KR102623114B1 - 구제역 바이러스 백신 항원의 순도 증가 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구제역 바이러스 백신 항원의 순도 증가 방법에 관한 것으로, 본 발명의 클로로포름 처리 방법을 사용할 경우, 종래 PEG 농축 방법과 비교하여 시간 및 경제적 측면에서 월등하게 우수하고, 보다 효율적으로 비구조 단백질을 완전하게 제거할 수 있으므로 구제역 백신 항원 제조 공정에서 유용하게 활용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 구제역 백신의 생산 단가를 대폭 절감시키고, 더불어 세계적 품질 경쟁력 향상에 크게 기여할 것으로 사료된다.

Description

구제역 바이러스 백신 항원의 순도 증가 방법{Method for Enhancing Purity of Foot-and-mouth Disease Vaccine Antigens}

본 발명은 구제역 바이러스 백신 항원의 순도 증가 방법에 관한 것이다.

구제역(foot-and-mouth disease)은 우제류 동물에서 바이러스 감염으로 고열, 수포 등의 증상을 나타내며 어린 가축에서는 폐사를 일으키는 국내 제 1종 법정 가축전염병이다. 국내에서는 2000년 이후로 8회 발생하였으며 2010-2011년 발생 시에는 무려 약 3조원의 직접적인 경제적 피해를 초래하기도 하였다.

구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 입자는 총 4개의 단백질(VP1, VP2, VP3, VP4)로 구성되어 있고, 통상적으로 구조 단백질로 명칭 한다. 바이러스가 세포에서 증식할 때 생성되는 상기 4개의 단백질들이 1개씩 모여서 단일체(protomer)를 형성했다가 단일체 5개가 모여서 펜타머(pentamer)를 형성한다. 그 후, 펜타머 12개가 모여서 완전한 형태의 구제역 바이러스 완전입자를 형성하고, 원심 분리의 밀도 및 침강 계수가 146S이므로 완전 입자 형태를 상기 146S로 부르기도 한다.

또한, 상기 완전한 형태의 구제역 바이러스가 고열이나 낮은 pH 등에 의해서 펜타머로 분해가 되면 완전한 형태의 바이러스 입자에 비해서 면역원성이 훨씬 낮아진다는 것이 보고된 바 있어, 구제역 백신을 제조하는 단계 혹은 완제품 단계에서 구제역 바이러스의 입자를 온전한 형태로 유지하는 것이 필요한 상황이다.

현재 구제역을 가장 효과적으로 제어할 수 있는 방법은 구제역 감수성 동물에 예방 백신을 사전에 접종하는 것뿐이다. 국내에서도 이미 2010년 12월 24일부터 지금까지 전국적으로 구제역 백신을 소, 돼지, 염소 등에 접종하고 있다.

보통 동물용 백신은 생산 단가를 낮추기 위하여 공정 단계를 최소화하기 때문에 인체용 백신과 같은 별도의 정제 공정이 없다. 그러나, 구제역 백신의 경우 다른 동물용 백신과는 다르게 추가적인 정제 과정이 수반된다.

생산 비용의 상승을 감수하며 추가적인 정제 단계를 거치는 목적은 비구조 단백질을 제거하기 위함이다. 비구조 단백질은 구제역이 감염된 후 바이러스가 동물의 체내에서 생성하는 단백질로서 바이러스의 증식 등에 관여한다.

현재 시판되고 있는 구제역 백신은 바이러스 전파에 대한 안전성 확보를 위하여 구제역 바이러스 불활화 단계를 거친 후, 감염성 부재가 보장된 바이러스만을 포함하고 있다. 따라서 구제역 백신을 목적 동물에 접종하더라도 이에 포함된 바이러스는 증식 능력이 없다.

구제역 바이러스 구조 단백질에 대한 항체는 백신접종시와 자연감염시 모두 동일하게 형성되는 반면, 비구조 단백질에 대한 항체는 구제역 바이러스의 자연 감염시에만 동물의 체내에서 형성되는 항체이므로 바이러스의 감염 여부를 판단하기 위한 최적의 지표가 된다. 만약 백신 접종에 의하여 비구조 단백질 항체가 유도된다면 백신접종축과 자연감염축의 감별 진단에 큰 어려움이 따르므로 구제역 백신 제조시 비구조 단백질의 제거는 필수 요소 중 하나이다.

