RU2810133C1

RU2810133C1 - Штамм "А/Танзания/2013" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа A/AFRICA/G-I для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа A/AFRICA/G-I

Info

Publication number: RU2810133C1
Application number: RU2023104101A
Authority: RU
Inventors: Максим Игоревич Доронин; Дмитрий Валерьевич Михалишин; Алексей Валерьевич Борисов; Виктор Викторович Никифоров; Ольга Ивановна Ручнова; Надежда Николаевна Медведева; Светлана Николаевна Фомина
Filing date: 2023-02-21
Publication date: 2023-12-22

Abstract

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа A/AFRICA/G-I, семейства Picornaviridae, рода Aphtovirus, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №410 - деп / 22-44 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» штамм «А/Танзания/2013» генотипа A/AFRICA/G-I вируса ящура. Представленный штамм репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21). В перевиваемой суспензионной культуре клеток почки сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH в течение 13,10±0,66 часов инкубирования концентрация 146S компонента штамма «А/Танзания/2013» генотипа А вируса ящура имеет средние значения 2,14±0,14 мкг/см³ (74,84±0,71%), сохраняя исходные характеристики при пассировании в клеточной культуре ВНК-21 /SUSP/ARRIAH. Представленный штамм может быть использован для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа A/AFRICA/G-I и для контроля антигенной активности противоящурных вакцин. 1 ил., 4 табл., 5 пр.

Description

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано для разработки и изготовления средств диагностики, специфической профилактики ящура генотипа A/AFRICA/G-I и контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин.

Высоко контагиозным и сверхопасным вирусным заболеванием животных в соответствии с Руководством МЭБ (OIE) является ящур {Food-and-Mouth Disease), который приносит огромный экономический ущерб в связи с затратами на ликвидацию болезни и введением строгих ограничений, налагаемых на внутреннюю и международную торговлю продукцией животноводства [1].

Вирус ящура в соответствии с международной классификацией относится к виду Foot-and-mouth disease virus (FMDV) рода Aphthovirus семейства Picomavir₁dae [2]. Геном вируса ящура представлен одноцепочечной молекулой РНК (ssRNA(+)) положительной полярности с длиной около 8400-8500 и.о., кодирует 4 структурных белка: VP₁, VP₂, VP₃, VP₄ и множество неструктурных протеинов. 5'-нетранслируемая область (5' UTR) (приблизительно 1300 н.о.) включает в себя несколько различных структурных элементов: поли(С)-участок (Cn), 3 или 4 псевдоокнота (PK) и внутренний сайт для рибосомы (IRES) [2].

Пептид VP_g представлен в 3 различных вариантах, кодируется генами 3В₁, 3В₂, 3В₃ и участвует в синтезе вирусной РНК. Уникальность ВЯ заключается в том, что его ген 3В кодирует три различные формы белка VP_g (VP_g1 (3B₁), VP_g2 (3В₂), VP_g3 (3В₃)) длиной по 23-24 а.о. каждый. VP_g1-3 повышают эффективность репликации вирусной РНК. В геноме имеется одна большая открытая рамка считывания (ORF) длиной около 7000 и.о., которая состоит из 1А-, 1В-, 1С-, 1D-, 2А-, 2В-, 2С-, 3А-, 3В-, 3С-, 3D-генов. За ORF следует 3'-нетранслируемая область (3' UTR) (приблизительно 90 н.о.) и поли(А)-фрагмент. Весь геном возбудителя ящура характеризуется высокой степенью вариабельности нуклеотидов, за исключением консервативных генов вируса ящура: 5'-UTR, 2В, 2С, 3D. Для отщепления всех белков вируса ящура от первоначального полипротеина требуется 3 протеазы: ведущая протеиназа (L-белок), 2А, 3С [2, 3].

Выделяют семь основных серотипов вируса ящура: О, А, С, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и Азия-1. Эти серотипы демонстрируют некоторую региональность, при этом серотип А является наиболее разнообразным в антигенном отношении. В пределах семи серотипов были описаны более 60 генетических линий и сублиний. Антитела против одного серотипа не обеспечивают иммунную защиту против другого серотипа и даже некоторых других генетических линий.

