CN109929032A - 一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是针对上述手足口病病毒感染难以预防和治疗的问题，提供一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法，一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法，包含以下步骤：1)制备手足口病病毒EV71病毒颗粒；2)根据EV71序列设计一对特异性引物，表达VP1蛋白；3)复合抗原的制备；4)将复合免疫抗原对SPF产蛋母鸡进行免疫，获得免疫鸡蛋；5)将免疫鸡蛋蛋黄进行提取、纯化，后过滤除菌，再经过超低温喷雾干燥，即得抗体纯品，4℃保存，本发明所制备的鸡卵黄抗体，具有安全方便、简单易得、产率高、成本低、特异性强。

Description

一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及免疫学技术领域，特别是指一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法。

背景技术

手足口病(Hand foot and mouth disease HFMD)是一种儿童传染病，又名发疹性水疱口腔炎，是由一组肠道病毒引起的常见传染病，该病全年均可发病，多发于夏秋季，可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹，具有很强的传染性，可以通过玩具、食具、鼻咽分泌物、飞沫粪便等多种途径传染。手足口病的易感人群基本是五岁以下儿童，临床表现以发热和手、足、口腔等部位的疱疹为主要临床特征，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等，合并神经系统、呼吸系统、循环系统等并发症状，导致严重的后遗症甚至死亡，尤以脑干脑炎为甚。严重威胁儿童健康。2008年我国首次将手足口病纳入法定传染病。

手足口病是由肠道病毒引起的传染病，引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，其中以肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(Cox A16)最为常见，不同年间的主要感染病毒类型有所变化。手足口病病例中，EV71型感染引发的后遗症更严重，致死率更高，在我国EV71-C4亚型占主导地位。中国疾病预防控制中心统计数据显示，2008-2015年，我国共报告手足口病约1380万例，平均年发病率为14.7例/万人，重症病例约13万例，死亡3300多人。其中EV71、CV-A16和其他肠道病毒感染比例分别为44％、25％和31％。重症病例中EV71感染占74％，死亡病例中EV71构成比高达93％，据估算，我国每年由EV71感染所致重症和轻症手足口病病例的费用分别为1.8亿元和10亿-20亿元。

HFMD病病人可以通过呼吸道分泌物、疱疹液和粪便排泄病毒，该病主要侵犯5岁以下儿童。儿童个人卫生行为难以控制，隔离也比较困难，并且隐性传播比例高，易造成大规模传染，这给手足口病的预防带来了困难。因此，研制一种能够特异性中和EV71和CA16病毒、抑制其感染的抗体产品，将能有效阻断病毒的传播，快速提高机体免疫力，恢复机体健康，对于防控和减少手足口病的发生具有重大意义，同时也具有广阔的市场前景。

发明内容

本发明的目的是针对上述手足口病病毒感染难以预防和治疗的问题，提供一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法。

本发明的技术方案是这样实现的：一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法，包含以下步骤：

1)制备手足口病病毒EV71病毒颗粒；

2)根据EV71序列设计一对特异性引物，以手足口患儿咽拭子标本提取病毒核酸经逆转录后产物(cDNA)为模板，PCR扩增VP1基因(反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；55℃，30sec；72℃,90sec)×30；72℃，10min)，再经PCR扩增后双酶切的方法构建原核表达载体pET22b-VP1，测序成功后的表达载体用于VP1蛋白的表达；

