CN100543132C - 引起严重急性呼吸道综合征(sars)的新型人病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及引起人类严重急性呼吸道综合征(SARS)的分离的新型病毒(“hSARS病毒”)。经鉴定，hSARS病毒在形态学上和系统发生学上与已知的冠状病毒科(Coronaviridae)成员相类似。本发明提供hSARS病毒的全基因组序列。此外，本发明提供由hSARS病毒编码和/或衍生的核酸和肽以及它们在诊断方法和治疗方法中的应用，包括疫苗。另外，本发明提供由所述核苷酸序列编码的嵌合病毒或重组病毒以及对所述核苷酸序列编码的多肽具有免疫特异性的抗体。

Description

引起严重急性呼吸道综合征(SARS)的新型人病毒及其应用

本申请要求以下申请的优先权：2003年3月24日提交的美国临时申请60/457,031、2003年3月26日提交的美国临时申请60/457,730、2003年4月2日提交的美国临时申请60/459,931、2003年4月3日提交的美国临时申请60/460,357、2003年4月8日提交的美国临时申请60/461,265、2003年4月14日提交的美国临时申请60/462,805、2003年4月23日提交的美国临时申请60/464,886，上述各申请通过引用整体结合到本文中。

本申请包含一份长序列表，该序列表通过一式三份的CD-R代替印刷的纸质文本一并提交，其通过引用整体结合到本文中。所述CD-R于2004年3月16日刻录，分别标记为“CRF”、“Copy1”和“Copy2”，每个只含有一个相同的1.58MB文件(V9661069.APP)。

1.前言

本发明涉及引起人类严重急性呼吸道综合征(SARS)的分离的新型病毒(“hSARS病毒”)。经鉴定，hSARS病毒在形态学上和系统发生学上与已知的冠状病毒科(Coronaviridae)成员相类似。本发明涉及包含hSARS病毒全基因组序列的核苷酸序列。本发明进一步涉及包含hSARS病毒一部分基因组序列的核苷酸序列。本发明还涉及hSARS病毒全基因组序列的推断氨基酸序列。本发明还进一步涉及由这些序列编码和/或衍生的核酸和肽及它们在诊断方法和治疗方法(例如用作免疫原)中的应用。本发明更进一步包括所述核苷酸序列编码的嵌合病毒或重组病毒以及抗所述核苷酸序列编码的多肽的抗体。此外，本发明涉及包含hSARS病毒的疫苗制品，包括所述病毒的重组形式和嵌合形式以及所述病毒的蛋白提取物和亚单位。

2.发明背景

最近，中国大陆的广东省爆发了非典型肺炎。在2002年11月到2003年3月之间，报道了792例病例，其中31例死亡(WHO.SevereAcute Respiratory Syndrome(SARS)Weekly Epidenziol Rec.2003；78：86)。为应对此次危机，香港医院管理局加强了对严重非典型肺炎患者的监视。在此次调查过程中，确认了多个卫生保健工作者患有此病。另外，与此病感染者密切接触的人中出现多个肺炎病例。尽管采用了针对已知通常与非典型肺炎有关的细菌病原体的典型抗生素治疗方法，此病的严重程度和发展仍非同寻常。本发明的发明者是参与调查这些患者的小组之一。在这些患者中，对常见病毒和细菌的所有鉴定试验结果均为阴性。此病按严重急性呼吸道综合征(Severe AcuteRespiratory Syndrome)的首字母缩略词命名(SARS)。在本发明发明者从SARS患者分离出本文所公开的hSARS病毒之后，才了解了此病的病源因子。也就是说，本发明公开了从SARS患者分离和鉴定出来的新型人病毒。本发明可用于临床和科学研究用途。

3.发明概述

本发明基于本发明发明人对引起人类严重急性呼吸道综合征的新型病毒(“hSARS病毒”)的分离和鉴定。所述病毒是从在最近中国的严重非典型肺炎爆发中患上SARS的患者中分离出来的。该分离病毒是正极性有包膜单链RNA病毒，属巢病毒(Nidovirales)目冠状病毒科(Coronaviridae)。因此，本发明涉及在形态学上和系统发生学上与已知的冠状病毒科成员相关的分离hSARS病毒。在一个具体的实施方案中，分离hSARS病毒是下文第7节所述的于2003年4月2日保藏于中国典型培养物中心(CCTCC)、给予保藏号CCTCC-V200303的病毒。在另一具体的实施方案中，本发明提供hSARS病毒的全基因组序列。在一个优选实施方案中，病毒包含SEQ ID NO：15核苷酸序列。在另一具体的实施方案中，本发明提供从病毒分离的核酸。所述病毒优选在其基因组中包含SEQ ID NO：1、11和/或13核苷酸序列。在一个具体的实施方案中，本发明提供如下分离核酸分子，所述分离核酸分子包含或由SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其互补序列或其部分组成，优选SEQ ID NO：1核苷酸序列或其互补序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600或更多个连续核苷酸。在另一具体的实施方案中，本发明提供如下分离核酸分子，所述分离核酸分子包含或由SEQ ID NO：11的核苷酸序列或其互补序列或其部分组成，优选SEQ ID NO：11核苷酸序列或其互补序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200或更多个连续核苷酸。在又一个具体的实施方案中，本发明提供如下分离核酸分子，所述分离核酸分子包含或由SEQ ID NO：13的核苷酸序列或其互补序列或其部分组成，优选SEQ ID NO：13核苷酸序列或其互补序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700或更多个连续核苷酸。在另一具体的实施方案中，本发明提供如下分离核酸分子，所述分离核酸分子包含或由SEQ ID NO：15核苷酸序列或其互补序列或其部分组成，优选SEQ ID NO：15核苷酸序列或其互补序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000或更多个连续核苷酸。此外，在另一具体实施方案中，本发明提供能在本文定义的严格条件下与具有SEQID NO：1、11、13、15、16、240、737、1108、1590或1965序列或其互补物的核酸分子杂交的分离核酸分子。在一个实施方案中，本发明提供与本发明核酸的编码链反义的分离核酸分子。在另一具体的实施方案中，本发明提供由如下核酸分子编码的分离多肽或蛋白质，所述核酸分子包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQ IDNO：1核苷酸序列或其互补序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600或更多个连续核苷酸。在又一个具体的实施方案中，本发明提供由如下核酸分子编码的分离多肽或蛋白质，所述核酸分子包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQ ID NO：11核苷酸序列或其互补序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200或更多个连续核苷酸。在又一个具体的实施方案中，本发明提供由如下核酸分子编码的分离多肽或蛋白质，所述核酸分子由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQ ID NO：13核苷酸序列或其互补序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700或更多个连续核苷酸。在又一个具体的实施方案中，本发明提供由如下核酸分子编码的分离多肽或蛋白质，所述核酸分子包含或由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列为SEQ ID NO：15核苷酸序列或其互补序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000或更多个连续核苷酸。本发明进一步提供从hSARS病毒分离的蛋白质或多肽，包括从感染病毒的细胞中分离出来、但不存在于可比较的未感染细胞中的病毒蛋白质。本发明进一步提供SEQ ID NO：2、12和14的蛋白质或多肽以及图11(SEQ ID NO：17-239、241-736和738-1107)和图12(SEQ ID NO：1109-1589、1591-1964、1966-2470)所示的蛋白质或多肽。本发明多肽或蛋白质优选具有SEQ ID NO：1、11、13、16、240、737、1108、1590或1965序列编码的蛋白质的生物活性(包括抗原性和/或免疫原性)。在其它实施方案中，本发明多肽或蛋白质具有如下核苷酸序列编码的蛋白质的生物活性(包括抗原性和/或免疫原性)，所述核苷酸序列为SEQ ID NO：15核苷酸序列或其互补序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000或更多个连续核苷酸。在其它实施方案中，本发明多肽或蛋白质具有图11(SEQ ID NO：17-239、241-736和738-1107)和图12(SEQ ID NO：1109-1589、1591-1964、1966-2470)的蛋白质的生物活性(包括抗原性和/或免疫原性)。

在一方面，本发明提供在宿主细胞中增殖hSARS病毒的方法，所述方法包括用分离hSARS病毒感染宿主细胞，培养宿主细胞以使病毒繁殖以及收获所得的病毒颗粒。本发明还提供被hSARS病毒感染的宿主细胞。在另一方面，本发明涉及分离hSARS病毒在诊断方法和治疗方法中的应用。在一个具体实施方案中，本发明提供在生物样品中使用分离hSARS病毒或其任何蛋白质或多肽检测对hSARS病毒具有免疫特异性的抗体的方法。在另一具体的实施方案中，本发明提供筛选免疫特异性结合或中和hSARS的抗体的方法。这种抗体可用于对感染了hSARS的患者进行被动免疫或免疫疗法。

本发明进一步涉及分离病毒的序列信息在诊断方法和治疗方法中的应用。在一个具体实施方案中，本发明提供适合用作引物的核酸分子，该引物包含或由SEQ ID NO：1、11、13或15核苷酸序列或其互补序列或至少其核苷酸序列的一部分组成。在另一具体的实施方案中，本发明提供适合与hSARS核酸进行杂交的核酸分子，所述核酸分子包括但不限于PCR引物、逆转录酶引物、用于Southern分析或其它核酸杂交分析以检测hSARS核酸的探针，例如包含或由SEQ ID NO：1、11、13或15核苷酸序列或其互补序列或其部分组成。本发明进一步包括由所述核苷酸序列全部或部分编码的嵌合病毒或重组病毒。

本发明进一步提供抗体，所述抗体能特异性地结合由SEQ IDNO：1、11、13、16、240、737、1108、1590或1965核苷酸序列或其片段编码的本发明多肽、或由包含在严格条件下与SEQ ID NO：1、11或13核苷酸序列杂交的核苷酸序列的核酸编码的本发明多肽、和/或具有本发明多肽一种或多种生物活性的任何hSARS表位。本发明进一步提供能特异性结合由SEQ ID NO：15核苷酸序列或其互补序列或其片段编码的本发明多肽的抗体。这些多肽包括图11(SEQ ID NO：17-239、241-736和738-1107)及图12(SEQ ID NO：1109-1589、1591-1964和1966-2470)所示的多肽。本发明进一步提供抗体，所述抗体能特异性地结合由包含在严格条件下与SEQ ID NO：15核苷酸序列杂交的核苷酸序列的核酸编码的本发明多肽，和/或具有本发明多肽一种或多种生物活性的任何hSARS表位。这种抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab′)₂片段、二硫键连接的Fvs、胞内抗体和含有能与本发明多肽特异性结合的VL或VH结构域或甚至互补决定区(CDR)的片段。

在一个实施方案中，本发明提供在生物材料如细胞、血液、唾液、尿等中检测本发明hSARS病毒的存在、活性或表达的方法。样品中hSARS病毒其活性或表达相对于对照样品的提高或降低如下确定，即将生物材料与能直接或间接检测hSARS病毒的存在、活性或表达的试剂相接触。在一个具体实施方案中，检测试剂是本发明抗体或核酸分子。本发明抗体也可用来治疗SARS。

在另一实施方案中，本发明提供包含hSARS病毒(包括所述病毒的重组形式和嵌合形式)或病毒的蛋白质亚单位的疫苗制品。在一个具体实施方案中，本发明疫苗制品包含活的但减毒的hSARS病毒，有或没有佐剂。在另一具体的实施方案中，本发明疫苗制品包含灭活或死的hSARS病毒。可通过病毒在宿主细胞中进行一系列的传代或通过制备病毒的重组形式或嵌合形式来制备这种减毒或灭活病毒。因此，本发明进一步提供制备hSARS的重组形式或嵌合形式的方法。在另一具体的实施方案中，本发明疫苗制品包含hSARS病毒(例如保藏号为CCTCC-V200303的病毒)的核酸或片段，或具有SEQ ID NO：1、11、13或15序列或其片段的核酸分子。在另一实施方案中，本发明提供包含从hSARS病毒(例如保藏号为CCTCC-V200303的病毒)分离的或从其核酸生产的一种或多种多肽的疫苗制品。在一个具体实施方案中，疫苗制品包含由SEQ ID NO：1、11、13、16、240、737、1108、1590或1965核苷酸序列或其片段编码的本发明多肽。在一个具体实施方案中，疫苗制品包含图11(SEQ ID NO：17-239、241-736和738-1107)及图12(SEQ ID NO：1109-1589、1591-1964和1966-2470)所示的本发明多肽或SEQ ID NO：15核苷酸序列或其片段编码的本发明多肽。此外，本发明提供通过单独或与佐剂或其它药物可接受赋形剂联合给予本发明疫苗制品或抗体来治疗、改善、控制或预防SARS的方法。

在另一方面，本发明提供包含本发明抗病毒药物和药物可接受载体的药物组合物。在一个具体实施方案中，本发明抗病毒药物是免疫特异性结合hSARS病毒或任何hSARS表位的抗体。在另一具体的实施方案中，抗病毒药物是本发明多肽或蛋白质或本发明核酸分子。本发明还提供包含本发明药物组合物的试剂盒。

3.1 定义

本文所用术语“免疫特异性结合本发明多肽的抗体或抗体片段”指免疫特异性结合SEQ ID NO：1、11、13或15核苷酸序列或其片段编码的多肽、且不会非特异性地结合其它多肽的抗体或其片段。免疫特异性结合本发明多肽的抗体或其片段可与其它抗原发生交叉反应。优选免疫特异性结合本发明多肽的抗体或其片段不与其它抗原发生交叉反应。免疫特异性结合本发明多肽的抗体或其片段可例如通过免疫测定或本领域技术人员熟知的其它技术进行鉴定。