그러나 비구조 단백질만을 제거하는 방법이 알려져 있지 않기 때문에 대부분의 구제역 백신 제조사에서는 구제역바이러스를 부분적으로 농축하는 방법들을 주로 활용하고 있다. 일반적으로 가장 널리 사용되는 구제역바이러스 농축방법은 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 이용하는 것이다.

PEG는 비이온성 고분자(non-ionic polymer)로 단백질을 둘러싸고 있는 수용액 층에 탈수작용을 일으켜 단백질과 단백질의 결합능력을 증가시키고 결과적으로 단백질의 침전을 야기한다. 이는 단백질을 변성시키지 않는 방법으로 단백질 정제과정에서 널리 사용되고 있으며, 구제역 백신 생산에도 백신 항원을 농축 정제하기 위하여 사용되고 있다. 농축은 대용량의 항원을 보관이 용이하도록 부피를 최소화하려는 목적이고, 정제는 고분자물질을 침전시킴으로써 분자량이 작은 비구조 단백질을 분리하여 제거하고자 하는 목적이다.

그러나, 이때 비구조 단백질을 포함한 작은 분자량의 단백질들도 일부 혼입되어 침전되기 때문에 구제역 바이러스의 비구조 단백질이 완전하게 제거되지 않는 문제가 있고, 이렇게 만들어진 백신을 가축에 여러 차례 반복하여 접종하면 특히 소와 염소 등에서 비구조 단백질 항체가 형성되는 경우가 발생한다.

즉, 기존의 구제역 백신 항원은 필터방식 혹은 PEG를 처리하여 구제역 백신 항원을 농축 제조하나, 이러한 방법의 경우에는 구제역 바이러스 비구조 단백질이 여전히 잔존하고 있어서 여러 번 반복해서 구제역 백신을 접종할 경우에는 가축에서 구제역 바이러스의 비구조 단백질 항체가 유도될 가능성이 농후해진다. 또한, 농축 정제하는 과정에서 필연적으로 약 30-40% 항원 손실이 발생한다.

따라서, 현행의 PEG 농축 정제 방법은 비구조 단백질을 완전하게 제거하지 못하므로 비구조 단백질을 보다 효과적이고 경제적으로 제거할 수 있으면서도 항원 손실이 10% 이하인 구제역 백신 항원 제조 기법의 개발이 절실히 필요한 상황이다.

이에, 본 발명자들은 구제역 바이러스 백신 항원에서 비구조 단백질을 제거하는 가장 효과적이고 경제적인 생산 방법을 예의 연구하였다. 그 결과, 구제역 바이러스 상층액으로부터 비구조 단백질을 제거할 수 있는 클로로포름 처리 기법을 확립하였다. 본 발명의 방법을 이용하는 경우, 구제역 바이러스 완전입자(146S)는 클로로포름에 영향을 받지 않아 온전하게 보존되어 바이러스 완전입자(146S)의 생산성을 증가시키면서, 비구조 단백질은 완벽히 제거되어, 구제역 바이러스 백신 항원을 고수율 및 고순도로 수득할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus)의 비구조 단백질만을 손쉽게 선택적으로 제거함으로써 구제역 백신 항원의 순도를 증가시키는 방법을 제공하는 데 있다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus, FMDV) 백신 항원의 순도 증가 방법을 제공한다:

(a) 구제역 바이러스의 상층액을 획득하여 불활화시키는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 불활화된 구제역 바이러스 상층액에 클로로포름(chloroform)을 첨가하는 단계; 및

(c) 상기 클로로포름 혼합액으로부터 수용액 층을 분리 및 농축하여, 비구조 단백질(NSP; Non Structural Protein)이 제거된, 순도가 증진된 구제역 바이러스 백신 항원을 획득하는 단계.