3)复合抗原的制备；

4)将复合免疫抗原对SPF产蛋母鸡进行免疫，获得免疫鸡蛋；

5)将免疫鸡蛋蛋黄进行提取、纯化，后过滤除菌，再经过超低温喷雾干燥，即得抗手足口病的鸡卵黄抗体纯品，4℃保存。

优选的，步骤2)中一对特异性引物的序列，上游引物：GGAGATAGGGTGGCAGATGTAA，下游引物：AAGAGTAGTGATCGCTGTGCGA。

优选的，步骤2)中PCR扩增的VP1，其基因序列为：GGAGATAGGGTGGCAGATGTAATTGAAAGTTCCATAGGAGATAGCGTGAGCAGAGCCCTCACTCACGCTCTACCAGCACCCACAGGCCAGAACACACAGGTGAGCAGTCATCGACTGGATACAGGCAAGGTTCCAGCACTCCAAGCTGCTGAAATTGGAGCATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGCATGATTGAGACACGCTGTGTTCTTAACTCGCACAGCACAGCTGAGACCACTCTTGATAGTTTCTTCAGCAGAGCGGGATTAGTCGGAGAGATAGATCTCCCTCTTGAAGGCACAACTAACCCAAATGGTTATGCCAACTGGGACATAGATATAACAGGTTACGCACAAATGCGTAGAAAGGTGGAGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGCAGAGTTCACTTTTGTTGCGTGCACACCCACCGGGGGAATTGTCCCACAATTGCTCCAATACATGTTTGTGCCACCTGGAGCCCCTAAGCCAGATTCCAGAGAATCCCTCGCATGGCAAACCGCTACCAACCCCTCGGTTTTTGTCAAGCTGTCAGACCCCCCAGCGCAGGTTTCAGTGCCATTCATGTCACCTGCGAGTGCTTACCAATGGTTTTATGATGGGTATCCCACATTCGGAGAACACAAACAGGAGAAAGATCTTGAGTATGGGGCATGTCCTAATAACATGATGGGCACGTTCTCAGTGCGGACTGTAGGGACCTCCAAGTCCAAGTACCCTTTAGTGGTTAGGATTTACATGAGAATGAAGCACGTTAGGGCGTGGATACCTCGCCCGATGCGTAACCAGAACTACCTATTCAAAGCCAACCCAAATTATGCTGGCAACTCCATTAAGCCAACTGGTACCAGTCGCACAGCGATCACTACTCTT。

优选的，步骤2)中PCR扩增的VP1的反应条件：在95℃条件下反应5min；在95℃下反应30sec；在55℃反应30sec；在72℃下反应90sec，这种95℃、55℃、72℃的方式循环30次；最后在72℃条件下反应10min。

优选的，步骤2)中EV71VP1蛋白的表达方法：将载体pET22b导入表达工程菌BL21，37℃培养细菌，16小时后将培养细菌以1:100的比例加入LB培养基中，37℃培养至OD值为0.6，加入诱导剂IPTG，其浓度为0.5mM，转入16℃培养20小时，离心收获细菌，加入缓冲液，每2L菌液加入50ml缓冲液，缓冲液中50mM Tris、150mM NaCl、pH＝8.0，充分重悬细菌，超声破碎细菌2小时后高速离心收集上清液，上清液通过镍亲和层析柱，使目的蛋白吸附于亲和柱，用50mM Tris、150mM NaCl、50mM咪唑、pH＝8.0的缓冲液除去杂质，再以洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，洗脱缓冲液中包含50mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑、pH＝8.0，目的蛋白再依次通过阴离子交换、凝胶层析进行精度纯化，获得重组EV71病毒VP1蛋白。

优选的，步骤3)中复合抗原的制备方法：将EV71病毒颗粒与重组EV71病毒VP1蛋白分别用0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS进行稀释，PBS缓冲液的pH为7.2，等比例混合后与弗氏完全佐剂按照1:1(V/V)比例充分乳化后制成手足口病病毒复合免疫抗原。

优选的，步骤1)EV71病毒颗粒的制备方法：收集EV71病毒，EV71病毒接种单层Vero细胞，37℃、5％二氧化碳培养至细胞半数死亡，冻融裂解细胞三次后，12000rpm离心收集上清液。甲醛或β-丙内酯灭活病毒，PEG8000沉淀病毒，4℃沉淀过夜，8000rpm离心20min，收集沉淀，PBS缓慢溶解沉淀，再通过蔗糖垫层进行超速离心，病毒颗粒收集完毕。

本发明的有益效果如下：

本发明所制备的鸡卵黄抗体，具有安全方便、简单易得、产率高、成本低、特异性强、不与IgG发生交叉血清学反应；且耐热、耐酸，巴氏灭菌温度下不会失活且在pH值小于3时也能保持稳定活性，这些独特的优点使鸡卵黄抗体在临床和基础科学的应用中起着重要的作用。因此鸡卵黄抗体在医学领域的应用越来越受到人类的关注，抗手足口病特异性鸡卵黄抗体的研制对手足口病的预防与治疗具有重要意义。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法，包含以下步骤：

1)制备手足口病病毒EV71病毒颗粒；具体方法，收集EV71病毒，EV71病毒接种单层Vero细胞，37℃、5％二氧化碳培养至细胞半数死亡，冻融裂解细胞三次后，12000rpm离心收集上清液。甲醛或β-丙内酯灭活病毒，PEG8000沉淀病毒，4℃沉淀过夜，8000rpm离心20min，收集沉淀，PBS缓慢溶解沉淀，再通过蔗糖垫层进行超速离心，病毒颗粒收集完毕；

