RU2793828C1 - Штамм "О/Кения/2017" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа O/EA-2 для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа O/EA-2 - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа О/ЕА-2, семейства Picornaviridae, рода Aphthovirus, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №412 - деп / 22-46 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» штамм «О/Кения/2017» генотипа О/ЕА-2 вируса ящура. Представленный штамм репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21). В перевиваемой суспензионной культуре клеток почки сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIАН в течение 10,25±0,49 часов инкубирования концентрация 146S компонента штамма «О/Кения/2017» генотипа О вируса ящура имеет средние значения 1,32±0,08 мкг/см³ (70,94±0,95%), сохраняя исходные характеристики при пассировании в клеточной культуре ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Представленный штамм может быть использован для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа О/ЕА-2 и для контроля антигенной активности противоящурных вакцин. 1 ил., 4 табл., 5 пр.

Description

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано для разработки и изготовления средств диагностики, специфической профилактики ящура генотипа О/ЕА-2 и контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин.

К особо опасным, высококонтагиозным, вирусным болезням животных в соответствии с Руководством МЭБ (ΟΙΕ) относится ящур (Food-and-Mouth Disease), который приносит непоправимый экономический ущерб в связи с затратами на ликвидацию болезни и введением строгих ограничений, налагаемых на внутреннюю и международную торговлю продукцией животноводства [1].

Возбудителем является безоболочечный вирус рода Aphthovirus семейства Picornaviridae. Выделяют 7 различных серотипов вируса ящура: О, А, Азия-1, С и SAT-1, SAT-2, SAT-3, причем самым распространенным является тип О [2]. Геном вируса ящура представлен одноцепочечной молекулой РНК (ssRNA(+)) положительной полярности с длиной около 8400-8500 н.о., кодирует 4 структурных белка: VP₁, VP₂, VP₃, VP₄ и множество неструктурных протеинов [2].

Явление мутационной изменчивости вируса в пределах одного генотипа приводит к возникновению новых изолятов, которые отличаются по степени вирулентности и иммуногенности от ранее выделенных штаммов вируса ящура. Каждый серотип генетически разделен на различные топотипы, генетические линии и сублинии (для некоторых штаммов ограничиваются только топотипом, поскольку для них более глубокого разделения не существует на сегодняшний день). Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP₁), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [1, 2, 3].

Протеин VP₁ вируса ящура является наиболее вариабельным, поскольку на него приходится около 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [3, 4]. Участок поверхностного белка VP₁ в регионе 130-160 а.о. отличается высокой изменчивостью, поскольку участвует в распознавании рецепторов клетки-хозяина [4, 5]. Серотипы вируса ящура в среднем на 86% имеют идентичные последовательностей, хотя VP₁ значительно более вариабелен. Нуклеотидные последовательности кодирующей области VP₁ используются для генетической характеристики штаммов ящура из-за их значимости для прикрепления и проникновения вируса в клетку, защитного иммунитета и специфичности серотипа. Филогенетический анализ на основе нуклеотидной последовательности ID-гена (белок VP₁) широко используется для вывода эволюционной динамики, эпидемиологических отношений между генетическими линиями и для отслеживания происхождения и перемещения штаммов вируса ящура [5].

В РНК-содержащих вирусах, в частности, для вируса ящура вариациям в геноме благоприятствуют высокие частоты мутаций во время процесса репликации вируса, а возникающие топотипы, генетические линии и сублинии обусловлены мутациями и явлением рекомбинации. Рекомбинация представляет собой обмен генетическим материалом между двумя несегментированными РНК-геномами и может происходить между вирусами одного и того же серотипа [5]. Данное явление в нуклеиновой кислоте вируса ящура происходит легче в 3'-части генома, чем в участках, кодирующих структурные вирусные белки. Мутации в результате рекомбинации могут привести к обмену генетическим материалом и образованию новых антигенных вариантов, которые зачастую приводят к изменениям тропизма клеток [4, 5].

Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием поверхностных вирусных белков и факторов клеток-хозяев [5, 6].

