RU2806602C1 - Штамм "SAT-2/Кения/19/2017" вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления средств диагностики и профилактики ящура генотипа SAT-2/IV - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-2/IV, семейства Picornaviridae, рода Aphthovirus, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №452 - деп / 23-2 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» штамм «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV вируса ящура. Представленный штамм репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21). В перевиваемой суспензионной культуре клеток почки сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH в течение 15,25±0,54 часов инкубирования концентрация 146S компонента штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV вируса ящура имеет средние значения 1,29±0,11 мкг/см³ (65,38±0,70%), сохраняя исходные характеристики при пассировании в клеточной культуре ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Представленный штамм может быть использован для изготовления средств диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/IV и для контроля антигенной активности противоящурных вакцин. 1 ил., 3 табл., 5 пр.

Description

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано для разработки и изготовления средств диагностики, специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/IV и контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин.

Ящур является высококонтагиозным вирусным заболеванием, которое причиняет серьезный экономический ущерб в связи с затратами на ликвидацию болезни и введением строгих ограничений, налагаемых на внутреннюю и международную торговлю продукцией животноводства.

В странах, благополучных по ящуру (страны ЕС и Северной Америки), политика контроля в основном основывалась на забое инфицированных и контактировавших с ними животных, а также на ограничении перемещения животных и продуктов животного происхождения. Предусмотрено прибегать к вакцинации в чрезвычайных обстоятельствах, когда вспышка обширна и забой большого количества животных становится неуправляемым [1, 2]. Вовремя и после вспышки ящура в Великобритании и Нидерландах в 2001 г. возрос спрос на «прививку за жизнь» в качестве альтернативы крупномасштабному забою для борьбы с ящуром. Несмотря на то, что во время вспышки 2001 г. в Нидерландах применялась вакцинация, после вспышки все вакцинированные животные были убиты («прививать на поражение»). В соответствии с так называемой политикой «вакцинируй, чтобы жить», контроль вспышек ящура в будущем в странах, свободных от ящура, можно было бы контролировать с помощью короткого периода экстренной вакцинации окружающих инфицированных стад с последующим выявлением и ликвидацией инфицированных животных. Как следствие, Всемирная организация по охране здоровья животных, Международное бюро по эпизоотиям (МЭБ) и ЕС одобрили новые правила, в соответствии с которыми страны теперь могут восстановить статус свободных от ящура зон через 6 месяцев после сообщения о последнем случае после использование политики «вакцинируй, чтобы жить», а не 1 год [3]. Страны, использующие этот подход, должны показать отсутствие циркуляции вируса (в случае продолжающейся вакцинации) и отсутствие каких-либо инфицированных животных в случае краткосрочной экстренной вакцинации [1, 2]. На сегодняшний день система мер для борьбы с ящуром и его профилактики предусматривает стемпинг-аут, а также массовую иммунизацию восприимчивых животных, и далее контроль уровня напряженности поствакцинального иммунитета [1].

Возбудителем является безоболочечный вирус рода Aphthovirus семейства Picornaviridae. Выделяют 7 различных серотипов вируса ящура: О, А, Азия-1, С и SAT-1, SAT-2, SAT-3. Геном вируса ящура представлен одноцепочечной молекулой РНК (ssRNA(+)) положительной полярности. Вирионная РНК различных штаммов вируса ящура имеют одинаковую длину около 8400-8500 и.о., кодирует 4 структурных белка: VP₁, VP₂, VP₃, VP₄ [2]. Вирус ящура серотипа SAT-2 имеет большую изменчивость последовательности в гене белка VP₁ по сравнению с вирусами серотипов О, А и С [2, 3], для которых он рассматривается как широкий антигенный вариант, поэтому в случае SAT-2 требуется тщательный отбор иммунодоминантного вакцинного штамма [3].