본 발명의 상기 (b) 단계의 클로로포름 처리(첨가) 농도는 2%(v/v) 이상일 수 있으나, 본 발명의 목적 효과인 비구조 단백질 제거 효과가 발휘되는 한, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서, 바람직하게는, 상기 클로로포름은 2%(v/v) 내지 99%(v/v)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 2%(v/v) 내지 50%(v/v), 보다 더욱 바람직하게는, 2%(v/v) 내지 30%(v/v), 가장 바람직하게는 2%(v/v) 내지 10%(v/v)이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 구제역 바이러스 입자는 완전입자 형태(146S)이다.

즉, 본 발명의 특징은 클로로포름을 이용함으로써, 종래 구제역 바이러스 백신 항원 획득 방법에 비해, 구제역 바이러스 완전입자(146S)는 클로로포름에 영향을 받지 않아 온전하게 보존되어 바이러스 완전입자(146S)의 생산성은 증가시키면서, 비구조 단백질은 제거시켜, 고순도의 구제역 바이러스 백신 항원을 고효율로 단축된 시간내에 수득한다는 데 있다.

통상적으로 구제역 바이러스 농축 및 정제를 위하여 당업계에서 이용하는 PEG 방법의 경우, 비구조 단백질을 완전하게 제거하지 못하므로 목적 동물에 반복 접종시 비구조 단백질 항체를 유도하는 문제점을 초래한다. 이는 구제역 백신 접종축과 자연감염축의 감별 진단에 혼란을 야기하여 구제역 바이러스 순환의 상시적 모니터링에 어려움을 준다.

또한, 불활화 구제역 바이러스를 항원으로 하는 구제역 백신은 매우 우수한 예방 효과를 보여주어 상용화시 높은 활용가치가 있으나, 상용화되기 위해서는 백신 항원 제조에 소요되는 비용이 백신 가격 상승의 요인이 되므로, 백신의 가격 경쟁력 제고를 위해 백신 항원의 생산 비용을 최소화하는 것이 중요한 과제로 남아있다. 구제역 백신의 생산 과정에는 PEG를 처리하여 비구조 단백질 제거를 통한 백신 항원의 순도 확보를 위한 정제과정을 거쳐야 하며, 이 과정에서 대상 항원의 수율 감소는 빈번하게 일어난다.

따라서, 정제 과정에서 항원의 고수율을 확보하는 것은 최종 생산되는 백신의 생산 비용에 중요한 영향을 미치는 요인이다.

그러나, 본 발명의 클로로포름 처리 방법을 이용할 경우, 구제역 바이러스의 최종 항원으로 유효한 단백질인 구제역 바이러스 입자(146S)를 온전하게 보존 및 유지하면서, 비구조 단백질을 완전하게 제거하므로, 상술한 바와 같은 문제점을 해결할 뿐만 아니라, 구제역 바이러스 입자(146S) 항원의 생산 수율(회수율)을 탁월하게 증가시킨다.

본 발명에 있어서, 상기 "구제역 바이러스 입자"는 원심분리의 침강계수에 따라 각 146S로 명명하며, 본 명세서에서 "구제역 바이러스 백신 항원"과 혼용된다.

상기 "완전입자"는 구제역 바이러스의 총 4개의 단백질(VP1, VP2, VP3, VP4)이 1개씩 모여 단일체(protomer)를 형성하고, 단일체 5개가 모여서 펜타머(pentamer)를 형성한 후, 펜타머 12개가 모인 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus) 입자는 총 4개의 단백질(VP1, VP2, VP3, VP4)로 구성되어 있고, 통상적으로 구조 단백질로 명칭한다.

본 발명에 있어서, 구제역 바이러스는 "혈청형"이 7가지로 존재하는데, 구제역 바이러스는 복제 과정에서 3D RNA-의존 RNA 중합효소가 유전자 교정(gene proofreading) 및 복제 후 수리 활성이 결여되어 있기 때문에 바이러스 입자의 일부 유전서열에 높은 변이성이 생겨 상기 혈청형이 존재한다. 반면, 비구조 단백질의 경우에는 모든 구제역 바이러스가 동일하게 발현하는 공통된 유전자 서열이므로 "혈청형"을 따로 구분 짓지 않는다.

