RU2817031C1

RU2817031C1 - Штамм "О N 2222/Тайвань/1/2012" вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура

Info

Publication number: RU2817031C1
Application number: RU2023122902A
Authority: RU
Inventors: Максим Игоревич Доронин; Дмитрий Валерьевич Михалишин; Алексей Валерьевич Борисов; Алексей Владимирович Константинов; Наталия Николаевна Луговская; Татьяна Валентиновна Жбанова; Олеся Олеговна Будина; Тамара Константиновна Майорова; Ольга Ивановна Ручнова
Filing date: 2023-09-04
Publication date: 2024-04-09

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа O/CATHAY, семейства Picornaviridae, рода Aphthovirus, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: штамм ВЯ О №2222/Тайвань/1/2012 (производственный и контрольный свиной). Представленный штамм репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21). В перевиваемой суспензионной культуре клеток почки сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH в течение 11,65±0,41 часов инкубирования концентрация 146S компонента штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура имеет средние значения 2,50±0,07 мкг/см3 (75,09±0,42%), сохраняя исходные характеристики при пассировании в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Представленный штамм «O №2222/Тайвань/1/2012» может быть использован для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа O/CATHAY и для контроля антигенной активности противоящурных вакцин. 2 ил., 5 табл., 8 пр.

Description

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано для разработки и изготовления средств диагностики, специфической профилактики ящура, вызванного изолятами, родственными штамму «O №2222/Тайвань/1/2012» и контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин.

Возбудитель ящура является особо опасным инфекционным агентом II группы патогенности, который вызывает карантинное, высококонтагиозное заболевание животных [1]. Вирус ящура имеет следующую таксономию: сфера Riboviria, царство Orthornavirae, тип Pisuviricota, класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus, серотип О, генотип O/CATHAY.

Геном вируса ящура представлен одноцепочечной молекулой РНК (ssRNA(+)) положительной полярности с длиной около 8400-8500 н.о., кодирует 12 белков, включая четыре структурных белка (VP₁, VP₂, VP₃, VP₄) и восемь неструктурных белков (L^pro, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C и 3D) [2]. Неструктурные белки FMDV вместе с некоторыми белками хозяина образуют сайты репликации вируса.

В настоящее время существуют семь следующих серотипов вируса ящура: O, А, Азия-1, C и SAT-1, SAT-2, SAT-3, среди которых самым распространенным является тип О [3, 4]. В пределах одного генотипа имеет место явление мутационной изменчивости, что приводит к возникновению новых изолятов/штаммов, которые отличаются по своим иммунобиологическим свойствам от ранее выделенных штаммов вируса ящура даже в рамках одной генетической линии.

Самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. поверхностного вирусного белка VP₁.Участок в регионе 130-160 а.о. характеризуется наибольшей изменчивостью, что обусловлено участием в распознавании рецепторов клетки-хозяина [5]. Филогенетический анализ на основе нуклеотидной последовательности 1D-гена, который несет в себе генетическую информацию о вирусном протеине VP₁, широко используется для исследования эволюционной динамики, эпидемиологических отношений между генетическими линиями и для отслеживания происхождения и перемещения возбудителя вируса ящура на территории земного шара [6-9].

Серотип О вируса ящура является наиболее изученным и самым распространенным во всем мире. Данный серотип разделен на 11 крупных топотипов: EAST AFRICA 1 - 4 (Восточная Африка) (EA-1-4), SOUTHEAST ASIA (Юго-Восточная Азия) (SEA), EUROPE-SOUTH AMERICA (Европа-Южная Америка) (EURO-SA), INDONESIA-1 и 2 (Индонезия-1 и 2) (ISA-1 и ISA-2), CATHAY (Китай), MIDDLE EAST-SOUTH ASIA (ME-SA) (Ближний Восток-Южная Азия) и WEST AFRICA (Западная Африка) (WA) [1, 6, 8]. Высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. Таким образом, возникает необходимость создания средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа О и, в частности, штамма «O №2222/Тайвань/1/2012», представители которого распространены на территории Юго-Восточной Азии, в частности, в Китае, Тайване, Республики Сингапур и за их пределами, где вспышки данного представителя вируса ящура имеют спорадический характер.