Изменчивость вируса в пределах одного генотипа приводит к возникновению новых изолятов, которые отличаются по степени вирулентности и иммуногенности от ранее выделенных штаммов вируса ящура. Каждый серотип генетически разделен на различные топотипы, генетические линии и сублинии. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности ID-гена (белок VP₁), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [1, 2, 3].

Белок VP₁ является наиболее вариабельным, поскольку на него приходится около 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [3, 4]. Участок поверхностного белка VP₁ в регионе 130-160 а.о. отличается высокой вариабельностью, поскольку участвует в процессе связывания с рецепторами клетки-хозяина [4, 5]. Изменчивость данного региона дает возможность вирусу ящура взаимодействовать с рецепторами клеток разных типов и облегчает переход от одного вида хозяина к другому. Серотипы вируса ящура в среднем на 86% имеют идентичные последовательности, хотя VP₁ значительно более вариабелен. Нуклеотидные последовательности кодирующей области VP₁ используются для генетической характеристики штаммов ящура из-за их значимости для прикрепления и проникновения вируса в клетку, защитного иммунитета и специфичности серотипа. Филогенетический анализ на основе последовательности VP₁ широко используется для вывода эволюционной динамики, эпидемиологических отношений между генетическими линиями и для отслеживания происхождения и перемещения штаммов вируса ящура [5].

Наблюдаемая генетическая вариация в геноме вируса ящура является результатом двух процессов. Во-первых, это ошибки, которые возникают в результате репликации вирусной РНК и отсутствия репарации кодируемой РНК-зависимой РНК-полимеразы. Во-вторых, конкурентный отбор, который воздействует на геном. В природной среде в результате будут преобладать изоляты новых генетических линий, которые включают в свой геном требуемые для данной среды характеристики [4, 5].

В РНК-содержащих вирусах вариациям в геноме благоприятствуют высокие частоты мутаций во время репликации вируса, а возникающие линии и су 6 линии обусловлены мутациями и рекомбинацией. Рекомбинация - еще один важный процесс, определяющий биологию и эволюцию вирусов. Она представляет собой обмен генетическим материалом между двумя несегментированными РНК-геномами. Генетическая рекомбинация происходит между вирусами одного и того же серотипа [5]. Рекомбинации в нуклеиновой кислоте вируса ящура происходят легче в 3'-части генома, чем в участках, кодирующих структурные вирусные белки. Мутации в результате рекомбинации могут привести к обмену генетическим материалом и образованию новых антигенных вариантов, которые зачастую приводят к изменениям тропизма клеток. Одна или несколько аминокислотных замен на поверхности вирусных частиц могут привести к изменению распознавания и использования рецепторов. В результате один и тот же вирус может приобретать способность проникать в клетки с использованием альтернативных рецепторов [4, 5].

Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием вирусных факторов и факторов клеток-хозяев. Изменения в генах, кодирующих капсидные белки, путем мутации могут привести к антигенным изменениям и появлению новых генетических линий [5, 6].

Для выявления генетических связей между различными изолятами и штаммами обычно применяют нуклеотидное секвенирование. Следовательно, в условиях вспышки можно проследить происхождение вируса. Антигенные характеристики вируса, связанные с появлением новых штаммов, важны для характеристики вспышек и поиска оптимальных вакцинных препаратов [4, 6].

Репрезентативные штаммы/изоляты для каждого топотипа ящура перечислены ниже. Они могут образовывать основные опорные точки филогенетического дерева. В базе данных GenBank представлены нуклеотидные последовательности для различных генетических линий и сублиний.

Для вируса ящура серотипа SAT-2 характерна высокая генетическая изменчивость, а именно он включает в себя следующие 14 топотипов (I - XIV), внутри которых, за исключением топотипа VII, нет разделения на генетические группы. Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа SAT-2.

