RU2799606C1

RU2799606C1 - Штамм "SAT-1/Танзания/2012" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-1/I для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-1/I

Info

Publication number: RU2799606C1
Application number: RU2022132953A
Authority: RU
Inventors: Максим Игоревич Доронин; Дмитрий Валерьевич Михалишин; Алексей Валерьевич Борисов; Виктор Викторович Никифоров; Маргарита Эдуардовна Воеводина; Светлана Николаевна Фомина; Надежда Николаевна Медведева
Filing date: 2022-12-14
Publication date: 2023-07-07

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-1/I, семейства Picornaviridae, рода Aphthovirus, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №411 - деп / 22-45 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» штамм «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I вируса ящура. Представленный штамм репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21). В перевиваемой суспензионной культуре клеток почки сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIАН в течение 13,0-14,5 ч инкубирования концентрация 146S компонента штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I вируса ящура имеет средние значения 1,34±0,07 мкг/см³ (64,88±0,66%), сохраняя исходные характеристики при пассировании в клеточной культуре BHK-21/SUSP/ARRIAH. Представленный штамм может быть использован для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-1/I и для контроля антигенной активности противоящурных вакцин. 1 ил., 4 табл., 5 пр.

Description

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано для разработки и изготовления средств диагностики, специфической профилактики ящура генотипа SAT-1/I и контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин.

За последние 30 лет для диагностики инфекционных заболеваний и контроля качества сырья при изготовлении вакцин для профилактики особо опасных и экономически значимых болезней сельскохозяйственных животных стали широко применяться молекулярно-биологические методы анализа, которые постепенно вытесняют классические методы исследования.

Ящур является высококонтагиозным вирусным заболеванием, которое причиняет серьезный экономический ущерб в связи с затратами на ликвидацию болезни и введением строгих ограничений, налагаемых на внутреннюю и международную торговлю продукцией животноводства. Система мер для борьбы с ящуром и его профилактики предусматривает стемпинг-аут, а также массовую иммунизацию восприимчивых животных, и далее контроль уровня напряженности поствакцинального иммунитета [1].

Возбудителем является безоболочечный вирус рода Aphthovirus семейства Picornaviridae. Выделяют 7 различных серотипов вируса ящура: О, А, Азия-1, С и SAT-1, SAT-2, SAT-З. Геном вируса ящура представлен одноцепочечной молекулой РНК (ssRNA(+)) положительной полярности. Вирионная РНК различных штаммов вируса ящура имеют одинаковую длину около 8400-8500 н.о., кодирует 4 структурных белка: VP₁, VP₂, VP₃, VP₄ [2].

Изменчивость вируса в пределах одного генотипа приводит к возникновению новых изолятов, которые отличаются по степени вирулентности и иммуногенности от ранее выделенных штаммов вируса ящура. Каждый серотип генетически разделен на различные топотипы, генетические линии и сублинии. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP₁), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [1, 2, 3].

Белок VP₁ является наиболее вариабельным, поскольку на него приходится около 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [3, 4]. Участок поверхностного белка VP₁ в регионе 130-160 а.о. отличается высокой вариабельностью, поскольку участвует в процессе связывания с рецепторами клетки-хозяина [4, 5]. Изменчивость данного региона дает возможность вирусу ящура взаимодействовать с рецепторами клеток разных типов и облегчает переход от одного вида хозяина к другому. Серотипы вируса ящура в среднем на 86% имеют идентичные последовательностей, хотя VP₁ значительно более вариабелен. Нуклеотидные последовательности кодирующей области VP₁ используются для генетической характеристики штаммов ящура из-за их значимости для прикрепления и проникновения вируса в клетку, защитного иммунитета и специфичности серотипа. Филогенетический анализ на основе последовательности VP₁ широко используется для вывода эволюционной динамики, эпидемиологических отношений между генетическими линиями и для отслеживания происхождения и перемещения штаммов вируса ящура [5].

Наблюдаемая генетическая вариация в геноме вируса ящура является результатом двух процессов. Во-первых, это ошибки, которые возникают в результате репликации вирусной РНК и отсутствия репарации кодируемой РНК-зависимой РНК-пол имеразы. Во-вторых, конкурентный отбор, который воздействует на геном. В природной среде в результате будут преобладать изоляты новых генетических линий, которые включают в свой геном требуемые для данной среды характеристики [4, 5].