В последние годы усилились торгово-экономические связи со странами Юго-Восточной Азии, но это, в свою очередь, влечет за собой высокие риски заноса изолятов генотипа O/CATHAY на территорию Российской Федерации. Это обстоятельство является серьезным угрожающим фактором в отношении биологической безопасности России, а именно распространения данного представителя вируса ящура на территории нашей страны и требует проведения исследований и изучение штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура.

Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа О, которые применяются для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм «О №1715/Тайвань/1997» (генотип O/CATHAY/CAM 94) (прототип),

- штамм «О №2212/Приморский/2014» (генотип O/SEA/Mya-98),

- штамм «О №2147/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia),

- штамм «О №2008/Саудовская Аравия/2008» (генотип O/ME-SA/PanAsia2),

- штамм «О №2311/Забайкальский/2016» (генотип O/ME-SA/Ind-2001e).

Изолят «TW-1/2012» вируса ящура был предоставлен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из Animal Health Reaserch Institute («AHRI») Китайской Республики Тайвань в 2014 году. При проведении научных исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» изолят был охарактеризован и получил название - штамм «O №2222/Тайвань/1/2012».

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм принадлежит к генотипу O/CATHAY вируса ящура и значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа О, в частности, штамма «О №1715/Тайвань/1997» (генотип O/CATHAY/CAM 94) (прототип).

Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал производственных штаммов вируса ящура серотипа О, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде, пригодный для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических тест-систем и высоко иммуногенных вакцинных препаратов путем получения штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура.

Штамм вируса ящура «O №2222/Тайвань/1/2012» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: штамм ВЯ О №2222/Тайвань/1/2012 (производственный и контрольный свиной).

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура для изготовления средств диагностики и профилактики ящура.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1. - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VР₁.

Фиг. 2. - Данные гель-электрофореза очищенного препарата антигена вируса ящура штамма «O №2222/Тайвань/1/2012». Примечание: 1 - белковый маркер молекулярного веса, 2 - исследуемый образец препарата антигена вируса ящура указанного штамма.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена белка VР₁ штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот 1D-гена белка VР₁ штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура.

Штамм «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 25 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP₄, VP₂, VP₃, VP₁.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. В сыворотке крови переболевших животных формируются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP₁ штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура принадлежит к генотипу O/CATHAY (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура изучено в РМН, в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на производственные штаммы вируса ящура.

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа О, против 10² ТЦД₅₀гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [10-12].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными;

при < 0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма.

Максимальное родство отмечается при значении r₁ в РМН, стремящимся к 1,0.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» составили r₁от 0,04 до 0,28, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа О (табл. 1).

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура является РНК(+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 8,084×10⁶Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,85×10⁶Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,44×10^-18 г. Плавучая плотность 1,48 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при pH 7,50-7,70. Сдвиги pH в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,4°С).

Дополнительные признаки и свойства штамма вируса ящура

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Исследование биологических свойств штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура при репродукции в монослойных перевиваемых клеточных линиях

При выделении изолята вируса ящура, из которого получили штамм «O №2222/Тайвань/1/2012» с целью наработки его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [10].

Биологические и вирусологические методы включали в себя метод выделения в клеточной линии и адаптацию вируса ящура к ним.

Выделение вируса ящура проводили в монослойных перевиваемых клеточных линиях ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 с последующей адаптацией в течение 5 последовательных пассажей. Культуры клеток выращивали в соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25,0 см², отмывали от ростовой среды и заражали 20%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в растворе Хэнкса с 0,5% гидролизата лактальбумина по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов вирусную суспензию предварительно обрабатывали 10%-ным раствором трихлорметана. После 30-минутного контакта вируса с клеточной культурой при температуре 37,0±0,1°C во флаконы вносили по 5,0 см³ поддерживающей среды и инкубировали при температуре 37,0±0,1°C до появления цитопатического действия (ЦПД) в культуре клеток, которое представлено в виде округления клеток, повышения их оптической плотности, дегенерации и отделении клеток от поверхности субстрата. При ЦПД не менее 95% клеток, флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение не менее 24 часов проявлялось 95-100% ЦПД в монослое клеточных культур. Адаптация представленного эпизоотического изолята к различным клеточным линиям наступала на уровне пятого пассажа. Титр инфекционной активности определяли с помощью разработанной ранее методики [13].