“分离的”或“纯化的”肽或蛋白质基本不含来自所述蛋白质的细胞源或组织源的细胞材料或其它污染蛋白质，或当它们通过化学法合成时，基本不含化学前体或其它化学物质。措词“基本不含细胞材料”包括多肽/蛋白质制品，其中多肽/蛋白质从其分离或重组生产的细胞的细胞成分中分离出来。因此，基本不含细胞材料的多肽/蛋白质包括含少于约30％、20％、10％、5％、2.5％或1％(干重)污染蛋白质的多肽/蛋白质制品。当多肽/蛋白质为重组生产时，还优选基本不含培养基，即培养基占蛋白质制品的体积少于约20％，、10％或5％。当多肽/蛋白质通过化学合成生产时，优选基本不含化学前体或其它化学物质，即与参与蛋白质合成的化学前体或其它化学物质分离。因此，这种多肽/蛋白质制品含少于约30％、20％、10％、5％(干重)不属于目的多肽/蛋白质片段的化学前体或化合物。在本发明优选的实施方案中，多肽/蛋白质是分离的或纯化的。

“分离的”核酸分子是与其天然来源中存在的其它核酸分子分离的核酸分子。此外，“分离的”核酸分子如cDNA分子，当通过重组技术生产时可基本不含其它细胞材料或培养基，当通过化学法合成时可基本不含化学前体或其它化学物质。在本发明优选的实施方案中，编码本发明多肽/蛋白质的核酸分子是分离的或纯化的。术语“分离的”核酸分子不包括属于文库的成员、还未与含有其它核酸分子的其它文库克隆分离的核酸。

本文所用术语“部分”或“片段”指含有相关核酸分子长度的至少约25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000或更多个连续核酸，且具有相关核酸分子的至少一种功能特征(或其编码的蛋白质具有相关核酸分子所编码的蛋白质的一种功能特征)的核酸分子片段；或指含有相关蛋白质或多肽的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、400、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,100、4,200、4,300、4,350、4,360、4,370、4,380个氨基酸残基长度，且具有相关蛋白质或多肽的至少一种功能特征的蛋白质或多肽片段。

术语“具有本发明蛋白质的生物活性”或“具有本发明多肽的生物活性”指具有共同生物活性的多肽或蛋白质的特性，其与SEQ IDNO：1、11、13、15、16、240、737、1108、1590或1965核苷酸序列编码的多肽相比具有类似或相同结构域和/或具有足够的氨基酸一致性。本发明多肽的这种共同生物活性包括抗原性和免疫原性。

术语“在严格条件下”指相互之间具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％一致性的核苷酸序列保持互相杂交的杂交和洗涤条件。这种杂交条件例如但不限于在CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6.；Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier Science PublishingCo.，Inc.，N.Y.(1986)，第75-78页和第84-87页；及Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1982)，第387-389页中描述，对本领域技术人员来说是熟知的。优选的严格杂交条件的非限制性实例是，在约68℃下6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5％SDS中杂交，然后在室温下2X SSC、0.5％ SDS中洗涤一次或多次。优选的严格杂交条件的另一个非限制性实例是，在约45℃下6X SSC中杂交，然后在约50-65℃下0.2X SSC、0.1％ SDS中洗涤一次或多次。

本文所用术语“变体”指天然产生的hSARS基因突变株或重组制备的hSARS突变体，与CCTCC-V200303的hSARS相比，它们各自在其基因组中含有一个或多个突变。术语“变体”也可指特定肽的天然产生的突变体或特定肽或蛋白质的重组制备的突变体，其中一个或多个氨基酸残基通过氨基酸置换、插入或缺失被修饰。

4.附图说明

图1显示从SARS病毒获得的部分DNA序列(SEQ ID NO：1)及其推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，所述SARS病毒与已知冠状病毒(Coronaviruses)的RNA依赖性RNA聚合酶蛋白具有57％的同源性。

图2显示具有类似冠状病毒的形态学特征的新型hSARS病毒的电子显微照片。

图3显示与感染新型冠状病毒科(Coronaviridae)人呼吸道病毒的FrHK-4细胞特异性结合的IgG抗体的免疫荧光染色。

图4显示生长于细胞培养物中、在pH7.0用3％磷钨酸钾负染色的hSARS病毒的超离心沉积物的电子显微照片。

图5A显示SARS患者的肺活组织切片检查的薄层切片电子显微照片；图5B显示hSARS感染细胞的薄层切片电子显微照片。

图6显示hSARS病毒(GenBank检索号AY268070)的部分蛋白序列(215氨基酸；SEQ ID NO：2)的系统发生学分析结果。系统树是通过邻接法构建的。水平线距离表示两个相比较的序列不同的位点的数目。自引导值是从500个重复中推断得出的。

图7A显示在能定量检测样品中hSARS病毒的实时定量PCR试验中荧光强度对PCR循环的扩增图。指出了反应中输入质粒DNA的拷贝数。X轴表示定量PCR试验的循环数，Y轴表示超过背景的荧光强度(FI)。图7B显示临床样品的PCR产物的解链曲线分析结果。指出了得自阳性(+ve)样品、阴性(-ve)样品和水对照(水)的信号。X轴表示温度(℃)，Y轴表示超过背景的荧光强度(FI)。

图8显示另一种从SARS病毒获得的部分DNA序列(SEQ ID NO：11)及其推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。

图9显示又一种从SARS病毒获得的部分DNA序列(SEQ ID NO：13)及其推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。

图10显示SARS病毒的整个基因组DNA序列(SEQ ID NO：15)。

图11显示以三种读框(参见SEQ ID NO：16、240和737)从SEQ IDNO：15获得的推断氨基酸序列。星号(*)表示标志肽的末端的终止密码子。第一读框氨基酸序列：SEQ ID NO：17-239；第二读框氨基酸序列：SEQ ID NO：241-736；第三读框氨基酸序列：SEQ ID NO：738-1107。

图12显示以三种读框(参见SEQ ID NO：1108、1590和1965)从SEQ ID NO：15的互补物获得的推断氨基酸序列。星号(*)表示标志肽的末端的终止密码子。第一读框氨基酸序列：SEQ ID NO：1109-1589；第二读框氨基酸序列：SEQ ID NO：1591-1964；第三读框氨基酸序列：SEQ ID NO：1966-2470。

5.发明详述

本发明涉及在形态学上和系统发生学上与已知冠状病毒相关的分离hSARS病毒。在一个具体的实施方案中，分离hSARS病毒是CCTCC-V200303病毒。在另一具体的实施方案中，所述病毒包含SEQID NO：1、11、13和/或15的核苷酸序列。在一个具体的实施方案中，本发明提供hSARS病毒的分离核酸分子或其互补物或其部分，该核酸分子包括或由SEQ ID NO：1、11、13和/或15的核苷酸序列组成。在另一具体的实施方案中，本发明提供那能在本文定义的严格条件下与具有SEQ ID NO：1、11、13或15序列的核酸分子、或冠状病毒科已知成员的特定基因、或其互补物杂交的分离核酸分子。在另一具体的实施方案中，本发明提供由如下核酸分子编码的分离多肽或蛋白质，所述核酸分子包含SEQ ID NO：1核苷酸序列或其互补序列的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600或更多个连续核苷酸的核苷酸序列。在另一具体的实施方案中，本发明提供由如下核酸分子编码的分离多肽或蛋白质，所述核酸分子包含SEQ ID NO：11核苷酸序列或其互补序列的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200或更多个连续核苷酸的核苷酸序列。在又一个具体的实施方案中，本发明提供由如下核酸分子编码的分离多肽或蛋白质，所述核酸分子包含SEQ ID NO：13核苷酸序列或其互补序列的至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700或更多个连续核苷酸的核苷酸序列。在又一个具体的实施方案中，本发明提供由如下核酸分子编码的分离多肽或蛋白质，所述核酸分子包含SEQ IDNO：15核苷酸序列或其互补序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、100、150、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000或更多个连续核苷酸的核苷酸序列。这些多肽包括图11(SEQ ID NO：17-239、241-736和738-1107)及图12(SEQ IDNO：1109-1589、1591-1964和1966-2470)所示的多肽。本发明多肽或蛋白质优选具有以下蛋白质的一种或多种生物活性：由SEQ ID NO：1、11、13、15序列编码的蛋白质；或含有由SEQ ID NO：1、11、13或15序列编码的氨基酸序列的天然病毒蛋白质；或图11(SEQ ID NO：17-239、241-736和738-1107)及图12(SEQ ID NO：1109-1589、1591-1964和1966-2470)所示的蛋白质。

本发明还涉及在宿主细胞中增殖hSARS病毒的方法。

本发明进一步涉及分离病毒的序列信息在诊断方法和治疗方法中的应用。在一个具体实施方案中，本发明提供hSARS病毒CCTCC-V200303的整个核苷酸序列SEQ ID NO：15或其片段或互补物。此外，本发明涉及能在严格条件下与hSARS病毒CCTCC-V200303的基因组SEQ ID NO：15的任何部分杂交的核酸分子。在一个具体实施方案中，本发明提供适合用作引物的核酸分子，该核酸分子包含或由SEQ IDNO：1、11、13或15核苷酸序列或其互补序列或其部分组成。在一个非限制性实施方案中，本发明提供包含或由SEQ ID NO：3和/或4的核苷酸序列组成的引物。在另一具体的实施方案中，本发明提供适合用作杂交探针的核酸分子，用于检测包含或由SEQ ID NO：1、11、13或15核苷酸序列或其互补序列或其部分组成的、编码本发明多肽的核酸。本发明进一步包括嵌合病毒或重组病毒或由所述核苷酸序列编码的病毒蛋白质。

本发明进一步提供能特异性结合由SEQ ID NO：1、11、13、16、240、737、1108、1590或1965核苷酸序列或其片段编码的本发明多肽或任何hSARS表位的抗体。本发明进一步提供能特异性结合由SEQID NO：15核苷酸序列或其片段编码的本发明多肽或任何hSARS表位的抗体。这种抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab′)₂片段、二硫键连接的Fvs、胞内抗体和含有能与本发明多肽特异性结合的VL或VH结构域或甚至互补决定区(CDR)的片段。

在一个实施方案中，本发明提供在生物材料如细胞、血液、唾液、尿、痰、鼻咽抽吸物等中检测本发明hSARS病毒的存在、活性或表达的方法。可通过将生物材料与能直接或间接检测hSARS病毒存在的试剂相接触来确定样品中hSARS病毒的存在。在一个具体实施方案中，检测试剂是本发明抗体。在另一实施方案中，检测试剂是本发明核酸分子。

在另一实施方案中，本发明提供包含hSARS病毒(包括所述病毒的重组形式和嵌合形式)或病毒亚单位的疫苗制品。在一个具体实施方案中，本发明疫苗制品包含活的但减毒的hSARS病毒，有或没有药物可接受赋形剂，包括佐剂。在另一具体的实施方案中，本发明疫苗制品包含灭活或死的hSARS病毒，有或没有药物可接受赋形剂，包括佐剂。

本发明进一步提供制备hSARS的重组形式或嵌合形式的方法。在另一具体的实施方案中，本发明疫苗制品包含一种或多种包含或由SEQ ID NO：1、11、13和/或15的序列或其片段组成的核酸分子。在另一实施方案中，本发明提供包含一种或多种本发明多肽的疫苗制品，所述多肽由包含或由SEQ ID NO：1、11、13、16、240、737、1108、1590和/或1965核苷酸序列或其片段组成的核苷酸序列编码。在另一实施方案中，本发明提供包含一种或多种本发明多肽的疫苗制品，所述多肽由包含或由SEQ ID NO：15核苷酸序列或其片段组成的核苷酸序列编码。此外，本发明提供通过单独或与以下药物联合给予本发明疫苗制品或抗体来治疗、改善、控制或预防SARS的方法：抗病毒药物[例如金刚烷胺、金刚乙胺、更昔洛韦、阿昔洛韦、利巴韦林、喷昔洛韦、奥塞米韦、膦甲酸、齐多夫定(AZT)、去羟肌苷(ddI)、拉米夫定(3TC)、扎西他滨(ddC)、司他夫定(d4T)、奈韦拉平、地位韦啶、茚地那韦、利托那韦、阿糖腺苷、奈非那韦、沙奎那韦、扎那米韦、磷酸奥塞米韦、普来可那立、干扰素等]、类固醇和皮质类固醇(如泼尼松、可的松、氟替卡松)和糖皮质激素、抗生素、止痛剂、支气管扩张药或其它用于呼吸道和/或病毒感染的疗法。

此外，本发明提供包含本发明抗病毒药物和药物可接受载体的药物组合物。本发明还提供包含本发明药物组合物的药盒。

在另一方面，本发明提供筛选能抑制hSARS病毒或其变体的传染性或复制的抗病毒药物的方法。

5.1 重组和嵌合hSARS病毒

本发明包括由来源于hSARS病毒或其自然变体的基因组的病毒载体编码的重主或嵌合病毒。在一个具体实施方案中，重组病毒来源于保藏号为CCTCC-V200303的hSARS病毒。在一个具体实施方案中，病毒具有SEQ ID NO：15的核苷酸序列。在另一具体的实施方案中，重组病毒来源于hSARS病毒的自然变体。hSARS病毒的自然变体具有与hSARS病毒CCTCC-V200303的基因组序列(SEQ ID NO：15)不同的序列，这是由于基因组序列的一种或多种自发突变，包括但不限于点突变、重排、插入、缺失等，所述突变会或不会导致发生表型改变。根据本发明，来源于hSARS病毒CCTCC-V200303的基因组的病毒载体含有编码至少hSARS病毒一个ORF的一部分的核酸序列。在一个具体实施方案中，所述OFR包含或由SEQ ID NO：1、11或13核苷酸序列或其片段组成。在一个具体实施方案中，在SEQ ID NO：15核苷酸序列或其互补序列或其片段中存在多于一个的OFR，如图11(SEQ ID NO：16、240和737)及图12(SEQ ID NO：1108、1590和1965)所示。在另一实施方案中，ORF编码的多肽包含或由SEQ IDNO：2、12或14氨基酸序列或其片段、或如图11(SEQ ID NO：17-239、241-736和738-1107)及图12(SEQ ID NO：1109-1589、1591-1964和1966-2470)所示或其片段组成。根据本发明，这些病毒载体可包含或不包含不属于天然病毒基因组的核酸。

