RU2817256C1

RU2817256C1 - Штамм А/Египет/EURO-SA/2022 вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа A/EURO-SA

Info

Publication number: RU2817256C1
Application number: RU2023122298A
Authority: RU
Inventors: Виктор Викторович Никифоров; Светлана Николаевна Фомина; Дмитрий Валерьевич Михалишин; Максим Игоревич Доронин; Алексей Валерьевич Борисов; Тамара Константиновна Майорова; Маргарита Эдуардовна Воеводина
Filing date: 2023-08-25
Publication date: 2024-04-12

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа A/EURO-SA семейства Picornaviridae рода Aphthovirus, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ ВНИИЗЖ под регистрационным номером №482 - деп/23-32 - ГКШМ ФГБУ ВНИИЗЖ штамм A/Египет/EURO-SA/2022 генотипа A/EURO-SA вируса ящура. Представленный штамм репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21). В перевиваемой суспензионной культуре клеток почки сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH в течение 10,25±0,59 часов инкубирования концентрация 146S частиц штамма А/Египет/EURO-SA/2022 вируса ящура имеет средние значения 2,39±0,09 мкг/см³ (71,15±0,96%), сохраняя исходные характеристики при пассировании в клеточной культуре ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Представленный штамм может быть использован для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа A/EURO-SA и для контроля антигенной активности противоящурных вакцин. 2 ил., 5 табл., 7 пр.

Description

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано для разработки и изготовления средств диагностики, специфической профилактики ящура генотипа A/EURO-SA и контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин.

В соответствии с международной классификацией возбудитель ящура относится к сфере Riboviria, царству Orthornavirae, типу Pisuviricota, классу Pisoniviricetes, отряду Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, виду Foot-and-mouth disease virus [1, 2]. Геном вируса ящура представлен одноцепочечной молекулой РНК положительной полярности с длиной около 8400-8500 н.о., которая кодирует 4 структурных белка: VP₁, VP₂, VP₃, VP₄ и множество неструктурных протеинов.

Выделяют семь основных серотипов вируса ящура: О, А, С, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и Азия-1. Эти серотипы демонстрируют некоторую региональность, при этом серотип А является разнообразным в антигенном отношении. В пределах семи серотипов были описаны более 60 генетических линий и сублиний. Антитела против одного серотипа не обеспечивают иммунную защиту против другого серотипа и даже некоторых других генетических линий.

По данным многочисленных исследований определено, что самым вариабельным белком вируса ящура является протеин VP₁, поскольку на него приходится около 90% мутаций всех структурных генов (1А, 1В, 1С, 1D). Самыми вариабельными областями являются участки белка VP₁ - 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. VP₁ содержит, по крайней мере, два важных иммуногенных сайта, петлю G-H (в положениях аминокислот 141-160) и С-конец (остатки 200-213). Петля G-H включает мотив аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD), который необходим для прикрепления вируса к клетке-хозяину [3, 4, 5].

Филогенетический анализ на основе нуклеотидной последовательности 1D-гена (вирусный белок VP₁) широко используется для отражения эпидемиологических отношений между генетическими линиями и для отслеживания происхождения и перемещения штаммов вируса ящура [5]. Антигенные вариации возникают из-за мутаций в аминокислотных последовательностях вирусных белков, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностные протеины вируса ящура особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием поверхностных вирусных белков и факторов клеток-хозяев [5, 6].

Для изолятов вируса ящура серотипа А характерно генетическое разнообразие. Серотип А включает в себя 3 охарактеризованных прототипа ASIA, AFRICA, EURO-SA и одну пока еще малоизученную группу изолятов. Генетическое и антигенное разнообразие вируса ящура серотипа А приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа А и, в частности, генотипа A/EURO-SA, представители которого распространяются на территории Южной Америки, а в 2022 году изоляты вируса ящура данного генотипа были выявлены на севере Африканского континента.

В последние годы усилились торгово-экономические связи со странами Африканского континента и Южной Америки. Имеются риски заноса изолятов данного генотипа вируса ящура на территорию Российской Федерации. Данное явление представляется опасным и требует исследования штаммов данного генотипа для создания средств диагностики и специфической профилактики ящура генотипа A/EURO-SA.

Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа А, которые применяются для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм «А₂₂/Ирак/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64),

- штамм «А/Турция/06» (генотип A/ASIA/Iran-05),

- штамм «А/Краснодарский/2013» (генотип A/ASIA/Iran-05^S1S-10),

- штамм «А/Забайкальский/2013» (генотип A/ASIA/Sea-97),

- штамм «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» (генотип A/ASIA/G-VII),

- штамм «А №2205/G-IV/2018» (генотип A/AFRICA/G-IV).

Изолят «A/EGY/2/2022» вируса ящура был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из патологического материала, полученного от крупного рогатого скота с территории населенного пункта Giza Арабской Республики Египет в 2022 г. В результате данной работы путем адаптации к культурам клеток получен штамм «A/Египет/EURO-SA/2022».

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный изолят принадлежит к серотипу А, топотипу EURO-SA вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа А.

Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал производственных штаммов вируса ящура генотипа A/EURO-SA, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде, пригодный для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических тест-систем и высоко иммуногенных вакцинных препаратов путем получения штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа A/EURO-SA.

Штамм вируса ящура «A/Египет/EURO-SA/2022» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №482 - деп / 23-32 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «A/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура для изготовления средств диагностики и профилактики ящура, вызванного вирусом генотипа A/EURO-SA.

Сущность изобретения представлена на дендрограмме, отражающей филогенетические взаимоотношения штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического серотипа А.

Фиг. 1 - Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP₁ штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура.

Фиг. 2. - Данные гель-электрофореза очищенного препарата антигена вируса ящура штамма «А/Египет/EURO-SA/2022».

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура генотипа A/EURO-SA;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот белка VP₁ штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура генотипа A/EURO-SA.

Штамм «А/Египет/EURO-S А/2022» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура серотипа А относится к отряду Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, виду Foot-and-Mouth Disease Virus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 22 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной молекулы РНК с позитивным смыслом, заключенной в белковую оболочку, которая состоит из 32 капсомеров.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура относится к серотипу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена, который кодирует аминокислотную последовательность белка VP₁ штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «A/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура принадлежит к генотипу A/EURO-SA (фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура изучено в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на производственные штаммы вируса ящура в РМН.

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа А, против 100 ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7, 8, 9].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются близкородственными;

при <0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура отличается от производственного штамма.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» составили r₁ от 0,02 до 0,22, что свидетельствует об отсутствии антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа А (табл.1).

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «A/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура является РНК (+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 6,99×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,80×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую только из четырех белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Выделяют следующие основные неструктурные функциональные белки вируса ящура: 2А, 2В, 2С, 3А, 3В₁, 3В₂, 3В₃, 3С, 3D.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная положительно заряженная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,41×10^-18 г. Плавучая плотность 1,42 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «A/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при рН 7,43-7,70. Сдвиги рН в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 37,6°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «A/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «A/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Исследование биологических свойств штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура при репродукции в монослойных перевиваемых клеточных культурах.

При выделении изолята «A/EGY/2/2022» вируса ящура с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и генетических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [7].

Вирусологические методы включали в себя метод выделения в клеточной линии и адаптацию вируса ящура к перевиваемым культурам клеток.

Выделение изолята «A/EGY/2/2022» вируса ящура проводили в монослойных перевиваемых клеточных линиях ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 с последующей адаптацией в течение 5 последовательных пассажей. Культуры клеток выращивали в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 75,0 см², отмывали от ростовой среды и заражали 10%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в среде Игла MEM с 0,5% гидролизата лактальбумина. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов вирусную суспензию предварительно обрабатывали 10%-ным раствором хлороформа. После 30-минутного контакта вируса с клеточной культурой при температуре 37±0,1°С во флаконы вносили по 25,0 см³поддерживающей среды и инкубировали при температуре 37±0,1°С до появления цитопатического действия (ЦПД) в культуре клеток, которое представлено в виде округления клеток, дегенерации и отделении клеток от поверхности субстрата. При ЦПД не менее 90% клеток, флаконы подвергали процессу «замораживание-оттаивание», очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3500 об/мин в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей.