Каждый серотип генетически разделен на различные топотипы, генетические линии и сублинии (для некоторых штаммов ограничиваются только топотипом, поскольку для них более глубокого разделения не существует на сегодняшний день). Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности ID-гена (белок VP₁), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [1, 2, 3]. Мутационная изменчивость вируса ящура в пределах одного генотипа приводит к возникновению новых изолятов, которые отличаются по степени вирулентности и иммуногенности от ранее выделенных штаммов вируса ящура.

Наиболее вариабельным белком вируса ящура является VP₁, поскольку на него приходится около 90% мутаций всех структурных генов (1А, 1В, 1С, 1D). Самыми вариабельными областями являются участки белка VP₁ - 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. VP₁ содержит, по крайней мере, два важных иммуногенных сайта, петлю G-H (в положениях аминокислот 141-160) и С-конец (остатки 200-213). Петля G-H включает мотив аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD), который необходим для прикрепления вируса к клетке-хозяину [3, 4, 5].

Нуклеотидные последовательности кодирующей области VP₁ используются для генетической характеристики штаммов вируса ящура из-за их значимости для прикрепления и пенетрации вируса в клетку, защитного иммунитета и специфичности серотипа. Филогенетический анализ на основе нуклеотидной последовательности ID-гена (вирусный белок VP₁) широко используется для отражения эпидемиологических отношений между генетическими линиями и для отслеживания происхождения и перемещения штаммов вируса ящура [5].

Для вируса ящура как яркого представителя РНК-содержащих микроорганизмов вариациям в геноме благоприятствуют высокие частоты мутаций во время процесса репликации вируса, а возникающие топотипы, генетические линии и сублинии обусловлены мутациями и явлением рекомбинации. Рекомбинация представляет собой обмен генетическим материалом между двумя несегментированными РНК-геномами и может происходить между вирусами одного и того же серотипа [5]. Данное явление в нуклеиновой кислоте вируса ящура происходит легче в 3'-части генома (кодирует функциональные неструктурные белки), чем в участках, кодирующих белки VP₁, VP₂, VP₃, VP₄ [4, 5].

Антигенные вариации возникают из-за мутаций в аминокислотных последовательностях вирусных белков, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностные протеины вируса ящура особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием поверхностных вирусных белков и факторов клеток-хозяев [5, 6].

Для изолятов вируса ящура серотипа А характерно наибольшее генетическое разнообразие. Серотип А включает в себя 3 охарактеризованных прототипа ASIA, AFRICA, EURO-SA и одну пока еще малоизученную группу изолятов. Генетическое и антигенное разнообразие вируса ящура серотипа А приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа А и, в частности, нового генотипа A/AFRICA/G-I, представители которого стали распространяться на территории Восточной Африки и за ее пределами.

На территории Восточной Африки, в частности, в Кении, Танзании, Эфиопии вспышки ящура генотипа A/AFRICA/G-I имеют яркий спорадический характер. Следует отметить, что в последние годы усилились торгово-экономические связи со странами Африканского континента, в частности, Восточной Африки. Имеются риски заноса изолятов данного генотипа вируса ящура на территорию Российской Федерации.

Анализируя вспышки, которые регистрировались на территории Африки, обнаружено, что в Кении, Танзании в период с 2003 по 2013 гг. были выявлены изоляты вируса ящура, которые принадлежат к генотипу A/AFRICA/G-I. Со вспышками удалось справиться, применяя серьезные меры по борьбе, однако, в последние годы в Эфиопии, Танзании, Кении вновь стали регистрировать вспышки ящура, вызванные вирусом того же генотипа. Данное явление представляется опасным и требует исследования штаммов данного генотипа для создания средств диагностики и специфической профилактики ящура генотипа A/AFRICA/G-I.

Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа А, которые применяются для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм «А₂₂/Ирак/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64),

- штамм «А/Турция/06» (генотип A/ASIA/Iran-05),

- штамм «А/Краснодарский/2013» (генотип A/ASIA/Iran-05^SIS-10),

- штамм «А/Забайкальский/2013» (генотип A/ASIA/Sea-97),

- штамм «А/ВНИИЗЖ/2015» (генотип A/ASIA/G-VII),

- штамм «A/KEN/42/66» (генотип A/AFRICA/G-I).