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2, данные которой свидетельствуют о высокой адаптационной способности представленного изолята вируса ящура к использованным клеточным линиям.

В монослойной культуре клеток ПСГК-30 за 14 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:32 и титром инфекционной активности 7,75±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток IB-RS-2 за 16 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,40±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток ВНК-21 за 18 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,41±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. Каждое исследование и культивирование проводили 5 раз. В итоге получен штамм «O №2222/Тайвань/1/2012» с охарактеризованными культуральными свойствами, который далее использовали для исследования его свойств.

Пример 2. Исследование биологических свойств штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура на крупном рогатом скоте

Заражение КРС исходным штаммом вируса ящура проводили интрадермолингвально (I пассаж). Адаптацию и наработку штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура на КРС проводили в течение двух последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт на этапе второго пассажа на КРС получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения в 1/15 М фосфатном буферном растворе (ФБР). Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили интрадермолингвально в 4 точки по 0,1 см³ двум головам КРС. Учёт результатов титрования на животных проводили спустя 24 ч по наличию афт на месте введения разведений вируса ящура штамма «O №2222/Тайвань/1/2012». Титр инфекционной активности на КРС данного штамма вируса ящура на стадии первого пассажа на КРС составил 5,75 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго пассажа - 6,50 lg ИД₅₀/0,1 см³. Таким образом, была получена 10%-ная афтозная суспензия вируса ящура штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» (2 пассаж на КРС) с титром инфекционной активности 6,50 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 3. Исследование биологических свойств штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура на свиньях

Заражение свиней исходным штаммом «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура проводили внутрикожно на стадии первого пассажа в область венчика передних конечностей. Адаптацию и наработку штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура на свиньях вели в течение двух последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт второго пассажа на свиньях получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения с использованием в качестве растворителя 1/15 М ФБР. Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили внутрикожно в венчики копытец по 0,1 см³ в 4 точки на каждый палец конечности одного разведения, из расчета 1 разведение на 2 копытца 1 конечности каждому из 2 подопытных подсвинков.

Учёт результатов титрования проводили через 24 ч по наличию афт на месте введения разведений. Титр инфекционной активности на свиньях для штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура на свиньях на стадии первого пассажа составил 5,50 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго - 6,00 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 4. Исследование биологических свойств штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH

Штамм «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура репродуцировали в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH. В качестве поддерживающей среды использовали среду Игла, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого при рН среды 7,50-7,70. Клеточную линию заражали вирусом из расчета 0,005 ТЦД₅₀/клетка.

Культивирование штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура осуществляли при температуре 37,0±0,1°С до достижения ЦПД вируса, соответствующего не менее 95%. Полученную вируссодержащую суспензию контролировали на стерильность и содержание 146S компонента и общего вирусного белка (ОВБ) с помощью ранее разработанных методик [14, 15]. Полученные суспензии были стерильными. Концентрация ОВБ в суспензии составляла 3,33±0,09 мкг/см³. Значения титра инфекционной активности вируса, а также процентное содержание 146S компонента штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура отражены в таблице 3, из данных которой видно, что при средней концентрации клеток линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, равной 4,03±0,13 млн клеток/см³, дозе заражения 0,005 ТЦД₅₀/клетку и продолжительности репродукции вируса 11,65±0,41 ч средний титр инфекционной активности возбудителя ящура был равен 9,05±0,09 lg ТЦД₅₀/см³. Концентрацию 146S компонента вируса ящура определяли с помощью ранее разработанной методики [14]. Содержание данного компонента составило 75,09±0,42 % (2,50±0,07 мкг/см³).