따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 구제역 바이러스의 혈청형은 O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 및 Asia-1의 모든 혈청형을 포함할 수 있고, 가장 바람직하게는 구제역 바이러스 O형이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 구제역 바이러스는 국내 분리 구제역 바이러스 O형 보은주(O/Boeun/SKR/2017) 및/또는 안동주 (O/Andong/SKR/2010)이다.

본 발명의 일 실시예에서 구제역 바이러스 백신 항원 제조를 위하여 클로로포름의 처리 농도를 특정하였으나, 비구조 단백질을 제거하기 위한 목적을 달성하는 한, 클로로포름의 농도는 제한되지 않는다.

일 실시예에서, 본 발명은 유기용매인 클로로포름을 사용하며, 구제역 바이러스 상층액 시료에 특정 농도(v/v)의 클로로포름을 처리한 후 상온에서 5분간 상하 반전하여 상층액과 혼합한다. 혼합액은 4,000 rpm에서 15분간 원심분리 하여 수용액과 클로로포름 층을 분리시킨다.

이에 따라, 비구조 단백질은 클로로포름에 의해 수용액층에서 분리되어 존재하고, 구제역 바이러스 입자(항원)는 수용액 층에서 수득된다.

본 발명에서 항원으로 될 수 있는 물질은 비구조 단백질 또는/및 구조 단백질을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 구조 단백질이다.

구조 단백질은 구제역 바이러스 입자 파쇄물이나 그 구성 요소인 VP1 내지 VP4의 폴리펩타이드가 있으며, 비구조 단백질은 리더펩타이드(Lb), 2B, 2C, 3A, 3D, 3AB, 3ABC 에서 선택되는 적어도 하나 이상의 폴리펩타이드가 여기에 포함될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계의 구제역 바이러스는 불활화된 상태 혹은 증식력이 있는 상태에 모두 적용 가능하다.

상기 불활화는 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 바이러스가 높은 역가로 증식되면, 바이러스를 수득한 후 이들을 포르말린, 베타프로프리오락톤 (BPL), 이성분 에틸렌이민 (BEI) 또는 감마선으로 처리하거나, 통상의 기술자에게 공지된 기타 방법에 의해 비활성화시킬 수 있다. 본 발명에서, 바람직하게는, 3mM 이원성 에틸렌이민(Binaryethyleneimine)으로 불활화한 것일 수 있다.

본 발명의 클로로포름 처리 방법을 사용할 경우, 종래 PEG 농축 방법과 비교하여 시간 및 경제적 측면에서 월등하게 우수하고, 보다 효율적으로 비구조 단백질을 제거할 수 있을 뿐만 아니라, 구제역 백신 항원 회수율을 극대화하는데 기여하여 구제역 백신 항원 제조 공정에서 매우 유용하게 활용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 구제역 백신의 생산 단가를 대폭 절감시키고, 더불어 세계적 품질 경쟁력 향상에 크게 기여할 것으로 사료된다.