Изолят «A/TAN/5/2013» вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории Объединенной Республики Танзания в 2013 году и поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из Всемирной справочной лаборатории института Пирбрайта (the World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease, the Pirbr₁ght institute, Великобритания) для проведения научных исследований. В результате данной работы путем адаптации к культурам клеток получен штамм «А/Танзания/2013».

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный изолят принадлежит к серотипу А, топотипу AFRICA, генетической линии G-I вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа А.

Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал производственных штаммов вируса ящура генотипа A/AFRICA/G-I, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде, пригодный для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических тест-систем и высоко иммуногенных вакцинных препаратов путем получения штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа A/AFRICA/G-I.

Штамм вируса ящура «А/Танзания/2013» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №410 - деп / 22-44 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура для изготовления средств диагностики и профилактики ящура, вызванного вирусом генотипа A/AFRICA/G-I.

Сущность изобретения представлена на дендрограмме, отражающей филогенетические взаимоотношения штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического серотипа А.

Фиг. 1 - Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP₁.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP₁ штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура генотипа A/AFRICA/G-I;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP₁ штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура генотипа A/AFRICA/G-I.

Штамм «А/Танзания/2013» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «А/Танзания/2013» вируса ящура серотипа А относится к отряду Picornavirales, семейству Picornavir₁dae, роду Aphthovirus, виду Foot-and-Mouth Disease Virus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 25 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной молекулы PFIK с позитивным смыслом, заключенной в белковую оболочку. Она состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «А/Танзания/2013» вируса ящура относится к серотипу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура ID-гена белка VP₁ штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «А/Танзания/2013» вируса ящура принадлежит к генотипу A/AFRICA/G-I (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура изучено в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм «А₂₂/Ирак/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64),

- штамм «А/Турция/06» (генотип A/ASIA/Iran-05),

- штамм «А/ВНИИЗЖ/2015» (генотип A/ASIA/G-VII),

- штамм «A/KEN/42/66» (генотип A/AFRICA/G-I) в РМН.

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа А, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7, 8, 9].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

При ≥0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются близкородственными;

При <0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура отличается от производственного штамма.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «А/Танзания/2013» составили r₁ от 0,03 до 0,20, что свидетельствует об отсутствии антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа А (табл. 1).

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «А/Танзания/2013» вируса ящура является РНК (+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 7,01×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,83×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую только из четырех белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Выделяют следующие основные неструктурные функциональные белки вируса ящура: 2А, 2В, 2С, 3А, 3В₁, 3В₂, 3В₃, 3С, 3D (РНК-зависимая РНК-полимераза).

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК (+) является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках.

Физические свойства.

Масса вириона составляет 8,43×10^-18 г. Плавучая плотность 1,43 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «А/Танзания/2013» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при рН 7,45-7,65. Сдвиги рН в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 37,8°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «А/Танзания/2013» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Исследование биологических свойств штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура при репродукции в монослойных перевиваемых клеточных культурах.

При выделении изолята «A/TAN/5/2013» вируса ящура с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и генетических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [7].

Вирусологические методы включали в себя метод выделения в клеточной линии и адаптацию вируса ящура к перевиваемым культурам клеток.

Выделение изолята «A/TAN/5/2013» вируса ящура проводили в монослойных перевиваемых клеточных линиях ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 с последующей адаптацией в течение 5 последовательных пассажей. Культуры клеток выращивали в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25,0 см², отмывали от ростовой среды и заражали 10%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в среде Игла с 0,5% гидролизата лактальбумина. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов вирусную суспензию предварительно обрабатывали 10%-ным раствором трихлорметана. После 30-минутного контакта вируса с клеточной культурой при температуре 37±0,1°С во флаконы вносили по 5,0 см³поддерживающей среды и инкубировали при температуре 37±0,1°С до появления цитопатического действия (ЦПД) в культуре клеток, которое представлено в виде округления клеток, повышения их оптической плотности, дегенерации и отделении клеток от поверхности субстрата. При ЦПД не менее 90% клеток, флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси трихлорметаном и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение не менее 24 часов проявлялось не менее 90% ЦПД в монослое клеточных культур. Адаптация африканского эпизоотического изолята «A/TAN/5/2013» к различным клеточным линиям наступала на уровне пятого пассажа. Титр инфекционной активности вируса ящура определяли с помощью разработанной ранее методики [10]. Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2, данные которой свидетельствуют о высокой адаптационной способности изолята «A/TAN/5/2013» вируса ящура к представленным клеточным культурам. В монослойной перевиваемой культуре клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30) за 19 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,52±0,12 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток IB-RS-2 за 16 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,69±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток ВНК-21 за 13 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,80±0,12 lg ТЦД₅₀/см³. Каждое исследование и культивирование проводили 9 раз. В итоге получен штамм «А/Танзания/2013» с охарактеризованными биологическими культуральными свойствами, который далее использовали для исследования его свойств.

