RU2815541C1

RU2815541C1 - Вакцина против ящура генотипа SAT-2/IV культуральная инактивированная сорбированная

Info

Publication number: RU2815541C1
Application number: RU2023112453A
Authority: RU
Inventors: Максим Игоревич Доронин; Дмитрий Валерьевич Михалишин; Алексей Валерьевич Борисов; Татьяна Владимировна Оковытая; Олеся Олеговна Будина; Евгения Александровна Разгуляева; Виктор Викторович Никифоров
Filing date: 2023-05-11
Publication date: 2024-03-18

Abstract

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Предложена вакцина против ящура инактивированная сорбированная культуральная. Вакцина состоит из активного вещества в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером: №452-деп/23-2 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 4,5 мкг; из адъюванта гидроокиси алюминия - 10%-ный коллоидный раствор с содержанием 47% по объему 4,7% в пересчете на сухое вещество, сапонина в количестве 1,8 мг, поддерживающей среды - до 2,0 см³. Вакцина обладает высокой иммуногенностью и способна обеспечить эффективную защиту от гомологичного возбудителя инфекции, циркулирующего в странах Африки и Ближнего Востока. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 14 пр.

Description

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура генотипа SAT-2/IV культуральной инактивированной сорбированной.

Ящур - острое вирусное заболевание животных, характеризующееся интоксикацией и везикулезно-эрозивным поражением слизистых оболочек ротовой и носовой полости, а также кожи межпальцевых складок и околоногтевого ложа [1, 2, 3, 4].

В настоящее время выделяют 7 серотипов вируса ящура: О, А, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2 и SAT-3. Каждый серотип генетически разделен на различные топотипы, генетические линии и сублинии. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности ID-гена (белок VP₁), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [1]. Вирус ящура серотипа SAT-2 имеет большую изменчивость последовательности в гене белка VP₁ по сравнению с вирусами серотипов О, А и С [2, 3], для которых он рассматривается как широкий антигенный вариант, поэтому в случае SAT-2 требуется тщательный отбор иммунодоминантного вакцинного штамма [3].

В пределах семи серотипов были описаны более 60 генетических линий и сублиний. Важность их знания заключается в том, что требуется очень тщательно подбирать вакцину, которая должна быть адаптирована именно к интересующему генотипу. Восстановление после переболевания животным каким-либо одним серотипом не обеспечивает иммунную защиту против другого серотипа и даже некоторых других генетических линий [3]. Антигенные характеристики вируса, связанные с появлением новых штаммов, важны для характеристики вспышек и поиска оптимальных вакцинных препаратов [4, 6].

Для вируса ящура серотипа SAT-2 характерна генетическая изменчивость, а именно он включает в себя следующие 14 топотипов (I-XIV), внутри которых, за исключением топотипа VII, нет разделения на генетические группы. Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа SAT-2 [5-11].

По причине легкого и быстрого распространения возбудителя ящура данное заболевание может приобретать размах эпизоотий [12]. С целью недопущения возникновения болезни в хозяйствах Российской Федерации применяется система мероприятий по борьбе и профилактике ящура, которая направлена на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной зоне, а также проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных.

Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса, гомологичного полевым изолятам [6-13]. Данная инфекция продолжает оставаться значимой экономической проблемой во всем мире. Для проведения эффективной кампании по вакцинации нужно наличие эффективной, безопасной вакцины, содержащей в качестве иммуногенной части антиген вируса, соответствующей эпизоотическому распространяющемуся изоляту определенного генотипа [14]. Создание подобных вакцин является актуальной задачей. Достижение данной цели позволит эффективно применять вакцину в неблагополучном пункте и угрожаемой зоне для формирования иммунитета против конкретного генотипа вируса ящура.

На территории Африканского континента регистрируются вспышки ящура серотипа SAT-2. Преимущественно эпизоотическая ситуация была связана с генотипами SAT-2/VII/Alx-12 и SAT-2/VII/Lib-12, которые распространены в странах Северной Африки, в частности, в Египте, где вспышки отмечают в период с 2012 по 2022 гг. и Либии (2012 г. ). На территории Западной Африки, в частности в Камеруне (2014 г. ), Нигерии (2019-2021 гг.), также преимущественно распространены изоляты вируса ящура генотипов SAT-2/VII/Alx-12 и SAT-2/VII/Lib-12. Соответственно, в указанных странах проводились мероприятия по ликвидации и борьбе с ящуром указанных генотипов. Но при этом постепенно с 2012 г. в странах Африканского континента и преимущественно на Востоке материка (Бурунди, Кения, Танзания и другие страны) стали появляться изоляты вируса ящура нового топотипа IV. Так, в Кении уже в 2012 и 2013 гг. выделили представителей генотипа SAT-2/IV, далее в Танзании в 2013 г. была сильная вспышка, вызванная вирусом данного варианта. В 2017 г. сложная эпизоотическая ситуация по ящуру генотипа SAT-2/IV отмечали в Кении, в 2020 г. - в Уганде, в 2022 г. - в Бурунди. Прогнозы экспертов неутешительны в отношении распространения данного варианта вируса ящура. Следует отметить, что в последние годы усилились торгово-экономические связи со странами Африканского континента, в частности, Восточной Африки. Имеются риски заноса изолятов данного серотипа на территорию Российской Федерации и других стран.