在另一具体的实施方案中，本发明嵌合病毒是进一步包含异源核苷酸序列的重组hSARS病毒。根据本发明，嵌合病毒可由核苷酸序列编码，其中已向基因组添加了异源核苷酸序列或其中内源或天然核苷酸序列已被异源核苷酸序列置换。

根据本发明，嵌合病毒由进一步包含异源核苷酸序列的本发明病毒载体编码。根据本发明，嵌合病毒由可包含或不包含不属于天然病毒基因组的核酸的病毒载体编码。根据本发明，嵌合病毒由病毒载体编码，其中已添加、插入异源核苷酸序列或已用异源核苷酸序列置换天然或非天然序列。根据本发明，嵌合病毒可由来源于hSARS病毒的不同毒株或变体的核苷酸序列编码。具体的说，嵌合病毒由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列编码来源于SARS病毒的不同毒株或变体的抗原多肽。

嵌合病毒对于生产抗两种或多种病毒的重组疫苗是特别有用的(Tao等，J.Virol.72，2955-2961；Durbin等，2000，J.Virol.74，6821-6831；Skiadopoulos等，1998，J.Virol.72，1762-1768(1998)；Teng等，2000，J.Virol.74，9317-9321)。例如，可以设想，来源于hSARS病毒、表达hSARS病毒变体一种或多种蛋白质(反之亦然)的病毒载体将保护接种了这种载体的对象免受天然hSARS病毒及其变体的感染。对于用活疫苗接种的目的，可像其它病毒一样使用减毒和复制缺陷型病毒。(参见PCT WO 02/057302第6页和第23页，其通过引用结合到本文中)。

根据本发明，待掺入编码本发明重组或嵌合病毒的病毒载体的异源序列包括从hSARS的不同毒株或变体获得或衍生的序列。

在某些实施方案中，本发明嵌合或重组病毒由来源于病毒基因组的病毒载体编码，其中一个或多个序列、基因间区、末端序列或ORF的整体或部分已被异源或非天然序列取代。在本发明的某些实施方案中，本发明嵌合病毒由来源于病毒基因组的病毒载体编码，其中一种或多种异源序列已被插入或添加到载体中。

病毒载体的选择可取决于待治疗病毒感染或保护免受病毒感染的对象的种类。如果对象是人类，则可用减毒hSARS病毒来提供抗原序列。

根据本发明，可对病毒载体进行人工改造，以提供对hSARS病毒及其天然变体的感染带来保护作用的抗原序列。可对病毒载体进行人工改造，以提供一种、两种、三种或更多种抗原序列。根据本发明，抗原序列可来源于同一病毒、同一种类病毒的不同毒株或变体、或不同病毒。

根据本发明获得的表达产物和/或重组或嵌合病毒颗粒可有利地应用在疫苗制品中。可对本发明表达产物和嵌合病毒颗粒进行人工改造，以产生抗多种病原体的疫苗，所述病原体包括病毒和细菌抗原、肿瘤抗原、变应原抗原和与自身免疫病有关的自身抗原。具体的说，可对本发明嵌合病毒颗粒进行人工改造，以制造能保护对象免受hSARS病毒或其变体感染的疫苗。

在某些实施方案中，可对本发明表达产物和重组或嵌合病毒颗粒进行人工改造，以产生抗多种病原体的疫苗，所述病原体包括病毒抗原、肿瘤抗原和与自身免疫病有关的自身抗原。实现此目标的一个方法包括对现有的hSARS基因进行修饰，使得在所述基因各自的外结构域中包含外源序列。在异源序列为病原体的表位或抗原的情况下，这些嵌合病毒可用来诱导针对衍生这些决定簇的疾病因子的保护性免疫应答。

因此，本发明涉及使用病毒载体和重组或嵌合病毒来制备抗多种病毒和/或抗原的疫苗。本发明还包括包含病毒载体的重组病毒，所述病毒载体来源于hSARS病毒或其变体，含有能使病毒具有更适合用于疫苗制品的表型(例如减毒表型或增强的抗原性)的序列。变异和修饰可出现在病毒的编码区、基因间区和前导序列和尾随序列。

本发明提供包含本发明核酸或载体的宿主细胞。含有hSARS病毒的聚合酶成分的质粒载体或病毒载体在原核细胞中产生，以在相关的细胞类型(细菌、昆虫细胞、真核细胞)中表达所述成分。含有hSARS基因组全长拷贝或部分拷贝的质粒或病毒载体在原核细胞中产生，以在体外或体内表达病毒核酸。后者载体可含有其它病毒序列以产生嵌合病毒或嵌合病毒蛋白，可缺少病毒基因组的某些部分以产生复制缺陷型病毒，并可含有突变、缺失或插入以产生减毒病毒。此外，本发明提供感染hSARS病毒(例如保藏号为CCTCC-V200303的hSARS病毒)的宿主细胞。

hSARS(野生型、减毒型、复制缺陷型或嵌合型)的传染性拷贝可根据上述现有技术在共表达聚合酶成分时产生。

此外，可使用短暂或稳定表达一种或多种全长或部分hSARS蛋白质的真核细胞。这种细胞可通过转染(蛋白质载体或核酸载体)、感染(病毒载体)或转导(病毒载体)来制成，可用于与所述野生型、减毒型、复制缺陷型或嵌合型病毒互补。

本发明病毒载体和嵌合病毒可用于通过刺激体液免疫应答、细胞免疫应答或通过刺激对抗原的耐受性而调节对象的免疫系统。本文所用的对象指：人、灵长目动物、马、牛、绵羊、猪、山羊、狗、猫、鸟类和啮齿动物。

5.2 疫苗和抗病毒药的配制

在优选的实施方案中，本发明提供由本发明核酸编码的蛋白质分子或hSARS病毒特异性病毒蛋白及其功能片段。有用的蛋白质分子例如来源于可从本发明病毒衍生的任何基因或基因组片段，包括包膜蛋白(E蛋白)、膜内在蛋白质(M蛋白)、刺突蛋白(S蛋白)、核壳蛋白(N蛋白)、血凝素酯酶(HE蛋白)和RNA依赖性RNA聚合酶。本文所提供的这种分子或其抗原片段例如可用于诊断方法或试剂盒中，以及用于药物组合物如亚单位疫苗中。特别有用的是由SEQ ID NO：1、11、13或15核苷酸序列编码的或图11(SEQ ID NO：17-239、241-736和738-1107)及图12(SEQ ID NO：1109-1589、1591-1964和1966-2470)所示的多肽或其抗原片段，供混入作为抗原或亚单位免疫原，但也可使用灭活的全病毒。还特别有用的是由hSARS基因组的重组核酸片段编码的蛋白物质，当然优选的是在ORF的优选界限内、尤其是在体内(例如出于保护目的或治疗目的，或用于提供诊断性抗体)或体外(例如通过噬菌体展示技术或其它用于产生合成抗体的技术)都引发hSARS特异性抗体或T细胞应答的蛋白物质。

本发明提供用于预防或治疗hSARS病毒感染的疫苗制品。在某些实施方案中，本发明疫苗包含hSARS病毒的重组和嵌合病毒。在某些实施方案中，病毒是减毒的。

在本发明此方面的另一实施方案中，灭活疫苗制品可通过使用常规技术“杀死”嵌合病毒来制备。在其传染性已被破坏的意义上，灭活疫苗是“死的”。理想的是，病毒的传染性被破坏，但不影响其免疫原性。为制备灭活疫苗，可使嵌合病毒在细胞培养物中或在鸡胚的尿囊中生长，通过区带超离心纯化，用甲醛或β-丙醇酸内酯灭活，收集。所得疫苗通常通过肌肉内接种。

灭活病毒可用合适的佐剂配制，以增强免疫应答。这种佐剂可包括但不限于无机凝胶，例如氢氧化铝；表面活性物质如溶血卵磷脂、聚醚多元醇(pluronic polyol)、聚阴离子；肽；油乳液；及具有潜在用途的人佐剂如BCG和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。

在另一方面，本发明还提供DNA疫苗制品，其中包含hSARS病毒(例如保藏号为CCTCC-V200303的病毒)的核酸或片段或具有SEQID NO：1、11、13或15序列的核酸分子或其片段。在另一具体的实施方案中，本发明DNA疫苗制品包含编码免疫特异性结合hSARS病毒的抗体的核酸或其片段。在DNA疫苗制品中，DNA疫苗包含带有插入片段的病毒载体(例如来源于hSARS病毒)、细菌质粒或其它表达载体，所述插入片段包含有效地与一种或多种控制元件相连的本发明核酸分子，从而使得由所述核酸分子编码的接种蛋白质可以在接种对象中表达。这种载体可用重组DNA技术制备成携带本发明核酸分子的重组或嵌合病毒载体(参见上文5.1节)。

已描述了各种供DNA接种以抗病毒感染的异源载体。例如，以下参考文献描述的载体可用来表达hSARS序列而不是所描述的病毒或其它病原体的序列；尤其描述用于以下的载体：乙肝病毒(Michel，M.L.等，1995，DAN-mediated immunization to the hepatitis B surfaceantigen in mice：Aspects of the humoral response mimic hepatitis B viralinfection in humans，Proc.Natl.Aca Sci.USA 92：5307-5311；Davis，H.L.等，1993，DNA-based immunization induces continuous seretion ofhepatitis B surface antigen and highlevels of circulating antibody，HumanMolec.Genetics 2：1847-1851)、HIV病毒(Wang，B.等，1993，Geneinoculation generates immune responses against human imunodeficiencyvirus type 1，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：4156-4160；Lu，S.等，1996，Simian immunodeficiency virus DNA vaccine trial in macques，J.Virol.70：3978-3991；Letvin，N.L等，1997，Potent，protective anti-HIV immuneresponses generated by bimodal HIV envelope DNA plus proteinvaccination，Proc Natl Acad Sci USA.94(17)：9378-83)和流感病毒(Robinson，HL等，1993，Protection against a lethal influenza viruschallenge by immunization with a haemagglutinin-expressing plasmidDNA，Vaccine 11：957-960；Ulmer，J.B.等，Heterologous protectionagainst influenza by injection of DNA encoding a viral protein，Science259：1745-1749)，以及细菌感染如结核病(Tascon，R.E.等，1996，Vaccination against tuberculosis by DNA injection，Nature Med.2：888-892；Huygen，K.等，1996，Immunogenicity and protective efficacy of atuberculosis DNA vaccine，Nature Med.，2：893-898)和寄生虫感染如疟疾(Sedegah，M.，1994，Protection against malaria by immunjzation withplasmid DNA encoding circumsporozoite protein，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9866-9870；Doolan，D.L.等，1996，Circumventing geneticrestriction of protection against malaria with multigene DNAimmunization：CD8+T cell-interferon δ，and nitric oxide-dependentimmunity，J.Exper.Med.，1183：1739-1746)。

可使用多种方法来输入上述疫苗制品。这些方法包括但不限于口、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下和鼻内途径。另外，优选通过疫苗针对其设计的病原体的自然感染途径来输入嵌合病毒疫苗制品。本发明DNA疫苗可以盐水溶液形式，通过用注射器和针头注射入肌肉或皮肤内来给予(WolffJ.A.等，1990，Direct gene transfer into mousemuscle in vivo，Science 247：1465-1468；Raz，E.，1994，Intradermal geneimmunization：The possible role of DNA uptake in the induction of cellularimmunity to viruses，Proc.Natl.Acd.Sci.USA 91：9519-9523)。另一种给予DNA疫苗的方式称为“基因枪”方法，通过该法，涂有目的DNA分子的微小金珠被射入细胞中(Tang，D.等，1992，Genetic immunizationis a simple method for eliciting an immune response，Nature 356：152-154)。有关DNA疫苗的方法的全面综述参见Robinson，H.L.，1999，DNA vaccines：basic mechanism and immune responses(综述)，Int.J.Mol.Med4(5)：549-555；Barber，B.，1997，Introduction：Emerging vaccinestrategies，Seminars in Immunology9(5)：269-270；和Robinson，H.L等，1997，DNA vaccines，Seminars in Immunology 9(5)：271-283。

5.3 hSARS病毒或其变体的减毒

可对本发明hSARS病毒或其变体进行基因工程改造，以显示出减毒表型。具体的说，本发明病毒在所述病毒作为疫苗给予的对象中显示出减毒表型。减毒可通过普通技术人员熟知的任何方法来实现。非为理论所囿，可例如通过使用本质上在预定宿主物种中不能很好地复制的病毒来产生本发明病毒的减毒表型，例如相对于病毒的野生型毒株，通过减少病毒基因组的复制，通过降低病毒感染宿主细胞的能力，或通过降低病毒蛋白质装配成传染性病毒颗粒的能力。

hSARS病毒及其变体的减毒表型可通过普通技术人员熟知的任何方法来检测。候选病毒可例如检测其感染宿主的能力或其在细胞培养系统中的复制速率。在某些实施方案中，用不同温度下的生长曲线来检测病毒的减毒表型。例如，减毒病毒能在35℃下生长，但不能在39℃或40℃下生长。在某些实施方案中，可用不同的细胞系评价病毒的减毒表型。例如，减毒病毒可只能在猴细胞系中生长，但却不能在人细胞系中生长，或者减毒病毒在不同细胞系中可达到的病毒滴度不同。在某些实施方案中，病毒在小型动物模型(包括但不限于仓鼠、棉鼠、小鼠、豚鼠)的呼吸道中的复制被用来评价病毒的减毒表型。在其它实施方案中，病毒诱导的免疫应答，包括但不限于抗体滴度(例如通过蚀斑减少中和试验或ELISA来检测)被用来评价病毒的减毒表型。在一个具体实施方案中，蚀斑减少中和试验或ELISA在低剂量下进行。在某些实施方案中，可检测出hSARS病毒在动物模型中引起病理症状的能力。病毒在动物模型中引起病理症状的能力降低是其减毒表型的指征。在一个具体实施方案中，检测候选病毒在猴模型中对鼻的感染，以黏液的产生为指标。