도 1은 유기용매가 종류별 처리된 O형 보은주 상층액 시료에 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 및 면역블로팅(western blotting)을 실시하여 구제역 바이러스 비구조 단백질(3B 항체 사용)의 검출 수준을 확인한 결과를 보여준다.
도 2a는 클로로포름이 농도별 처리된 O형 보은주 및 안동주 상층액 시료에 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 및 면역블로팅(western blotting)을 실시하여 구제역 바이러스 구조 단백질(VP1 항체 사용)과 비구조 단백질(3B 항체 사용)의 검출 수준을 확인한 결과를 보여준다. 도 2b는 트리클로로에틸렌이 농도별 처리된 O형 보은주 및 안동주 상층액 시료에 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 및 면역블로팅(western blotting)을 실시하여 구제역 바이러스 비구조 단백질(3B항체 사용)의 검출 수준을 확인한 결과를 보여준다. 도 2c는 클로로포름이 농도별 처리된 O형 보은주 및 안동주 상층액 시료를 세포에 감염하여 증식된 구제역 바이러스의 역가를 확인한 결과를 보여준다.
도 3은 종래 방법인 PEG 및 본 발명의 클로로포름을 각각 처리한 후 농축하여 제조한 구제역 백신 항원 시료를 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 및 면역블로팅(western blotting)을 실시하여 구제역 바이러스 비구조 단백질(3B 항체 사용)의 검출 수준을 확인한 결과를 보여준다.
도 4a는 종래 방법인 PEG 및 본 발명의 클로로포름을 각각 처리하여 제조한 구제역 백신을 염소에 반복 접종하여 혈청을 수득한 후 효소결합면역측정법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 키트를 사용하여 구조 단백질의 항체 형성률을 측정한 그래프이다. 도 4b는 종래 방법인 PEG 및 본 발명의 클로로포름을 각각 처리하여 제조한 구제역 백신을 염소에 반복 접종하여 혈청을 수득한 후 이에 포함되어 있는 구제역 바이러스 중화 항체의 역가를 측정한 그래프이다. 도 4c는 종래 방법인 PEG 및 본 발명의 클로로포름을 각각 처리하여 제조한 구제역 백신을 염소에 반복 접종하여 혈청을 수득한 후 효소결합면역측정법(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 키트를 사용하여 비구조 단백질의 항체 형성률을 측정한 그래프이다.
도 5는 PEG와 클로로포름 처리 방법을 적용한 구제역 백신 항원 제조 공정의 흐름과 소요시간을 비교한 모식도이다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 클로로포름 처리에 따른 구제역 바이러스 비구조 단백질 제거 조건 탐색

현재 당업계에 농축 및 정제 방법으로 사용중인 PEG는 단백질의 용해도 감소를 유도하여 단백질 간의 상호 작용이 증가하여 가역적으로 응집되는 원리이고, 이와는 다르게 클로로포름은 유기용매로서 단백질을 비가역적으로 변성하여 침전시키는 특성을 가진다. 일반적으로 클로로포름에 의한 단백질 침전은 아미노산 잔기의 소수성(hydrophobic) 성질에 기인한다. 또한, 클로로포름은 물에 대한 용해도가 낮은 비극성 유기용매로 수용액과 혼합 시 완전하게 층이 분리되어 쉽게 제거가 가능하다.

본 발명자들은 클로로포름을 처리하여 구제역 바이러스 상층액으로부터 비구조 단백질을 제거시키면서, 목적 백신 항원을 고순도/고수율로 제조 및 수득할 수 있는 방법을 확립하고자, 클로로포름을 농도별로 처리하여 구제역 바이러스 상층액으로부터 비구조 단백질이 제거되는 조건을 확인하였다.

먼저, 구제역 바이러스 완전입자를 확보하고자 BHK-21(Baby hamster kidney-21) 세포를 부유 배양하고 목표 세포수에 도달시, 국내에서 분리된 구제역 바이러스(FMDV) O형 보은주(O/Boeun/SKR/2017) 및 안동주(O/Andong/SKR/2010)를 0.001 MOI(Muliplicity of Infection) 농도로 세포에 접종하였다. 이 후, 세포 변성 효과(Cytopathic effect; CPE)가 90% 이상 관찰되었을 때 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 상기 바이러스 상층액에 불활화제로서 3mM 이원성 에틸렌이민(Binaryethyleneimine, BEI)을 첨가하여 26℃에서 28 시간동안 불활화하고 2% 삼황산나트륨(1N Sodium thiosulfate)으로 BEI를 중화하였다. 불활화된 바이러스 상층액 1 ml을 시료로 사용하였다.

O형 보은주 상층액에 6 종의 유기용매(클로로포름(chloroform), 트리클로로에틸렌(trichloroethylene), 이소프로판올(isopropanol), 아세톤(acetone), 펜탄올(pentanol), 부탄올(butanol))를 50% (v/v)로 처리한 후 상온에서 5분간 상하 반전하여 혼합한 후 유기용매가 제거된 상층액에서 비구조 단백질을 확인하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 클로로포름 처리군에서만 유의하게 비구조 단백질이 제거되었다.