В РНК-содержащих вирусах вариациям в геноме благоприятствуют высокие частоты мутаций во время репликации вируса, а возникающие линии и сублинии обусловлены мутациями и рекомбинацией. Рекомбинация - еще один важный процесс, определяющий биологию и эволюцию вирусов. Она представляет собой обмен генетическим материалом между двумя несегментированными РНК-геномами. Генетическая рекомбинация происходит между вирусами одного и того же серотипа [5]. Рекомбинации в нуклеиновой кислоте вируса ящура происходят легче в 3'-части генома, чем в участках, кодирующих структурные вирусные белки. Мутации в результате рекомбинации могут привести к обмену генетическим материалом и образованию новых антигенных вариантов, которые зачастую приводят к изменениям тропизма клеток. Одна или несколько аминокислотных замен на поверхности вирусных частиц могут привести к изменению распознавания и использования рецепторов. В результате один и тот же вирус может приобретать способность проникать в клетки с использованием альтернативных рецепторов [4, 5].

Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием вирусных факторов и факторов клеток-хозяев. Изменения в генах, кодирующих капсидные белки, путем мутации могут привести к антигенным изменениям и появлению новых генетических линий [5, 6].

Для выявления генетических связей между различными изолятами и штаммами обычно применяют нуклеотидное секвенирование. Следовательно, в условиях вспышки можно проследить происхождение вируса. Антигенные характеристики вируса, связанные с появлением новых штаммов, важны для характеристики вспышек и поиска оптимальных вакцинных препаратов [4, 6].

Репрезентативные штаммы/изоляты для каждого топотипа ящура перечислены ниже. Они могут образовывать основные опорные точки филогенетического дерева. В базе данных GenBank представлены нуклеотидные последовательности для различных генетических линий и сублиний.

Для вируса ящура серотипа SAT-1 характерна высокая генетическая изменчивость, а именно он включает в себя следующие 13 топотипов: I (NORTHWEST ZIMBABWE, NWZ), II (SOUTHEAST ZIMBABWE, SEZ), III (WESTERП ZIMBABWE, WZ), IV (EAST AFRICA 1, EA-1), V, VI, VII (EAST AFRICA 2, EA-2), VIII (EAST AFRICA 3, EA-3), IX, X, XI, XII, XIII. Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа SAT-1.

На территории Восточной Африки, в частности, в Нигерии, Кении, Танзании, Эфиопии вспышки ящура серотипа SAT-1 имеют спорадический характер и вызваны заносом возбудителя с территории сопредельных стран. Следует отметить, что в последние годы усилились торгово-экономические связи со странами Африканского континента, в частности, Восточной Африки. Имеются риски заноса изолятов данного серотипа на территорию Российской Федерации.

Анализируя вспышки, которые регистрировались на территории Африки, обнаружено, что были выявлены изоляты разных топотипов серотипа SAT-1, в частности, II (SAT-1 RV 11 37), III (SAT-1 ВОТ 1 68), IV (SAT-1 UGA BUFF 21 70), V (SAT-1 NIG 11 75), VI (SAT-1 SUD 3 76), VII (SAT-1 UGA 13 74), VIII (SAT-1 UGA 1 97), IX (SAT-1 ETH 3 2007), X (SAT-1/X), XI (SAT-1 TCH 1/72), XII (SAT-1/ANG/9/74), XIII (SAT 1 MOZP132010 В16). В последние годы, начиная с 2012 г. стали широко распространяться изоляты вируса ящура серотипа SAT-1 топотипа I. В частности, вспышки ящура генотипа SAT-1/I фиксировались в Кении, Танзании, Уганде, Эфиопии.

Известны производственные штаммы вируса ящура типа SAT-1, которые применяются или применялись в мире для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм «SAT-1 Т 155 71» (генотип SAT-1/I),

- штамм «SAT-1 RV 11 37» (генотип SAT-1/II),

- штамм «SAT-1 ВОТ 1 68» (генотип SAT-1/III),

- штамм «SAT-1 UGA BUFF 21 70» (генотип SAT-1/IV),

- штамм «SAT-1 NIG 11 75» (генотип SAT-1/V),

- штамм «SAT-1 SUD 3 76» (генотип SAT-1/VI),

- штамм «SAT-1 UGA 13 74» (генотип VII),

- штамм «SAT-1 UGA 1 97» (генотип VIII),

- штамм «SAT-1 ETH 3 2007» (генотип IX),

- штамм «SAT-1/Х» (генотип X),

- штамм «SAT-1 TCH 1/72» (генотип XI),

- штамм «SAT-l/ANG/9/74» (генотип XII),

- штамм «SAT 1 MOZP132010 В16» (генотип XIII).

Изолят «SAT-1 /TAN/11/2012» вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории Объединенной Республики Танзания в 2012 году. Данный изолят поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для проведения научных исследований и получения нового штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура.