Пример 5. Анализ типовой специфичности и активности штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура

Исследование типовой специфичности и активности штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура проводили в реакции связывания комплемента (РСК). К полученному антигену штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура, взятому в объеме 0,4 см³ в цельном виде и в разведениях 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 добавляли по 0,1 см³ гомологичной и гетерологичных гипериммунных сывороток, полученных на вирус ящура в рабочем (удвоенном) титре и 0,1 см³ комплемента в рабочем разведении. Смесь выдерживали в водяной бане в течение 20 мин при температуре 37,0±0,1°С. Затем вносили по 0,2 см³ гемолитической системы и выдерживали 30 мин при температуре 37,0±0,1°С. Положительный результат реакции соответствовал 100%-ной задержке гемолиза эритроцитов барана («4 креста»). Параллельно проводили контрольные реакции без сыворотки, без комплемента и компонентов реакции.

В качестве реагентов в РСК использовали сыворотки ящурные типоспецифические гипериммунные морских свинок, полученные на производственные штаммы вируса ящура «O №2222/Тайвань/1/2012» (предлагаемое изобретение), «О №1715/Тайвань/1997» «А №2029/Турция/06», «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SAT-2/SAU 7/2000», комплемент сухой для РСК, гемолизин (сыворотка гемолитическая), эритроциты барана 2% (взвесь на физиологическом растворе, рН = 7,05-7,15). В качестве контроля использовали антигены вируса ящура штаммов «O №2222/Тайвань/1/2012», «О №1715/Тайвань/1997» «А №2029/Турция/06», «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SAT-2/SAU 7/2000».

Результаты исследования отражены в таблице 4, из которой следует, что штамм «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура обладает выраженной типовой специфичностью, относится к вирусу ящура серотипа О и активен в РСК в разведении 1:64.

Пример 6. Получение, контроль качества и применение антигена штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура

Для получения антигена штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура как компонента биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли за счет полигексаметиленгуанидина.

Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 30 мин. при 6000 об/мин и 4±2°С на центрифуге типа Bekman J2-21 (Beckman Coulter, USA) или аналоге. Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 Д (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 8% и хлорид натрия (сухой) до конечной концентрации 0,85%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2°С в течение 22±1 ч. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин., осадок растворяли в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе, концентрируя в 7 раз (1/7 от первоначального объёма).

К полученному преципитату добавляли 50% трихлорметана, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура. Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле.

Для получения очищенного антигена штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50%. Инактивированную суспензию вируса ящураналивали по 10 мл в центрифужные пробирки, затем последовательно подслаивали растворы сахарозы, начиная с 10%-го и заканчивая 50%-м раствором. Пробирки помещали в металлические центрифужные стаканы и после тщательно выполненного уравновешивания центрифугировали при скорости 40000 об/мин и температуре 4±2°С в течение 4 часов. Фракционирование градиента сахарозы производили с помощью перистальтического насоса, отбирая фракции по 1 мл в отдельные пробирки. Опалесцирующий слой, содержащий очищенный антиген вируса ящура, располагается приблизительно в 30%-м слое сахарозы. Данную фракцию переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 40 000 об/мин. и температуре 4±2°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.

Результаты спектрометрического исследования полученных фракций штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура как компонента для диагностики и специфической профилактики ящура представлены в таблице 5. Анализ проводили для всех фракций, высокие значения оптической плотности наблюдали для 6-12 фракции с максимальными значениями для 9-11 пиков.

Проведен электрофорез полученных фракций в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях для отобранной фракции. Полученные результаты отражены на фиг. 2, из которой видно, что получен очищенный антиген вируса ящура.

С помощью реакции связывания комплемента определили концентрацию 146S компонента в полученном антигене, которая составила 17,53±0,05 мкг/см³(n = 3, p<0,005), что вполне достаточно для использования при изготовлении диагностических наборов для выявления антигена и антител против вируса ящура, а также изготовления специфических препаратов для профилактики данного заболевания.

Таким образом, проведены получение и контроль качества антигена штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура.

