RU2741639C1

RU2741639C1 - Вакцина для ранней защиты против ящура типа Азия-1 инактивированная эмульсионная

Info

Publication number: RU2741639C1
Application number: RU2020119505A
Authority: RU
Inventors: Вячеслав Алексеевич Стариков; Дмитрий Валерьевич Михалишин; Дмитрий Анатольевич Лозовой; Максим Игоревич Доронин; Алексей Валерьевич Борисов; Юлия Сергеевна Елькина; Алексей Владимирович Константинов; Светлана Николаевна Фомина
Priority date: 2020-06-05
Filing date: 2020-06-05
Publication date: 2021-01-28

Abstract

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Предложена вакцина для ранней защиты против ящура типа Азия-1 инактивированная эмульсионная, содержащая авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма вируса Aphtae epizooticae «Азия-1 №2356/14/2018», сем. Picornaviridae, рода Aphthovirus, типа Азия-1, депонированого под регистрационным номером №176 - деп/19-66 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», в эффективном количестве и адъюванты. Изобретение расширяет арсенал производственных вакцин, обладающих высокой иммуногенностью и обеспечивающих раннюю эффективную защиту от гомологичного возбудителя инфекции ящура типа Азия-1, циркулирующего в странах Центральной и Юго-Восточной Азии. 6 з.п. ф-лы, 10 табл., 10 пр., 1 ил.

Description

Ящур занимает первоочередное место в системе мер борьбы и профилактики вирусных болезней крупного рогатого скота во многих государствах. Данное заболевание представляет собой мировую проблему, которой особое внимание уделяют ветеринарные службы многих стран и международные организации (ФАО/МЭБ). По итогам 81-й Генеральной сессии ФАО/МЭБ (2013 г.) была принята резолюция, согласно которой ящур, принадлежащий группе «трансграничных инфекций», признается глобальной проблемой, наносящей значительный ущерб для торговли и продовольственной безопасности всех стран [1, 2]. Вирус ящура легко распространяется, по этой причине данное заболевание может приобретать размах эпизоотий [3, 4]. В Российской Федерации применяется система мероприятий по борьбе и профилактике ящура, которая направлена на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной зоне, а также проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных. Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса, гомологичного полевым изолятам [5, 6].

Недавние вспышки вируса ящура (FMDV) демонстрируют, что данная крайне заразная вирусная инфекция парнокопытных животных продолжает оставаться значимой экономической проблемой во всем мире. Споры о наиболее эффективном способе реагирования на вспышки ящура в странах, свободных от болезней, по-прежнему сосредоточены на использовании вакцин [7]. Для проведения эффективной компании по вакцинации нужно наличие эффективной, безопасной вакцины, соответствующей эпизоотическому изоляту. Вакцина и схема ее применения должны достаточно быстро обеспечить иммунитет, обычно, противоящурные препараты создают напряженный иммунитет на 21 день после вакцинации. Уменьшение сроков по защите животных является актуальной задачей, чтобы остановить и замедлить передачу вируса другим животным. Это позволит эффективно применять вакцину в неблагополучном пункте и угрожаемой зоне.

Экстренная вакцинация является одной из нескольких мер, которые могут быть применены для борьбы со вспышками ящура. Это является ценным дополнением к применению основных мер зоосанитарного контроля, которые должны включать быструю диагностику, отслеживание, контроль за передвижением и дезинфекцию, а также убой инфицированных и контактирующих животных и их безопасное удаление. Критерии, определяющие успешное осуществление экстренной вакцинации, включают в себя доступ к вакцине, которая: 1) содержит штамм вируса ящура с достаточным антигенным родством по отношению к изолятам, циркулирующим в очаге; 2) относится к требуемому виду среди разработанных вакцин; 3) характеризуется приемлемой безвредностью и эффективностью; 4) имеет соответствующий доступ, в том числе объем партий и своевременность их поставок.