Репрезентативные штаммы/изоляты для каждого топотипа вируса ящура могут образовывать основные опорные точки филогенетического дерева. В базе данных GenBank представлены нуклеотидные последовательности для различных топотипов, генетических линий и сублиний.

Серотип О вируса ящура является наиболее изученным и распространенным во всем мире. Данный серотип разделен на 11 топотипов: EAST AFRICA 1 - 4 (Восточная Африка) (ЕА-1-4), SOUTHEAST ASIA (Юго-Восточная Азия) (SEA), EUROPE-SOUTH AMERICA (Европа-Южная Америка) (EURO-SA), INDONESIA-1 и 2 (Индонезия-1 и 2) (ISA-1 and -2), CATHAY (Китай), MIDDLE EAST-SOUTH ASIA (ME-SA) (Ближний Восток-Южная Азия) и WEST AFRICA (Западная Африка) (WA). Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа О и в частности нового генотипа О/ЕА-2, представители которого стали распространяться на территории Восточной Африки и за ее пределами.

На территории Восточной Африки, в частности, в Нигерии, Кении, Танзании, Эфиопии вспышки ящура генотипа О/ЕА-2 имеют спорадический характер. Следует отметить, что в последние годы усилились торгово-экономические связи со странами Африканского континента, в частности, Восточной Африки. Имеются риски заноса изолятов данного генотипа на территорию Российской Федерации.

Анализируя вспышки, которые регистрировались на территории Африки, обнаружено, что в Нигерии, Кении, Танзании, Эфиопии были выявлены изоляты вируса ящура, которые принадлежат к серотипу О, в частности, в 2009, 2010 гг. отмечали вспышки ящура генотипа О/ЕА-1, в 2010 г. - О/ЕА-4, в 2010, 2011, 2017, 2020, 2021 гг. - О/ЕА-2. При этом следует отметить, что представители генотипа О/ЕА-2 вируса ящура встречались в единичном количестве, а с 2021 г. стали массово регистрировать в странах Восточной Африки и на прилегающих территориях, что является опасным и требует исследования штаммов данного генотипа для создания средств диагностики и специфической профилактики ящура генотипа О/ЕА-2.

Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа О, которые применяются для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм «О/Тайвань/1997» (генотип O/CATHAY/CAM 94),

- штамм «О/Приморский/2014» (генотип O/SEA/Mya-98),

- штамм «О/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia),

- штамм «О/Саудовская Аравия/2008» (генотип 0/ME-SA/PanAsia2),

- штамм «О/Забайкальский/2016» (генотип O/ME-SA/Ind-2001).

Изолят «Ο/ΚΕΝ/4/2017» вируса ящура был выделен из патологического материала от крупного рогатого скота на территории Республики Кении в 2017 г. При проведении научных исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» был охарактеризован и получил название - штамм «О/Кения/2017».

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм принадлежит к генотипу О/ЕА-2 вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа О.

Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал производственных штаммов вируса ящура серотипа О, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде, пригодный для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических тест-систем и высоко иммуногенных вакцинных препаратов путем получения штамма «О/Кения/2017» вируса ящура для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа О/ЕА-2.

Штамм вируса ящура «О/Кения/2017» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №412 - деп / 22-46 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «О/Кения/2017» вируса ящура для изготовления средств диагностики и профилактики ящура генотипа О/ЕА-2.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1. - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «О/Кения/2017» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP₁.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP₁ штамма «О/Кения/2017» вируса ящура генотипа О/ЕА-2;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP₁ штамма «О/Кения/2017» вируса ящура генотипа О/ЕА-2.

Штамм «О/Кения/2017» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «О/Кения/2017» вируса ящура серотипа О относится к отряду Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, виду Foot-and-Mouth Disease virus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 20-25 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной молекулы РНК с позитивным смыслом, заключенной в белковую оболочку. Она состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии. Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «О/Кения/2017» вируса ящура относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP₁ штамма «О/Кения/2017» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «О/Кения/2017» вируса ящура принадлежит к генотипу О/ЕА-2 (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «О/Кения/2017» вируса ящура изучено в РМН, в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм «О/Тайвань/1997» (генотип O/CATHAY/CAM 94),

- штамм «О/Приморский/2014» (генотип O/SEA/Mya-98),

- штамм «О/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia),

- штамм «О/Саудовская Аравия/2008» (генотип 0/ME-SA/PanAsia2),

- штамм «О/Забайкальский/2016» (генотип O/ME-SA/Ind-2001).