Вирус считался адаптированным к клеточным линиям, если в течение 12-24 часов проявлялось не менее 90% ЦПД в монослое клеточных культур. Адаптация африканского эпизоотического изолята «A/EGY/2/2022» к различным клеточным линиям наступала на уровне пятого пассажа. Титр инфекционной активности вируса ящура определяли с помощью разработанной ранее методики [10]. Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2, данные которой свидетельствуют о высокой адаптационной способности изолята «A/EGY/2/2022» вируса ящура к представленным клеточным культурам. В монослойной перевиваемой культуре клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30) за 20,5 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:24 и титром инфекционной активности 7,71±0,08 lg ТЦД₅₀/см³.

В монослойной культуре клеток IB-RS-2 за 19 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:32 и титром инфекционной активности 7,79±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

В монослойной культуре клеток ВНК-21 за 15 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:32 и титром инфекционной активности 7,96±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. Каждое исследование и культивирование проводили 7 раз. В итоге получен штамм «А/Египет/EURO-SA/2022» с охарактеризованными биологическими культуральными свойствами, который далее использовали для исследования его свойств.

Пример 2. Оценка биологических свойств штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура на крупном рогатом скоте.

Заражение КРС исходным штаммом «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура проводили интрадермолингвально (I пассаж). Адаптацию и наработку данного штамма вируса ящура в организме КРС проводили в течение двух последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт получали 33%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения с помощью 1/15 М фосфатно-солевого буферном растворе (ФСБР). Подготовленные разведения в диапазоне с 10^-2 по 10^-6 вводили интрадермолингвально в 4 точки по 0,1 см³ двум головам КРС. Учет результатов титрования штамма «A/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура на животных проводили спустя 24 ч по наличию афт на месте введения разведений возбудителя данного заболевания. Титр инфекционной активности штамма «А/Египет/EURU-SA/2022» вируса ящура на КРС на стадии первого пассажа составил 4,50 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго пассажа - 5,25 lg ИД₅₀/0,1 см³. Таким образом, была получена 10%-ная афтозная суспензия вируса ящура штамма «A/Египет/EURO-SA/2022» (2 пассаж на КРС) с титром инфекционной активности 5,25 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 3. Исследование биологических свойств штамма «A/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура на свиньях.

Заражение свиней исходным штаммом «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура проводили внутрикожно на стадии первого пассажа в область венчика передних конечностей. Адаптацию и наработку штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура на свиньях вели в течение двух последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура из афт 2 пассажа на свиньях получали 33%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения с использованием в качестве растворителя 1/15 М раствора ФСБР. Подготовленные разведения в диапазоне от 10^-2 до 10^-6 вводили внутрикожно в венчики копытец по 0,1 см³ в 4 точки на каждый палец конечности одного разведения, из расчета 1 разведение на 2 копытца 1 конечности каждому из 2 подопытных подсвинков.

Учет результатов титрования полученного штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура проводили через 24 ч по наличию афт на месте введения разведений. Титр инфекционной активности штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура на свиньях на стадии первого пассажа составил 5,50 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго - 6,00 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 4. Исследование биологических свойств штамма «A/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Штамм «A/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура репродуцировали в суспензионной перевиваемой культуре клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH. В качестве поддерживающей среды использовали среду Игла MEM, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого при рН среды 7,43-7,70. Клеточную линию заражали суспензией штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура из расчета 0,005 ТЦД₅₀/клетка.

Культивирование штамма «A/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура осуществляли при температуре 37,0±0,1°С до достижения ЦПД вируса, соответствующего не менее 90%. Полученную вируссодержащую суспензию контролировали на стерильность, содержание 146S частиц и общего вирусного белка (ОВБ).