可对本发明病毒进行减毒，以使病毒的一种或多种功能特征受损。在某些实施方案中，减毒是通过与减毒病毒来源的病毒野生型毒株作比较来测定的。在其它实施方案中，减毒是通过比较减毒病毒在不同宿主系统中的生长来确定的。因此，作为非限制性实例，当在人宿主中生长时，如果hSARS病毒或其变体与非减毒hSARS或其变体相比在人宿主中的生长降低，则hSARS病毒或其变体被称为减毒的。

在某些实施方案中，本发明减毒病毒能够感染宿主，能够在宿主中复制，从而产生传染性病毒颗粒。但是，与野生型毒株相比，减毒株生长得到的滴度低，或生长得更缓慢。可用普通技术人员熟知的任何方法确定减毒病毒的生长曲线并将其与野生型病毒的生长曲线相比较。

在某些实施方案中，本发明减毒病毒(例如重组或嵌合hSARS病毒)在人细胞中复制得不如野生型病毒(例如野生型hSARS)好。但是，减毒病毒在缺乏干扰素功能的细胞系如Vero细胞中可复制良好。

在其它实施方案中，本发明减毒病毒能够感染宿主，能够在宿主中复制，以及能够使本发明病毒的蛋白质嵌入到胞质膜中，但是减毒病毒不会引起宿主产生新的传染性病毒颗粒。在某些实施方案中，减毒病毒感染宿主、在宿主中复制、并且导致病毒蛋白质嵌入到宿主的胞质膜中的效率与野生型hSARS一样。在其它实施方案中，减毒病毒相对于野生型病毒其导致病毒蛋白质嵌入到宿主细胞的胞质膜中的能力降低。在某些实施方案中，减毒hSARS病毒相对于野生型病毒其在宿主中复制的能力降低。可使用普通技术人员熟知的任何技术来确定病毒是否能够感染哺乳动物细胞，是否能够在宿主中复制以及是否能够导致病毒蛋白质嵌入到宿主的胞质膜中。

在某些实施方案中，本发明减毒病毒能够感染宿主。但与野生型hSARS相反的是，减毒hSARS病毒不能在宿主中复制。在一个具体实施方案中，减毒hSARS病毒能感染宿主，能导致宿主将病毒蛋白质嵌入到其胞质膜中，但减毒病毒不能够在宿主中复制。可使用普通技术人员熟知的任何方法来检测减毒hSARS病毒是否已感染宿主以及是否已导致宿主将病毒蛋白质嵌入到其胞质膜中。

在某些实施方案中，减毒病毒感染宿主的能力与野生型病毒感染相同宿主的能力相比降低了。可使用普通技术人员熟知的任何技术来确定病毒是否能够感染宿主。

在某些实施方案中，突变(例如错义突变)被引入到病毒的基因组中，例如被引入到SEQ ID NO：1、11、13或15序列中，以产生具有减毒表型的病毒。突变(例如错义突变)可被引入到hSARS的结构基因和/或调节基因中。突变可以是增添、置换、缺失或它们的组合。可筛选这种hSARS变体的预期功能性，如在细胞培养物中的传染性、复制能力、蛋白质合成能力、装配能力以及致细胞病变效应。在一个具体实施方案中，错义突变是冷敏突变。在另一实施方案中，错义突变是热敏突变。在另一实施方案中，错义突变防止病毒蛋白质的正常加工或剪切。

在其它实施方案中，缺失被引入到hSARS病毒的基因组中，导致病毒的减毒。

在某些实施方案中，病毒的减毒是通过用不同种、不同亚群或不同变体的病毒基因替换野生型病毒的基因来实现的。在另一方面，病毒的减毒是通过用来源于不同种病毒的相应蛋白质的结构域替换野生型病毒的蛋白质的一个或多个特定结构域来实现的。在某些其它实施方案中，病毒的减毒是通过缺失野生型病毒的蛋白质的一个或多个特定结构域来实现的。

当使用活减毒疫苗时，必须考虑其安全性。所述疫苗必须不会导致疾病。本领域熟知的能使疫苗安全的任何技术均可在本发明中使用。除减毒技术外，也可使用其它技术。一个非限制性实例是使用不能被掺入到病毒颗粒膜中的可溶性异源基因。例如，可使用单拷贝的缺乏跨膜结构域和胞质结构域的病毒跨膜蛋白质可溶性形式。

可使用多种试验检测疫苗的安全性。例如，可使用蔗糖梯度试验和中和试验来检测安全性。蔗糖梯度试验可用来确定异源蛋白质是否被插入到病毒颗粒中。如果异源蛋白质被插入到病毒颗粒中，则应检测病毒颗粒在适当的动物模型中导致症状的能力，因为病毒可能已经获得新的、可能致病的性质。

5.4 佐剂和载体分子

hSARS相关抗原与一种或多种佐剂一起给药。在一个实施方案中，hSARS相关抗原与无机盐佐剂或无机盐凝胶佐剂一起给药。这种无机盐佐剂和无机盐凝胶佐剂包括但不限于氢氧化铝(ALHYDROGEL、REHYDRAGEL)、磷酸铝凝胶、羟基磷酸铝(ADJU-PHOS)和磷酸钙。

在另一实施方案中，hSARS相关抗原与免疫刺激佐剂一起给药。这类佐剂包括但不限于细胞因子(例如白介素-2、白介素-7、白介素-12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ、白介素-1β(IL-1β)和IL-1β肽或Sclavo肽)、含细胞因子的脂质体、三萜类糖苷或皂苷(例如QuilA和QS-21，亦在商标STIMULON、ISCOPREP下出售)、胞壁酰二肽(MDP)衍生物如N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(苏氨酰-MDP，在商标TERMURTIDE下出售)、GMDP、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)乙胺、胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺(MTP-PE)、未甲基化的CpG二核苷酸和寡核苷酸如细菌DNA及其片段、LPS、一磷酰脂质A(3D-MLA，在商标MPL下出售)和聚磷腈。

在另一实施方案中，所用的佐剂是特殊的佐剂，包括但不限于乳液，例如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、例如与嵌段共聚物如L-121(聚氧丙烯/聚氧乙烯，在商标PLURONIC L-121下出售)制备的角鲨烯或角鲨烷水包油佐剂制剂如SAF和MF59、脂质体、病毒体、脂质体卷(cochleates)和在商标ISCOM下出售的免疫刺激复合物。

在另一实施方案中，使用微粒佐剂。微粒佐剂包括但不限于生物可降解和生物相容性聚酯、乳酸的均聚物(PLA)及乙醇酸的均聚物(PGA)和它们的共聚物、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)微粒、能自缔合成微粒的聚合物(泊洛沙姆颗粒)、可溶性聚合物(聚磷腈)和病毒样颗粒(VLP)如重组蛋白质微粒，例如乙肝表面抗原(HbsAg)。

可以使用的又一类佐剂包括黏膜佐剂，包括但不限于来自大肠杆菌(Escherichia coli)的不耐热肠毒素(LT)、来自霍乱弧菌(Vibriocholerae)的霍乱全毒素(CT)和霍乱毒素B亚单位(CTB)、突变株毒素(例如LTK63和LTR72)、微粒和聚合脂质体。

在其它实施方案中，上述任何类型的佐剂可相互组合或与其它佐剂组合使用。例如，可用来给予本发明hSARS相关抗原的组合佐剂制剂的非限制性实例包括包含免疫刺激蛋白质、细胞因子、T细胞和/或B细胞肽的脂质体；或带有或不带包埋IL-2的微生物或含有肠毒素的微粒。本领域熟知的其它佐剂也包括在本发明的范围内(参见VaccineDesign：The Subunit and Adjuvant Appoach，第7章，Michael F.Powell和Mark J.Newman(编辑)，Plenum Press，New York，1995，其通过引用整体结合到本文中)。

佐剂的效力可通过测量诱导针对免疫原性多肽(含有hSARS多肽表位)的抗体来确定，所述抗体由在也包含各种佐剂的疫苗中给予这种多肽而产生。

所述多肽可配制成中性形式或盐形式的疫苗。药物可接受的盐包括酸加成盐(通过肽的游离氨基形成)和与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、马来酸等)形成的盐。通过游离羧基形成的盐也可来源于无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，及有机碱，例如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。

本发明疫苗可以是多价疫苗或单价疫苗。多价疫苗由能指导多于一种抗原表达的重组病毒制成。

可使用多种方法来引入本发明疫苗制品；这些方法包括但不限于口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内途径和通过划痕法(例如使用分叉针刮破皮肤的上层)。

被给予疫苗的患者优选是哺乳动物，最优选是人类，但也可以是非人类动物，包括但不限于牛、马、绵羊、猪、禽(例如鸡)、山羊、猫、狗、仓鼠、小鼠和大鼠。

5.5 抗体的制备

特异性识别本发明多肽，例如但不限于包含SEQ ID NO：2、12和14序列的多肽及图11(SEQ ID NO：17-239、241-736和738-1107)和图12(SEQ ID NO：1109-1589、1591-1964、1966-2470)所示的多肽，或hSARS表位的抗体或其抗原结合片段，可用来检测、筛选和分离本发明多肽或其片段，或可能编码其它生物体类似酶的类似序列。例如，在一个具体实施方案中，免疫特异性结合hSARS表位的抗体或其片段可用于各种体外检测试验中，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定、蛋白质印迹等，以在样品例如生物材料中检测本发明多肽或优选hSARS，所述生物材料包括细胞、细胞培养基(例如细菌细胞培养基、哺乳动物细胞培养基、昆虫细胞培养基、酵母细胞培养基等)、血液、血浆、血清、组织、痰、鼻咽抽吸物等。

对本发明多肽或hSARS的任何表位具有特异性的抗体可通过本领域熟知的任何适合方法产生。抗目的抗原(例如保藏号为CCTCC-V200303或包含SEQ ID NO：15核苷酸序列的hSARS病毒)的多克隆抗体可通过本领域熟知的各种方法生产。例如，可将抗原给予各种宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等，以诱导产生含有抗原特异性多克隆抗体的抗血清。可使用多种佐剂来增强免疫应答，取决于宿主物种，佐剂包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐剂、无机凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、聚醚多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔

血蓝蛋白、二硝基酚和对人类具有潜在用途的佐剂如BCG(卡介苗)和小棒杆菌。这种佐剂在本领域也是熟知的。

单克隆抗体可使用多种本领域熟知的技术制备，包括使用杂交瘤技术、重组体技术和噬菌体展示技术或它们的组合。例如单克隆抗体可使用杂交瘤技术生产，包括本领域公知的杂交瘤技术和例如在Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring HarborLaboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等，Monoclonal Antibodiesand T-Cell Hybridomas，第563-681页(Elsevier，N.Y.，1981)中讲授的杂交瘤技术(两者通过引用整体结合到本文中)。本文所用术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。术语“单克隆抗体”指来源于单个克隆的抗体，包括任何真核克隆、原核克隆和噬菌体克隆，而不是指抗体生产的方法。

使用杂交瘤技术生产和筛选具体抗体的方法是常规的和本领域熟知的。在非限制性实例中，小鼠可用目的抗原或表达这种抗原的细胞免疫。一旦检测出免疫应答，例如在小鼠血清中检测出对抗原特异的抗体，则收获小鼠脾脏，分离脾细胞。然后通过熟知的技术将脾细胞与任何适合的骨髓瘤细胞融合。通过有限稀释选择和克隆杂交瘤。然后用本领域熟知的方法检测杂交瘤克隆中分泌能结合抗原的抗体的细胞。通常含有高水平抗体的腹水可通过用阳性杂交瘤克隆腹膜内接种小鼠来产生。

识别特定表位的抗体片段可通过公知技术产生。例如，Fab和F(ab′)₂片段可通过使用酶例如木瓜蛋白酶(用于产生Fab片段)或胃蛋白酶(用于产生F(ab′)₂片段)，对免疫球蛋白分子进行蛋白酶解来生产。F(ab′)₂片段含有全部轻链以及重链的可变区、CH1区和铰链区。

本发明抗体或其片段也可通过本领域熟知的任何抗体合成方法来生产，具体的说通过化学合成法，或优选通过重组表达技术来生产。

编码抗体的核苷酸序列可从本领域普通技术人员可获取的任何信息获得(即从Genbank、文献获得或通过常规克隆和序列分析获得)。如果含有编码特定抗体或其表位结合片段的核酸的克隆不可获得，但抗体分子或其表位结合片段的序列是已知的，则编码免疫球蛋白的核酸可通过化学法合成，或获得自合适的来源(例如抗体cDNA文库，或从表达抗体的任何组织或细胞(如选择用来表达抗体的杂交瘤)产生的cDNA文库或从其中分离的核酸，优选poly A+RNA)，通过使用可与序列的3′和5′末端杂交的合成引物进行PCR扩增，或通过使用对特定基因序列具有特异性、例如用于从编码抗体的cDNA文库中鉴别cDNA克隆的寡核苷酸探针进行克隆来获得。通过PCR产生的扩增核酸随后可使用本领域熟知的任何方法克隆至可复制克隆载体中。

一旦确定了抗体的核苷酸序列，抗体的核苷酸序列可使用本领域熟知的操作核苷酸序列的方法，例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(参见例如上述Sambrook等和Ausubel等编，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，NY，它们通过引用整体结合到本文中)进行操作，以通过例如在抗体的表位结合域中或者在可增强或降低抗体生物活性的任何部分中引入氨基酸取代、缺失和/或插入，来产生具有不同氨基酸序列的抗体。