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа О, против 10² ТЦД50 гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7, 8, 9].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются близкородственными;

при < 0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура отличается от производственного штамма.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «О/Кения/2017» составили r₁ от 0,04 до 0,08, что свидетельствует об отсутствии антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа О (табл. 1).

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «О/Кения/2017» вируса ящура является РНК(+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, выделяют РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации РНК для сборки вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Плавучая плотность 1,45 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «О/Кения/2017» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при рН 7,42-7,65. Сдвиги рН в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,3°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «О/Кения/2017» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «О/Кения/2017» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Исследование биологических свойств штамма «О/Кения/2017» вируса ящура при репродукции в монослойных перевиваемых клеточных линиях.

При выделении изолята «Ο/ΚΕΝ/4/2017» вируса ящура с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [7].

Биологические и вирусологические методы включали в себя метод выделения в культуре клеток и адаптацию вируса ящура к перевиваемым клеточным линиям.

Выделение вируса ящура проводили в монослойных перевиваемых клеточных линиях ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 с последующей адаптацией в течение 5 последовательных пассажей. Культуры клеток выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25,0 см², отмывали от ростовой среды и заражали 10%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в растворе Хэнкса с 0,5% гидролизата лактальбумина по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов вирусную суспензию предварительно обрабатывали 10%-ным раствором хлороформа. После 30-минутного контакта вируса с клеточной культурой при температуре 37±0,5°С во флаконы вносили по 5,0 см³ поддерживающей среды и инкубировали при температуре 37±0,5°С до появления цитопатического действия (ЦПД) в культуре клеток, которое представлено в виде округления клеток, повышения их оптической плотности, дегенерации и отделении клеток от поверхности субстрата. При ЦПД не менее 90% клеток, флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение не менее 24 часов проявлялось 90-100% ЦПД в монослое клеточных культур. Адаптация эпизоотического изолята «Ο/ΚΕΝ/4/2017» к различным клеточным линиям наступала на уровне пятого пассажа. Титр инфекционной активности определяли с помощью разработанной ранее методики [10]. Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2, данные которой свидетельствуют о высокой адаптационной способности изолята «Ο/ΚΕΝ/4/2017» вируса ящура к использованным клеточным линиям. В монослойной культуре клеток ПСГК-30 за 15 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,50±0,13 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток IB-RS-2 за 12 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,80±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток ВНК-21 за 13 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,65±0,14 lg ТЦД₅₀/см³. Каждое исследование и культивирование проводили 7 раз. В итоге получен штамм «О/Кения/2017» с охарактеризованными биологическими культуральными свойствами, который далее использовали для исследования его свойств.

Пример 2. Оценка биологических свойств штамма «О/Кения/2017» вируса ящура на крупном рогатом скоте.

Заражение КРС исходным штаммом вируса ящура проводили интрадермолингвально (I пассаж). Адаптацию и наработку штамма «О/Кения/2017» вируса ящура на КРС проводили в течение 2 последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт на этапе 2 пассажа на КРС получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения на 1/15 Μ фосфатно-солевом буферном растворе (ФБР). Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили интрадермолингвально в 4 точки по 0,1 см³ двум головам КРС. Учет результатов титрования на животных проводили спустя 24 ч по наличию афт на месте введения разведений вируса ящура штамма «О/Кения/2017». Титр инфекционной активности на КРС штамма «О/Кения/2017» вируса ящура на стадии первого пассажа на КРС составил 4,75 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго пассажа - 5,25 lg ИД₅₀/0,1 см³. Таким образом, была получена 10%-ная афтозная суспензия вируса ящура штамма «О/Кения/2017» (2 пассаж на КРС) с титром инфекционной активности 5,25 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 3. Исследование биологических свойств штамма «О/Кения/2017» вируса ящура на свиньях.