2)根据EV71序列设计一对特异性引物，上游引物：GGAGATAGGGTGGCAGATGTAA，下游引物：AAGAGTAGTGATCGCTGTGCGA，以手足口患儿咽拭子标本提取病毒核酸经逆转录后产物cDNA为模板，PCR扩增VP1基因，反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；55℃，30sec；72℃,90sec)×30；72℃，10min)，再经PCR扩增后双酶切的方法构建原核表达载体pET22b-VP1，测序成功后的表达载体用于VP1蛋白的表达；EV71VP1蛋白的表达方法：将载体pET22b导入表达工程菌BL21，37℃培养细菌，16小时后将培养细菌以1:100的比例加入LB培养基中，37℃培养至OD值为0.6，加入诱导剂IPTG，其浓度为0.5mM，转入16℃培养20小时，离心收获细菌，加入缓冲液，每2L菌液加入50ml缓冲液，缓冲液中50mM Tris、150mM NaCl、pH＝8.0，充分重悬细菌，超声破碎细菌2小时后高速离心收集上清液，上清液通过镍亲和层析柱，使目的蛋白吸附于亲和柱，用50mM Tris、150mM NaCl、50mM咪唑、pH＝8.0的缓冲液除去杂质，再以洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，洗脱缓冲液中包含50mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑、pH＝8.0，目的蛋白再依次通过阴离子交换、凝胶层析进行精度纯化，获得重组EV71病毒VP1蛋白；VP1蛋白序列GDRVADVIESSIGDSVSRALTHALPAPTGQNTQVSSHRLDTGKVPALQAAEIGASSNASDESMIETRCVLNSHSTAETTLDSFFSRAGLVGEIDLPLEGTTNPNGYANWDIDITGYAQMRRKVELFTYMRFDAEFTFVACTPTGGIVPQLLQYMFVPPGAPKPDSRESLAWQTATNPSVFVKLSDPPAQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGEHKQEKDLEYGACPNNMMGTFSVRTVGTSKSKYPLVVRIYMRMKHVRAWIPRPMRNQNYLFKANPNYAGNSIKPTGTSRTAITTL；

步骤2)中PCR扩增的VP1，其基因序列为：GGAGATAGGGTGGCAGATGTAATTGAAAGTTCCATAGGAGATAGCGTGAGCAGAGCCCTCACTCACGCTCTACCAGCACCCACAGGCCAGAACACACAGGTGAGCAGTCATCGACTGGATACAGGCAAGGTTCCAGCACTCCAAGCTGCTGAAATTGGAGCATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGCATGATTGAGACACGCTGTGTTCTTAACTCGCACAGCACAGCTGAGACCACTCTTGATAGTTTCTTCAGCAGAGCGGGATTAGTCGGAGAGATAGATCTCCCTCTTGAAGGCACAACTAACCCAAATGGTTATGCCAACTGGGACATAGATATAACAGGTTACGCACAAATGCGTAGAAAGGTGGAGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGCAGAGTTCACTTTTGTTGCGTGCACACCCACCGGGGGAATTGTCCCACAATTGCTCCAATACATGTTTGTGCCACCTGGAGCCCCTAAGCCAGATTCCAGAGAATCCCTCGCATGGCAAACCGCTACCAACCCCTCGGTTTTTGTCAAGCTGTCAGACCCCCCAGCGCAGGTTTCAGTGCCATTCATGTCACCTGCGAGTGCTTACCAATGGTTTTATGATGGGTATCCCACATTCGGAGAACACAAACAGGAGAAAGATCTTGAGTATGGGGCATGTCCTAATAACATGATGGGCACGTTCTCAGTGCGGACTGTAGGGACCTCCAAGTCCAAGTACCCTTTAGTGGTTAGGATTTACATGAGAATGAAGCACGTTAGGGCGTGGATACCTCGCCCGATGCGTAACCAGAACTACCTATTCAAAGCCAACCCAAATTATGCTGGCAACTCCATTAAGCCAACTGGTACCAGTCGCACAGCGATCACTACTCTT；

3)复合抗原的制备；将EV71病毒颗粒与重组EV71病毒VP1蛋白分别用0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS进行稀释，PBS缓冲液的pH为7.2，等比例混合后与弗氏完全佐剂按照1:1(V/V)比例充分乳化后制成手足口病病毒复合免疫抗原

