctgcagct cagactcagg gaccagttct ggtctactgc cctcaaatag ggttctctgg 540 ataggtgatg ttgcttgcca gcctatgaca cccatccctg aggagacatt tctggagctg 600 aagagtttta gccagagtga attcccagac atatgcaaaa ttgatggcat tgtgttcaac 660 cagtgtgaga gtgagagtct acctcagccc tttgatgtcg catggatgga tgtaggccac 720 tctcataaaa tcatcatgag ggagcacaag accaaatggg tacaagagag ctcatctaag 780 gattttgtgt gctacaagga agggactggg ccgtgttctg aatcagaaga aaagacttgc 840 aagaccagtg gatcatgcag gggggacatg cagttttgca aggtagcagg ttgtgaacat 900 ggggaagagg catctgaagc caagtgtaga tgctcactag tgcacaagcc cggggaagtt 960 gttgtgtcat atggagggat gcgtgtcaga ccaaagtgtt atggtttctc cagaatgatg 1020 gcaacactag aggtgaaccc accagagcaa agaattggcc aatgcactgg ctgccatcta 1080 gaatgcataa atgggggtgt gaggctaatt actctaacta gtgagctcaa gtcagctact 1140 gtctgtgctt cccacttttg tagttctgct acaagtggca agaaaagcac ggagattcaa 1200 ttccactcag ggtcattagt tgggaaagca gcaattcacg tcaaagggac tttggtggat 1260 ggaactgaat tcacatttga gggcagttgc atgttcccag atggttgtga cgcagtggac 1320 tgcacattct gtcgcgagtt cctaaaaaat cctcagtgct accctgcaaa gaaatggttg 1380 ttcataatta ttgccaccct ccttggatat gcaggcctca tgctgctcac caatgttctt 1440 aaggcaatcg gggtttgggg atcatgggtc atagctccag tgaagctgat gtttgccatc 1500 ataaagaaac tgatgagatc tgtgagctgc ttgatgggga aattaatgga taggggaagg 1560 caagtgatcc atgaagaaat aggggagaat agagagggca accaagaaga tgttaggatt 1620 gagatggcaa gacccagaag ggtgagacat tggatgtact cacctgtcat cctggctatt 1680 ctagcaattg ggcttgctga gggctgcgat gagatggtcc atgcagattc aaaacttgtt 1740 tcgtgcaggc aagggagcgg aaatatgaag gaatgtgtca caactgggag ggcgcttctt 1800 cctgcggtga acccaggaca agaggcatgt ctgcacttaa cggcacctgg aagtccggac 1860 tcaaaatgtc tcaaaatcaa ggttaagagg atcaacctaa aatgtaagaa gtcatcatca 1920 tattttgttc ctgatgctcg gtccagatgt acgtctgtga ggagatgtcg ctgggcagga 1980 gactgtcagt ctgggtgccc ctctcatttc acgtccaact ccttctctga tgattgggca 2040 ggtaaaatgg acagggctgg tctaggattc agtgggtgct ctgatggatg tggaggagca 2100 gcctgcggct gctttaatgc ggccccttca tgcatctttt ggaggaaatg ggtagagaat 2160 ccacatggga tcatctggaa agtatctcca tgtgctgcat gggtcccttc agcagtcata 2220 gagctaacaa tgccctcggg ggaagtgagg acattccacc ccatgagcgg catccccaca 2280 caagtcttca agggtgtgag tgtgacttac ttaggctcag atatggaggt gtctggcctg 2340 actgacctgt gtgagataga agagctcaag tccaagaagc tggcattagc tccctgcaat 2400 caggctggca tgggagttgt gggcaaggtt ggagagatac agtgcagtag cgaggaaagc 2460 gcccgttcca taaagaaaga tgggtgtata tggaatgctg accttgtggg catagagcta 2520 cgagtggatg acgcagtgtg ctattctaag atcactagtg tggaggctgt tgcaaactac 2580 tctgccatac ccaccactat tggggggttg aggtttgaga gaagccatga cagccagggt 2640 aaaatatctg gtagccccct agacattaca gccataagag ggtctttttc cgttaattat 2700 agaggccttc gactgagcct ctcagaaatc actgctactt gcacaggaga ggtgacgaat 2760 gtgagtgggt gttactcttg catgacaggc gccaaagtct ccatcaaact gcatagcagc 2820 aaaaatagca ctgcccatgt aagatgcaaa ggggatgaga ccgcattcag tgtcctggag 2880 ggagttcaca gctatactgt cagtcttagc tttgaccatg cagtggtcga tgagcagtgc 2940 cagctgaact gtggggggca tgagagtcaa gtgactctaa aaggcaacct catcttcctg 3000 gatgtcccaa aatttgtaga tggcagctat atgcagacat atcatagttc tgtgcccaca 3060 ggggctaata tcccaagccc tacagactgg ctgaatgcct tgtttggcaa tgggctgagt 