Пример 2. Оценка биологических свойств штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура на крупном рогатом скоте.

Заражение КРС исходным штаммом «А/Танзания/2013» вируса ящура проводили интрадермолингвально (I пассаж). Адаптацию и наработку данного штамма вируса ящура в организме КРС проводили в течение 2 последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения с помощью 1/15 М фосфатно-солевого буферном растворе (ФСБР). Подготовленные разведения в диапазоне с 10^-2 по 10^-6 вводили интрадермолингвально в 4 точки по 0,1 см³ двум головам КРС. Учет результатов титрования штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура на животных проводили спустя 24 ч по наличию афт на месте введения разведений возбудителя данного заболевания. Титр инфекционной активности штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура на КРС на стадии первого пассажа составил 5,00 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго пассажа - 5,50 lg ИД₅₀/0,1 см³. Таким образом, была получена 10%-ная афтозная суспензия вируса ящура штамма «А/Танзания/2013» (2 пассаж на КРС) с титром инфекционной активности 5,50 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 3. Исследование биологических свойств штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура на свиньях.

Заражение свиней исходным штаммом «А/Танзания/2013» вируса ящура проводили внутрикожно на стадии первого пассажа в область венчика передних конечностей. Адаптацию и наработку штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура на свиньях вели в течение 2 последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура из афт 2 пассажа на свиньях получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения с использованием в качестве растворителя 1/15 М раствора ФСБР. Подготовленные разведения в диапазоне от 10^-2 до 10^-6 вводили внутрикожно в венчики копытец по 0,1 см³ в 4 точки на каждый палец конечности одного разведения, из расчета 1 разведение на 2 копытца 1 конечности каждому из 2 подопытных подсвинков.

Учет результатов титрования полученного штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура проводили через 24 ч по наличию афт на месте введения разведений. Титр инфекционной активности штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура на свиньях на стадии первого пассажа составил 5,25 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго - 5,75 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 4. Исследование биологических свойств штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21 /SUSP/ARRIAH.

Штамм «А/Танзания/2013» вируса ящура репродуцировали в суспензионной перевиваемой культуре клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 /SUSP/ARRIAH. В качестве поддерживающей среды использовали среду Игла DMEM, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого при рН среды 7,45-7,65. Клеточную линию заражали штаммом «А/Танзания/2013» вируса ящура из расчета 0,005 ТЦД₅₀/клетка.

Культивирование штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура осуществляли при температуре 37,0±0,2°С до достижения ЦПД вируса, соответствующего не менее 90% (по количеству пораженных вирусом клеток). Полученную вируссодержащую суспензию контролировали на стерильность и содержание 146S компонента и общего вирусного белка (ОВБ). По результатам анализа в агаре Сабуро, мясо-пептонном агаре, тиогликолевой среде и мясо-пептонном бульоне полученные суспензии не были контаминированы бактериями, грибами и микоплазмами. Проведен комплексный анализ в ПЦР в различных тест-системах на вирусные инфекции крупного рогатого скота и свиней. Выявлено, что полученные суспензии не были контаминированы посторонними вирусными агентами.

Провели анализ для определения концентрации иммуногенных компонентов штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура. Концентрация ОВБ в суспензии составляла 2,86±0,18 мкг/см³. Значения титра инфекционной активности штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура, а также процентное содержание 146S компонента штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура отражены в таблице 3, из данных которой видно, что при средней концентрации клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, равной 4, 23±0,18 млн клеток/см³, дозе заражения 0,005 Т1ГД₅₀/кл. и продолжительности репродукции вируса 13,10±0,6 ч средний титр инфекционной активности возбудителя ящура был равен 8,35±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. Концентрацию 146S компонента вируса ящура определяли с помощью ранее разработанной методики [11]. Содержание данного компонента составило 74,84±0,71% (2,14±0,14 мкг/см³).