4)将复合免疫抗原对SPF产蛋母鸡进行免疫，获得免疫鸡蛋；用手足口病病毒复合免疫抗原免疫产蛋母鸡：取健康适龄的SPF产蛋母鸡，在鸡双翅轴骨头下的臂三角肌、背部等位置用乳化好的复合免疫抗原进行肌肉、皮下多点注射，以使蛋鸡产生更好的免疫反应；首次免疫前收集未免疫鸡蛋作为阴性对照品，21天后免疫第二次，以后每隔21天免疫一次，每次免疫剂量为0.2-1ml/只，共免疫4-6次；用ELISA跟踪检测免疫鸡蛋中抗手足口病病毒鸡卵黄抗体的效价，收集高效价免疫鸡蛋(1:1024)，将每日收集的免疫鸡蛋编号，4℃下保存；

5)将免疫鸡蛋蛋黄进行提取、纯化，后过滤除菌，再经过超低温喷雾干燥，即得抗手足口病的鸡卵黄抗体纯品，4℃保存。

步骤5)的具体实施方法：将获得的免疫鸡蛋用清水清洗鸡蛋，浸泡于0.1％新洁尔灭溶液中10min后，灭菌水冲洗沥干，去壳，分离蛋黄和蛋清，留取蛋黄部分，测定所收集的蛋黄体积，水稀释法提取：按比例1：6-12比例加入纯化水，用1mol/L盐酸溶液调节PH为5.2-5.6，4℃条件下静置过夜，6000-10000r/min离心，取上清液，测定所收集上清液的体积；根据以上步骤制得的上清液中稍慢速度搅拌下加入PEG6000或者硅藻土，充分搅拌后，置于高速冷冻离心机中，在10℃下以6000-10000r/min r/min，离心，倾去上清液，沉淀部分即为抗手足口病病毒鸡卵黄抗体粗品；用纯化水溶解制得的粗品至上清液初体积，用超滤膜进行超滤浓缩，超滤截留相对分子量为30KD-150KD滤液，将超滤截留液进行除菌过滤，即可制得抗手足口病病毒鸡卵黄抗体纯品；进行超低温喷雾干燥，即制得抗手足口病病毒鸡卵黄抗体，4℃保存。

用上述方法制备的抗体，进行纯度、稳定性检测。

纯度检测

采用醋酸纤维膜电泳分离并测定抗流感病毒鸡卵黄抗体纯度，醋酸纤维膜电泳是以醋酸纤维膜为支持物的电泳方法。醋酸纤维膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一泡沫样的结构，厚度仅120微米，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速，样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点，目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白、同工酶的分离和鉴定。检测结果表明：纯度≥40％。

稳定性检测

1、将卵黄抗体IgY溶液(IgY溶解于PBS溶液)梯度稀释成不同浓度，置于25℃室温环境下孵育，评价其室温稳定性。

2、在不同pH环境下孵育，评价卵黄抗体IgY pH稳定性。

3、在不同温度下孵育，评价卵黄抗体IgY热稳定性。

4、将卵黄抗体IgY用不同pH环境的胃蛋白酶进行处理，评价胃蛋白酶对鸡卵黄抗体IgY的影响。

抗手足口病病毒鸡卵黄抗体的ELISA效价活性检测。

采用“ELISA法”(酶联免疫吸附试验)检测本发明的工艺制取的抗手足口病病毒鸡卵黄抗体的ELISA效价。检测结果表明，效价达到了1:1400。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于描述复合抗原的制备及免疫方法、鸡卵黄抗原的纯化方法及鸡卵黄抗原的稳定性评价方法，包含以下步骤：

1)制备手足口病病毒EV71病毒颗粒；

2)根据EV71序列设计一对特异性引物，以手足口患儿咽拭子标本提取病毒核酸经逆转录后产物cDNA为模板，PCR扩增VP1基因，再经PCR扩增后双酶切的方法构建原核表达载体pET22b-VP1，测序成功后的表达载体用于VP1蛋白的表达；