По результатам анализа в агаре Сабуро, мясо-пептонном агаре, тиогликолевой среде и мясо-пептонном бульоне полученные суспензии не были контаминированы бактериями, грибами и микоплазмами. Проведен комплексный анализ в ПЦР в различных тест-системах на вирусные инфекции крупного рогатого скота и свиней. Выявлено, что полученные суспензии не были контаминированы посторонними вирусными агентами.

Провели анализ для контроля концентрации иммуногенных компонентов штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура. Концентрация ОВБ в суспензии составляла 3,36±0,15 мкг/см³. Значения титра инфекционной активности штамма «А/Египет/ЕГЖО-8А/2022» вируса ящура, а также процентное содержание 146S компонента штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура отражены в таблице 3, из данных которой видно, что при средней концентрации клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, равной 4,27±0,23 млн клеток/см³, дозе заражения 0,005 ТЦД₅₀/кл. и продолжительности репродукции вируса 10,25±0,59 ч средний титр инфекционной активности возбудителя ящура был равен 9,40±0,13 lg ТЦД₅₀/см³. Концентрацию 146S компонента вируса ящура определяли с помощью ранее разработанной методики [11]. Содержание данного компонента составило 71,15±0,96% (2,39±0,09 мкг/см³).

Пример 5. Оценка типовой специфичности и активности штамма «A/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура.

Оценку типовой специфичности и активности штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура проводили в реакции связывания комплемента (РСК).

К полученному антигену штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура, взятому в объеме 0,4 см³ в цельном виде и в разведениях 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 добавляли по 0,1 см³ гомологичной и гетерологичных гипериммунных сывороток, полученных на вирус ящура в удвоенном титре и 0,1 см³комплемента в рабочем разведении. Смесь выдерживали в водяной бане в течение 20 мин при температуре 37±0,1°С. Затем вносили по 0,2 см³гемолитической системы и выдерживали 30 мин при температуре 37±0,1°С. Положительный результат реакции соответствовал 100%-ной задержке гемолиза эритроцитов барана («4 креста»). Параллельно проводили контрольные реакции без сыворотки, без комплемента и компонентов реакции.

В качестве реагентов в РСК использовали сыворотки ящурные типоспецифические гипериммунные морских свинок, полученные на производственные штаммы вируса ящура «А/Турция/06», «А №2205/G-IV/2018», «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SAT-2/SAU7/2000», «SAT-3/Бечуаналенд/65», комплемент сухой для РСК, гемолизин (сыворотка гемолитическая), эритроциты барана 2% (взвесь на физиологическом растворе, рН=7,10-7,15). В качестве контроля использовали антигены вируса ящура штаммов «А/Турция/06», «А №2205/G-IV/2018», «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SAT-2/SAU7/2000», «SAT-3/Бечуаналенд/65».

Результаты исследования отражены в таблице 4, из которой следует, что штамм «A/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура обладает выраженной типовой специфичностью, относится к вирусу ящура серотипа А и активен в РСК в разведении 1:32.

Пример 6. Получение антигена штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура.

Для получения антигена штамма «A/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура как бипрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа A/EURO-SA проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 7,00 lg ТЦД₅₀/см³. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли за счет полигексаметиленгуанидина.

Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 30 мин. при 6000 об/мин и 4±2°С на центрифуге типа Bekman J2-21 (Beckman Coulter, USA) или аналоге. Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 Д (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 8% и хлорид натрия (сухой) до конечной концентрации 0,90%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2°С в течение 22±1 ч. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин., осадок растворяли в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе, концентрируя в 500 раз (1/500 от первоначального объема).

К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура. Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле.

Для получения очищенного антигена штамма «A/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50%. Инактивированную суспензию вируса ящура наливали по 10 мл в центрифужные пробирки, затем последовательно подслаивали растворы сахарозы, начиная с 10%-го и заканчивая 50%-м раствором. Пробирки помещали в металлические центрифужные стаканы и после тщательно выполненного уравновешивания центрифугировали при скорости 40000 об/мин и температуре 4±2°С в течение 4 часов. Фракционирование градиента сахарозы производили с помощью перистальтического насоса, отбирая фракции по 1 мл в отдельные пробирки. Опалесцирующий слой, содержащий очищенный антиген вируса ящура, располагается приблизительно в 30%-м слое сахарозы. Данную фракцию переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 40000 об/мин. и температуре 4±2°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.