Анализируя вспышки, которые регистрировались на территории Африки, обнаружено, что были выявлены изоляты всех топотипов серотипа SAT-2, в частности, I («SAT-2/ZIM/14/2002»), II («SAT-2/ZIM/5/81»), III («SAT-2/BOT/P3/98»), IV («SAT-2/ETH/l/90»), V («SAT-2/GHA/2/90»), VI («SAT-2/GAM/8/79»), VII («SAT-2/SAU/6/2000»), VIII («SAT-2/RWO/1/00»), IX («SAT-2/KEN/2/84»), X («SAT-2/UGA/19/98»), XI («SAT-2/ANG/4/74»), XII («SAT-2/UGA/51/75»), XIII («SAT-2/ETH/2/2007»), XIV («SAT-2/ETH/2/9»l).

Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа SAT-2, которые применяются или использовались ранее в мире для производства средств специфической профилактики ящура: «SAT-2/ZIM/14/2002», «SAT-2/ZIM/5/81», «SAT-2/BOT/P3/98», «SAT-2/ETH/1/90», «SAT-2/GHA/2/90», «SAT-2/GAM/8/79», «SAT-2/SAU/6/2000», «SAT-2/RWO/1/00», «SAT-2/KEN/2/84», «SAT-2/UGA/19/98», «SAT-2/ANG/4/74», «SAT-2/UGA/51/75», «SAT-2/ЕТН/2/2007», «SAT-2/ETH/2/91».

Изолят «SAT-2/KEN/19/2017» вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории населенного пункта Rongai в регионе Nakuru Республики Кения в 2017 году и поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для проведения научных исследований в 2022 г.

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный изолят принадлежит к топотипу IV серотипа SAT-2 вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура типа SAT-2, в том числе штамма «SAT-2/ETH/1/90».

Торгово-экономические взаимоотношения между Россией и странами Африканского континента, показывают опасность возникновения ящура в РФ, следовательно появляется проблема возможной экстренной профилактики данного заболевания для формирования иммунитета у восприимчивых животных. Таким образом, возникла необходимость разработать новую вакцину против ящура генотипа SAT-2/IV культуральную инактивированную сорбированную для обеспечения биологической безопасности территории Российской Федерации и сопредельных государств.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная сорбированная против ящура серотипа SAT-2 (штамм «SAT-2/ETH/1/90»), содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного культурального антигенного материала из гомологичного возбудителю ящура штамма «SAT-2/ETH/1/90», полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде гидроокиси алюминия и сапонина (адъювант): концентрация антигена (инактивированные 146S+75S компоненты вируса ящура) не менее 3,0 мкг/см³, содержание 10% раствора гидроокиси алюминия - 50% по объему, концентрация сапонина - 1,5 мг/см³, добавка в виде поддерживающей среды - до 1,0 см³ (прототип) [15].

В качестве чувствительной биологической системы для репродукции вируса ящура используют перевиваемую суспензионную клеточную линию почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21, в качестве поддерживающей среды применяют среду Игла DMEM без внесения сыворотки, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого при рН среды 7,4-7,6.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ). При изготовлении сорбированной вакцины в качестве адъюванта служит гидроксид алюминия (Al(ОН)₃). Очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей осуществляют с применением полигексаметиленгуанидин гидрохлорида (ПГМГ) [16].

Авирулентный и очищенный инактивированный антигенный материал из штамма вируса ящура серотипа SAT-2 представляет собой суспензию, состоящую из 146S+75S компонентов вируса ящура, то есть полных иммуногенных частиц и «пустых» капсидов.

Существенный недостаток вакцины-прототипа состоит в его очень низкой иммуногенной активности относительно изолятов вируса ящура генотипа SAT-2/IV, циркулирующих в странах Африки и Ближнего Востока. Кроме того, в прототипном варианте вакцины учитывается сумма компонентов 146S и 75S, при этом полноценными иммуногенными свойствами обладают только 146S частицы, которые являются полными вирионами, несущими абсолютно все иммуногенные сайты и структурные вирусные белки и вирусную РНК [17].

Для решения этой проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка вакцины против ящура генотипа SAT-2/IV культуральной инактивированной сорбированной.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала инактивированных культуральных сорбированных вакцин для защиты животных против изолятов и штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 и, в частности, генотипа SAT-2/IV.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ящура генотипа SAT-2/IV культуральной инактивированной сорбированной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.

Разработанная вакцина в 2,0 см³ препарата содержит следующие основные компоненты:

1) активное вещество в виде авирулентного и очищенного 146S компонента из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV вируса ящура, репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 4,5 мкг;

2) гидроксид алюминия 10%-ный коллоидный раствор с содержанием 47% по объему (4,7% в пересчете на сухое вещество),

3) сапонин в количестве 1,8 мг,

4) поддерживающая среда - до 2,0 см³.

Штамм «SAT-2/Кения/19/2017», который получен из изолята «SAT-2/ KEN/19/2017», депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером: №452 - деп/23-2 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным клеткам линии свиной почки (СП) и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21 /SUSP/ARRIAH), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют предпочтительно перевиваемую суспензионную культуру клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, а в качестве поддерживающей среды применяют среду Игла DMEM без внесения сыворотки, но с добавлением гидролизата белков крови в количестве 5% от общего объема при рН среды 7,50-7,70. Инактивацию вируса проводят с использованием аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с концентрацией 0,022% от объема вируссодержащей суспензии. Инактивированный вирус очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,015% от общего объема.

Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура представляет собой суспензию, содержащую преимущественно инактивированный 146S иммуногенный компонент вируса ящура. Содержание компонента в продукте оценивают с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [18]. Для приготовления вакцины используют вирусный материал, содержащий в 2,0 см³ не менее 4,5 мкг инактивированных иммуногенных 146S частиц вируса ящура. Необходимую концентрацию иммуногенного компонента в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена с помощью сорбирования на поверхности коллоидных частиц гидроксида алюминия.

Вакцину против ящура из штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV культуральную инактивированную сорбированную получают путем смешивания очищенного антигена (инактивированный 146S иммуногенный компонент) и 10% суспензии гидроксида алюминия в соотношении 53% на 47% по объему, соответственно. Для усиления иммунного ответа используют сапонин в количестве 1,8 мг в дозе. Полученная вакцина представляет собой суспензию, содержащую частицы не растворимого в воде гидроокиси алюминия, несущие на своей поверхности инактивированные 146S частицы вируса ящура, которые обеспечивают формирование иммунитета у животных.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против ящура генотипа SAT-2/IV культуральная инактивированная сорбированная.

2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю заболевания штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV вируса ящура в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный 146S компонент штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV вируса ящура в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV вируса ящура, полученный в суспензионной перевиваемой клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую предпочтительно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в эффективном количестве.

2. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV вируса ящура, полученный в суспензионной перевиваемой культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в количестве не менее 4,5 мкг в 2,0 см³готового вакцинного препарата.

3. Из целевых добавок вакцина содержит адъювант.

4. Из целевых добавок вакцина содержит адъювант - гидроксид алюминия в комплексе с сапонином.

5. Вакцина содержит адъювант - гидроокись алюминия 4,7% в пересчете на сухой остаток в комплексе с сапонином в концентрации 1,8 мг в 2,0 см³ готового препарата.

6. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV вируса ящура, полученного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21 /SUSP/ARRIAH, адъювант - гидроксид алюминия и сапонин, добавка в готовом препарате в виде поддерживающей среды в следующих количествах:

Авирулентный и очищенный антиген штамма
«SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV
вируса ящура	не менее 4,5 мкг
Гидроокись алюминия	4,7% (в пересчете на сухое вещество)
Сапонин	1,8 мг
Поддерживающая среда	до 2,0 см³

Предлагаемая вакцина против ящура генотипа SAT-2/IV культуральная инактивированная сорбированная обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против изолятов вируса ящура генотипа SAT-2/IV, циркулирующего в странах Африки и Ближнего Востока.

Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой противоящурной вакцины в качестве активного вещества введен инактивированный 146S компонент штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV вируса ящура, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против изолятов вируса ящура представленного генотипа, которые в последние годы широко вызывают вспышки заболевания в странах Африки и Ближнего Востока.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Положение штамма «SAT-2/Кения/19/2017» на филогенетическом древе вируса ящура серотипа SAT-2. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP₁). Штамм выделен красным цветом и обозначен «SAT-2/KEN/19/2017».

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP₁штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура генотипа SAT-2/IV;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP₁ штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура генотипа SAT-2/IV.

Штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура серотипа SAT-2 относится к отряду Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, виду Foot-and-Mouth Disease Virus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 20 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной молекулы РНК с позитивным смыслом, заключенной в белковую оболочку.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура относится к серотипу SAT-2. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой и не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура ID-гена белка VP₁ штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура принадлежит к генотипу SAT-2/IV.

Антигенное родство (r₁) штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура изучено в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм («SAT-2/ZIM/l4/2002») (генотип SAT-2/I),

- штамм («SAT-2/ZIM/5/81») (генотип SAT-2/II),

- штамм («SAT-2/BOT/P3/98») (генотип SAT-2/III),

- штамм («SAT-2/ETH/1/90») (генотип SAT-2/IV),

- штамм («SAT-2/GHA/2/90») (генотип SAT-2/V),

- штамм («SAT-2/GAM/8/79») (генотип SAT-2/VI),

- штамм («SAT-2/SAU/6/2000») (генотип SAT-2/VII),

- штамм («SAT-2/RWO/1/00») (генотип SAT-2/VIII),

- штамм («SAT-2/KEN/2/84») (генотип SAT-2/IX),

- штамм («SAT-2/UGA/19/98») (генотип SAT-2/X),

- штамм («SAT-2/ANG/4/74») (генотип SAT-2/XI),

- штамм («SAT-2/UGA/51/75») (генотип SAT-2/XII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/2007») (генотип SAT-2/XIII),

- штамм («SAT-2/ETH/2/91») (генотип SAT-2/XIV)

в реакции микронейтрализации (РМН). Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [19].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются близкородственными;