抗体的重组表达需要构建含有编码抗体的核苷酸序列的表达载体。一旦获得编码抗体分子或抗体的重链或轻链或其部分的核苷酸序列，用于生产抗体分子的载体可通过重组DNA技术，使用前面各节讨论的本领域熟知的技术来生产。可使用本领域普通技术人员熟知的方法来构建含有抗体编码序列和合适转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。可将编码重链可变区、轻链可变区、重链和轻链可变区、重链和/或轻链可变区的表位结合片段、或抗体的一个或多个互补决定区(CDR)的核苷酸序列克隆到这种载体中进行表达。然后，如此制备的表达载体可被引入到合适的宿主细胞中以表达抗体。因此，本发明包括含有多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸编码对本发明多肽或其片段具有特异性的抗体。

宿主细胞可用本发明的两种表达载体共转染，第一种载体编码重链衍生的多肽，第二种载体编码轻链衍生的多肽。所述两种载体可含有相同的可选择标记，以使重链和轻链多肽的表达相等，或含有不同的可选择标记，以确保维持两种质粒。另外，也可使用编码和能够表达重链多肽和轻链多肽的单一载体。在这种情况下，轻链应位于重链的前面，以避免出现过量的有毒游离重链(Proudfoot，Nature，322：52，1986和Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：2197，1980)。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。

在另一实施方案中，抗体也可使用本领域熟知的各种噬菌体展示方法来产生。在噬菌体展示方法中，功能抗体结构域被展示在携带其编码多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。在一个具体实施方案中，这种噬菌体可被用来展示从所有成分或组合抗体文库(例如人的或鼠的)表达的抗原结合域，如Fab和Fv或二硫键稳定的Fv。表达结合目的抗原的抗原结合域的噬菌体可用抗原来选择或鉴定，例如使用标记抗原或被结合或捕捉到固体表面或珠粒的抗原。在这些方法中使用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括fd和M13。抗原结合域被表达为与噬菌体基因III或基因VIII蛋白质融合的重组融合蛋白质。可用来制备本发明免疫球蛋白或其片段的噬菌体展示方法的实例包括在以下文献中公开的方法：Brinkman等，J.Immunol.Methods，182：41-50，1995；Ames等，J.Immunol.Methods，184：177-186，1995；Kettleborough等，Eur.J.Immunol.，24：952-958，1994；Persic等，Gene，187：9-18，1997；Burton等，AdvancesinImmunology，57：191-280，1994；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公开号WO 90/02809；WO 91/10737；WO92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；及美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821，047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108；以上各文献通过引用整体结合到本文中。

如以上参考文献所述，进行噬菌体选择后，可分离和使用来自噬菌体的抗体编码区以产生完整抗体，包括人抗体，或任何其它需要的片段，并可表达于任何需要的宿主中，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如以下所详细描述的。例如，也可应用重组生产Fab、Fab′和F(ab′)₂片段的技术，使用例如在以下文献中公开的本领域熟知的方法：PCT公开号WO 92/22324；Mullinax等，BioTechniques，12(6)：864-869，1992；及Sawai等，AJRI，34：26-34，1995；及Better等，Science，240：1041-1043，1988(以上各文献通过引用整体结合到本文中)。可用来生产单链Fv和抗体的技术的实例包括在以下文献中描述的技术：美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等，Methods in Enzymology，203：46-88，1991；Shu等，PNAS，90：7995-7999，1993；及Skerra等，Science，240：1038-1040，1988。

一旦本发明抗体分子已通过上述任何方法生产出来，其随后可通过本领域熟知的任何纯化免疫球蛋白分子的方法进行纯化，所述方法例如色谱法(例如离子交换色谱，亲和色谱，尤其是进行A蛋白和G蛋白纯化后对特定抗原的亲和色谱，以及排阻柱色谱)、离心法、差示溶解度法、或任何其它蛋白质纯化的标准技术。此外，本发明抗体或其片段可与本文所述的或本领域熟知的异源多肽序列融合，以促进纯化。

对于某些应用，包括在人体内使用抗体和体外检测试验，优选使用嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。嵌合抗体是其中抗体的不同部分来源于不同的动物物种的抗体分子，例如具有来源于鼠单克隆抗体的可变区和来源于人免疫球蛋白的恒定区的抗体。生产嵌合抗体的方法是本领域熟知的。参见例如Morrison，Science，229：1202，1985；Oi等，BioTechniques，4：2141986；Gillies等，J.Immunol.Methods，125：191-202，1989；美国专利号5,807,715、4,816,567和4,816,397，以上各文献通过引用整体结合到本文中。人源化抗体是来自非人类物种的能结合所需抗原的抗体分子，其具有一个或多个来自非人类物种的互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区。通常，人构架区中的构架残基会被来自CDR供体抗体的相应残基所取代，以改变、优选改进抗原的结合。这些构架取代可通过本领域熟知的方法来鉴定，例如通过对CDR和构架残基的相互作用进行建模，以鉴定对抗原结合重要的构架残基，以及通过序列比较，以鉴定在特定位置的稀有构架残基。参见例如Queen等，美国专利号5,585,089；Riechmann等，Nature，332：323，1988，以上文献通过引用整体结合到本文中。抗体可使用多种本领域熟知的技术进行人源化，包括例如CDR嫁接(EP239，400；PCT公开号WO91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101和5,585,089)、表面胶合(veneering)或表面重修(resurfacing)(EP592,106；EP519,596；Padlan，Molecular Immunology，28(4/5)：489-498，1991；Studnicka等，Protein Engineering，7(6)：805-814，1994；Roguska等，Proc Natl.Acad.Sci.USA，91：969-973，1994)和链改组(美国专利号5,565,332)，以上各文献通过引用整体结合到本文中。

完全人抗体特别适合用于对人患者进行治疗处理。人抗体可通过多种本领域熟知的方法来制备，包括使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体文库通过上述噬菌体展示技术来制备。参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及PCT公开号WO 98/46645；WO 98/50433；WO98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO 96/33735和WO91/10741，以上各文献通过引用整体结合到本文中。

人抗体也可使用不能表达功能性内源免疫球蛋白、但能表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来生产。有关这种生产人抗体的技术的综述，参见Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol.，13：65-93，1995。有关这种生产人抗体和人单克隆抗体的技术以及生产这种抗体的方案的详细讨论，参见例如PCT公开号WO 98/24893；WO 92/01047；WO96/34096；WO 96/33735；欧洲专利号0 598 877；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771和5,939,598，以上各文献通过引用整体结合到本文中。另外，可与例如Abgenix，Inc.(Fremont，CA)，Medarex(NJ)和Genpharm(San Jose，CA)等公司约定，以提供使用类似上述技术生产的针对选定抗原的人抗体。

识别选定表位的完全人抗体可使用称为“导向选择”的技术来产生。在这种方法中，选定的非人单克隆抗体如小鼠抗体被用来指导选择识别同一表位的完全人抗体。(Jespers等，Bio/technology，12：899-903，1988)。

与异源多肽融合或缀合的抗体可用于本领域熟知的体外免疫试验或纯化方法(例如亲和色谱)中。参见例如PCT公开号WO 93/21232；EP439,095；Naramura等，Immunol.Lett.，39：91-99，1994；美国专利号5,474,981；Gillies等，PNAS，89：1428-1432，1992和Fell等，J.Immunol.，146：2446-2452，1991，以上各文献通过引用整体结合到本文中。

抗体也可吸附到固体支持体上，这对免疫试验和纯化本发明多肽或其片段、衍生物、类似物或变体或具有与本发明多肽类似酶活性的类似分子来说是特别有用的。这种固体支持体包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。

5.6 药物组合物和药盒

本发明包括包含本发明抗病毒剂的药物组合物。在一个具体实施方案中，抗病毒剂是免疫特异性结合和中和hSARS病毒或其变体或其任何衍生蛋白质的抗体(参见5.5节)。在另一具体实施方案中，抗病毒剂是本发明多肽或核酸分子(参见例如5.1节和5.2节)。药物组合物具有预防性抗病毒剂的效用，可给予已暴露于或预期暴露于病毒的对象。

已知有各种给药系统可用来给予本发明药物组合物，所述给药系统例如脂质体包囊化、微粒、微胶囊、能表达突变病毒的重组细胞、受体介导胞吞作用(参见例如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262：44294432)。引入的方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。化合物可通过任何方便的途径给药，例如通过输液或大剂量注射、通过上皮或黏膜皮肤内层(例如口腔黏膜、直肠黏膜和肠黏膜等)吸收，也可与其它生物活性剂一起给药。给药可以是全身给药或局部给药。在优选的实施方案中，期望通过任何合适的途径将本发明药物组合物引入肺部。也可例如通过使用吸入器或喷雾器，与气雾化剂一起配制来实施肺部给药。

在一个具体实施方案中，期望将本发明药物组合物局部给予需要进行治疗的区域；这可例如(非限制性地)通过手术中的局部输液、局部敷用(例如与手术后的伤口敷料联用)、通过注射、通过导管、通过栓剂、通过鼻内喷雾或通过植入物来实现，所述植入物是多孔、无孔或凝胶状材料，包括薄膜如硅橡胶(sialastic)膜或纤维。在一个实施方案中，可通过在受感染组织的部位(或从前述部位)直接注射来给药。

在另一实施方案中，药物组合物可在小泡、尤其是脂质体中进行送递(参见Langer，1990，Science 249：1527-1533；Treat等，Liposomesin the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez Berestein和Fidler(编辑)，Liss，New York，第53-365页(1989)；Lopez-Berestein，出处同上，第317-327页；通常参见出处同上)。

在又一个实施方案中，药物组合物可在控释系统中送递。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer，出处同上；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201；Buchwald等，1980，Surgery 88：507；和Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一实施方案中，可使用聚合物材料(参见Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise(编辑)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled DrugBioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball(编辑)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61(1983)；也参见Levy等，1985，Science 228：190；During等，1989，Ann.Neturol.25：351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71：105)。在又一个实施方案中，控释系统可置于组合物靶标即肺的附近，从而只需要全身剂量的一部分即可(参见例如Goodson，MedicalApplications of Controlled Release，出处同上，第2卷，第115-138页(1984))。

其它控释系统在Langer的综述(Science 249：1527-1533(1990))中有讨论。

本发明药物组合物包含治疗有效量的活但减毒的、灭活的或死的hSARS病毒，或重组或嵌合的hSARS病毒以及药物可接受的载体。在一个具体实施方案中，术语“药物可接受的”指得到联邦政府或州政府的管理机关批准，或被列入美国药典或其它通常公认的药典中，以供在动物中、更具体在人类中使用。术语“载体”指与药物组合物一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或介质。这种药物载体可以是无菌液体如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的液体，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内给予药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖及甘油水溶液也可用作液体载体，尤其是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、石灰石、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如需要，组合物也可含有少量的湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释剂等形式出现。组合物可与传统的粘合剂和载体如甘油三酯一起配制成栓剂。口服剂型可包含标准的载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin著的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中有描述。剂型应与给药方式相适应。

在优选的实施方案中，组合物按照常规程序配制成适合供静脉内给予人类的药物组合物。典型的是，供静脉内给药的组合物是无菌等渗水缓冲液的溶液。必要时，组合物也可包括增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。通常，各成分以单位剂量形式单独或混合供应，例如作为在密封容器如安瓿或小袋中的冻干粉或无水浓缩物，容器上标明活性药物的量。在组合物通过输液给药的情况下，其可用装有无菌药物级水或盐水的输液瓶来调剂。在组合物通过注射给药的情况下，可提供一安瓿注射用无菌水或盐水，以便在给药前混合各成分。

本发明药物组合物可配制成中性形式或盐形式。药物可接受的盐包括与游离氨基形成的盐，如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及与游离羧基形成的盐，如来源于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。

本发明药物组合物能有效治疗具体病状或病症的量须取决于病状或病症的性质，可通过标准的临床技术来确定。另外，可任选采用体外试验来帮助确定最佳的剂量范围。在制剂中待采用的精确剂量也须取决于给药途径和疾病或病状的严重程度，且应按照执业医生的判断和各个患者的情况来决定。但是，静脉内给药的合适剂量范围通常是每公斤体重约20-500微克活性化合物。鼻内给药的合适剂量范围通常是约0.01pg/kg体重至1mg/kg体重。有效剂量可从得自体外或动物模型测试系统的量效曲线推知。

栓剂通常含有0.5％-10％(重量)的活性成分；口服剂型优选含有10％-95％的活性成分。

本发明还提供包含一个或多个容器的药物小包或药盒，容器中装有一种或多种本发明药物组合物成分。可以任选伴随这种容器的是一份管理药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机关的规定形式的通知书，该通知书反映了政府机关对生产、使用或销售人用药品或生物制品的批准。在一个优选实施方案中，药盒包含本发明抗病毒剂，例如对SEQ ID NO：1、11、13或15核苷酸序列编码的多肽、或图11(SEQ ID NO：17-239、241-736和738-1107)和图12(SEQ ID NO：1109-1589、1591-1964和1966-2470)所示的多肽、或任何hSARS表位、或本发明多肽或蛋白质、或本发明核酸分子具有特异性的抗体，其可单独存在，或与佐剂、抗病毒药物、抗生素、止痛剂、支气管扩张药或其它药物可接受的赋形剂组合。

本发明进一步包括这种药盒，其包含含有本发明药物组合物的容器和使用说明书。

5.7 检测试验

本发明提供在来自SARS患者的生物样品如血液、血清、血浆、唾液、尿等中检测免疫特异性结合hSARS病毒的抗体的方法。在一个具体实施方案中，所述方法包括将样品与直接固定化在底物上的hSARS病毒，例如保藏号为CCTCC-V200303的hSARS病毒或具有SEQ ID NO：15基因组核酸序列的hSARS病毒接触，然后直接检测或通过标记的异源抗同种型抗体间接检测与病毒结合的抗体。在另一具体实施方案中，样品与被hSARS病毒，例如保藏号为CCTCC-V200303的hSARS病毒或具有SEQ ID NO：15基因组核酸序列的hSARS病毒感染的宿主细胞接触，然后被结合的抗体可通过以下6.5节描述的免疫荧光试验来检测。