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный изолят принадлежит к топотипу I, типа SAT-1 вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура типа SAT-1.

Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде, пригодный для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических тест-систем и высоко иммуногенных вакцинных препаратов путем получения штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа SAT-1.

Штамм «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №411 - деп / 22-45 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура для изготовления средств диагностики и профилактики ящура генотипа SAT-1/I.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1. - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «SAT-1 /Танзания/2012» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического типа SAT-1. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP₁.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP₁ штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура типа SAT-1;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP₁ штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура типа SAT-1.

Штамм «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура серотипа SAT-1 относится к отряду Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, виду Foot-and-Mouth Disease virus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 20-25 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной молекулы РНК с позитивным смыслом, заключенной в белковую оболочку. Она состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура относится к серотипу SAT-1. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА).и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура ID-гена белка VP₁ штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура принадлежит к генотипу SAT-1/I (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура изучено в реакции микронейтрализации в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм «SAT-1 Т 155 71» (генотип SAT-1/I),

- штамм «SAT-1 RV 11 37» (генотип SAT-1/II),

- штамм «SAT-1 ВОТ 1 68» (генотип SAT-1/III),

- штамм «SAT-1 UGA BUFF 21 70» (генотип SAT-1/IV),

- штамм «SAT-1 NIG 11 75» (генотип SAT-1/V),

- штамм «SAT-1 SUD 3 76» (генотип SAT-1/VI),

- штамм «SAT-1 UGA 13 74» (генотип VII),

- штамм «SAT-1 UGA 1 97» (генотип VIII),

- штамм «SAT-1 ETH 3 2007» (генотип IX),

- штамм «SAT-1/Х» (генотип X),

- штамм «SAT-1 TCH 1/72» (генотип XI),

- штамм «SAT-l/ANG/9/74» (генотип XII),

- штамм «SAT 1 MOZP132010 В16» (генотип XIII).

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7, 8, 9].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются близкородственными;

при <0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура отличается от производственного штамма.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-1/Танзания/2012» составили r₁ от 0,01 до 0,15, что свидетельствует об отсутствии антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-1 (табл. 1).

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура является РНК(+) содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, выделяют РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации РНК для сборки вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Плавучая плотность 1,45 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура устойчив к детергентам и органическим растворителям, таким как эфир, хлороформ, фреон, ацетон. Наиболее стабилен при рН 7,4-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 37,7°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Исследование биологических свойств штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура при репродукции в монослойных перевиваемых клеточных линиях.

При выделении изолята «SAT-1/TAN/11/2012» вируса ящура с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [7].

Биологические и вирусологические методы включали в себя метод выделения в культуре клеток и адаптацию вируса ящура к перевиваемым клеточным линиям.

Выделение вируса ящура проводили в монослойных перевиваемых клеточных линиях ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 с последующей адаптацией в течение 5 последовательных пассажей. Культуры клеток выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25 см², отмывали от ростовой среды и заражали 10%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в растворе Хэнкса с 0,5% гидролизата лактальбумина по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов вирусную суспензию предварительно обрабатывали 10%-ным раствором хлороформа. После 30-минутного контакта вируса с клеточной культурой при температуре 37±0,5°С во флаконы вносили по 5,0 см³ поддерживающей среды и инкубировали при температуре 37±0,5°С до появления цитопатического действия (ЦПД) в культуре клеток, которое представлено в виде округления клеток, повышения их оптической плотности, дегенерации и отделении клеток от поверхности субстрата. При ЦПД не менее 90% клеток, флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение не менее 24 часов проявлялось 90-100% ЦПД в монослое клеточных культур. Адаптация эпизоотического изолята «SAT-1 /TAN/11/2012» к различным клеточным линиям наступала на уровне пятого пассажа. Титр инфекционной активности определяли с помощью разработанной ранее методики [10]. Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2, данные которой свидетельствуют о высокой адаптационной способности изолята «SAT-1/TAN/11/2012» вируса ящура к использованным клеточным культурам. В монослойной культуре клеток ПСГК-30 за 16 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,65±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток IB-RS-2 за 14 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,80±0,12 lg ТЦД₅₀/см³. В монослойной культуре клеток ВНК-21 за 13 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,50±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. В итоге получен штамм «SAT-1/Танзания/2012» с охарактеризованными биологическими культуральными свойствами, который далее использовали для исследования его свойств.

Пример 2. Оценка биологических свойств штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура на крупном рогатом скоте.