На территории Африканского континента регистрируются вспышки ящура серотипа SAT-2. Преимущественно эпизоотическая ситуация была связана с генотипами SAT-2/VII/Alx-12 и SAT-2/VII/Lib-12, которые распространены в странах Северной Африки, в частности, в Египте, где вспышки отмечают в период с 2012 по 2022 гг. и Либии (2012 г.). На территории Западной Африки, в частности в Камеруне (2014 г.), Нигерии (2019-2021 гг.), также преимущественно распространены изоляты вируса ящура генотипов SAT-2/VII/Alx-12 и SAT-2/VII/Lib-12. Соответственно, в указанных странах проводились мероприятия по ликвидации и борьбе с ящуром указанных генотипов. Но при этом постепенно с 2012 г. в странах Африканского континента и преимущественно на Востоке материка (Бурунди, Кения, Танзания и другие страны) стали появляться изоляты вируса ящура нового топотипа IV. Так, в Кении уже в 2012 и 2013 гг. выделили представителей генотипа SAT-2/IV, далее в Танзании в 2013 г. была сильная вспышка, вызванная вирусом данного варианта. В 2017 г. сложная эпизоотическая ситуация по ящуру генотипа SAT-2/IV отмечали в Кении, в 2020 г. - в Уганде, в 2022 г. - в Бурунди. Прогнозы экспертов неутешительны в отношении распространения данного варианта вируса ящура. Следует отметить, что в последние годы увеличились торгово-экономические связи со странами Африканского континента, в частности, Восточной Африки. Имеются риски заноса изолятов данного серотипа на территорию Российской Федерации и других стран.

Анализируя вспышки, которые регистрировались на территории Африки, обнаружено, что были выявлены изоляты разных топотипов серотипа SAT-2, в частности, I («SAT-2/ZIM/14/2002»), II («SAT-2/ZIM/5/81»), III («SAT-2/ВОТ/Р3/98»), IV («SAT-2/ETH/1/90»), V («SAT-2/GHA/2/90»), VI («SAT-2/GAM/8/79»), VII («SAT-2/SAU/6/2000»), VIII («SAT-2/RWO/1/00»), IX («SAT-2/KEN/2/84»), X («SAT-2/UGA/19/98»), XI («SAT-2/ANG/4/74»), XII («SAT-2/UGA/51/75»), XIII («SAT-2/ETH/2/2007»), XIV («SAT-2/ETH/2/9»l).

Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа SAT-2, которые применяются или использовались ранее в мире для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм («SAT-2/ZIM/14/2002») (генотип SAT-2/I),

- штамм («SAT-2/ZIM/5/81») (генотип SAT-2/II),

- штамм («SAT-2/BOT/P3/98») (генотип SAT-2/III),

- штамм («SAT-2/ETH/l/90») (генотип SAT-2/IV),

- штамм («SAT-2/GHA/2/90») (генотип SAT-2/V),

- штамм («SAT-2/GAM/8/79») (генотип SAT-2/VI),

- штамм («SAT-2/SAU/6/2000») (генотип SAT-2/VII),

- штамм («SAT-2/RWO/l/00») (генотип SAT-2/VIII),

- штамм («SAT-2/KEN/2/84») (генотип SAT-2/IX),

- штамм («SAT-2/UGA/19/98») (генотип SAT-2/X),

- штамм («SAT-2/ANG/4/74») (генотип SAT-2/XI),

- штамм («SAT-2/UGA/51/75») (генотип SAT-2/XII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/2007») (генотип SAT-2/XIII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/9»l) (генотип SAT-2/XIV).

Изолят «SAT-2/KEN/19/2017» вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории населенного пункта Rongai в регионе Nakuru Республики Кения в 2017 году и поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для проведения научных исследований в 2022 г.

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный изолят принадлежит к топотипу IV серотипа SAT-2 вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура типа SAT-2, в том числе штамма «SAT-2/ETH/l/90» (генотип SAT-2/IV).

Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде, пригодный для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических тест-систем и высоко иммуногенных вакцинных препаратов путем получения штамма «8АТ-2/Кения/19/2017» вируса ящура для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа SAT-2.

Штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №452 - деп / 23-2 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура для изготовления средств диагностики и профилактики ящура генотипа SAT-2/VI.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1. - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического типа SAT-2 Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP₁.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP₁ штамма «8АТ-2/Кения/19/2017» вируса ящура серотипа SAT-2;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP₁ штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура серотипа SAT-2.

Штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура серотипа SAT-2 относится к отряду Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, виду Foot-and-Mouth Disease virus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 24-25 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной молекулы РНК с позитивным смыслом, заключенной в белковую оболочку. Она состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура относится к серотипу SAT-2. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой и не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура ID-гена, кодирующего белок VP₁, штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура принадлежит к генотипу SAT-1/IV (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура изучено в РМН в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм («SAT-2/ZIM/14/2002») (генотип SAT-2/I),

- штамм («SAT-2/ZIM/5/81») (генотип SAT-2/II),

- штамм («SAT-2/BOT/P3/98») (генотип SAT-2/III),

- штамм («SAT-2/ETH/l/90») (генотип SAT-2/IV),

- штамм («SAT-2/GHA/2/90») (генотип SAT-2/V),

- штамм («SAT-2/GAM/8/79») (генотип SAT-2/VI),

- штамм («SAT-2/SAU/6/2000») (генотип SAT-2/VII),

- штамм («SAT-2/RWO/l/00») (генотип SAT-2/VIII),

- штамм («SAT-2/KEN/2/84») (генотип SAT-2/IX),

- штамм («SAT-2/UGA/19/98») (генотип SAT-2/X),

- штамм («SAT-2/ANG/4/74») (генотип SAT-2/XI),

- штамм («SAT-2/UGA/51/75») (генотип SAT-2/XII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/2007») (генотип SAT-2/XIII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/9»l) (генотип SAT-2/XIV).

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7, 8, 9].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

При ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются близкородственными;

При < 0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура отличается от производственного штамма.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-2/Кения/19/2017» составили r₁ от 0,02 до 0,25, а именно для генотипа SAT-2/1 - 0,23, для генотипа SAT-2/II - 0,21, для SAT-2/III - 0,22, для SAT-2/IV - 0,25, для SAT-2/V - 0,19, для SAT-2/VI - 0,15, для SAT-2/VII - 0,10, для SAT-2/VIII -0,14, для SAT-2/IX - 0,09, для SAT-2/X - 0,06, для SAT-2/XI - 0,18, для генотип SAT-2/XII - 0,02, для SAT-2/XIII - 0,13, для SAT-2/XIV - 0,12.

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-2.

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура является РНК(+) содержащим вирусом с молекулярной массой 8,08×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, выделяют РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации РНК для сборки вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Плавучая плотность 1,44 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура устойчив к детергентам и органическим растворителям, таким как эфир, хлороформ, фреон, ацетон. Наиболее стабилен при рН 7,4-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,3°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Исследование биологических свойств штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура при репродукции в монослойных перевиваемых клеточных линиях.

При выделении изолята «SAT-2/KEN/19/2017» вируса ящура с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [7].

Биологические и вирусологические методы включали в себя метод выделения в культуре клеток и адаптацию вируса ящура к перевиваемым клеточным линиям.

Выделение вируса ящура проводили в монослойных перевиваемых клеточных линиях ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 с последующей адаптацией в течение 5 последовательных пассажей. Культуры клеток выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью рабочей поверхности 25 см², освобождали от ростовой среды и заражали 10%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в растворе Хэнкса с 0,5% гидролизата лактальбумина по стандартной рецептуре.

Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов вирусную суспензию предварительно обрабатывали 10%-ным раствором трихлорметана. После 30-минутного контакта вируса с клеточной культурой при температуре 37±0,5°С во флаконы вносили по 5,0 см³ поддерживающей среды и инкубировали при температуре 37±0,5°С до появления цитопатического действия (ЦПД) в культуре клеток, которое представлено в виде округления клеток, повышения их оптической плотности, дегенерации и отделении клеток от поверхности субстрата. При ЦПД не менее 95% клеток, флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение не менее 24 часов проявлялось 95-100% ЦПД в монослое клеточных культур. Адаптация эпизоотического изолята «SAT-2/KEN/19/2017» к различным клеточным линиям наступала на уровне пятого пассажа. Титр инфекционной активности определяли с помощью разработанной ранее методики [10].