при <0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-2/Кения/19/2017» составили r₁ от 0,02 до 0,25, а именно для штамма «SAT-2/ZIM/l4/2002» (генотип SAT-2/I) - 0,23, для «SAT-2/ZIM/5/81» (генотип SAT-2/II) - 0,21, для «SAT-2/BOT/P3/98» (генотип SAT-2/III) - 0,22, для «SAT-2/ETH/1/90» (генотип SAT-2/IV) - 0,25, для «SAT-2/GHA/2/90» (генотип SAT-2/V) - 0,19, для «SAT-2/GAM/8/79» (генотип SAT-2/VI) - 0,15, для «SAT-2/SAU/6/2000» (генотип SAT-2/VII) - 0,10, для «SAT-2/RWO/l/00» (генотип SAT-2/VIII) - 0,14, для «SAT-2/KEN/2/84» (генотип SAT-2/IX) - 0,09, для «SAT-2/UGA/19/98» (генотип SAT-2/X) - 0,06, для «SAT-2/ANG/4/74» (генотип SAT-2/XI) - 0,18, для «SAT-2/UGA/51/75» (генотип SAT-2/XII) - 0,02, для «SAT-2/ETH/2/2007» (генотип SAT-2/XIII) - 0,13, для «SAT-2/ЕТН/2/9»1 (генотип SAT-2/XIV) - 0,12.

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-2. Антигенное родство штамма «SAT-2/Кения/19/2017» со штаммом «SAT-2/ЕТН/1/90» (генотип SAT-2/IV) составило 0,25, при <0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма. Хотя они оба принадлежат к генотипу SAT-2/IV исследования подтверждают генетические изменении, мутации штамма «SAT-2/Кения/19/2017». Обоснованно возникает потребность в создании вакцины против ящура генотипа SAT-2/IV культуральная инактивированная сорбированная из штамма «SAT-2/Кения/19/2017».

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура является РНК(+) -содержащим вирусом с молекулярной массой 8,08×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, выделяют РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации РНК для сборки вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Плавучая плотность 1,44 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура устойчив к детергентам и органическим растворителям, таким как эфир, хлороформ, фреон, ацетон. Наиболее стабилен при рН 7,4-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,3°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм «8АТ-2/Кения/19/2017» вируса ящура по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура генотипа SAT-2/IV.

Для снижения эпизоотической опасности возникновения ящура, вызванного генотипом SAT-2/IV, и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки новой высокоиммуногенной и эффективной вакцины.

Получена высокоиммуногенная и эффективная вакцина против ящура генотипа SAT-2/IV культуральная инактивированная сорбированная.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Генетическая характеристика штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура.

Проведенные исследования методами ПЦР и нуклеотидного секвенирования заключались в изучении первичной структуры гена 1D (белок VP₁) (648 н.о.) штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура методом Сенгера и определении положения данного штамма на филогенетическом древе вируса ящура серотипа SAT-2. Метод основан на определении первичной структуры гена 1D (белок VP₁) испытуемого изолята/штамма с последующим анализом филогенетического родства с другими изолятами вируса ящура серотипа SAT-2. Провели сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 1D, кодирующего белок VP₁ вируса ящура вакцинного штамма «SAT-2/Кения/19/2017», с другими изолятами и штаммами. Последовательность нуклеотидов гена белка VP₁ штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV вируса ящура представлена SEQ ID NO:1. Последовательность аминокислот ID-гена, кодирующего белок VP₁штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV вируса ящура отражена на SEQ ID NO:2.

Проведен филогенетический анализ штамма «SAT-2/Кения/19/2017». Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA6 и алгоритма Neighbor-Joining [20]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (300 повторов), показан рядом с ветвями [21, 22]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [23] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 15 нуклеотидных последовательностей, в том числе последовательность ID-гена штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). В окончательном наборе данных было всего 648 позиций. Эволюционный анализ проводился в MEGA 6 [24].

В результате проведенной работы по сравнению полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP₁) штамма «SAT-2/Кения/19/2017» и других изолятов/штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 определено положение исследуемого штамма на филогенетическом древе (фиг. 1).

По результатам всего анализа сделали вывод, что исследуемый штамм «SAT-2/Кения/19/2017» относится к серотипу SAT-2 топотипу IV, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.

Пример 2. Адаптация штамма «SAT-2/Кения/19/2017» к перевиваемой монослойной культуре клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30.

Для заражения перевиваемой монослойной культуры клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30 использовали 20%-ную афтозную суспензию вируса ящура, полученную из афт КРС (2 пассаж). Посевная концентрация клеток составляла 0,15-0,20 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,01 ТЦД₅₀/кл. По результатам исследования репродукция вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» проходила при специфическом разрушении монослоя на 90-100% за 19-22 ч. В течение 6 последовательных пассажей отмечали рост значений титра инфекционной активности вируса от 5,15±0,10 до 7,20±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Максимальное значение титра инфекционной активности вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (7,20±0,10 lg ТЦД₅₀/см³). Концентрация 146S частиц с 1 по 6 пассажи изменялась с 0,15±0,01 до 0,72±0,01 мкг/см³. При этом наибольшее количество 146S компонента отмечали на этапе 6 пассажа (0,72±0,01 мкг/см³). Степень достоверности (R²) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ колебалась от 97,11 до 99,94%. Таким образом, на протяжении 6-ти последовательных пассажей была успешно проведена адаптация штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура к перевиваемой монослойной клеточной линии ПСГК-30.

