CN101863976A

CN101863976A - 一种ev71病毒抗体的制备方法

Info

Publication number: CN101863976A
Application number: CN201010172735A
Authority: CN
Inventors: 支旭勃; 刘磊; 郭海荣; 王俊
Original assignee: ZHUHAI YINGPING BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: ZHUHAI YINGPING BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2010-05-14
Filing date: 2010-05-14
Publication date: 2010-10-20
Anticipated expiration: 2030-05-14
Also published as: CN101863976B

Abstract

本发明公开了一种EV71病毒抗体的制备方法。包括以下设计含有不同酶切位点的上、下游引物，扩增EV71病毒株SHZH98的抗原决定序列；将扩增得到的抗原决定序列克隆到载体上，构建重组质粒；将重组质粒转入细菌或真菌中进行表达，收集表达得到的抗原蛋白；将抗原蛋白溶解，注射至动物体内，诱导动物产生抗体，收集、纯化得到抗体。本发明方法制得的抗体，可以阻止EV71病毒的感染，具有预防和治疗手足口病的功能。可以直接添加在食品、保健品中。

Description

一种EV71病毒抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及一种病毒抗体的制备方法，特别涉及一种EV71病毒抗体的制备方法。

背景技术

手足口病，英文名为：Hand-foot-and-mouth disease，是由肠道病毒引起的传染病，多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿如果病情发展快，会导致死亡。

引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，以及肠道病毒71型均为手足口病较常见的病原体，其中以柯萨奇病毒A16型(CoxA16)和肠道病毒71型(EV71)最为常见。

手足口病是全球性传染病，自1957年新西兰首次发现此病以来，世界大部分地区均有此病流行的报导，且近几年来每次爆发的规模跟持续的时间都在不断增长。

我国自1981年在上海始见本病，以后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、西宁、广东等十几个省市均有报导。此病每隔2-3年便会爆发一次，每年的4-8月份为该病的流行期。我国以EV71型病毒感染居多。

EV71病毒属肠道病毒属(Enterovirus)的成员，EV71病毒株SHZH98基因序列病毒基因组为7408个核苷酸的正链RNA，编码约2194个氨基酸，其Genebank登记号为：AF302996.1，其序列如SEQ ID NO：1所示。

截止2009年4月份，全国已累计报告手足口病115618例，死亡50例，而此时该病才刚刚开始流行，还未达到高峰。

目前针还没有针对该病的疫苗，治疗上主要以预防为主，配合药物治疗，但是由于该病存在很多隐性感染，同时传播速度快，传播途径多，所以预防和控制该病难度很大。加上感染的大部分是5周岁以下的小孩，病程短发病急，稍有不慎就有可能危机到小孩的生命，所以该病已被我国纳入丙类传染疾病进行管理。因此开发EV71病毒的多克隆卵黄抗体的研究，具有广泛的社会需求和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种EV71病毒抗体的制备方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种EV71病毒抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)设计含有不同酶切位点的上、下游引物，扩增EV71病毒株SHZH98的抗原决定序列；

2)将扩增得到的抗原决定序列克隆到载体上，构建重组质粒；

3)将重组质粒转入细菌或真菌中进行表达，收集表达得到的抗原蛋白；

4)将抗原蛋白溶解，注射至动物体内，诱导动物产生抗体，收集、纯化得到抗体，所述抗原决定序列为EV71病毒株SHZH98的2439bp-3329bp、1713bp-3329bp、2439bp-3779bp。

优选的，上、下游引物中的酶切位点为EcoRI、XhoI的酶切位点。

优选的，产生EV71病毒抗体的动物为禽类。

本发明方法制得的抗体，可以阻止EV71病毒的感染，具有预防和治疗手足口病的功能。

本发明方法制得的抗体，可以直接添加在食品、保健品中，也可以阻止EV71病毒的感染，具有预防和治疗手足口病的功能。

采用抗原免疫禽类产生抗体，可以直接收集禽类卵，大大降低了抗体提纯的成本，制备速度快。

附图说明

图1是各抗体的免疫效果对比图。

具体实施方式

下面结合实例，进一步说明本发明。

以下实施例中：

EV71病毒由第四军医大学西京医院儿科惠赠，病毒分离自患儿咽拭子标本，检测鉴定均参考国家手足口病标本采集及检测技术方案，荧光定量PCR检测为阳性后，感染细胞分离扩增保存。当然，也可以使用其他可公开获得的EV71病毒，扩增得到本发明的抗原决定序列。