检测生物样品中本发明多肽或核酸是否存在的示例性方法包括，从各种来源获得生物样品，将样品与能够检测hSARS病毒的表位或核酸(例如mRNA、基因组DNA)的化合物或试剂接触，这样检测样品中hSARS病毒的存在。检测本发明hSARS mRNA或基因组RNA的优选试剂是能够与编码本发明多肽的mRNA或基因组RNA杂交的标记核酸探针。该核酸探针可以是例如包含或由SEQ ID NO：1、11、13或15核苷酸序列或其部分组成的核酸分子，如长度为至少15、20、25、30、50、100、250、500、750、1,000或更多连续核苷酸的寡核苷酸，其在严格条件下足以特异性与hSARS mRNA或基因组RNA杂交。

在另一优选的具体实施方案中，样品中hSARS病毒的存在是使用如下引物通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)来检测的，所述引物基于hSARS病毒(例如保藏检索号CCTCC-V200303的hSARS病毒或具有SEQ ID NO：15基因组核酸序列的hSARS病毒)的基因组的部分核苷酸序列构建，或基于SEQ ID NO：1、11、13或15核苷酸序列构建。在一个非限制性具体实施方案中，用于RT-PCR方法的优选引物是：5′-TACACACCTCAGCGTTG-3′(SEQ ID NO：3)和5′-CACGAACGTG-ACGAAT-3′(SEQ ID NO：4)，在2.5mM MgCl₂存在下，热循环例如但不限于94℃8分钟，随后94℃1分钟、50℃1分钟、72℃1分钟的循环40次(另参见下文6.7节)。在更优选的具体实施方案中，本发明提供实时定量PCR试验以如下检测生物样品中hSARS病毒的存在：从样品提取总RNA，对提取总RNA进行逆转录获得cDNA，使用特定的引物如具有SEQ ID NO：3和4核苷酸序列的引物以及荧光染料如

Green I(其当非特异性与双链DNA结合时会发出荧光)，使cDNA经历PCR反应。由于经一系列热循环后产生PCR产物，在各延伸步骤结束时捕捉这些反应的荧光信号，从而可以基于扩增图定量测定样品中的病毒负载量(参见下文6.7节)。

优选检测hSARS的试剂是特异性结合本发明多肽或任何hSARS表位的抗体，优选具有可检测标记的抗体。所述抗体可以是多克隆抗体，或更优选为单克隆抗体。可使用完整的抗体或其片段(例如Fab或F(ab′)₂)。

涉及探针或抗体的术语“标记”包括通过将可检测物质偶联(即物理连接)到探针或抗体以对探针或抗体进行直接标记，以及通过与被直接标记的另一试剂反应以对探针或抗体进行间接的标记。间接标记的实例包括用荧光标记的第二抗体检测第一抗体和用生物素对DNA探针进行末端标记，这样就可用荧光标记的链霉抗生物素蛋白来检测。本发明检测方法可用来体外或体内检测样品中的mRNA、蛋白质(或任何表位)或基因组RNA。例如体外检测mRNA的技术包括Northern杂交、原位杂交、RT-PCR和RNA酶保护。体外检测hSARS表位的技术包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀法和免疫荧光法。体外检测基因组RNA的技术包括Northern杂交、RT-PCR和RNA酶保护。此外，体内检测hSARS的技术包括向对象生物体中引入针对多肽的标记抗体。例如，抗体可用放射性标志标记，所述放射性标志在对象生物体中的存在和位置可通过标准成像技术(包括放射自显影术)来检测。

在一个具体实施方案中，本发明方法进一步包括从对照对象获得对照样品，将对照样品与能检测hSARS(例如本发明多肽或编码本发明多肽的mRNA或基因组RNA)的化合物或试剂接触，从而检测样品中hSARS或多肽或编码多肽的mRNA或基因组RNA的存在，并将对照样品中hSARS或多肽或编码多肽的mRNA或基因组RNA的不存在与待测样品中hSARS或多肽或编码多肽的mRNA或基因组RNA的存在相比较。

本发明还包括检测待测样品中hSARS或本发明多肽或核酸的存在的试剂盒。所述试剂盒可例如包含能检测待测样品中hSARS或多肽或编码多肽的核酸分子的标记化合物或试剂，在某些实施方案中，还包含确定样品中多肽或mRNA的量的工具(例如结合多肽的抗体或与编码多肽的DNA或mRNA结合的寡核苷酸探针)。试剂盒还可包含使用说明书。

对于基于抗体的试剂盒，其可包含例如：(1)第一抗体(例如连接到固体支持体上)，其结合本发明多肽或hSARS表位；任选(2)不同的第二抗体，其结合多肽或第一抗体，且缀合到可检测的试剂上。

对于基于寡核苷酸的试剂盒，其可包含例如：(1)寡核苷酸，例如可检测地标记的寡核苷酸，其可与编码本发明多肽的核酸序列或hSARS基因组内的序列杂交，或(2)一对引物，其可用于扩增含有hSARS序列的核酸分子。所述试剂盒还可包含例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。所述试剂盒也可包含用于检测可检测的试剂所需的成分(例如酶或底物)。所述试剂盒还可含有对照样品或一系列对照样品，所述对照样品可用来进行试验并与待测样品所含的相比较。试剂盒的各成分通常封闭在单独的容器中，所有的各种容器与使用说明书一起装在单一包装物中。

5.8 鉴定抗病毒剂的筛选试验

本发明提供用于鉴定抑制hSARS病毒感染宿主或宿主细胞能力的化合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供用于鉴定降低hSARS病毒在宿主或宿主细胞中复制能力的化合物的方法。可使用普通技术人员熟知的任何技术筛选破坏或降低hSARS病毒感染宿主和/或在宿主或宿主细胞中复制的能力的化合物。

在某些实施方案中，本发明提供用于鉴定抑制hSARS病毒在哺乳动物或哺乳动物细胞中复制能力的化合物的方法。更具体地说，本发明提供用于鉴定抑制hSARS病毒感染哺乳动物或哺乳动物细胞能力的化合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供用于鉴定抑制hSARS病毒在哺乳动物细胞中复制能力的化合物的方法。在一个具体实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。

在另一实施方案中，将细胞与测试化合物接触并用hSARS病毒感染。在某些实施方案中，对照培养物在测试化合物不存在下用hSARS病毒感染。细胞可在用hSARS病毒感染之前、同时或之后与测试化合物接触。在一个具体实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一个甚至更具体实施方案中，细胞是人细胞。在某些实施方案中，细胞与测试化合物一起孵育至少1分钟、至少5分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少5小时、至少12小时或至少1天。病毒的滴度可在试验的任何时间进行测量。在某些实施方案中，测定培养物中病毒生长的时间进程。如果在测试化合物存在下病毒生长被抑制或降低，则测试化合物可鉴定为对抑制或降低hSARS病毒的生长或感染有效。在一个具体实施方案中，测试抑制或降低hSARS病毒生长的化合物抑制或降低其它病毒生长速率的能力，以测试其对hSARS病毒的特异性。

在一个实施方案中，将测试化合物给予模型动物，后者用hSARS病毒感染。在某些实施方案中，对照模型动物用hSARS病毒感染但不给予测试化合物。测试化合物可在用hSARS病毒感染之前、同时或之后给予。在一个具体实施方案中，模型动物是哺乳动物。在一个甚至更具体实施方案中，模型动物是可以是但不限于棉鼠、小鼠或猴。模型动物中的病毒滴度可在试验的任何时间进行测量。在某些实施方案中，测定培养物中病毒生长的时间进程。如果在测试化合物存在下病毒生长被抑制或降低，则测试化合物可鉴定为对抑制或降低hSARS病毒的生长或感染有效。在一个具体实施方案中，测试抑制或降低模型动物中hSARS病毒生长的化合物抑制或降低其它病毒生长速率的能力，以测试其对hSARS病毒的特异性。

6.实施例

以下实施例说明了新型hSARS病毒的分离和鉴定。这些实施例不应被解释为对本发明的限制。

方法和结果

使用Wiedbrauk DL和Johnston SLG的Manual of ClinicalVirology，Raven Press，New York，1993作为一般参考文献。

6.1 临床对象

本研究包括共50名符合SARS的世界卫生组织(WHO)修正定义的患者，他们于2003年2月26日至3月26日之间被香港特别行政区(HKSAR)的两个急性病地区医院收治(WHO.Severe acute respiratorysyndrome(SARS)2000，Weekly Epidemiol Rec；78：81-83)。本研究还包括另外一名患者的肺部活组织检查，该患者患典型的SARS并被第三家医院收治。简单的说，SARS的病例定义是：(i)发热38℃或更高；(ii)咳嗽或气短；(iii)胸部X光照片显示新的肺部浸润；及(iv)具有与SARS患者的接触史或对典型和非典型肺炎的经验抗生素药物覆盖(β-内酰胺和大环内酯药物、氟喹诺酮或四环素)无反应。

从所有患者收集鼻咽抽吸物和血清样品。从一些患者身上可获得成对的急性期和康复期的血清和粪便。对来自一个患者的肺部活组织进行处理，供进行病毒培养、RT-PCR、常规组织病理学检查和电子显微镜检查。供进行其它疾病的微生物试验的鼻咽抽吸物、粪便和血清在盲试情况下加入本研究中，作为对照物。

由主治医师和临床微生物学者对医疗记录进行回顾审阅。进行常规血液学、生物化学和微生物学检查，包括血液和痰的细菌培养、血清学研究，并收集鼻咽抽吸物进行病毒学试验。

6.2 细胞系

FRhK-4(胎猕猴肾)细胞在含1％胎牛血清、1％链霉素和青霉素、0.2％制霉菌素和0.05％硫酸庆大霉素的极限必需培养基(MEM)中维持。

6.3 病毒感染

用来自两个患者(参见下文“结果”一节)、处于病毒转运培养基中的200μl临床(鼻咽抽吸物)样品感染FRhK-4细胞。将接种细胞在37℃下温育1小时。然后将含1μg胰蛋白酶的1ml MEM加入到培养物中，将感染细胞在提供5％二氧化碳的37℃培养箱中温育。温育2-4天后，观察感染细胞中出现的细胞病变效应。使感染细胞传代成为新的FRhK-4细胞，在接种后1天内观察细胞病变效应。通过免疫荧光试验测试感染细胞的流感病毒A、流感病毒B、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒1型、2型和3型、腺病毒和人间质肺病毒(hMPV)，所有病例的试验结果均为阴性。还通过RP-PCR测试感染细胞的流感病毒A和人间质肺病毒，结果为阴性。

6.4 病毒形态学

收集如上制备的感染细胞，离心成颗粒状物，处理细胞颗粒状物，供进行薄切片透射电子显微镜检。在感染两个临床样本的细胞中鉴定出病毒颗粒，但在不被病毒感染的对照细胞中没有。从感染细胞分离的病毒颗粒约有70-100纳米(图2)。病毒衣壳主要发现于高尔基体和内质网的小泡中，在细胞质中也有发现。在细胞膜中也发现病毒颗粒。

对一份病毒分离物进行超离心，用磷钨酸对所得细胞颗粒状物进行负染色。这样显示了具有冠状病毒科特征的病毒颗粒。由于迄今已识别的人类冠状病毒已知并不会导致类似疾病，本发明人认为所述病毒分离物代表了感染人类的新型病毒。

6.5 对分离病毒的抗体应答

为进一步确认此新型病毒在受感染患者中引起SARS，从SARS患者身上获取血清样品，进行中和试验。将典型稀释的血清(x50、x200、x800和x1600)与用丙酮固定的感染hSARS的FRhK-4细胞一起在37℃下温育45分钟。然后用磷酸缓冲的盐水洗涤温育细胞，用抗人IgG-FITC缀合抗体染色。然后洗涤细胞，在荧光显微镜下检查。在这些实验中，在8名SARS患者中发现阳性信号(图3)，表明这些患者对此冠状病毒科新型人呼吸道病毒具有IgG抗体应答。与此对比，在4份阴性对照成对血清中没有信号检出。受试患者的抗hSARS抗体的血清滴度见表1。

表1

注：*SARS患者

这些结果表明，此冠状病毒科新成员是SARS的关键病原体。

6.6 hSARS病毒的序列

感染后两天从感染或未感染FrHK-4细胞收获总RNA。用逆转录酶(Invitrogen)按生产商的推荐在含10pg简并引物(5′-GCCGGAGCTCTGCAGAATTCNNNNNNN-3′：SEQ ID NO：5；N＝A、T、G或C)的20μl反应混合物中对100ng纯化RNA进行逆转录。然后通过

PCR纯化试剂盒按生产商的使用说明纯化逆转录产物，洗脱到30μl的10mM Tris-HCl(pH8.0)中。将3μl纯化cDNA产物加入到含以下成分的25μl反应混和物中：2.5μl10x PCR缓冲液、4μl 25mM MgCl₂、0.5μl 10mM dNTP、0.25μl AmpliTaq

DNA聚合酶(Applied Biosystems)、2.5μCi[α-³²P]CTP(Amersham)、2μl10μM引物(5′-GCCGGAGCTCTGCAGAATTC-3′：SEQ ID NO：6)。按以下程序对反应进行热循环：94℃8分钟，然后94℃1分钟、40℃1分钟，72℃2分钟的循环2次。该热循环后，进行94℃1分钟、60℃1分钟、72℃1分钟的循环35次。取6μlPCR产物进行5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。将凝胶对X光片曝光，X光片曝光过夜后显影。将只在感染细胞样品中鉴定出的独特PCR产物从凝胶中分离出来，用50μl1x TE缓冲液洗脱。然后将洗脱的PCR产物在含有以下成分的25μl反应混合物中再扩增：2.5μl 10x PCR缓冲液、4μl 25mM MgCl₂、0.5μl 10mM dNTP、0.25μl AmpliTaq  DNA聚合酶(AppliedBiosystems)、1μl 10μM引物(5′-GCCGGA GCTCTGCAGAATT-C-3′：SEQ ID NO：6)。按以下程序对反应进行热循环：94℃8分钟，然后94℃1分钟、60℃1分钟、72℃1分钟的循环35次。用TOPO TA Clonin