Планирование на случай непредвиденных обстоятельств должно включать обеспечение экстренной вакцинации и учитывать возможность сложных решений не только в отношении того, когда, где и как применять вакцину, но и экономическую целесообразность ее использования [8].

В литературных источниках указывают, что экстренная вакцинация крупного рогатого скота, овец и свиней может быть эффективной для профилактики заболевания в течение первых 4-5 дней после вакцинации. Данные исследования показывают, что риск распространения инфекции уменьшается по мере увеличения интервала между вакцинацией и заражением вирусом. Кроме того, вакцинация может уменьшить количество выделяемого вируса по сравнению с не иммунизированными животными [9, 10].

Высокий уровень антигенной и генетической вариабельности вируса ящура в пределах одного генотипа приводит к возникновению новых полевых изолятов, которые отличаются по степени вирулентности и иммуногенности от ранее выделенных штаммов [11, 12].

Принимая во внимание опасность возникновения ящура в нашей стране и возможность больших экономических потерь, особое значение приобретает проблема экстренной профилактики данного заболевания.

Инактивированные противоящурные вакцины, применяемые для проведения экстренной иммунизации, могут использоваться в не эндемичных странах во время вспышек с целью предотвращения распространения вируса. В эндемичных странах для регулярной вакцинации используются либо стандартные, либо высокоэффективные противоящурные вакцины. Несмотря на их широкое применение, данных об эффективности инактивированных вакцин против ящура на местах недостаточно [13].

Угроза возникновения ящура в России существует постоянно, в особенности это актуально для регионов, граничащих с Китаем, Монголией, странами средней Азии и Закавказья [14].

Возникновение вспышки ящура типа Азия-1 на территории РФ возможно в случае заноса из неблагополучных по данному заболеванию стран. В настоящее время широкое распространение получил вирус Азия-1/ASIA/Sindh-08.

После проведения необходимых лабораторных исследований обнаруженных изолятов вируса ящура, особое внимание было обращено на 2 изолята, которые выделены от крупного рогатого скота. По результатам ПЦР и нуклеотидного секвенирования с последующим филогенетическим анализом, проведенных специалистами Всемирной справочной лаборатории по ящуру (Пирбрайт, Великобритания) и ФГБУ «ВНИИЗЖ», выявили, что изолят Азия-1 Пакистан/2018 принадлежит топотипу ASIA, генетической линии Sindh-08.

Изменения антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого изолята, могут варьировать от незначительных, детектируемых моноклональными антителами, до существенных, регистрируемых с помощью поликлональных иммуноглобулинов. Существенные генетические изменения природного изолята вызывают ослабление специфического иммунитета против ящура, индуцированного гетерологичным антигеном. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики ящура.

В Российской Федерации вспышки ящура типа Азия-1 регистрировались в 2005-06 гг. и в 2016 г. [15].

Известны производственные штаммы вируса ящура типа Азия-1, ранее использовавшиеся для специфической профилактики ящура на территории России:

- производственный штамм Азия-1 №48;

- штамм вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005;

- штамм вируса ящура Азия-1 /Шамир 3/89;

- штамм Азия-1 №2145/Таджикистан/2011.

В ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2018 г. был доставлен патологический материал от крупного рогатого скота с территории Пакистана, из которого выделен изолят вируса ящура типа Азия-1.

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный изолят принадлежит к топотипу ASIA, генетической линии Sindh-08 вируса ящура типа Азия-1, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура типа Азия-1.