Результаты спектрометрического исследования полученных фракций штамма «A/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа A/EURO-SA представлены в таблице 5. Анализ проводили для всех фракций, высокие значения оптической плотности наблюдали для 5-12 фракции с максимальными значениями для 8-10 пиков.

Проведен электрофорез полученных фракций в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях для отобранной фракции. Полученные результаты отражены на фиг. 2, из которой видно, что получен очищенный антиген вируса ящура.

С помощью реакции связывания комплемента определили концентрацию 146S компонента в полученном антигене, которая составила 11,24±0,07 мкг/см³ (n3, р<0,005), что достаточно для использования при изготовлении диагностических наборов для выявления антигена и антител против вируса ящура, а также изготовления вакцин для профилактики данного заболевания.

Таким образом, проведены получение и контроль качества антигена штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа A/EURO-SA.

Полученный антиген использовали в качестве биопрепарата для проведения реакции связывания комплемента для детекции антигена вируса ящура штамма «A/Египет/EURO-SA/2022» в исследуемых пробах при изготовлении вакцинных препаратов. Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 658 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. По результатам проведения реакции связывания комплемента (РСК) доказали, что из 658 образцов сывороток крови 658 определены в качестве положительных. Для исследования специфичности реакции тестировали 402 отрицательных проб. В результате исследования с помощью РСК установили, что из 402 отрицательных проб все определены в качестве отрицательных. Пользуясь статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,44-100,00%), диагностическая специфичность (DSp) - 99,09-100,00%), k-критерий - 1,000; общая точность (DAc) - 99,65-100,00%.

Таким образом, полученный антиген штамма

«A/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура применим для использования в качестве биопрепарата в диагностических тест-системах.

Пример 7. Получение гипериммунных сывороток кролика против антигена штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура как биопрепарата для диагностики ящура генотипа A/EURO-SA.

Для получения гипериммунной сыворотки кролика против антигена штамма «А/Египет/EURO-S А/2022» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа A/EURO-SA применяли 20 клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.

Для гипериммунизации животных применяли антиген вируса ящура, полученный как описано в примере 6, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG (в соотношении адъювант/антиген=60/40 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 21 и 42 дни в объеме 0,5 см³. Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливали и получали сыворотку крови, содержащую антитела против антигена штамма «А/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре 4-8°С.

Полученные 20 сывороток крови кроликов проверяли в реакции связывания комплемента и определили, что их активность составила 1:1000-1:10500. Данные показатели являются высокими и достаточными для изготовления диагностических наборов по выявлению антигена и антител против вируса ящура.

Изготовленные сыворотки объединили в общий пул, провели лиофильную сушку и, таким образом, получили биопрепарат, который использовали для проведения реакции связывания комплемента для детекции антигена вируса ящура штамма «A/Египет/EURO-SA/2022». Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 775 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. По результатам проведения реакции связывания комплемента (РСК) доказали, что из 775 образцов сывороток крови все определены в качестве положительных. Для исследования специфичности реакции тестировали 306 отрицательных проб. В результате исследования с помощью РСК установили, что из 306 отрицательных проб все определены в качестве отрицательных. Пользуясь статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,53-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,80-100,00%, k-критерий - 1,000; общая точность (DAc) - 99,66-100,00%.

Таким образом, полученный вакцинный препарат из штамма «A/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура применен для иммунизации животных как биопрепарат. Проведено получение и контроль качества сывороток кролика против антигена штамма «A/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура, а также показано применение полученной сыворотки как биопрепарата для диагностики ящура генотипа A/EURO-SA.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм «A/Египет/EURO-SA/2022» вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа A/EURO-SA».

1. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. Paris, 2022. - Ch. 3.1.8

2. Пономарев А.П., Узюмов В.Л. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

3. Alexandersen, S. The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease / S. Alexsandersen, Z. Zhang, A.L. Donaldson // J. Compr. Pathol. - 2003. - V. 129. - P. 268-282.