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 1, данные которой свидетельствуют о высокой адаптационной способности изолята «SAT-2/KEN/19/2017» вируса ящура к использованным клеточным культурам. В монослойной культуре клеток ПСГК-30 за 20 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:32 и титром инфекционной активности 7,85±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток IB-RS-2 за 16 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:32 и титром инфекционной активности 7,94±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток ВНК-21 за 16 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:32 и титром инфекционной активности 7,90±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В итоге получен штамм «SAT-2/Кения/19/2017» с охарактеризованными биологическими культуральными свойствами, который далее использовали для исследования его свойств.

Пример 2. Оценка биологических свойств штамма «SAT-2/Кения/ 19/2017» вируса ящура на крупном рогатом скоте.

Заражение КРС исходным штаммом вируса ящура проводили интрадермолингвально (I пассаж). Адаптацию и наработку штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура на КРС проводили в течение 2 последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт на этапе 2 пассажа на КРС получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения на 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе (ФБР). Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили интрадермолингвально в 4 точки по 0,1 см³ двум головам КРС. Учет результатов титрования на животных проводили спустя 24 ч по наличию афт на месте введения разведений вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017». Титр инфекционной активности штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура на стадии первого пассажа на КРС составил 4,75 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго пассажа - 5,50 lg ИД₅₀/0,1 см³. Таким образом, была получена 10%-ная афтозная суспензия вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» (2 пассаж на КРС) с титром инфекционной активности 5,50 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 3. Оценка биологических свойств штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура на свиньях.

Заражение свиней исходным штаммом «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура проводили внутрикожно на стадии первого пассажа в область венчика передних конечностей. Адаптацию и наработку штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура на свиньях вели в течение 2 последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт 2 пассажа на свиньях получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения с использованием в качестве растворителя 1/15 М ФБР. Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили внутрикожно в венчики копытец по 0,1 см³ в 4 точки на каждый палец конечности одного разведения, из расчета 1 разведение на 2 копытца 1 конечности каждому из 2 подопытных подсвинков.

Учет результатов титрования проводили через 24 ч по наличию афт на месте введения разведений. Титр инфекционной активности на свиньях для штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура на свиньях на стадии первого пассажа составил 5,00 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго - 5,75 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 4. Исследование биологических свойств штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура репродуцировали в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH. В качестве поддерживающей среды использовали среду Игла, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого (ФГМС), гидролизата белков крови сухого (ГБКС) при рН среды 7,4-7,6. Клеточную линию заражали вирусом из расчета 0,001-0,100 ТЦД₅₀/клетка.

Культивирование штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура осуществляли при температуре 37,0±0,2°С до достижения цитопатического действия вируса, соответствующего 90-100%. Полученную вируссодержащую суспензию контролировали на стерильность, а также определяли концентрацию 146S компонента (иммуногенный компонент) и общего вирусного белка (ОВБ). Концентрация ОВБ в суспензии составляла 1,45±0,10 мкг/см³. Значения титра инфекционной активности вируса, а также процентное содержание 146S компонента штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура отражены в таблице 2, из данных которой видно, что при средней концентрации клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, равной 4,04±0,12 млн клеток/см³, дозе заражения 0,005 ТЦД₅₀/кл. и продолжительности репродукции вируса 15,25±0,54 ч средний титр инфекционной активности возбудителя ящура был равен 8,53±0,13 lg ТЦД₅₀/см³. Концентрацию 146S компонента вируса ящура определяли с помощью ранее разработанной методики [11]. Содержание данного компонента составило 65,38±0,70% (1,29±0,11 мкг/см³).