Пример 3. Изучение условий монослойного культивирования вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/ 19/2017» в промышленных масштабах.

В процессе промышленного культивирования штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 осуществляли подбор оптимальных условий культивирования вируса, анализируя разный состав поддерживающей среды, температурный фактор и дозу заражения клеток (n=5).

На первом этапе исследования оценивали влияние состава поддерживающей среды на репродукцию штамма «8АТ-2/Кения/19/2017» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 в масштабах производства (на этапе с 5 на 6 пассажи). Для сравнения применяли три среды с добавлением 2,5% фетальной сыворотки крови телят: 1) среда Игла DMEM; 2) среда RPMI-1640; 3) раствор Хэнкса с 5,0% гидролизата белков крови. Посевная концентрация клеток составляла 0,15-0,20 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,1000-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли при температурах 35±0,2 - 38±0,2°С до разрушения клеточного монослоя на 90-100% в течение 18-24 ч. Результаты репродукции штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура с поддерживающими средами разного состава отражены в таблице 1.

Из данных таблицы 1 видно, что при репродукции штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 с применением поддерживающих сред разного состава, оптимальной является среда «раствор Хэнкса с 5% гидролизата белков крови и 2,5% фетальной сыворотки крови КРС», позволяющая за 16-17 ч достичь специфического разрушения клеточного монослоя на 95-100% с накоплением в полученной суспензии 146S компонента в количестве 0,72±0,01 мкг/см³ и титром инфекционной активности 7,20±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. При использовании среды «RPMI-1640» и «Игла DMEM+2,5% S_KPC» показатели репродукции вируса были ниже.

На следующем этапе изучения условий монослойного культивирования штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в условиях производства оценивали влияние на процесс репродукции вируса температурного фактора. Для этого культивирование вируса проводили в среде «раствор Хэнкса с 5% гидролизата белков крови и 2,5% фетальной сыворотки крови КРС» при следующих температурах: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом ящура составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли до разрушения клеточного монослоя на 80-100% в течение 16-35 ч (табл. 1). По итогам исследования выявили, что для полной репродукции штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой за 16-17 ч развитие ЦПД достигало 95-100% с накоплением 146S частиц, равным 0,72±0,01 мкг/см³ и титром инфекционной активности вируса 7,20±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Оценивали влияние дозы заражения монослоя клеток линии ПСГК-30 штаммом «SAT-2/Кения/19/2017» при культивировании в масштабах производства. Для этого использовали разные дозы вируса: 0,10-0,01; 0,010-0,001; 0,0010-0,0001 ТЦД₅₀/кл. В качестве поддерживающей среды применяли среду «раствор Хэнкса с 5% гидролизата белков крови и 2,5% фетальной сыворотки крови КРС». Репродукцию вируса проводили при температуре 37,0±0,2°С в течение 16-17 ч до специфического разрушения клеток на 90-100%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S компонента и титр инфекционной активности вируса ящура. Как следует из данных таблицы 1, наибольшее накопление «полных» частиц вируса достигалось при дозе заражения 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл. и составило 0,72±0,01 мкг/см³ с титром инфекционной активности вируса 7,20±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение условий монослойного культивирования штамма «8АТ-2/Кения/19/2017» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в промышленных масштабах. В результате исследования определены следующие оптимальные параметры репродукции штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура в монослойной клеточной линии ПСГК-30: 1) поддерживающая среда - среда «раствор Хэнкса с 5% гидролизата белков крови и 2,5% фетальной сыворотки крови КРС»; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,2°С; 3) доза заражения вирусом-0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 4. Изучение условий суспензионного культивирования штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура в промышленных масштабах.

При промышленном культивирования штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура в перевиваемой суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH проводили поиск оптимальных параметров для успешной репродукции возбудителя ящура, используя разные концентрации клеток, температуру и дозу заражения.

На первом этапе работы определяли влияние посевной концентрации клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии на репродукцию штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура в промышленных масштабах. Для анализа подготовили суспензии со следующими концентрации клеток: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 млн кл./см³. Водородный показатель рН поддерживали в диапазоне 7,52-7,72. Температура культивирования вируса составляла 37,0±0,02°С, доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД50/КЛ. Репродукцию вируса проводили до специфической гибели клеток на 95-100%, которая осуществлялась в течение 11-13 ч. Результаты суспензионного культивирования штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура в суспензии с разными концентрациями клеток представлены в таблице 2.

Как следует из таблицы 2, при культивировании вируса ящура штамма «8АТ-2/Кения/19/2017» в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разными концентрациями клеток, определили, что накопление 146S компонента в суспензии с концентрацией клеток 2,5 млн кл./см³ составило 0,49±0,03 мкг/см³, с концентрацией 3,0 млн кл./см³ - 0,80±0,03 мкг/см³, с концентрацией 3,5 млн кл./см³ - 1,25±0,03 мкг/см³, и с концентрацией 4,0 млн кл./см³ - 1,13±0,03 мкг/см³. Как следует из полученных данных для репродукции штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура оптимальной и достаточной с точки зрения результата и экономической целесообразности является концентрация клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии, равная 3,5 млн кл./см³. Значение титра инфекционной активности вируса при этом составило 8,75±0,10 lg ТЦД₅₀/см₃.