이에 따라, 본 발명자들은 클로로포름의 비구조 단백질 제거 효과를 농도별로 확인하였다. O형 보은주와 O형 안동주 상층액에 클로로포름을 0.5, 1, 2, 5, 10% (v/v) 처리한 후 상온에서 5분간 상하 반전하여 혼합하였고, 혼합액은 4,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 수용액과 클로로포름 층을 분리시켰다. 수용액 층을 회수하여 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 후 항-FMDV type O VP1 및 항-FMDV 3B 모노클로날 항체를 이용하여 면역블로팅(western blotting)을 실시하였다.

그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, 구조 단백질(VP1 항체 사용)의 양은 일정하게 유지되는 반면, 비구조 단백질(3B 항체 사용)은 클로로포름 2% 이상(1% 초과)의 농도에서부터 효과적으로 제거되는 것을 확인하였다.

또한, 구제역 바이러스 비구조 단백질이 클로로포름에 의해 특이적으로 제거됨을 확인하고자, 대조군으로서 클로로포름과 화학적 구조가 유사한 트리클로로에틸렌을 농도별로 처리하여 실험을 실시하였다.

그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이, 트리클로로에틸렌의 농도가 증가함에도 불구하고 비구조 단백질(3B 항체 사용)은 일정한 함량으로 검출되는 것을 확인하였다.

또한, 감염력이 있는 구제역 O형 보은주 및 O형 안동주 배양 상층액에 클로로포름 농도를 상기와 동일하게 처리한 후 숙주세포에 감염시켜 바이러스 증식을 관찰하였다.

그 결과, 도 2c에 나타난 바와 같이, 클로로포름의 농도가 증가함에도 구제역 바이러스의 역가는 일정한 수준으로 유지됨을 확인하였다. 이는, O형 보은주 상층액 및 O형 안동주 상층액 모두에서 동일하게 결과를 얻을 수 있었다.

따라서, 상기 결과들은, 모든 종류의 유기용매에서 비구조 단백질 제거 효과가 달성되는 것이 아니며, 국내 FMDV 분리주인 O형 보은주 상층액 및 O형 안동주를 대상으로 했을 때, 선별된 특정 유기용매인 클로로포름이 최적의 농도인 2% 이상일 때 비구조 단백질을 효과적으로 제거하므로, FMDV 정제시 본 발명의 2% 이상의 클로로포름을 이용하는 경우, 고순도의 백신 항원을 수득할 수 있음을 제시한다.

실시예 2. 클로로포름 처리 기법으로 제조한 구제역 백신의 면역원성 확인

본 발명자들은 클로로포름 특정 농도 이상에서 구제역 바이러스 비구조 단백질이 제거되는 것을 확인하였고, 이로써 클로로포름 처리 방법으로 비구조 단백질이 완전하게 제거된 구제역 백신 항원 제조 기법을 확립하였다. 클로로포름을 처리함에 따라 비구조 단백질이 제거되었으므로, 이를 목적 동물에 접종하여 비구조 단백질 항체가 형성되지 않음을 확인하고자 하였다.

이때, 구제역 백신 제조를 위하여 본 발명과 기존의 PEG 농축(침전)방법을 적용하여 구제역 O형 보은주 백신 항원을 제조한 후 이에 포함되어 있는 비구조 단백질 함량을 비교하였다.

구체적으로, FMDV 백신은, 종래 방법인 PEG 침전 방법으로 획득한 PEG 침전-FMDV 백신 항원(비교대조군) 및 클로로포름 처리-FMDV 백신 항원으로 제조되었다. 불활화된 바이러스 배양 상층액은 앞서 상술한 방법으로 획득하고 다음 절차를 실시하였다.

PEG 침전-FMDV 백신 항원의 경우 상층액을 7.5% (w/v) PEG 6,000 (Sigma-Aldrich, St. Louis. MO, USA)으로 처리하고 밤새 4℃에서 교반한 다음 10,000 x g에서 30 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, 펠릿을 Tris-KCl 완충액 (pH 7.6)에 재현탁하고 15μg/mL의 농도로 조정하였다.

클로로포름 처리-FMDV 백신 항원의 경우 상층액을 5 분 동안 뒤집어 10% (v/v) 클로로포름과 혼합하고 3,134 x g에서 15 분 동안 원심분리하였다. 유기 용매층 상부의 수성층을 수확하고 300 kDa 폴리에테르설폰 막(Millipore, Billerica, USA)의 분자량 컷오프에 연결된 한외 여과 장치에 의해 최종 농도 15 μg/mL로 농축하였다.