Заражение КРС исходным штаммом вируса ящура проводили интрадермолингвально (I пассаж). Адаптацию и наработку штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура на КРС проводили в течение 2 последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт на этапе 2 пассажа на КРС получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения на 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе (ФБР). Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили интрадермолингвально в 4 точки по 0,1 см³ двум головам КРС. Учет результатов титрования на животных проводили спустя 24 ч по наличию афт на месте введения разведений вируса ящура штамма «SAT-1/Танзания/2012». Титр инфекционной активности на КРС штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура на стадии первого пассажа на КРС составил 4,50 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго пассажа - 5,25 lg ИД₅₀/0,1 см³. Таким образом, была получена 10%-ная афтозная суспензия вируса ящура штамма «SAT-1/Танзания/2012» (2 пассаж на КРС) с титром инфекционной активности 5,25 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 3. Исследование биологических свойств штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура на свиньях.

Заражение свиней исходным штаммом «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура проводили внутрикожно на стадии первого пассажа в область венчика передних конечностей. Адаптацию и наработку штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура на свиньях вели в течение 2 последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт 2 пассажа на свиньях получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения с использованием в качестве растворителя 1/15 М ФБР. Подготовленные разведения с 10^-2 по 10^-6 вводили внутрикожно в венчики копытец по 0,1 см³ в 4 точки на каждый палец конечности одного разведения, из расчета 1 разведение на 2 копытца 1 конечности каждому из 2 подопытных подсвинков.

Учет результатов титрования проводили через 24 ч по наличию афт на месте введения разведений. Титр инфекционной активности на свиньях для штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура на свиньях на стадии первого пассажа составил 4,75 lg ИД₅₀/0,1 см³, второго - 5,50 lg ИД₅₀/0,1 см³.

Пример 4. Исследование биологических свойств штамма «SAT-1 /Танзания/2012» вируса ящура при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Штамм «SAT-1 /Танзания/2012» вируса ящура репродуцировали в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 /SUSP/ARRIAH. В качестве поддерживающей среды использовали среду Игла, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого (ФГМС), гидролизата белков крови сухого (ГБКС) при рН среды 7,4-7,6. Клеточную линию заражали вирусом из расчета 0,001-0,100 ТЦД₅₀/клетка.

Культивирование штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура осуществляли при температуре 37,0±0,2°С до достижения цитопатического действия вируса, соответствующего 90-100%. Полученную вируссодержащую суспензию контролировали на стерильность и содержание 146S компонента и общего вирусного белка (ОВБ). Концентрация ОВБ в суспензии составляла 2,06±0,10 мкг/см³. Значения титра инфекционной активности вируса, а также процентное содержание 146S компонента штамма «SAT-1 /Танзания/2012» вируса ящура отражены в таблице 3, из данных которой видно, что при средней концентрации клеток ВНК-21 /SUSP/ARRIAH, равной 3,99±0,10 млн клеток/см³, дозе заражения 0,005 ТЦД₅₀/кл. и продолжительности репродукции вируса 13,85±0,58 ч средний титр инфекционной активности возбудителя ящура был равен 7,57±0,09 lg ТЦД₅₀/см³. Концентрацию 146S компонента вируса ящура определяли с помощью ранее разработанной методики [11]. Содержание данного компонента составило 64,88±0,66% (1,34±0,07 мкг/см³).

Пример 5. Оценка типовой специфичности и активности штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура

Оценку типовой специфичности и активности штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура проводили в реакции связывания комплемента (РСК).

К полученному антигену штамма «SAT-1 /Танзания/2012» вируса ящура, взятому в объеме 0,4 см³ в цельном виде и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 добавляли по 0,1 см³ гомологичной и гетерологичных гипериммунных сывороток, полученных на вирус ящура в рабочем (удвоенном) титре и 0,1 см³комплемента в рабочем разведении. Смесь выдерживали в водяной бане в течение 20 мин при температуре 37±0,5°С. Затем вносили по 0,2 см³гемолитической системы и выдерживали 30 мин при температуре 37±0,5°С. Положительный результат реакции соответствовал 100%-ной задержке гемолиза эритроцитов барана («4 креста»). Параллельно проводили контрольные реакции без сыворотки, без комплемента и компонентов реакции.

В качестве реагентов в РСК использовали сыворотки ящурные типоспецифические гипериммунные морских свинок, полученные на производственные штаммы вируса ящура А/Турция/06, О/Забайкальский/2016, Азия-1/Таджикистан/2011, SAT-2/SAU/7/2000, SAT-3/Бечуаналенд/65 комплемент сухой для РСК, гемолизин (сыворотка гемолитическая), эритроциты барана 2% (взвесь на физиологическом растворе, рН=7,05-7,15). В качестве контроля использовали антигены вируса ящура штаммов А/Турция/06, О/Забайкальский/2016, Азия-1/Таджикистан/2011, SAT-2/SAU/7/2000, SAT-3/Бечуаналенд/65.