На следующем этапе работы исследовали влияние фактора температуры на суспензионное культивирование штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура в культуре клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Для этого репродукцию вируса проводили при следующих температурных условиях: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Водородный показатель рН вирусной суспензии поддерживали в диапазоне 7,50-7,70. Культивирование вируса проводили до ЦПД, равного 90-100%, в течение 13-32 ч. По результатам анализа определили, что для полной репродукции штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой в течение 13-14 ч наблюдается специфическая гибель клеток на 95-100% с высоким накоплением 146S компонента (1,25±0,03 мкг/см³) и титром инфекционной активности вируса 8,75±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

В ходе работы по изучению условий суспензионного культивирования штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура в промышленных масштабах с применением культуры клеток ВНК-21 /SUSP/ARRIAH оценивали влияние дозы заражения клеток. Для этого клеточные суспензии заражали вирусом в разных дозах: 0,10-0,01; 0,01-0,001; 0,001-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса осуществляли при температуре 37,0±0,2°С в течение 13-20 ч до цитопатического действия, равного 90-95%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S частиц и титр инфекционной активности вируса ящура. Как видно из данных таблицы 2, наибольшее накопление 146S компонента отмечали при дозе заражения 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. (1,25±0,03 мкг/см³) с титром инфекционной активности вируса, равным 8,75±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение параметров суспензионного культивирования штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Выявлены оптимальные условия репродукции штамма «8АТ-2/Кения/19/2017» в суспензионной культуре клеток ВНК-21: 1) концентрация клеток перед заражением - 3,5 млн кл./см³; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,2°С; 3) доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 5. Инактивация суспензии вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017».

По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования (37,0±0,2°С), в вируссодержащую суспензию добавляли подкисленный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с рН, равным 8,2-8,6. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,022%. Инактивацию инфекционной активности вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» проводили в течение 12 часов при температуре 37,0±0,1°С и рН 7,50-7,70 с перемешиванием.

Для определения времени полной инактивации после добавления АЭЭИ каждый час производили отбор проб. Полученные образцы проверяли на наличие инфекционной активности вируса ящура в первичной культуре клеток почки свиньи СП. Результаты представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, полная инактивация инфекционной активности культурального вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017», репродуцированного в культиваторах, произошла через 6 часов после внесения инактиванта.

Готовые вирусные инактивированные суспензии исследовали в реакции связывания комплемента для оценки содержания в них компонентов вируса. Концентрация 146S компонента составила 1,22±0,03 мкг/см³, a 146S+75S компонента - 1,60±0,03 мкг/см³.

Пример 6. Подбор условий очистки суспензии вируса ящура штамма «SA T-2/Кения/19/2017».

Суспензию вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017», полученную при репродукции в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергают инактивации и очистке. Для получения очищенного антигена вируса ящура использовали полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) с концентрациями 0,012, 0,015 и 0,018%. До и после процесса очистки антигена вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» в количественном варианте реакции связывания комплемента определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов. Результаты анализа отражены в таблице 4.

Как следует из данных таблицы 4, в результате очистки антигена вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» с помощью ПГМГ в концентрации 0,010% отмечали снижение концентрации балластного белка на 14%, иммуногенных компонентов - на 2%. При использовании ПГМГ в концентрации 0,015% наблюдали снижение количества балластного белка на 33%, 146S компонента - на 3%. Применяя ПГМГ в концентрации 0,018% содержание балластного белка уменьшалось на 64%, а иммуногенных компонентов - на 25%. Таким образом, исследуя условия очистки антигена штамма «SAT-2/Кения/19/2017», пришли к выводу о том, что для получения очищенного продукта оптимально использовать ПГМГ с концентрацией 0,015%.

Пример 7. Подбор условий концентрирования суспензии антигена штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура.

Культуральную инактивированною суспензию штамма «SAT-2/Кения/19/2017», полученную с применением суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали концентрированию в 9 раз по объему. Для увеличения концентрации иммуногенных компонентов антигена вируса ящура использовали следующие приемы:

1) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 4 ч;

2) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 12 ч;

3) концентрирование с помощью гидроокиси алюминия (10% коллоидный раствор в количестве 40%, антиген вируса - 60% от общего объема).

До и после процесса концентрирования суспензии антигена вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов в количественном варианте РСК. Результаты исследований представлены в таблице 5.

Как следует из данных таблицы 5, при концентрировании антигена штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура с помощью ПЭГ-6000 в течение 4 ч отмечали увеличение содержания компонентов по сравнению с исходными значениями (до концентрирования) в 6,7 раз. Используя тот же полимер, но повышая время воздействия до 12 ч, увеличили концентрацию компонентов вируса в 8,0 раз. Применяя метод сорбирования с помощью гидроксида алюминия, удалось увеличить количество иммуногенных компонентов антигена штамма «SAT-2/Кения/19/2017» вируса ящура в суспензии в 8,9 раз (от теоретического 9 раз). Таким образом, исследуя условия концентрирования антигена штамма «SAT-2/Кения/19/2017», пришли к выводу о том, что оптимальным способом увеличения концентрации компонентов вируса ящура является метод сорбирования с применением коллоидного раствора гидроксида алюминия.

Пример 8. Подбор адъюванта и соотношения антиген-адъювант.