이 두 종류의 항원에 사포닌(Sigma-Aldrich) 및 수산화 알루미늄 겔 (General Chemical, NJ, USA)을 첨가한 다음 30℃에서 예열한 ISA 206 VG 보조제(Seppic, Paris, France)를 1:1 비율로 첨가하였다. 혼합물을 빛으로부터 차단하고 수조에서 1 시간 동안 20℃에서 인큐베이션한 후 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, O형 보은주 상층액을 PEG와 클로로포름 처리하여 농축한 후 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 및 면역블로팅(western blotting)을 실시했을 때, PEG 처리된 구제역 백신 항원에서는 비구조 단백질(3B 항체 사용)이 잔존하여 여전히 검출되는 반면, 클로로포름 처리된 구제역 백신 항원에서는 최대 100배로 농축하였음에도 비구조 단백질 (3B항체 사용)이 검출되지 않아 모두 제거되었음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 방법을 이용하는 경우, 종래 방법에 비해 비구조 단백질이 모두 제거되어 구제역 백신 항원의 순도가 탁월하게 향상되었음을 알 수 있다.

또한, 본 발명자들은 본 발명의 클로로포름 처리 방법을 이용하여 비구조 단백질만을 선택적으로 제거하는 조건으로 제작된 구제역 백신 항원의 순도를 확인하기 위해, 면역원성이 가장 높은 염소를 대상으로 하여 PEG-처리 백신(2 ml/dose)과 클로로포름-처리 백신(2 ml/dose)을 각 10 마리에 4 주 간격으로 총 3회 근육 접종하였고, 접종 후 4 주마다 채혈하여 혈청을 회수하였다. 효소결합면역측정법(ELISA) 키트를 통해 비구조 단백질 및 구조 단백질의 항체 형성률(percentage inhibition, PI)을 측정하였고, 바이러스 중화시험을 통해 중화항체 역가를 측정하였다.

그 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이, PEG 및 클로로포름 처리군은 모두 1회 접종 이후 PI 평균값이 최대치에 도달하여 정점을 유지하였고, 두 그룹간에 차이가 없었다.

따라서, 클로로포름 처리 구제역 백신은 종전의 PEG 처리 백신과 비교하여 동일한 면역 효과를 가지는 것을 확인하였다.

또한, 도 4b에 나타난 바와 같이, PEG 및 클로로포름 처리군은 1회 접종 이후 모든 개체가 중화항체 양성으로 나타났으며, 2회 접종 후부터 PI 평균값은 정점을 유지하였고, 두 그룹간에 차이가 없었다.

따라서, 클로로포름 처리 구제역 백신은 종전의 PEG 처리 백신과 비교하여 동일한 수준의 구제역 바이러스 중화 항체를 형성함을 확인하였다.

또한, 도 4c에 나타난 바와 같이, PEG 처리군의 NSP 항체 양성수는 2회 접종시 20%(n=2/10), 3회 접종시 40% (4/10)였으며, 클로로포름 처리군 비구조 단백질 항체 양성수는 모두 음성으로 PEG 처리군과 비교할 때 현저히 낮았다. PEG 처리군의 평균 PI 값은 1회 접종이후 점차적으로 증가한 반면에 클로로포름 처리군의 평균 PI 값은 3회 접종 때까지도 증가하는 양상이 없었다.

또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 클로로포름 처리 방법을 사용할 경우, 통상적으로 사용되는 PEG 농축 방법의 구제역 백신 항원 제조 공정과 비교하여 소요시간을 약 2일 단축할 수 있다.

이를 종합해 보면, 구조 단백질 항체 양성률에 있어서는 두 가지 처리군이 동등하였으나, 클로로포름 처리군이 PEG 처리군보다 비구조 단백질 항체 형성률이 현저히 낮아서(^*** P < 0.001) 백신 순도가 상대적으로 훨씬 우세함을 입증한다.