Заражение свиней исходным штаммом «О/Кения/2017» вируса ящура проводили внутрикожно на стадии первого пассажа в область венчика передних конечностей. Адаптацию и наработку штамма «О/Кения/2017» вируса ящура на свиньях вели в течение 2 последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт 2 пассажа на свиньях получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения с использованием в качестве растворителя 1/15 Μ ФБР. Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили внутрикожно в венчики копытец по 0,1 см³ в 4 точки на каждый палец конечности одного разведения, из расчета 1 разведение на 2 копытца 1 конечности каждому из 2 подопытных подсвинков.

Учет результатов титрования проводили через 24 ч по наличию афт на месте введения разведений. Титр инфекционной активности на свиньях для штамма «О/Кения/2017» вируса ящура на свиньях на стадии первого пассажа составил 5,00 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго - 5,50 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 4. Исследование биологических свойств штамма «О/Кения/2017» вируса ящура при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Штамм «О/Кения/2017» вируса ящура репродуцировали в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH. В качестве поддерживающей среды использовали среду Игла, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого при рН среды 7,42-7,65. Клеточную линию заражали вирусом из расчета 0,005 ТЦД₅₀/клетка.

Культивирование штамма «О/Кения/2017» вируса ящура осуществляли при температуре 37,0±0,2°С до достижения ЦПД вируса, соответствующего не менее 90%. Полученную вируссодержащую суспензию контролировали на стерильность и содержание 146S компонента и общего вирусного белка (ОВБ). Полученные суспензии были стерильными. Концентрация ОВБ в суспензии составляла 1,87±0,10 мкг/см³. Значения титра инфекционной активности вируса, а также процентное содержание 146S компонента штамма «О/Кения/2017» вируса ящура отражены в таблице 3, из данных которой видно, что при средней концентрации клеток ВНК-21/SUSP/ARRTAH, равной 4,07±0,11 млн клеток/см³, дозе заражения 0,005 ТЦД₅₀/клетку и продолжительности репродукции вируса 10,25±0,49 ч средний титр инфекционной активности возбудителя ящура был равен 7,63±0,05 lg ТЦД₅₀/СМ³. Концентрацию 146S компонента вируса ящура определяли с помощью ранее разработанной методики [11]. Содержание данного компонента составило 70,94±0,95% (1,32±0,08 мкг/см³).

Пример 5. Оценка типовой специфичности и активности штамма «О/Кения/2017» вируса ящура

Оценку типовой специфичности и активности штамма «О/Кения/2017» вируса ящура проводили в реакции связывания комплемента (РСК).

К полученному антигену штамма «О/Кения/2017» вируса ящура, взятому в объеме 0,4 см³ в цельном виде и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 добавляли по 0,1 см³ гомологичной и гетерологичных гипериммунных сывороток, полученных на вирус ящура в рабочем (удвоенном) титре и 0,1 см³ комплемента в рабочем разведении. Смесь выдерживали в водяной бане в течение 20 мин при температуре 37±0,2°С. Затем вносили по 0,2 см³ гемолитической системы и выдерживали 30 мин при температуре 37±0,2°С. Положительный результат реакции соответствовал 100%-ной задержке гемолиза эритроцитов барана («4 креста»). Параллельно проводили контрольные реакции без сыворотки, без комплемента и компонентов реакции.

В качестве реагентов в РСК использовали сыворотки ящурные типоспецифические гипериммунные морских свинок, полученные на производственные штаммы вируса ящура А/Турция/06, О/Кения/2017 (предлагаемое изобретение), Азия-1/Таджикистан/2011, SAT-1 №96/62, SAT-2/SAU7/2000, О/Приморский/2014 комплемент сухой для РСК, гемолизин (сыворотка гемолитическая), эритроциты барана 2% (взвесь на физиологическом растворе, рН=7,05-7,15). В качестве контроля использовали антигены вируса ящура штаммов А/Турция/06, О/Кения/2017, Азия-1/Таджикистан/2011, SAT-1 №96/62, SAT-2/SAU7/2000, О/Приморский/2014.