Результаты исследования отражены в таблице 4, из которой следует, что штамм «SAT-1 /Танзания/2012» вируса ящура обладает выраженной типовой специфичностью, относится к вирусу ящура серотипа SAT-1 и активен в РСК в разведении 1:16.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм «SAT-1 /Танзания/2012» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-1/1 для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-1/I».

1. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. Paris, 2018. - Ch. 3.1.8

2. Пономарев А.П., Узюмов В.Л. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

3. Alexandersen, S. The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease / S. Alexsandersen, Z. Zhang, A.L. Donaldson // J. Compr. Pathol. - 2003. - V. 129.-P. 268-282.

4. Жильцова M.B. Биологические свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типов А, О и Азия-1: Автореф… дис.кан. наук. - Владимир: 2008. - 23 с.

5. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. / Под ред. А.Н. Бурдова. - М, Агропромиздат, 1990, 320 с.

6. Анализ эпизоотической ситуации по ящуру в России с 2010 г. по март 2019 г. / В.П. Семакина, Т.П. Акимова, В.А. Мищенко, А.К. Караулов // Ветеринария. - 2019. - №11. - С. 16-20.

7. Методические рекомендации по выделению и идентификации штаммов вируса ящура /А.А. Гусев, В.М. Захаров, Ж.А. Шажко и др.; ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир. 2002. - 31 с.

8. Методические рекомендации по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации /С.Р. Кременчугская, М.В. Жильцова, Т.К. Майорова; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2012. - 36 с.

9. Эпизоотологические особенности ящура типа А, вызванного гетерологичными штаммами вируса / А.В. Мищенко, В.А. Мищенко, В.В. Дрыгин [и др.] // Ветеринария. - 2014. - №11. - С.20-24.

10. Патент №2674076 С1 Российская Федерация, МПК А61К 39/135 C12Q 1/68. Способ определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: №2017145889: заявл. 25.12.2017: опубл. 04.12.2018 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

11. Патент №2712769 С1 Российская Федерация, МПК G01M 33/58, C12Q 1/68. Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов: №2019116272: заявл. 27.05.2019: опубл. 31.01.2020 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="2012.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2022-11-01">

</ApplicationIdentification>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны

здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI "ARRIAH"</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru"> Штамм «SAT-1/Танзания/2012»

вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-1/I для изготовления

биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура

генотипа SAT-1/I </InventionTitle>

<INSDSeq_length>663</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..663</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacatcggcgggtgaaggcgcagagcccgtgactaccgatgcatcac

agcatggcggtgggcgccgcgccacgcgcaggcaacacactgacgtggctttcctccttgaccggttcac

cctggtcgggaagactgctggcaacagattgacactggacctgctccagaccaaggagaaagcactggtg

ggcgcaatcctgcgcgctgccacgtactacttctcggacttggaggtggcttgtgttggtacgaacaagt

gggtcggctggacgccgaacggcgcgccagaactcagtgaggtcggcgacaacccagtcgtcttctctca

caacgggaccacacgctttgctctaccatacactgccccacacagatgtcttgctactgcctacaacggc

gactgcaagtacaaaccaaccagtgaggcaccgcggacgcacatccgtggggaccttgcggcactcgctg

agcgcatcgctagcgagacacacatcccaaccacctttaactatggcaggatctacacagaggcggaagt

cgacgtgtatgtgaggatgaagcgggcggagctctactgcccacgcccggtgctgactcactatgaccac

caggacaaggaccgctacaaagtggccctgacaaagcctgccaaacaactgtgc</INSDSeq_sequen

ce>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>221</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..221</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGEGAEPVTTDASQHGGGRRATRRQHTDVAFLLDRFTLVGKTAGNR

LTLDLLQTKEKALVGAILRAATYYFSDLEVACVGTNKWVGWTPNGAPELSEVGDNPVVFSHNGTTRFALP

YTAPHRCLATAYNGDCKYKPTSEAPRTHIRGDLAALAERIASETHIPTTFNYGRIYTEAEVDVYVRMKRA

ELYCPRPVLTHYDHQDKDRYKVALTKPAKQLC</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims

Штамм «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-1/I, семейства Picornaviridae, рода Aphthovirus, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №411 - деп / 22-45 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» и предназначенный для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-1/I.