Полученный антиген использовали в качестве биопрепарата для проведения реакции связывания комплемента для детекции антигена вируса ящура штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» в исследуемых пробах при изготовлении вакцинных препаратов. Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 566 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. По результатам проведения реакции связывания комплемента (РСК) доказали, что из 566 образцов сывороток крови все определены в качестве положительных. Для исследования специфичности реакции тестировали 157 отрицательных проб. В результате исследования с помощью РСК, что из 157 заявленных проб все определены в качестве отрицательных. Пользуясь статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,35-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 97,68-100,00%, k-критерий - 1,000; общая точность (DAc) - 99,49-100,00%. Таким образом, полученный антиген штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура применим для использования в качестве биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура.

Пример 7. Применение антигена вируса ящура штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» для получения сывороток крови кролика, контроль качества и применение сывороток крови против антигена штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура

Для получения сыворотки крови кролика против антигена штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура использовали 24 клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.

Для гипериммунизации животных применяли антиген вируса ящура, полученный как описано в примере 6, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-201 VG (в соотношении адъювант/антиген = 50/50 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 21 и 42 дни в объеме 0,5 см³. Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливали и получали сыворотку крови, содержащую антитела против антигена штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре 4-8°С.

Полученные 24 сыворотки крови кроликов проверяли в реакции связывания комплемента и определили, что их активность составила 1:8500-1:9000. Данные показатели являются высокими и достаточными для изготовления диагностических наборов по выявлению антигена и антител против вируса ящура.

Изготовленные сыворотки объединили в общий пул, провели лиофильную сушку и, таким образом, получили биопрепарат, который использовали для проведения реакции связывания комплемента для детекции антигена вируса ящура штамма «O №2222/Тайвань/1/2012».

Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 455 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. По результатам проведения реакции связывания комплемента (РСК) доказали, что из 455 образцов сывороток крови все определены в качестве положительных. Для исследования специфичности реакции тестировали 250 отрицательных проб. В результате исследования с помощью РСК, что из 250 отрицательных проб все определены в качестве отрицательных. Пользуясь статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,19-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,54-100,00%, k-критерий - 1,000; общая точность (DAc) - 99,48-100,00%.

Таким образом, полученный антиген вируса ящура штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» применим для иммунизации животных как биопрепарат. Проведены получение и контроль качества сывороток крови кролика против антигена штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура, а также показано применение полученной сыворотки как биопрепарата для диагностики ящура.

Пример 8. Применение антигена вируса ящура штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» для изготовления биопрепарата для специфической профилактики ящура

Инактивированный вирус ящура штамма «O №2222/Тайвань/1/2012», полученный как описано в примере 6 и масляный адъювант Montanide ISA-206 VG смешивали в равных пропорциях (в соотношении 50÷50 по объему), получив препарат для иммунизации животных. Свиней в количестве 17 голов свиней разделили на 3 группы по 5 голов в каждой и в качестве контроля вируса оставили 2 головы без инокуляции. Иммунизирующая доза составляла 2,0 см³. Первую группу животных (№№ 1-5) иммунизировали препаратом без разведения, вторую группу свиней (№№ 6-10) - в разведении 1/5, третья группа животных (№№ 11-15) - 1/25. Препарат вводили внутримышечно в среднюю треть шеи.

На 21 сутки после введения препарата у свиней отбирали кровь и проводили исследование полученных сывороток крови в реакции микронейтрализации (РМН) [1]. Выявлено, что у свиней, иммунизированных вакциной в цельной дозе (5 голов), средние значения титра антител составили 8,03±0,15 log2 SN50, с разведением 1/5 (5 голов) - 4,52±0,17 log2 SN50, а с разведением 1/25 (5 голов) - 3,14±0,22 log2 SN50. Полученные данные РМН свидетельствуют о том, что после введения препарата в цельном виде обеспечивается формирование гуморального иммунитета с защитными титрами штаммоспецифических антител (5,5 и более log2 SN50), что соответствует требованиям международных стандартов [1]. Таким образом, инактивированный вирус ящура штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» применим для создания биопрепарата для специфической профилактики ящура, получив результаты, удовлетворяющие OIE.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура»:

1. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th еd. Paris, 2022. - Ch. 3.1.8.

2. Beard CW, Mason PW. 2000. Genetic determinants of altered virulence of Taiwanese foot-and-mouth disease virus. J Virol 74:987-991.