3)复合抗原的制备；

4)将复合免疫抗原对SPF产蛋母鸡进行免疫，获得免疫鸡蛋；

5)将免疫鸡蛋蛋黄进行提取、纯化，后过滤除菌，再经过超低温喷雾干燥，即得抗手足口病的鸡卵黄抗体纯品，4℃保存。

2.如权利要求1所述的一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于，

步骤1)EV71病毒颗粒的制备方法：收集EV71病毒，EV71病毒接种单层Vero细胞，37℃、5％二氧化碳培养至细胞半数死亡，冻融裂解细胞三次后，12000rpm离心收集上清液，甲醛或β-丙内酯灭活病毒，PEG8000沉淀病毒，4℃沉淀过夜，8000rpm离心20min，收集沉淀，PBS缓慢溶解沉淀，再通过蔗糖垫层进行超速离心，病毒颗粒收集完毕。

3.如权利要求1所述的一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于，

步骤2)中一对特异性引物的序列，上游引物：GGAGATAGGGTGGCAGATGTAA，下游引物：AAGAGTAGTGATCGCTGTGCGA。

4.如权利要求1所述的一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于，

步骤2)中PCR扩增的VP1，其基因序列为：GGAGATAGGGTGGCAGATGTAATTGAAAGTTCCATAGGAGATAGCGTGAGCAGAGCCCTCACTCACGCTCTACCAGCACCCACAGGCCAGAACACACAGGTGAGCAGTCATCGACTGGATACAGGCAAGGTTCCAGCACTCCAAGCTGCTGAAATTGGAGCATCATCAAATGCTAGTGACGAGAGCATGATTGAGACACGCTGTGTTCTTAACTCGCACAGCACAGCTGAGACCACTCTTGATAGTTTCTTCAGCAGAGCGGGATTAGTCGGAGAGATAGATCTCCCTCTTGAAGGCACAACTAACCCAAATGGTTATGCCAACTGGGACATAGATATAACAGGTTACGCACAAATGCGTAGAAAGGTGGAGCTATTCACCTACATGCGCTTTGATGCAGAGTTCACTTTTGTTGCGTGCACACCCACCGGGGGAATTGTCCCACAATTGCTCCAATACATGTTTGTGCCACCTGGAGCCCCTAAGCCAGATTCCAGAGAATCCCTCGCATGGCAAACCGCTACCAACCCCTCGGTTTTTGTCAAGCTGTCAGACCCCCCAGCGCAGGTTTCAGTGCCATTCATGTCACCTGCGAGTGCTTACCAATGGTTTTATGATGGGTATCCCACATTCGGAGAACACAAACAGGAGAAAGATCTTGAGTATGGGGCATGTCCTAATAACATGATGGGCACGTTCTCAGTGCGGACTGTAGGGACCTCCAAGTCCAAGTACCCTTTAGTGGTTAGGATTTACATGAGAATGAAGCACGTTAGGGCGTGGATACCTCGCCCGATGCGTAACCAGAACTACCTATTCAAAGCCAACCCAAATTATGCTGGCAACTCCATTAAGCCAACTGGTACCAGTCGCACAGCGATCACTACTCTT。

5.如权利要求1所述的一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于，

步骤2)中PCR扩增的VP1的反应条件：在95℃条件下反应5min；在95℃下反应30sec；在55℃反应30sec；在72℃下反应90sec，这种95℃、55℃、72℃的方式循环30次；最后在72℃条件下反应10min。

6.如权利要求1所述的一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于，

步骤2)中EV71VP1蛋白的表达方法：将载体pET22b导入表达工程菌BL21，37℃培养细菌，16小时后将培养细菌以1:100的比例加入LB培养基中，37℃培养至OD值为0.6，加入诱导剂IPTG，其浓度为0.5mM，转入16℃培养20小时，离心收获细菌，加入缓冲液，每2L菌液加入50ml缓冲液，缓冲液中50mM Tris、150mM NaCl、pH＝8.0，充分重悬细菌，超声破碎细菌2小时后高速离心收集上清液，上清液通过镍亲和层析柱，使目的蛋白吸附于亲和柱，用50mMTris、150mM NaCl、50mM咪唑、pH＝8.0的缓冲液除去杂质，再以洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，洗脱缓冲液中包含50mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑、pH＝8.0，目的蛋白再依次通过阴离子交换、凝胶层析进行精度纯化，获得重组EV71病毒VP1蛋白。

7.如权利要求1所述的一种抗手足口病鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于，

步骤3)中复合抗原的制备方法：将EV71病毒颗粒与重组EV71病毒VP1蛋白分别用0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS进行稀释，PBS缓冲液的pH为7.2，等比例混合后与弗氏完全佐剂按照1:1(V/V)比例充分乳化后制成手足口病病毒复合免疫抗原。