Пример 5. Оценка типовой специфичности и активности штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура

Оценку типовой специфичности и активности штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура проводили в реакции связывания комплемента (РСК).

К полученному антигену штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура, взятому в объеме 0,4 см³ в цельном виде и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 добавляли по 0,1 см³ гомологичной и гетерологичных гипериммунных сывороток, полученных на вирус ящура в рабочем (удвоенном) титре и 0,1 см³ комплемента в рабочем разведении. Смесь выдерживали в водяной бане в течение 20 мин при температуре 37±0,2°С.Затем вносили по 0,2 см³ гемолитической системы и выдерживали 30 мин при температуре 37±0,2°С. Положительный результат реакции соответствовал 100%-ной задержке гемолиза эритроцитов барана («4 креста»). Параллельно проводили контрольные реакции без сыворотки, без комплемента и компонентов реакции.

В качестве реагентов в РСК использовали сыворотки ящурные типоспецифические гипериммунные морских свинок, полученные на штаммы вируса ящура «SAT-2/Кения/19/2017», «SAT-2/ETH/l/90», «Азия-1/Таджикистан/2011», «А/Турция/06», «SAT-1 №96», «SAT-3/Bech/65» комплемент сухой для РСК, гемолизин (сыворотка гемолитическая), эритроциты барана 2% (взвесь на физиологическом растворе, рН=7,05-7,15). В качестве контроля использовали антигены вируса ящура штаммов «SAT-2/Кения/19/2017», «SAT-2/ETH/l/90», «Азия-1/Таджикистан/2011»,

«А/Турция/06», «SAT-1 №96», «SAT-3/Bech/65».

Результаты исследования отражены в таблице 3, из которой следует, что штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура обладает выраженной типовой специфичностью, относится к вирусу ящура серотипа SAT-2 и активен в РСК в разведении 1:16.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления средств диагностики и профилактики ящура генотипа SAT-2/IV».

1. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. Paris, 2018. - Ch. 3.1.8

2. Пономарев А.П., Узюмов В.Л. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

3. Alexandersen, S. The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease / S. Alexsandersen, Z. Zhang, A.L. Donaldson // J. Compr. Pathol. - 2003. - V. 129. - P. 268-282.

4. Жильцова M.B. Биологические свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типов А, О и Азия-1: Автореф…дис. кан. наук. - Владимир: 2008. - 23 с.

5. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. / Под ред. А.Н. Бурдова. - М., Агропромиздат, 1990, 320 с.

6. Анализ эпизоотической ситуации по ящуру в России с 2010 г. по март 2019 г. / В.П. Семакина, Т.П. Акимова, В.А. Мищенко, А.К. Караулов // Ветеринария. - 2019. - №11. - С. 16-20.

7. Методические рекомендации по выделению и идентификации штаммов вируса ящура /А.А. Гусев, В.М. Захаров, Ж.А. Шажко и др.; ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир. 2002. - 31 с.

8. Методические рекомендации по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации /С.Р. Кременчугская; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2012. - 36 с.

9. Эпизоотологические особенности ящура типа А, вызванного гетерологичными штаммами вируса / А. В. Мищенко, В. А. Мищенко, В. В. Дрыгин [и др.] // Ветеринария. - 2014. - №11. - С. 20-24.

10. Патент №2674076 С1 Российская Федерация, МПК А61К 39/135 C12Q 1/68. Способ определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: №2017145889: заявл. 25.12.2017: опубл. 04.12.2018 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

11. Патент №2712769 С1 Российская Федерация, МПК G01M 33/58, C12Q 1/68. Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов: №2019116272: заявл. 27.05.2019: опубл. 31.01.2020 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

Claims (1)

1. Штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-2/IV, семейства Picornaviridae, рода Aphthovirus, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №452 - деп / 23-2 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» и предназначенный для изготовления средств диагностики и профилактики ящура генотипа SAT-2/IV.

Images