3. Пономарев А.П., Узюмов В.Л. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

4. Pacheco JM, Gladue DP, Holinka LG, Arzt J, Bishop E, Smoliga G, Pauszek SJ, Bracht AJ, O9Donnell V, Fernandez-Sainz I, Fletcher P, Piccone ME, Rodriguez LL, Borca MV. 2013. A partial deletion in non-structural protein 3A can attenuate foot-and-mouth disease virus in cattle. Virology 446: 260-267.

5. Gao H, Wang J, Zhao G, Zhu M, He Y, Xin A. 2020. Substitution 3A protein of foot-and-mouth disease virus of attenuated ZB strain rescued the viral replication and infection in bovine cells. Res Vet Sci 128:145-152.

6. Liu Y, Zhu Z, Zhang M, Zheng H. 2015. Multifunctional roles of leader protein of foot-and-mouth disease viruses in suppressing host antiviral responses. Vet Res 46:127.

7. Жильцова М.В. Биологические свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типов А, О и Азия-1: Автореф… дис. кан. наук. - Владимир: 2008. - 23 с.

8. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. / Под ред. А.Н. Бурдова. - М., Агропромиздат, 1990, 320 с.

9. Анализ эпизоотической ситуации по ящуру в России с 2010 г. по март 2019 г. / В. П. Семакина, Т. П. Акимова, В. А. Мищенко, А. К. Караулов // Ветеринария. - 2019. - № 11. - С. 16-20.

10. Методические рекомендации по выделению и идентификации штаммов вируса ящура /А. А. Гусев, В. М. Захаров, Ж. А. Шажко и др.; ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир. 2002. - 31 с.

11. Методические рекомендации по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации /С. Р. Кременчугская, М. В. Жильцова, Т. К. Майорова; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2012. - 36 с.

12. Эпизоотологические особенности ящура типа А, вызванного гетерологичными штаммами вируса / А. В. Мищенко, В. А. Мищенко, В. В. Дрыгин [и др.] // Ветеринария. - 2014. - № 11. - С. 20-24.

13. Патент № 2674076 C1 Российская Федерация, МПК А61К 39/135 С12Q 1/68. Способ определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: № 2017145889: заявл. 25.12.2017: опубл. 04.12.2018 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

14. Патент № 2712769 C1 Российская Федерация, МПК G01M 33/58, C12Q 1/68. Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов: № 2019116272: заявл. 27.05.2019: опубл. 31.01.2020 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

15. Европейская фармакопея. Версия 11.0. Стерильность. Раздел 2.6.1 - 2023 г. URL: https://www.webofpharma.com/ (дата обращения: 15.07.2023).

Таблица 1 Антигенное соответствие (r₁) штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура (предлагаемое изобретение) с производственными штаммами вируса ящура серотипа О в реакции микронейтрализации
Исследуемые штаммы вируса ящура	Значения показателя r ₁ в реакции микронейтрализации с производственными штаммами вируса ящура для штамма «O №2222/Тайвань/1/2012»
«О №1715/Тайвань/1997» (генотип O/CATHAY/CAM 94) (прототип)	0,28
«О №2212/Приморский/2014» (генотип O/SEA/Mya-98)	0,13
«О №2147/Приморский/2012» (генотип O/ME-SA/PanAsia)	0,11
«О №2008/Саудовская Аравия/2008» (генотип O/ME-SA/PanAsia2)	0,07
«О №2311/Забайкальский/2016» (генотип O/ME-SA/Ind-2001e)	0,04

Таблица 2 Биологические свойства штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура (предлагаемое изобретение) при культивировании в различных клеточных линиях (n=5, p<0,005)
Наименование клеточной линии	Время проявления биологической активности, ч	Количество адаптационных пассажей	Характеристика адаптированного материала
Наименование клеточной линии	Время проявления биологической активности, ч	Количество адаптационных пассажей	Активность в РСК	Титр инфекционной активности вируса, lg ТЦД ₅₀ /см ³
ПСГК-30	14	5	1:32	7,75±0,10
IB-RS-2	16	5	1:16	7,40±0,10
ВНК-21	18	5	1:16	7,41±0,10