pGEX-4T1质粒、细菌BL21、大肠杆菌Rosetta，均由西北农林科技大学张智英教授惠赠。

将EV71病毒扩增，提取其总RNA，使用RT-PCR扩增所需片断。

抗原制备实施例1

1)使用上游引物：CCCGAATTCGGAGATAGGGTGGCAGAT(SEQ ID NO：

5)，下游引物：CCCCTCGAGGAGAGTGGTGATCGCTGC(SEQ ID NO：

6)，采用TouchDown-PCR扩增与EV71病毒株SHZH98基因序列的2439bp-3329bp(SEQ ID NO：2)一致的片断，片段大小891bp，上游引物中，GAATTC为EcoRI的酶切位点，下游引物中，CTCGAG为XhoI酶切位点；

2)使用EcoRI、XhoI将PCR产物克隆到pGEX-4T1载体上，构建成重组质粒，测序确认后，将重组质粒转入细菌BL21，37℃，250rpm摇菌至OD₆₀₀0.6～0.8后添加IPTG诱导表达两小时。

3)表达得到的重组蛋白在细菌以包涵体的形式存在，12000rpm离心收集细胞，裂解液(100mM NaH₂PO₄、10mM Tris-HCl、8M尿素、pH8.0)重悬后经超声波破碎，收集上清过0.45μm滤膜备用，GST结合柱经平衡液(100mM NaH₂PO₄、10mM Tris-HCl、pH8.0)平衡后上样，洗柱后(100mM NaH₂PO₄、10mM Tris-HCl、8M尿素、pH6.3)用高盐缓冲液(100mM NaH₂PO₄、10mM Tris-HCl、8M尿素、pH4.5)洗脱收集SDS-PAGE胶检测，目的蛋白用PBS(pH7.4)透析24h，每隔6h换水一次。

经鉴定抗原纯度达到85％以上。

抗原制备实施例2

1)使用上游引物：AAAGAATTCGGTTTTCCCACTGAA(SEQ ID NO：7)，下游引物：CCCCTCGAGGAGAGTGGTGATCGCTG(SEQ ID NO：8)，采用TouchDown-PCR扩增与EV71病毒株SHZH98基因序列的1713bp-3329bp(SEQ ID NO：3)一致的片断，片段大小1617bp，上游引物中，GAATTC为EcoRI的酶切位点，下游引物中，CTCGAG为XhoI酶切位点；

2)使用EcoRI、XhoI将PCR产物克隆到pGEX-4T1载体上，构建成重组质粒，测序确认后，将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta中，37℃，250rpm摇菌至OD₆₀₀0.6～0.8后添加IPTG诱导表达三小时。

经鉴定抗原纯度达到85％以上。

抗原制备实施例3

1)使用上游引物：AAAGAATTCGGAGATAGGGTGGCAGATGT(SEQ IDNO：9)，下游引物：CCCCTCGAGCTGCTCCATAGCTTCTTCATC(SEQID NO：10)，采用TouchDown-PCR扩增与EV71病毒株SHZH98基因序列的2439bp-3779bp(SEQ ID NO：4)一致的片断，片段大小1341bp，上游引物中，GAATTC为EcoRI的酶切位点，下游引物中，CTCGAG为XhoI酶切位点；

2)使用EcoRI、XhoI将PCR产物克隆到pGEX-4T1载体上，构建成重组质粒，测序确认后，将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta中，37℃，250rpm摇菌至OD₆₀₀0.6～0.8后添加IPTG诱导表达两小时。

经鉴定抗原纯度达到85％以上。

蛋白抗体的制备方法如下：

1)将抗原用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)溶解，调节浓度至1mg/ml，将该抗原液与等量完全弗氏佐剂混合，充分乳化制备初次免疫抗原；

2)将初次免疫抗原通过颈部皮下多点注射免疫母鸡，注射量1.0ml，初次免疫；

3)2周后使用不完全弗氏佐剂乳化抗原加强免疫，第3周同前处理再加强免疫一次；

4)3天后采血，采用ELISA法检测血清中特异性抗体效价。当效价达到10000以上时，开始收集鸡蛋。母鸡隔离饲养，自由摄食。

5)将收集的鸡蛋进行清洗，打蛋，用分离器将蛋黄和蛋清分离，蛋黄处理方法如下：将蛋黄和9倍体积的去离子水，充分混合后4℃静置过夜，4000rpm离心10min，取上清，加入硫酸铵至终浓度40％，剧烈搅拌10min，静置2h，离心弃上清，沉淀重新溶解于PBS中，超滤截留100k-300k之间的部分，同时脱盐，然后应用冷冻干燥机将蛋白抗体干燥。