4. Жильцова М.В. Биологические свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типов А, О и Азия-1: Автореф. дис .кан. наук. - Владимир: 2008. - 23 с.

5. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. / Под ред. А.Н. Бурдова. - М., Агропромиздат, 1990, 320 с.

6. Анализ эпизоотической ситуации по ящуру в России с 2010 г. по март 2019 г. / В.П. Семакина, Т.П. Акимова, В.А. Мищенко, А.К. Караулов // Ветеринария. - 2019. - №11. - С. 16-20.

7. Методические рекомендации по выделению и идентификации штаммов вируса ящура / А.А. Гусев, В.М. Захаров, Ж..А. Шажко и др.; ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир. 2002. - 31 с.

8. Методические рекомендации по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации / С.Р. Кременчугская, М.В. Жильцова, Т.К. Майорова; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2012. - 36 с.

9. Эпизоотологические особенности ящура типа А, вызванного гетерологичными штаммами вируса / А.В. Мищенко, В.А. Мищенко, В.В. Дрыгин [и др.] // Ветеринария. - 2014. - №11. - С. 20-24.

10. Патент №2674076 С1 Российская Федерация, МПК А61К 39/135 C12Q 1/68. Способ определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: №2017145889: заявл. 25.12.2017: опубл. 04.12.2018 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

11. Патент №2712769 С1 Российская Федерация, МПК G01M 33/58, C12Q 1/68. Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов: №2019116272: заявл. 27.05.2019: опубл. 31.01.2020 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FMDV A

EURO-SA.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-06-30">

</ApplicationIdentification>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны

здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI "ARRIAH"</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Никифоров Виктор

Викторович</InventorName>

<InventorNameLatin>Nikiforov Viktor Viktorivich</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Штамм «А/Египет/EURO-SA/2022»

вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для

диагностики и специфической профилактики ящура генотипа

A/EURO-SA</InventionTitle>

<INSDSeq_length>663</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..663</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cagcgccggcaaggactttgagttgcgcctcccgattgaccctcgctcg

caaaccacagccaccggggaatcagcggacccggtcaccaccaccgtggagaactacggaggtgagacgc

aggtgcagaggcgtcaacacacagacattggcttcatcatggacaggtttgttaagatcaaaaaccccac

ctcaccacatgtcattgatctcatgcagacccatgaacatgggctggttggtgcaatgctgcgtgcagcc

acgtactacttttccgacttggaaattgtcgtacggcacgatggcagcctgacctgggtgcccaacggcg

cccctgaagcagctctggacaacaccaccaaccccactgcttaccagaaaccaccactcacgagacttgc

tttgccctacaccgcgccacaccgtgtgctggcgacagtgtacaacggggtgaacaaatacactgtgagc

ggttcaagtaggcgtggtgacatgggggcgctcgcggcgcgagtcgcaaagcagctccctgcctcattca

actacggtgcaatcaaggccacgagcattgaggagattctcgtgcgcatgaagcgagctgaactctactg

ccccagaccactcttggcggtggaggtgacatcgcaggacagacacaagcagaa</INSDSeq_sequen

ce>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>221</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..221</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>SAGKDFELRLPIDPRSQTTATGESADPVTTTVENYGGETQVQRRQHTDI

GFIMDRFVKIKNPTSPHVIDLMQTHEHGLVGAMLRAATYYFSDLEIVVRHDGSLTWVPNGAPEAALDNTT

NPTAYQKPPLTRLALPYTAPHRVLATVYNGVNKYTVSGSSRRGDMGALAARVAKQLPASFNYGAIKATSI

EEILVRMKRAELYCPRPLLAVEVTSQDRHKQK</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims

Штамм A/Египет/EURO-SA/2022 вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа A/EURO-SA семейства Picornaviridae рода Aphthovirus, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ ВНИИЗЖ под регистрационным номером №482 - деп/23-32 - ГКШМ ФГБУ ВНИИЗЖ для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа A/EURO-SA.