Таблица 3 Оценка стабильности репродукции штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура (предлагаемое изобретение) в суспензионной перевиваемой культуре клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH (n=10, p<0,01)
№ п/п	Концентрация клеток, млн/см ³	Доза заражения, ТЦД ₅₀ /кл.	Длительность репродукции, ч	Титр инфекционной активности вируса, lg ТЦД ₅₀ /см ³	Концент-рация ОВБ, мкг/см ³	Концентрация 146S компонента, мкг/см ³	Содержание 146S компонента, %
1	4,2	0,005	12,0	9,15	3,42	2,57	75,0
2	4,0	0,005	12,0	9,02	3,30	2,48	75,2
3	4,0	0,005	11,5	9,00	3,27	2,46	75,3
4	3,9	0,005	12,0	8,95	3,21	2,44	75,9
5	3,9	0,005	11,0	8,96	3,25	2,42	74,5
6	4,2	0,005	11,5	9,19	3,50	2,63	75,0
7	4,0	0,005	11,0	9,00	3,28	2,46	75,0
8	3,9	0,005	12,0	9,04	3,32	2,47	74,5
9	4,2	0,005	12,0	9,16	3,44	2,58	75,0
10	4,0	0,005	11,5	9,02	3,31	2,50	75,5
M±m	4,03±0,13	0,005	11,65±0,41	9,05±0,09	3,33±0,09	2,50±0,07	75,09±0,42

Примечание: ОВБ - общий вирусный белок,

146S - иммуногенный компонент,

ТЦД - тканевая цитопатическая доза.

Таблица 5 Результаты спектрометрического исследования полученных фракций штамма «O №2222/Тайвань/1/2012» вируса ящура как компонента для диагностики и специфической профилактики ящура (предлагаемое изобретение) (n = 3, p<0,005
№ фракции п/п	Значение оптической плотности (ОП), у.е.
1	0,010±0,001
2	0,123±0,001
3	0,599±0,001
4	1,233±0,002
5	1,699±0,001
6	2,233±0,001
7	2,569±0,002
8	2,755±0,002
9	3,001±0,001
10	3,599±0,001
11	3,018±0,001
12	2,005±0,001
13	0,774±0,001
14	0,014±0,001

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FMDV O2222.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-08-16">

</ApplicationIdentification>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны

здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI "ARRIAH"</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Штамм «O №2222/Тайвань/1/2012»

вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для

диагностики и специфической профилактики ящура</InventionTitle>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacttccgcgggtgagtctgcggaccccgttactgccaccgtcgaga

attacggtggtgagacacaagtccagaggcgccagcacacggacattgcgtttatattggacagattcgt

gtttatattggacagattcgtgaaagtcacgccaaaagaccaaattaatgtgctagacctgatgcagatc

cctgcccacaccctagtaggagcgctcctgcgaacggccacctactatttctctgacttgganattgccg

tcaagcacgaaggcgatctcacctgggtcccgaacggcgcccctgagacggcgttggacaacactaccaa

cccaacggcttaccacaaggaacnactcacgcggttggccttgccttacacggccccacaccgcgtctta

gcaaccgtctacaatggaagctgcaagtacagtgacgcccgcgtaagtaacgtgaggggtgaccttcaag

tgttggctcagaaggcagaaagaactctgcctacctccttcaactttggtgccattaaggcaactcgggt

gactgaactactctaccgaatgaagagagccgagacatactgtcccagcccccttctcgccattcagccg

agtgacgccagacacaagcagaagtttttg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGESADPVTATVENYGGETQVQRRQHTDIAFILDRFVFILDRFVKV

TPKDQINVLDLMQIPAHTLVGALLRTATYYFSDLXIAVKHEGDLTWVPNGAPETALDNTTNPTAYHKEXL

TRLALPYTAPHRVLATVYNGSCKYSDARVSNVRGDLQVLAQKAERTLPTSFNFGAIKATRVTELLYRMKR

AETYCPSPLLAIQPSDARHKQKFL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims

Штамм вируса ящура Aphtae epizooticae «O №2222/Тайвань/1/2012» генотипа O/CATHAY, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: штамм ВЯ О №2222/Тайвань/1/2012, для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа O/CATHAY.