试剂盒(Invitrogen)克隆PCR产物，将连接的质粒转化到TOP10大肠杆菌(E.coli)感受态细胞(Invitrogen)中。PCR插入片段通过BigDye循环测序试剂盒按生产商(Applied Biosystems)的建议进行测序，测序产物通过自动测序仪(Applied Biosystems，型号3770)进行分析。获得的序列(SEQ ID NO：1)见图1。从获得的DNA序列推断的氨基酸序列(SEQ IDNO：2)显示，其与已鉴定冠状病毒的聚合酶蛋白有57％的同源性。

与此类似，从hSARS病毒获得另外两种部分序列(SEQ ID NO：11和13)及推断的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：12和14)，见图8(SEQID NO：11和12)和图9(SEQ ID NO：13和14)。

hSARS病毒的整个基因组序列见图10(SEQ ID NO：15)。以全部三种读框获得的SEQ ID NO：15的推断氨基酸序列见图11(核苷酸序列见SEQ ID NO：16、240和737；氨基酸序列见SEQ ID NO：17-239、241-736和738-1107)。以全部三种读框获得的SEQ ID NO：15的互补物的推断氨基酸序列见图12(核苷酸序列见SEQ NO：1108、1590和1965；氨基酸序列见SEQ ID NO：1109-1589、1591-1964和1966-2470)。

6.7 鼻咽抽吸物中hSARS病毒的检测

首先，通过快速免疫荧光抗原检测法检查鼻咽抽吸物(NPA)中的流感病毒A和B、副流感病毒1型、2型和3型、呼吸道合胞体病毒和腺病毒(Chan KH，Maldeis N，Pope W，Yup A，Ozinskas A.Gill J，Seto WH，Shortridge KF，Peiris JSM.Evaluation of Directigen Fly A+Btest for rapid diagnosis of influenza A and B virus infections.J ClinMicrobiol.2002；40：1675-1680)，在Mardin Darby犬肾细胞、LLC-Mk2、RDE、Hep-2和MRC-5细胞中培养鼻咽抽吸物的常规呼吸道病原体(WiedbraukDL，Johnston SLG.Manual of clinical virology.RavenPress，New York.1993)。随后，将胎猕猴肾细胞(FRhK-4)和A-549细胞加入到所用的一系列细胞系中。直接对临床样本进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以检测流感病毒A(Fouchier RA，Bestebroer TM，HerfstS，Van Der Kemp L，Rimmelzwan GF，Osterhaus AD.Detection ofinfluenza A virus from different species by PCR amplification of conservedsequences in the matrix gene.J Clin Microbiol.2000；38：4096-101)和人间质肺病毒(HMPV)。用于HMPV的引物为：第一轮，5′-AARGTSAATGCATCAGC-3′(SEQ ID NO：7)和5′-CAKATTYTGCTTATGCTTTC-3′(SEQ ID NO：8)；及嵌套引物：5′-ACACCTGTTACAATACCAGC-3′(SEQ ID NO：9)和5′-GACTTGAGTCCCAGCTCCA-3′(SEQ ID NO：10)。嵌套PCR产物的大小是201bp。用针对支原体的ELISA筛选细胞培养物(RocheDiagnostics GmbH，Roche，Indianapolis，USA)。

RT-PCR试验

对来自两个患者的hSARS病毒进行培养和遗传测序后(参见上文6.6节)，开发出用于从NPA样品检测hSARS病毒的RT-PCR。来自临床样品的总RNA用随机六聚体进行逆转录，cDNA用引物5′-TACACACCTCAGCGTTG-3′(SEQ ID NO：3)和5′-CACGAACGTGACGAAT-3′(SEQ ID NO：4)在2.5mM MgCl₂存在下扩增(94℃8分钟，然后94℃1分钟、50℃1分钟、72℃1分钟的循环40次)，所述两种引物是基于hSARS病毒的RNA依赖性RNA聚合酶编码序列(SEQ ID NO：1)构建的。

典型的RT-PCR方案概述如下：

1.RNA提取

通过QIAquick病毒RNA提取试剂盒从140μl NPA样品中提取RNA，洗脱在50μl洗脱缓冲液中。

2.逆转录

RNA                       11.5μl

0.1M DTT                                2μl

5x缓冲液                                4μl

10mM dNTP                               1μl

Superscript II，200U/μl(Invitrogen)     1μl

随机六聚体，0.3μg/μl                    0.5μl

反应条件       42℃，50分钟

               94℃，3分钟

               4℃

3.PCR

如下在50ul反应物中扩增通过随机引物产生的cDNA：

cDNA                                             2μl

10mM dNTP                                        0.5μl

10x缓冲液                                        5μl

25mM MgCl₂                                       5μl

25μM正向引物                                     0.5μl

25μM反向引物                                     0.5μl

AmpliTaq 聚合酶，5U/μl(Applied Biosystems)    0.25μl

水                                               36.25μl

热循环条件：95℃10分钟，然后95℃ 1分钟、50℃ 1分钟、72℃1分钟的循环40次。

4.引物序列

引物基于hSARS病毒的RNA依赖性RNA聚合酶编码序列(SEQID NO：1)设计。

正向引物：5′TACACACCTCAGCGTTG3′(SEQ ID NO：3)

反向引物：5′CACGAACGTGACGAAT3′(SEQ ID NO：4)

产物大小：182bp

实时定量PCR试验

通过

病毒RNA微型试剂盒(Qiagen)按生产商的说明从140μl鼻咽抽吸物(NPA)提取总RNA。在含有0.15μg随机六聚体、10mmol/LDTT和0.5mmol/LdNTP的20μl反应混和物中，将10μl洗脱的RNA样品用200 U 

逆转录酶(Invitrogen)按说明进行逆转录。然后互补DNA在 Green I荧光反应(Roche)混合物中进行扩增。简单的说，含有2μl的cDNA、3.5mmol/L MgCl₂、0.25μmol/L正向引物(5′-TACACACCTCAGCGTTG-3′；SEQ ID NO：3)和0.25μmol/L反向引物(5′-CACGAACGTGACGAAT-3′；SEQ ID NO：4)的20μl反应混合物中，用Light-Cycler(Roche)按PCR程序[95℃ 10分钟，然后95℃10分钟；57℃5秒；72℃9秒的循环50次]进行热循环。含有目标序列的质粒用作阳性对照。这些反应的荧光信号在每个循环的延伸步骤结束时捕捉(参见图7A)。为确定试验的特异性，在试验结束时对PCR产物(184个碱基对)进行解链曲线分析(65℃至95℃，每秒0.1℃；参见图7B)。

临床结果

临床发现：

所有50个SARS患者均为中国种族。他们代表了5个不同的流行病学相关群以及符合病例定义的其它偶发病例。他们平均在症状开始后5天住院。他们的中值年龄是42岁(23岁至74岁)，女性与男性的比例是1.3。其中14人(28％)是医护工作者，5人(10％)有到严重暴发SARS的医院的探望史。13人(26％)在家庭接触SARS患者，另外12人(24％)在社会上接触过SARS患者。4人(8％)有最近到中国大陆的旅行史。

大部分患者的主诉是发热(90％)和气短。半数以上的患者出现咳嗽和肌痛(表2)。少数患者出现上呼吸道症状，如鼻溢(24％)和喉咙痛(20％)。腹泻(10％)和食欲减退(10％)也有报道。最初听诊检查发现，只有38％的患者出现捻发音和进气减少。62％的患者报告有干咳。所有患者在接诊时经放射检查均发现实变迹象，包括1个区域(36例)、2个区域(13例)和3个区域(1例)。

表2

^*1名患者出现躯干斑丘疹。

大部分患者(98％)尽管发高烧，却没有白细胞增多的迹象。外周血检查发现淋巴细胞减少(68％)、白细胞减少(26％)、血小板减少(40％)和贫血(18％)(表3)。肝实质酶丙氨酸转氨酶(ALT)和肌肉酶肌酸酐激酶(CPK)分别在34％和26％的病例中升高。

表3

通过培养、抗原检测和PCR对已知病毒和细菌进行的常规微生物学检查在大部分病例中为阴性。一名接入重病监护室的74岁男性患者的血液培养发现大肠杆菌阳性，这是因为医院获得性尿道感染。另外两名患者入院时从其痰样本中分离出肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和流感嗜血菌(Hemophilus influenzae)。

给9名患者每24小时口服500mg左氧氟沙星，给另外40名患者静脉注射(每8小时1.2g)/口服(375mg，每日三次)阿莫西林-克拉维酸盐并每12小时静脉注射/口服500mg克拉霉素。给4名患者每日两次口服75mg奥塞米韦。给1名患者每24小时静脉注射2gm头孢曲松，每24小时口服500mg阿奇霉素，每日两次口服100mg金刚烷胺，以对典型和非典型肺炎进行经验覆盖。

19名患者发展为带有氧气去饱和的严重疾病，需要接受重病监护和通气支持。自症状开始起病情恶化的平均天数是8.3天。症状开始后平均6.7天给予49名患者每8小时静脉注射利巴韦林8mg/kg以及类固醇。

与需要接受重病监护和通气支持的严重并发疾病有关的风险因素是年老、淋巴细胞减少、ALT受损及延迟给予利巴韦林和类固醇(表4)。所有并发病例在接入重病监护室后用利巴韦林和类固醇治疗，而所有无并发病例在普通病房中开始用利巴韦林和类固醇治疗。正如所料，31个无并发病例痊愈或好转，而8个并发病例病情恶化，其中1个在本说明书写作时死亡。所有50名患者在本说明书写作时平均接受监控12天。

表4

^*由于病例数量少，没有进行多变量分析；

名患者有糖尿病，1名有肥厚性梗阻性心肌症，1名有慢性活动性乙型肝炎，1名有脑肿瘤；

名患者有原发性高血压；

§去饱和作用需要重病监护支持；

‖1名患者死亡。

从两名患者身上分离了两个病毒分离物，后来鉴定为冠状病毒科成员(参见下文)。一个病毒分离物来自一名53岁的中国香港居民的切开肺活组织检查组织，另一个病毒分离物来自一名以往健康良好的42岁女性的鼻咽抽吸物。该53岁男性与一名来自广州、后来死于SARS的中国游客有10个小时的家庭接触史。接触两天后，他就出现发热、身体不适、肌痛和头痛症状。肺右下区有捻发音，胸部放射照片显示有相应的肺泡阴影。血液学检查显示淋巴细胞减少，为0.7 x 10⁹/L，总白细胞和血小板计数正常。ALT(41U/L)和CPK(405U几)均受损。尽管他口服了阿奇霉素、金刚烷胺并静脉注射了头孢曲松，仍出现两侧肺部浸润物增加以及进行性氧气去饱和。因此，他入院9天后进行切开肺活组织检查。组织病理学检查显示中等间质炎症，分散的肺泡细胞呈现细胞巨大化、粒状两染性细胞质、细胞核增大、核仁突出。没有细胞显示出疱疹病毒或腺病毒感染的典型包涵体。该患者进行手术后需接受通气和重病监护。经验性给他静脉注射了利巴韦林和氢化可的松。但他还是在入院20天后死亡。在回顾时在其鼻咽抽吸物、肺活组织检查和死后的肺中发现冠状病毒样RNA。他抗自身hSARS分离物的抗体滴度显著升高，从1/200升至1/1600。

第二名分离出hSARS病毒的患者是一个以往健康良好的42岁女性。她曾到中国大陆的广州出行两天，回到香港五天后出现发热和腹泻症状。对她进行身体检查显示，肺右下区有捻发音，胸部放射照片显示有相应的肺泡阴影。检查还显示白细胞减少(2.7 x 10⁹/L)、淋巴细胞减少(0.6 x 10⁹/L)和血小板减少(104 x 10⁹/L)。尽管用阿莫西林-克拉维酸盐、克拉霉素和奥塞米韦给她进行经验性抗微生物药物覆盖，她在入院后五天病情还是恶化，需要接受机械通气和重病监护达五天。随后她逐渐好转，不需接受利巴韦林或类固醇治疗。其鼻咽抽吸物在RT-PCR试验中对病毒为阳性，并且她实现血清转化，抗hSARS分离物抗体滴度从<1/50至<1/1600。

病毒学发现：

从分别来自上述两名患者的肺活组织检查和鼻咽抽吸物的FRhK-4细胞分离出病毒。接种后2天至4天出现初始致细胞病变效应，但经随后的传代，致细胞病变效应在24小时内出现。两个病毒分离物均不与用于鉴定病毒分离物的一系列常规试剂反应，包括用于鉴定流感病毒A、B、副流感病毒1型、2型和3型、腺病毒和呼吸道合胞体病毒的试剂(DAKO，Glostrup，丹麦)。所述两个病毒分离物也不在用于流感病毒A和HMPV的RT-PCR试验中反应，或在用于支原体的PCR试验中反应。病毒对乙醚敏感，表明它是有包膜病毒。对通过超离心获得的负染色(2％磷钨酸钾，pH7.0)细胞培养提取物进行电子显微镜检查发现，存在多型有包膜病毒颗粒，直径约为80-90nm(70-130nm的范围)，其表面形态学似乎可与冠状病毒科成员相比(图5A)。对感染细胞进行薄切片电子显微镜检查显示，细胞质中的滑壁小泡内有直径为55-90nm的病毒颗粒(图5A和5B)。在细胞表面也可见病毒颗粒。总体发现与冠状病毒科病毒造成的细胞感染一致。

所述53岁男性的肺活组织检查薄切片电子显微照片显示，其脱屑细胞的细胞质中含有60-90nm病毒颗粒。这些病毒颗粒在大小和形态学上与在来自两名患者的细胞培养病毒分离物中观察到的病毒颗粒相似(图4)。