Для изготовления противоящурной моновалентной сорбированной вакцины из антигена штамма «SAT-2/Кения/19/2017» в качестве адъюванта была выбран гидроксид алюминия в комплексе с сапонином. При изготовлении моновалентной сорбированной вакцины против вируса ящура использовали 4,7% гидроокиси алюминия в пересчете на сухое вещество и сапонин в количестве 1,8 мг в дозе.

Пример 9. Компоновка вакцины против ящура генотипа SAT-2/IV кулътуральная инактивированная сорбированная (предлагаемое изобретение).

Из полученного концентрата антигена вируса ящура штамма «SAT-2/Кения/19/2017» изготовили вакцину против ящура генотипа SAT-2/IV культуральную инактивированную сорбированную с применением в качестве адъювантов гидроокиси алюминия и сапонина. Количество 146S иммуногенного компонента в 1,0 см³ готового антигена составило 10,50±0,03 мкг/см³ (табл. 5).

Пример 10. Иммунизация животных вакциной против ящура генотипа SAT-2/IV культуральной инактивированной сорбированной.

Из полученной вакцины против ящура генотипа SAT-2/IV культуральной инактивированной сорбированной был приготовлен ряд разведений для КРС с 4-х кратным шагом. 15 голов КРС разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. Иммунизирующая доза составляла 2,0 см³. Первую группу КРС (№1-5) иммунизировали вакциной без разведения, вторую группу КРС (№6-10) привили вакциной, разведенной 1/4, третья группа КРС (№11-15) - вакциной, разведенной 1/16. Препарат вводили внутримышечно в среднюю треть шеи. В качестве контроля вируса оставили 2 головы без вакцинации.

Пример 11. Исследование сывороток крови вакцинированных животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура.

Сыворотки крови от КРС, полученные до иммунизации животных, через 14 суток после начала тестирования вакцины на авирулентность и безвредность и на 14 сутки после иммунизации, исследовали на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура с помощью блокирующего варианта иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (МЭБ) [3]. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «Prio CHECK®FMDV NSP ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Полученные результаты исследований отражены в таблице 6, из которой видно, что сыворотки крови животных не содержали антител к неструктурным белкам вируса ящура (значения PI для сывороток крови КРС <50%).

Пример 12. Определение авирулентности и безвредности вакцины против ящура генотипа SAT-2/IV культуральной инактивированной сорбированной.

Для определения авирулентности вакцины на КРС отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно по 0,1 см³. В исследовании использовали КРС массой 250-300 кг. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Данные результаты свидетельствовали об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.

Контроль безвредности продукта на КРС проводили путем внутримышечного введения вакцины в дозе 6,0 см³. Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после иммунизации температура тела животного может повышаться до 41,4°С и удерживаться на этом уровне в течение 1 -2 суток.

По результатам исследований вакцина против ящура генотипа SAT-2/IV культуральная инактивированная сорбированная была безвредна, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.

Пример 13. Изучение иммуногенных свойств вакцины против ящура генотипа SAT-2/IV культуральной инактивированной сорбированной по способности индуцирования вируснейтрализующих антител у естественно восприимчивых животных.

На 21 сутки после введения вакцины против ящура генотипа SAT-2/IV культуральной инактивированной сорбированной у КРС отбирали кровь и проводили исследование полученных сывороток крови в реакции микронейтрализации [3]. Выявлено, что у КРС, иммунизированных вакциной в цельной дозе (5 голов), средние значения титра антител составили 7,90±0,34 log₂ SN₅₀, с разведением 1/4 (5 голов) - 4,40±0,22 log₂ SN₅₀, с разведением 1/16 (5 голов) - 3,40±0,52 log₂ SN₅₀ (табл. 7). Полученные данные реакции микронейтрализации свидетельствуют о том, что после введения вакцины в цельном виде обеспечивается формирование гуморального иммунитета с защитными титрами штаммоспецифических антител (5,5 и более log₂ SN₅₀), что соответствует требованиям международных стандартов [3].

Пример 14. Изучение защитной способности вакцины против ящура генотипа SAT-2/IV культуральной инактивированной сорбированной методом контрольного заражения на естественно восприимчивых видах животных.

Крупный рогатый скот, иммунизированный в количестве 15 голов, вакциной в цельном виде и в разведениях, заражали контрольным штаммом «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV вируса ящура, адаптированного к этим животным в слизистую оболочку языка в дозе 10^4,0 ИД₅₀/0,20 см³ (в две точки по 0,10±0,05 см³). Спустя 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и провели патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения. Первичные афты не учитывали.

Результаты контрольного заражения представлены в таблице 7, из которой следует, что вакцина против ящура генотипа SAT-2/IV культуральная инактивированная сорбированная в цельном виде и в разведении 1/4, введенная в однократной дозе (2,0 см³) защищает КРС от заражения гомологичным штаммом всех животных (5 из 5 голов).

Препарат, инокулированный в разведении 1/16, защитил 4 из 5 животных. По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 24,25 ПД₅₀ и 0,08 ИМД₅₀ для КРС.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина против ящура генотипа SAT-2/IV культуральная инактивированная сорбированная, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина против ящура генотипа SAT-2/IV культуральная инактивированная сорбированная обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура серотипа SAT-2 генотипа SAT-2/IV, циркулирующего в странах Африки и Ближнего Востока.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина против ящура генотипа SAT-2/IV культуральная инактивированная сорбированная»:

1. Ящур. Меры профилактики. URL: http://89.rospotrebnadzor.ru /directions/epid_nadzor/146902 (Дата обращения: 03.09.2022).