分别使用抗原制备实施例1～3制得的抗原，按上述抗体的制备方法得到抗体，分别记为抗体1、抗体2、抗体3。

使用SDS-PAGE检测抗体纯度。抗体回收率约为70％，抗体纯度＞95％。

全病毒灭活抗体的制备

一、细胞培养

用恒河猴肾细胞对EV71病毒进行扩增，用生长液培养细胞，待细胞长至70％左右的时候接种病毒。细胞培养液如下表：

二、接种和观察

1)使用10cm细胞培养皿培养细胞，传细胞时，每管加细胞培养液10ml。显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康、无污染的；

2)待细胞长至70％左右，倒掉生长液(GM)，换上8ml的维持液(MM)；

3)接种50ul病毒原液，培养温度要求36℃；

4)使用显微镜每天观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应(CPE)的出现(如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等)；

5)观察有75％的细胞出现特征性的肠道病毒CPE变化(3+CPE)时，消化离心收集细胞，液氮反复冻融3-4次，12000转离心10min，收集上清，重新感染新培养的细胞，反复操作，扩增所需病毒；

6)将扩增好的病毒的细胞离心破碎后，收集沉淀灭菌PBS重悬制成含有病毒颗粒的悬液，调整滴度到1×10⁸/pfu，-70℃冻存备用。

三、病毒纯化

采用蔗糖密度梯度离心法纯化病毒，操作如下：

1)取上步所得病毒悬液，溶解后，先以5000g离心15分钟后，获取上清夜，然后再20000g高速离心30分钟后取上清夜；

2)接着10万g超速离心2h，将沉淀用少量STE溶解；

3)先在超速离心管中加入5-8mL的第3步所获取的含病毒样品的溶解液，然后在离心管中用长针头从底部往上依次加入30％，45％，60％的蔗糖，11万g离心2.5h，在30％与45％以及45％与60％之间都有一条明亮的带，用长针头将两条不同部位的带都吸取出来，分别收集到不同的瓶内；

4)用STE缓冲液适量稀释纯化的病毒，然后11万g离心3h，用少量STE缓冲液把沉淀悬起，即最后获得了纯化的病毒，分光光度计测定其病毒含量；

5)应用甲醛灭活病毒，检测病毒活性，调整滴度待用。

由上述方法制得的抗体记为抗体4。

疗效实验：

将上述方法制得的蛋白抗体(IgY)+饲料饲喂健康小鼠，用扩增得到的EV71病毒感染小鼠；同时设正常饲料饲养的对照小鼠，采用相同剂量病毒进行感染，检测抗体对小鼠的保护作用。

实验分组设计如下：

每组10只小鼠，自由饮食，两周后感染病毒，继续饲喂原设计饲料两周，观察记录小鼠健康状况，统计数据结果。

病毒感染

取纯化后病毒，调整病毒滴度，分别按照10⁴pfu/只、10⁵pfu/只、10⁵pfu/只的剂量饲喂正常小鼠，观察小鼠健康状况，1～3天均出现食欲不振，精神萎靡，排水样粪便等病状，7天左右开始有小鼠死亡。

攻毒各实验组均取中间剂量即10⁵pfu/只添加进饲料中饲喂上述实验组小鼠，随后仍按原设计继续饲喂相应饲料，观察记录小鼠健康状况，与正常组对比。

结果

实验结果显示，饲料中添加IgY对小鼠有一定的保护作用，经过两周的攻毒实验后，添加IgY各组小鼠死亡率较低，尤其是抗体组1按照100ug/kg及200ug/kg体重添加IgY组，小鼠的存活率达到100％，且无不良症状。详细结果如图1所示。

可以看出，口服IgY抗体的小鼠对EV71病毒感染有较好的防御作用。实验显示，口服EV71病毒IgY抗体对抵御该病毒感染有较好的作用。本发明方法制得的IgY可以开发为口服疫苗、保健食品，用于手足口病的预防或治疗。

Claims

1.一种EV71病毒抗体的制备方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种EV71病毒抗体的制备方法，其特征在于：引物中的酶切位点为EcoRI、XhoI的酶切位点。

3.根据权利要求1所述的一种EV71病毒抗体的制备方法，其特征在于：所述动物为禽类。