Результаты исследования отражены в таблице 4, из которой следует, что штамм «О/Кения/2017» вируса ящура обладает выраженной типовой специфичностью, относится к вирусу ящура серотипа О и активен в РСК в разведении 1:16.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм «О/Кения/2017» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа О/ЕА-2 для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа О/ЕА-2»:

1. ΟΙΕ. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. Paris, 2018. - Ch. 3.1.8.

2. Пономарев А.П., Узюмов В.Л. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

3. Alexandersen, S. The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease / S. Alexsandersen, Z. Zhang, A.L. Donaldson // J. Compr. Pathol. - 2003. - V. 129. - P. 268-282.

4. Жильцова M.B. Биологические свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типов А, О и Азия-1: Автореф…дис. кан. наук. - Владимир: 2008. - 23 с.

5. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. / Под ред. А.Н. Бурдова. - М., Агропромиздат, 1990, 320 с.

6. Анализ эпизоотической ситуации по ящуру в России с 2010 г. по март 2019 г. / В.П. Семакина, Т.П. Акимова, В.А. Мищенко, А.К. Караулов // Ветеринария. - 2019. - №11. - С. 16-20.

7. Методические рекомендации по выделению и идентификации штаммов вируса ящура / А.А. Гусев, В.М. Захаров, Ж.А. Шажко и др.; ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир. 2002. - 31 с.

8. Методические рекомендации по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации / С.Р. Кременчугская, М.В. Жильцова, Т.К. Майорова; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2012. - 36 с.

9. Эпизоотологические особенности ящура типа А, вызванного гетерологичными штаммами вируса / А.В. Мищенко, В.А. Мищенко, В.В. Дрыгин [и др.] // Ветеринария. - 2014. - №11. - С. 20-24.

10. Патент №2674076 С1 Российская Федерация, МПК А61К 39/135, C12Q 1/68. Способ определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: №2017145889: заявл. 25.12.2017: опубл. 04.12.2018 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

11. Патент №2712769 С1 Российская Федерация, МПК G01M 33/58, C12Q 1/68. Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов: №2019116272: заявл. 27.05.2019: опубл. 31.01.2020 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="2017.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2022-11-03">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-11-03</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>467</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-11-03</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Штамм «О/Кения/2017» вируса ящура

Aphtae epizooticae генотипа O/EA-2 для изготовления биопрепаратов для

диагностики и специфической профилактики ящура генотипа

O/EA-2</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacctccccgggtgagtcggctgaccctgtgactgccactgtggaga

actacggtggcgcaactcaggcccagagacgccaacacacggatgtctcgttcattctggacagatttgt

gaaggttacaccccaagaccaaatcaatgttctggacctgatgcagatccctgcccacacactggtgggc

gcgctcttgcgcgcatccacttactactttgctgatttggaagtggcagtgaaacacgagggcaacctca

cttgggtcccgaacggagcacccgaagttgcactggataacaccaccaacccaacagcataccacaaggc

acctctcactcgccttgcattgccttacacggcaccacaccgcgtgttggcaaccgtgtacaacgggaac

tgcaagtacagtggctcctcagtgactaacgtgaggggtgaccttcaagtgttggcccagaaggctgcga

gagcgctgcccacctccttcaactacggtgccgtcaaggccactcgggtgacagaactgctttaccgcat

gaagagggctgaaacatactgcccccggcccctcttggccatccacccgagtgatgctagacacaaacaa

aagattgtggcacctgtcaaacaactccta</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSPGESADPVTATVENYGGATQAQRRQHTDVSFILDRFVKVTPQDQIN

VLDLMQIPAHTLVGALLRASTYYFADLEVAVKHEGNLTWVPNGAPEVALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPY

TAPHRVLATVYNGNCKYSGSSVTNVRGDLQVLAQKAARALPTSFNYGAVKATRVTELLYRMKRAETYCPR

PLLAIHPSDARHKQKIVAPVKQLL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims (1)

1. Штамм «О/Кения/2017» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа О/ЕА-2, семейства Picornaviridae, рода Aphthovirus, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №412 - деп / 22-46 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» и предназначенный для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа О/ЕА-2.

Images