3120 aggtggattc ttggggtaat aggggttcta ctggggggat tggctctctt cttcttaatc 3180 atgtccttgt tcaaactggg aacaaaacag atattccgat caaggacgaa gctggcttag 3240 atgggcaaaa ttctggtcta gtgaccctct gagagcagtg ctctcagggg agttggctca 3300 ctgtgtacat gtttcgtggt cctggctcac attcttagag catggaggtt ctattaaagt 3360 g 3361 <210> 3 <211> 6320 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> severe fever thrombocytopenia syndrome virus <400> 3 agacgcccag atgaacttgg aagtgctttg tggtaggata aacgtggaga atgggctgtc 60 tcttggagaa ccaggcctgt acgaccaaat ctacgacagg ccagggctgc cagacctaga 120 tgtgactgtc gatgccacag gtgtgacagt ggacataggg gctgtgccag actcagcatc 180 acaactgggt tcatcaatca atgctgggtt gatcacaatc cagctctctg aagcatataa 240 gatcaatcat gatttcacgt tttttggcct gtcaaagaca acagaccgac gcctctcaga 300 ggtattcccc attacacatg atggttctga tgggatgacc cctgatgtga tccacaccag 360 attggatgga accattgtgg tggttgaatt ttcaactact aggagccata 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gctacaggta tacctcctca ggaagcatct ggattgcatg gtgcgaattg cttcacagcc 2160 attcagcctg atccctagag aggggagggt agaatgggga gggacattcc atgccatctc 2220 aggccggtcc acaaaccttg agaatatggt aaacagctgg tacattgggt actacaagaa 2280 caaagaggag tcaacagagc taaatgctct tggagaaatg tataagaaga ttgtggagat 2340 ggaagaggac aagcccagca gccctaagtt tctagggtgg ggggacactg attcccctaa 2400 gaagcatgaa ttctcacgga gcttcctcag agctgcttgc tcatctctgg agagagaaat 2460 tgctcagcga catggaagac aatggaagca gaaccttgag gagcgtgtcc tgagagagat 2520 tggaaccaag aacatcctag accttgcatc tatgaaggct acaagcaact tttccaaaga 2580 ctgggagctc tactcagaag tccagaccaa agagtaccat aggtccaaat tgctggagaa 2640 gatggccaca ttgattgaga agggggttat gtggtacatt gatgctgtgg gccaggcatg 2700 gaaggcagtt ctagatgacg ggtgcatgcg aatctgtctc ttcaaaaaga atcagcatgg 2760 tggcctcaga gagatctacg ttatggatgc aaatgcccgg ctcgtgcagt ttggggttga 2820 gaccatggct aggtgtgtct gtgagctgag cccacatgag actgttgcca atcctaggct 2880 taagaattcc atcatagaga accatgggct gaagtcagcc cgtagccttg gccctggctc 2940 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Claims

(제1단계) 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스를 동물세포주에서 배양하는 단계;
(제2단계) 동물세포주의 배양액을 수거하여 포르말린을 처리하여 바이러스를 불활화하는 단계;
(제3단계) 불활화된 바이러스가 포함된 배양액을 한외 여과 및 원심분리하여 바이러스를 농축하는 단계; 및
(제4단계) 농축된 바이러스를 글루코오스, 만노오스, L-라이신, 콜라겐, 키토산, 알파-토코페놀, 둘시톨 및 알긴산나트륨을 혼합한 면역 보조제 조성물이 주입된 백신용기에 주입하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 질환의 예방용 백신 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 동물세포주는 포유동물의 세포주인 것을 특징으로 하는 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 질환의 예방용 백신 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 농축된 바이러스는 8.6-9.8 Log EID50/0.5 ml의 바이러스 수율을 갖는 것을 특징으로 하는 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 질환의 예방용 백신 조성물의 제조방법.
제1항 내지 제3항의 방법으로 제조한 것을 특징으로 하는 중증 열성 혈소판 감소 증후군 바이러스 질환의 예방용 백신 조성물.
서열번호 1 내지 3의 유전자를 갖는 중증 열성 혈소판 감소증 바이러스 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 중증 열성 혈소판 감소증의 예방 또는 치료용 면역원성 조성물.
제5항에 있어서,
상기 면역원성 조성물은 백신인 것을 특징으로 하는 중증 열성 혈소판 감소증의 예방 또는 치료용 면역원성 조성물.
제5항에 있어서,
상기 면역원성 조성물에 글루코오스, 만노오스, L-라이신, 콜라겐, 키토산, 알파-토코페놀, 둘시톨 및 알긴산나트륨을 혼합한 면역 보조제 조성물이 함유되는 것을 특징으로 하는 중증 열성 혈소판 감소증의 예방 또는 치료용 면역원성 조성물.