对随机引物RT-PCR试验中产生的RT-PCR产物进行了分析，对病毒感染样本中发现的特有条带进行了克隆和测序。在检查的30个克隆中，鉴定出含未知来源的646个碱基对(SEQ ID NO：1)的克隆。对此DNA片段进行测序分析表明，此序列与冠状病毒科家族的病毒有弱的同源性(数据未给出)。但是从此未知序列推断的氨基酸序列(215个氨基酸：SEQ ID NO：2)与牛冠状病毒和鼠肝炎病毒的RNA聚合酶具有高度的同源性(57％)，确证此病毒属于冠状病毒科家族。蛋白质序列的系统发生学分析显示，此病毒虽然与冠状病毒II类最紧密相关，但却是截然不同的病毒(图5A和5B)。

根据此分离物的646个碱基对序列，设计了用于检测新病毒的特异性引物，供在临床样本中对此hSARS病毒基因组进行RT-PCR检测。从50名SARS患者获得的44个鼻咽抽吸物样本中，22个样本有hSARS RNA迹象。在18个受检的粪便样品中有10个可检测出病毒RNA。RT-PCR反应的特异性通过对选出的阳性RT-PCR扩增产物进行测序来确认的。来自无关疾病患者的40个鼻咽抽吸物和粪便样本中没有一个在RT-PCR试验中具有反应性。

为确定实时定量PCR的动态范围，制备含目标序列的质粒DNA的连续稀释物，使其进行实时定量PCR试验。如图7A所示，该试验能够检测少至10个拷贝的目标序列。与之相比，在水对照中没有观察到信号(图7A)。在29名血清学确认的SARS患者中有23名观察到阳性信号。在所有这些阳性病例中，观察到与阳性对照的信号相对应的独特PCR产物(T_m＝82℃)(图7B，数据未给出)。这些结果表明，此试验对目标具有高度的特异性。这些反应中目标序列的拷贝数从4539至少于10。因此，在1mlNPA样品中可发现高达6.48 x 10⁵个拷贝的此病毒序列。上述阳性病例中有5个可以在血清转化前收集NPA样品。在这些样品中的3个检测出病毒RNA，表明此试验甚至在感染发作的早期就可检测出病毒。

为进一步确认此试验的特异性，征集健康人(n＝11)和感染腺病毒(n＝11)、呼吸道合胞体病毒(n＝11)、人间质肺病毒(n＝11)、流感病毒A(n＝13)或流感病毒B(n＝1)的患者的NPA样品作为阴性对照。所有这些样品除一个外，试验结果均为阴性。假阳性病例在随后的测试中为阴性。包括开始的假阳性的病例在内，实时定量PCR试验的灵敏度是79％，特异性是98％。

流行病学数据表明，飞沫传播是此病毒的主要传播途径之一。本研究从NPA样品中检测出活病毒和高拷贝的病毒序列，明确支持SARS患者的咳嗽和喷嚏飞沫可能是此传染媒介的主要来源。有趣的是，本研究中来自SARS患者的4个粪便样品中有2个在试验中呈阳性(数据未给出)。粪便中检测出病毒表明可能存在其它传播途径。有关指出的是，某些动物冠状病毒是通过粪-口途径传播的(McIntoshK.，1974，Coronaviruses：a comparative review.Current Top MicrobiolImmunol.63：85-112)。但是，需要进一步的研究以检验粪便中的病毒是否有传染性。

除此hSARS病毒外，目前还有两种已知的人冠状病毒血清群(229E和OC43)(Hruskova J.等，1990，Antibodies to human coronaviruses229E and OC43 in the population of C.R.，Acta Virol.34：346-52)。用于本试验的引物对与229E毒株没有同源性。由于在Genebank中不能获得相应的OC43序列，不知道这些引物是否能与此毒株发生交叉反应。但是，对在OC43聚合酶基因其它区域中可获得的序列进行的序列分析表明，与SARS有关的新型人病毒在遗传上与OC43截然不同。此外，在本研究中使用的引物与已知冠状病毒的任何序列都没有同源性。因此，这些引物不大可能会与OC43毒株发生交叉反应。

有报道说，除所述新型病原体外，在某些SARS患者身上还鉴定出间质肺病毒(Center for Disease Control and Prevention，2003，Morbidity and Mortality Weekly Report 52：269-272)。在本研究的任何患者中没有检出间质肺病毒感染的任何迹象(数据未给出)，表明本发明新型hSARS病毒是SARS发病机理中的主要参与者。

免疫荧光抗体测定：

在来自SARS患者的50份最新血清样品中有35份具有抗hSARS抗体的迹象(参见图3)。可获得成对急性期和康复期血清的27名患者都发生血清转化或其抗病毒抗体滴度均提高>4倍。来自本研究组以外群体的其它SARS患者的其它5对血清也进行了检测，以在社会上对SARS患者进行更广泛的取样，他们全部都发生血清转化。来自呼吸道疾病患者或其它疾病患者的80份血清以及200个正常献血者均没有可检测的抗体。

如果单一血清中对HP-CV血清阳性或在NPA或粪便中检出病毒RNA均被认为是感染hSARS的证据，那么50名患者中有45名具有感染迹象。在5名没有任何冠状病毒科病毒感染的病毒学证据的患者当中，只有一名患者在临床症状发作>14天后接受了血清检验。

讨论

SARS的暴发在许多方面是不寻常的，尤其是在医护工作者和家庭接触中集中出现肺炎患者。在这一系列SARS患者当中，对非典型肺炎的常规病原体的检查证实为阴性。但是从分别获自两名SARS患者的肺活组织检查和鼻咽抽吸物中分离出属于冠状病毒科家族的病毒。该病毒在系统发生学上与任何已知的人或动物冠状病毒或环状病毒都不紧密相关。本分析基于分离的hSARS病毒的聚合酶基因的646碱基对片段(SEQ ID NO：1)和全基因组，表明该病毒与冠状病毒的抗原2类以及鼠肝炎病毒和牛冠状病毒相关。但是，冠状病毒科病毒能够在病毒家族内部进行异源重组，故有必要对新型病毒的基因组的其它部分进行遗传分析，然后更加确凿地定义此病毒的本质(Holmes KV.Coronaviruses.Eds Knipe DM，Howley PM Fields Virology，第4版，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，1187-1203)。将生物学、遗传学和临床数据综合在一起，表明此新型病毒不是两种已知人冠状病毒的任一种。

患上临床定义的SARS的大部分患者(90％)有感染此病毒的血清学和RT-PCR证据。与此对比，在健康人对照中没有抗体或病毒RNA可检测出。可获得急性期和康复期血清的所有27名患者均显示抗hSARS病毒的抗体滴度升高，这加强了以下论点，即最近感染此病毒是SARS发展中的必要因素。另外，来自香港其它医院的患者的所有5对急性期和康复期血清经检测也显示对病毒的血清转化。没有显示hSARS病毒感染的血清学或病毒学证据的5名患者以后需要对康复期血清进行检测，以确定他们是否也发生血清转化。但是，假使临床病例的定义从未明确，hSARS病毒与SARS临床定义的一致性表现得仍很显著。

无论是通过RT-PCR还是根据抗HMPV抗体滴度的升高，这些患者中没有一个检测到HMPV感染的迹象。在我们的SARS患者组中始终没有检测到其它病原体。因此，很可能此hSARS病毒是导致SARS的原因或是该疾病发展的必要前提。是否有其它微生物因素或另外的辅助因素在该疾病的发展中发生作用还有待调查。

冠状病毒科家族包括冠状病毒属和环状病毒属。它们是有包膜RNA病毒，可导致人类和动物患病。以前知道的人冠状病毒229E和OC43型是导致普通感冒的主要原因(Holmes KV.Coronaviruses.EdsKnipe DM，Howley PM Fields Virology，第4版，Lippincott Williams &Wilkins，Philadelphia，1187-1203)。但是，虽然冠状病毒有时能在老人、新生婴儿或免疫受损患者中导致肺炎(El-Sahly HM，Atmar RL，Glezen WP，Greenberg SB.Spectrum of clinical illness in hospitaliziedpatients with“common cold”virus infections.Clin Infect Dis.2000；31：96-100；和Foltz EJ，Elkordy MA.Coronavirus pneumonia followingautologous bone marrow transplantation for breast cancer.Chest1999；115：901-905)，有报道说它们是军队新兵中肺炎的重要原因，在某些研究中占高达30％的病例(Wenzel RP，Hendley JO，Davies JA，Gwaltney JM，Coronavirus infections in military recruits：Three-year studywith coronavirus strains OC43 and 229E.Am Rev Respir Dis.1974；109：621-624)。人冠状病毒能感染神经元，已在多发性硬化症患者的大脑中检测到病毒RNA(Talbot PJ，Cote G，Arbour N.Human coronavirusOC43 and 229E persistence in neural cell cultures and human brains.AdvExp Med Biol.发表中)。另一方面，某些动物冠状病毒(例如猪传染性肠胃炎病毒、鼠肝炎病毒、禽传染性支气管炎病毒)会导致它们各自的宿主发生呼吸道疾病、胃肠疾病、神经疾病或肝病(McIntosh K.Coronaviruses：a comparative review.Current Top Microbiol Immunol.1974；63：85-112)。

我们第一次对SARS的临床表现和并发症进行了描述。不到25％的冠状病毒肺炎患者具有上呼吸道症状。正如对非典型肺炎所料到的，呼吸道症状和阳性听诊结果与胸部放射照片结果很不相称。10％的患者出现胃肠道症状。有关的是，冠状病毒RNA可在某些患者的粪便中检出，并且冠状病毒已知与动物和人类的腹泻有关(Caul EO，Egglestone SI.Further studies on human enteric coronaviruses Arch Virol.1977；54：107-17)。肝脏功能紊乱、白细胞减少、显著淋巴细胞减少、血小板减少及随后发展为成人呼吸窘迫综合征的高发率表明，此hSARS病毒导致了严重的全身性炎性损害。因此通过类固醇进行免疫调节以辅助利巴韦林的抗病毒疗法是很重要的。在这点上，同样假定与禽流感H5N1亚型(近来从动物交叉传染给人类的另一种病毒)有关的严重人类疾病具有免疫病理学成分是恰当的(Cheung CY，PoonLLM，Lau ASY等，Induction of proinflammatory cytokines in humanmacrophages by influenza A(H5N1)viruses：a mechanism for the unusualseverity of human disease.Lancet 2002；360：1831-1837)。和H5N1疾病一样，严重SARS患者也是成年人，其淋巴细胞减少更显著，且具有呼吸道以外器官功能障碍的特征(表4)(YuenKY，ChanPKS，Peiris JSM等，Clinical features and rapid viral diagnosis of human disease associatedwith avian influenza A H5N1 virus.Lancet 1998；351：467-471)。值得说明的是，从症状开始到呼吸衰竭有约8天的机会窗口。严重的并发症病例与潜在疾病及利巴韦林和类固醇疗法的延迟使用强烈相关。根据我们从最初病例得到的临床经验，在入院时基本上没有并发症的后来病例中我们很早就实施上述组合疗法。采用这个治疗方案，到本说明书写作时总死亡率只有2％。在19个并发症病例中还有8个没有出现明显的反应。由于剂量及起始治疗时间不一致，不可能详细分析对此组合方案的治疗反应。

与此严重疾病有关的其它因素是通过家庭接触而患病，这可归因于高剂量或持续暴露于病毒以及存在潜在疾病。

在此所作的临床描述基本上是关于入院治疗的较严重病例。目前我们还没有任何关于社会和门诊中出现的冠状病毒科感染的完整临床范围数据。本文描述的诊断试验的有效性将有助于解决以上问题。另外，这也允许解决关于康复中病毒脱落(及传染性)的时期、病毒在其它体液和排泄物中的存在以及潜伏期中病毒脱落的发生等问题。

目前的流行病学数据似乎表明病毒是通过飞沫或直接和间接接触而传播的，虽然在某些情况下不能排除通过空气传播。在呼吸道中发现传染性病毒支持了此论点。初步的证据也暗示病毒可能脱落于粪便中。但是，值得说明的是，病毒RNA的检出并不能证明病毒有生存力或传染性。如果在粪便中检出活病毒，这可能是需要加以考虑的另一潜在传播途径。可恰当指出的是，某些动物冠状病毒是通过粪-口途径传播的(McIntosh K.，Coronaviruses：a comparative review.Current TopMicrobiol Immunol.1974，63：85-112)。

总之，本报告提供了如下证据，即冠状病毒科家族的病毒是SARS的病原因子。

7.保藏

分离hSARS病毒的样品根据微生物保藏布达佩斯条约于2003年4月2日保藏在位于武汉大学(中国武汉430072)的中国典型培养物中心(CCTCC)，给予的保藏号检索是CCTCC-V200303，其通过引用整体结合到本文中。

8.市场潜力

现能大规模培养hSARS病毒，这使得可以开发如上所述的各种诊断试验和开发能有效预防、改善或治疗SARS的疫苗和抗病毒药物。鉴于该疾病的严重性及其在全世界的迅速蔓延，对用于对抗该疾病的诊断试验、疗法和疫苗的需求很可能在全世界范围内明显上升。另外，此病毒含有对临床和科研应用极其重要和有价值的遗传信息。

9.等价方案

本领域普通技术人员仅仅采用常规实验，就将认识到或能够确定本文所述具体实施方案的许多等价方案。这种等价方案被以下权利要求书所包涵。

在本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过引用结合到本文说明书中，其程度如同各个单独的出版物、专利或专利申请被明确和个别指出通过引用结合到本文中。

本文对参考文献的引用或讨论不应被解释为承认这就是本发明的现有技术。

Claims (4)

1.一种分离的hSARS病毒，所述病毒在中国典型培养物中心的保藏检索号为CCTCC-V200303。

2.一种宿主细胞，所述细胞被保藏检索号CCTCC-V200303的hSARS病毒感染。

3.权利要求2的宿主细胞，所述细胞是灵长目动物细胞。

4.权利要求3的宿主细胞，所述细胞是FRhK-4胎猕猴肾细胞。

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