2. Опасность болезни ящура. URL: https://vet.astrobl.ru/press-release/opasnost-bolezni-yashchura (Дата обращения: 14.08.2022).

3. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. - Paris, 2015-Vol.1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.

4. Бурдов A.H., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.

5. Пономарев А.П., Узюмов В.Л., Груздев К.Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

6. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

7. Brown F. A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strateies: Proc. Jnt. Symp.2-5. June 2002, Lyons, France. - Paris, 2003. - p.13-21.

8. Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in 7 days and partial protection in 4 days: Use in emergency outbreak response / T.G. William, J. M. Pachecoa, T. Doel [et al.] // Vaccine. - December 2005. - V. 23. - P. 5775-5782.

9. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

10. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

11. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - URL: http://www.wrlfmd.org/ref_labs/fmd_ref_lab_reports.htm (Дата обращения 14.08.2022).

12. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. - V. 16. - P. 746-754.

13. Рахманов A.M. Современная эпизоотическая ситуация в мире по ящуру и меры ее контроля //Ветеринарная медицина мiжвiд. тем. наук. Харкiв, 2013. - С. 37-38.

14. Longjam N., Тауо Т. Antigenic variation of Foot and Mouth Disease Virus // Vet. World. - 2011. - Vol.4(10). - P. 475-479.

15. Мельник P.H., Хаустова H.B., Мельник H.B., Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Святенко М.С., Литенкова И.Ю. Антигенная вариабельность вируса ящура серотипа А и обоснование необходимости получения новых актуальных производственных штаммов/ Ветеринария и кормление. - 2019. - №3. - С. 29-31.

16. Paton D.J., Sumption К.J., Charleston В. Options for control of foot-and-mouth disease: knowledge, capability and policy/ Phil. Trans. R. Soc. В (2009) 364. - P. 2657-2667.

17. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

18. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Утв. 21.09.17.

19. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017. - 24 с.

20. Saitou N. and Nei М. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-42.

21. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791.

22. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.

23. Kumar S., Stecher G., Li M, Knyaz C, and Tamura K. (2018). MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549.

24. Barnett P. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - 2002. - V. 25. - P. 345-364.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Vaccine FMD SAT-2

IV_1678165456867.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.1.2" productionDate="2023-03-07">

</ApplicationIdentification>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны

здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI "ARRIAH"</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Вакцина против ящура генотипа

SAT-2/IV культуральная инактивированная

сорбированная</InventionTitle>

<INSDSeq_length>648</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..648</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accaccagcgccggtgagggagcagacgttgtcacaactgacccctcgt

cacacggcggtagtgtagcagacaaaaggcggatgcacacagacgttgcattcgtgcttgacaggttcac

ccatgtacacaccaacaaaaccacatttaacgtggacctgatggacaccagacagcacactctggtgggg

gctctcctcagagcatcaacctactatttctgtgacctggaaattgcctgtgttggcacacacaagcgcg

tctactggcaacctaacggcgcaccacgtacgacgcaactgggtgacaaccccatggtgtttgcccacaa

cagtgtcactaggttcgccataccttacactgcaccacaccggttgcttgcaactgcgtacaacggtgag

tgcaagtacacagaccgagtttccgcaatccgcggtgaccgtactgtgttggcagccaagtatgctgact

ccaggcacacgcttccgtccacgttcaactttggacacgtgaccgccgaccaaccagtcgacgtttacta

caggatgaagcgggctgagctgtactgtccaagaccacttctcccggcttaccacaacgaccgggataga

ttcgacgcaccyatcggcgtcgagaaacaactgtgcaac</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>216</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..216</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGEGADVVTTDPSSHGGSVADKRRMHTDVAFVLDRFTHVHTNKTTF

NVDLMDTRQHTLVGALLRASTYYFCDLEIACVGTHKRVYWQPNGAPRTTQLGDNPMVFAHNSVTRFAIPY

TAPHRLLATAYNGECKYTDRVSAIRGDRTVLAAKYADSRHTLPSTFNFGHVTADQPVDVYYRMKRAELYC

PRPLLPAYHNDRDRFDAPIGVEKQLCN</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims

1. Вакцина против ящура инактивированная сорбированная культуральная, содержащая активное вещество и адъювант, отличающаяся тем, что состоит из активного вещества в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером: №452-деп/23-2 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 4,5 мкг; из адъюванта гидроокиси алюминия - 10%-ный коллоидный раствор с содержанием 47% по объему 4,7% в пересчете на сухое вещество, сапонина в количестве 1,8 мг, поддерживающей среды - до 2,0 см³.

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV, полученный в чувствительной биологической системе и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура серотипа SAT-2.

3. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-2/Кения/19/2017» генотипа SAT-2/IV, полученный в перевиваемой суспензионной клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура серотипа SAT-2 и адъювант гидроксид алюминия в комплексе с сапонином, в эффективном соотношении: 53% и 47%, соответственно.