Пример 5. Оценка типовой специфичности и активности штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура

Оценку типовой специфичности и активности штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура проводили в реакции связывания комплемента (РСК).

К полученному антигену штамма «А/Танзания/2013» вируса ящура, взятому в объеме 0,4 см³ в цельном виде и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 добавляли по 0,1 см³ гомологичной и гетерологичных гипериммунных сывороток, полученных на вирус ящура в рабочем (удвоенном) титре и 0,1 см³комплемента в рабочем разведении. Смесь выдерживали в водяной бане в течение 20 мин при температуре 37±0,2°С. Затем вносили по 0,2 см³гемолитической системы и выдерживали 30 мин при температуре 37±0,2°С. Положительный результат реакции соответствовал 100%-ной задержке гемолиза эритроцитов барана («4 креста»). Параллельно проводили контрольные реакции без сыворотки, без комплемента и компонентов реакции.

В качестве реагентов в РСК использовали сыворотки ящурные типоспецифические гипериммунные морских свинок, полученные на производственные штаммы вируса ящура «А/Турция/06», «A/KEN/42/66», «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SAT-2/SAU7/2000», «8АТ-3/Бечуаналенд/65» комплемент сухой для РСК, гемолизин (сыворотка гемолитическая), эритроциты барана 2% (взвесь на физиологическом растворе, рН=7,05-7,15). В качестве контроля использовали антигены вируса ящура штаммов «А/Турция/06», «A/KEN/42/66», «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SAT-2/SAU7/2000», «8АТ-3/Бечуаналенд/65».

Результаты исследования отражены в таблице 4, из которой следует, что штамм «А/Танзания/2013» вируса ящура обладает выраженной типовой специфичностью, относится к вирусу ящура серотипа А и активен в РСК в разведении 1:16.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм «А/Танзания/2013» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа A/AFRICA/G-I для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа A/AFRICA/G-I».

1. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestr₁al Animals. 7th ed. Par₁s, 2018. - Ch. 3.1.8

2. Пономарев А.П., Узюмов В.Л. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

3. Alexandersen, S. The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease / S. Alexsandersen, Z. Zhang, A.L. Donaldson // J. Compr. Pathol. - 2003. - V. 129. - P. 268-282.

4. Жильцова M.B. Биологические свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типов А, О и Азия-1: Автореф. дис. кан. наук. - Владимир: 2008. -23 с.

5. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. / Под ред. А.Н. Бурдова. - М., Агропромиздат, 1990, 320 с.

6. Анализ эпизоотической ситуации по ящуру в России с 2010 г. по март 2019 г. / В.П. Семакина, Т.П. Акимова, В.А. Мищенко, А.К. Караулов // Ветеринария. - 2019. - №11. - С. 16-20.

7. Методические рекомендации по выделению и идентификации штаммов вируса ящура / А.А. Гусев, В.М. Захаров, Ж.А. Шажко и др.; ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир. 2002. - 31 с.

8. Методические рекомендации по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации /С.Р. Кременчугская, М.В. Жильцова, Т.К. Майорова; ФГБУ «ВНИИЗЖ». -Владимир, 2012. - 36 с.

9. Эпизоотологические особенности ящура типа А, вызванного гетерологичными штаммами вируса / А.В. Мищенко, В.А. Мищенко, В.В. Дрыгин [и др.] // Ветеринария. - 2014. - №11. - С. 20-24.

10. Патент №2674076 С1 Российская Федерация, МПК А61К 39/135, C12Q 1/68. Способ определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: №2017145889: заявл. 25.12.2017: опубл. 04.12.2018 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

11. Патент №2712769 С1 Российская Федерация, МПК G01M 33/58, C12Q 1/68. Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов: №2019116272: заявл. 27.05.2019: опубл. 31.01.2020 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

Claims

Штамм «А/Танзания/2013» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа A/AFRICA/G-I, семейства Picomaviridae, рода Aphthovirus, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №410 - деп / 22-44 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» и предназначенный для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа A/AFRICA/G-I.