이로써 구제역 백신 항원에 포함되어 있는 비구조 단백질을 완전하게 제거함과 동시에 백신 항원의 생산 수율을 증가시키는 클로로포름 처리 방법을 확립하였다.

또한, 이는 면역원성이 가장 높은 염소에서 도출된 결과이므로 다른 목적 대상, 즉, 돼지나 소에게 백신을 접종 시에도 비구조 단백질 항체가 검출되지 않음을 보장할 수 있다.

종래 당업계에서는 구제역 바이러스 농축 및 정제를 위하여 PEG를 사용하고 있으나, 이는 비구조 단백질을 완전하게 제거하지 못하므로 목적 동물에 반복 접종시 비구조 단백질 항체를 유도하는 문제점이 발생하였다. 이는 구제역 백신 접종축과 자연감염축의 감별 진단에 혼란을 야기하여 구제역 바이러스 순환의 상시적 모니터링에 어려움을 준다.

또한, 불활화 구제역 바이러스를 항원으로 하는 구제역 백신은 매우 우수한 면역 효과를 보여주어 상용화시 높은 활용가치가 있으나, 상용화를 위해서는 백신 항원 제조에 소요되는 비용이 백신 완제품 가격 상승의 요인이 되므로, 백신의 가격 경쟁력 확보를 위해서 백신 항원의 생산 비용을 최소화하는 것이 중요한 과제로 남아있다.

구제역 백신의 생산 과정에서는 백신 항원의 순도 확보를 위한 정제 과정을 거쳐야 하며, 이 과정에서 대상 항원의 수율 감소는 빈번하게 일어난다.

따라서, 정제 과정에서 구제역 백신 항원의 수율을 확보하는 것은 최종 생산되는 백신의 생산 비용에 중요한 영향을 미치는 요인이다.

이에, 상술한 문제점들을 해결하기 위해 클로로포름 처리 방법을 확립함으로써, 구제역 바이러스의 최종 항원으로 유효한 단백질인 구제역 바이러스 입자(146S)를 온전하게 보존 및 유지하면서, 비구조 단백질을 기존 방법보다 더 완전하게 제거하였고, 구제역 바이러스 입자(146S) 항원의 생산 수율(회수율)을 현격하게 증가시켰을 뿐만 아니라, 통상적으로 사용되는 PEG 농축 방법의 구제역 백신 항원 제조 공정과 비교하여 소요시간을 약 2일 단축할 수 있다.

결론적으로, 클로로포름을 처리하는 구제역 백신 항원 제조 공정은 시간 및 경제적 측면에서 높은 효율성을 제공하며, 비구조 단백질이 효과적으로 제거하여 백신에 잔존하지 않도록 하는 강한 이점을 가진다.

이에, 최종적으로 비구조단백질만을 선택적으로 제거할 수 있어, 백신을 대상축에 3회 이상 접종하더라도 비구조단백질 항체를 유도하지 않으므로 혈청 예찰시 감염축과 백신축의 감별에 혼란이 야기될 우려가 없다.

따라서, 본 발명은 기존 농축 및 정제 방법의 백신 항원 회수율을 보장하면서도 백신 항원의 순도를 향상시키도록 개선된 방법을 제공함으로써 구제역 백신의 국산화 기술로 활용하여 백신의 품질 경쟁력 제고에 기여할 수 있다.

Claims (5)

1. 다음 단계를 포함하며, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 처리과정을 불포함하는 것을 특징으로 하는, 국내형 O형 보은주 및 안동주 구제역 바이러스 백신 항원의 순도 증가 방법:
   (a) 국내형 O형 보은주 및 안동주 구제역 바이러스의 상층액을 획득하여 불활화시키는 단계;
   (b) 상기 (a) 단계의 불활화된 국내형 O형 보은주 및 안동주 구제역 바이러스 상층액에 2 내지 10%(v/v) 클로로포름(chloroform)을 첨가하는 단계; 및
   (c) 상기 클로로포름 혼합액으로부터 수용액 층을 분리 및 농축하여, 비구조 단백질(NSP; Non Structural Protein)이 제거되어, 순도가 증진된 완전 입자 형태(146S)의 구제역 바이러스 백신 항원을 획득하는 단계.
   
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