Учитывая интенсивные торговые связи между Российской Федерацией и странами Западной и Центральной Азии, вероятность риска заноса ящура на территорию России остается очень высокой [14]. В связи с этим возникла необходимость получить новую вакцину для ранней защиты из эпизоотического изолята вируса ящура серотипа Азия-1 для обеспечения безопасности территории Российской Федерации и сопредельных государств от этого.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа Азия-1, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма Азия-1 №2145/Таджикистан/2011, полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде масляного адъюванта в соотношении, мкг/см³:

Антигенный материал	3,0
Масляный адъювант	500000,0÷600000,0

В качестве чувствительной биологической системы для репродукции вируса ящура используют перевиваемую суспензионную клеточную линию из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21, в качестве поддерживающей среды применяют раствор Эрла без внесения сыворотки, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого (ФГМС), гидролизата белков крови сухого (ГБКС) и антибиотиков при рН среды 7,4-7,6.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ). При изготовлении эмульсионной вакцины в качестве адъювантов служат Montanide ISA-206. Очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей осуществляют с применением полигексаметиленгуанидин гидрохлорид (ПГМГ).

Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма Азия-1 представляет собой суспензию, состоящую преимущественно из 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура.

Существенный недостаток вакцины-прототипа, состоит в их недостаточной иммуногенной активности, что объясняется невысокой степенью защиты восприимчивых животных от эпизоотических изолятов вируса ящура типа Азия-1, циркулирующего в странах Центральной и Юго-Восточной Азии.

Для решения этой проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка противоящурной инактивированной эмульсионной вакцины, обеспечивающей эффективную раннюю защиту восприимчивых животных против полевых изолятов вируса ящура типа Азия-1, распространенных на территории Центральной и Юго-Восточной Азии.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала вакцин для ранней защиты против ящура типа Азия-1 инактивированных эмульсионных.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины для ранней защиты против ящура типа Азия-1 инактивированной эмульсионной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Разработанная вакцина в 1 см препарата содержит следующие компоненты: активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура, репродуцированного предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21, в количестве не менее 3,0 мкг и масляный адъювант Montanide ISA-206 предпочтительно в количестве 500000,0-575000,0 мкг, соответственно.

Изолят, послуживший источником для получения штамма вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018, был выделен в 2018 году от больных ящуром КРС на территории Пакистана (экспертиза №2356). Производственный штамм вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018 получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.

Штамм вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018 депонирован в Коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером: №176- деп /19-66 ГКШМ «ВНИИЗЖ».

Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным клеткам свиной почки и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют предпочтительно перевиваемую суспензионную культуру клеток ВНК-21, а в качестве поддерживающей среды применяют раствор Эрла без внесения сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН среды 7,4-7,6. Инактивацию вируса проводят с использованием АЭЭИ с концентрацией 0,025-0,050% от объема вируссодержащей суспензии. По окончании процесса АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию тиосульфата натрия [16]. Инактивированный антиген очищают от балластных примесей с помощью ПГМГ, который вносят в суспензию до концентрации 0,005-0,007% от общего объема [17].

Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма Азия-1 №2356/14/2018 представляет собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура.

Содержание компонента в продукте оценивают с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [18]. Для приготовления вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1 см³ не менее 0,5 мкг 146S иммуногенного компонента вируса ящура. Необходимую концентрацию 146S компонента в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена методом проточной ультрафильтрации.

Эмульсионную инактивированную вакцину для ранней защиты против ящура типа Азия-1 получают путем диспергирования при помощи гомогенизатора концентрата ящурного антигена и масляного адъюванта в соотношении 1:1 по массе, соответственно. Для усиления иммунного ответа используют масляный адъювант производства фирмы «Seppic» Montanide ISA-206.

Полученная вакцина представляет собой молокоподобную жидкость, не растворимую в воде.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:

1. Вакцина инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура типа Азия-1.

2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный антигенный материал из штамма Азия-1 №2356/14/2018 в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура типа Азия-1, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в эффективном количестве.

2. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура типа Азия-1, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см³ готового препарата.

3. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант.

4. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-206.

5. Вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-206 в количестве 500000,0-575000,0 мкг в 1 см³ готового препарата.

6. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура, полученного предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и масляный адъювант Montanide ISA-206 в количестве, мкг/см готового препарата:

Авирулентный и очищенный
антигенный материал вируса	не менее 3,0 ящура
Масляный адъювант	500000,0-575000,0

Предлагаемая вакцина обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную раннюю защиту против вируса ящура типа Азия-1, циркулирующего в странах Центральной и Юго-Восточной Азии.

Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой противоящурной вакцины в качестве активного вещества введен антигенный материал из штамма Азия-1 №2356/14/2018, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную раннюю защиту восприимчивых животных против вируса ящура серотипа Азия-1, вызывающего в последние годы вспышки заболевания в странах Центральной и Юго-Восточной Азии.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении. Представлена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018 с эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серологического типа Азия-1. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP1.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура типа Азия-1;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура типа Азия-1.

Штамм Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018 типа Азия-1 относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, серотипу Азия-1 и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 22-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура относится к серотипу Азия-1. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP1 штамма вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм Азия-1 №2356/14/2018 принадлежит к генетической линии Sindh-08 топотипа ASIA.

Антигенное родство штамма вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018 с производственными штаммами вируса ящура Азия-1 /Шамир 3/89 и Азия-1 №1987/Амурский/2005 изучено в РМН в соответствии с Методическими указаниями по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации [15].

Результаты исследований антигенного соответствия представлены в таблице 1. Антигенное соответствие (r₁) штамма Азия-1 №2356/14/2018 с производственными штаммами вируса ящура составило для ящура Азия-1 /Шамир 3/89 - 0,16; Азия-1 №1987/Амурский/2005 - 0,21.

При значении r₁>0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r₁<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса.

Биотехнологические характеристики

Штамм вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018 репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21). В течение 20-24 часов инкубирования, титр инфекционной активности вируса в указанных культурах клеток достигает значений от 5,25 до 7,00 lg ТЦД₅₀/см³ (таблица 2) и сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 5 пассажей (срок наблюдения).

Гено- и хемотаксономическая характеристика.

Штамм Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10⁶Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является белок VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP_66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,4-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к щелочам, кислотам, формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей на перевиваемой культуре клеток IB-RS-2 (срок наблюдения).

При испытании проведено 5 последовательных пассажей штамма вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018 в перевиваемой культуре клеток IB-RS-2. Для определения биологической активности проводили титрование вируса каждого пассажа в перевиваемой культуре клеток IB-RS-2.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа Азия-1, обладает более высокой протективной и иммуногенной активностью.

Для снижения эпизоотической опасности ящура типа Азия-1 и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки высокоиммуногенной вакцины.

Получена высокоиммуногенная инактивированная эмульсионная вакцина для ранней защиты против ящура типа Азия-1 из штамма Азия-1 №2356/14/2018.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Получение и исследование биологических свойств штамма Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма вируса ящура типа Азия-1 №2356/14/2018, был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из проб биологического материала, полученных 2018 г. от подозреваемых в заболевании ящуром КРС.

При выделении вируса с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [2].

Биологические и вирусологические методы включали в себя выделение и адаптацию вируса ящура.

Выделение вируса проводили на культуре монослойных перевиваемых линиях клеток ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК - 21 с последующей адаптацией (5 пассажей). Культуры клеток выращивали на соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25 см², отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀ на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов вирусную суспензию предварительно обрабатывали 10% раствором хлороформа. После 30-минутного контакта вируса с клеточной культурой при 37°С во флаконы вносили по 5 см³ поддерживающей среды и инкубировали при 37°С до появления ЦПД на культуре клеток. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) не менее 80-95% клеток, флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение 20-24 часов проявлялось 90-100% ЦПД в монослое клеточных культур. Адаптация эпизоотического изолята Азия-1 №2356/14/2018 к различным клеточным линиям наступала на уровне третьего пассажа. Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2.

Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о высокой адаптационной способности штамма вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018 к использованным клеточным культурам.

Инактивированный материал исследовали в РСК на наличие антигена вируса ящура, при этом использовали сыворотки ящурные типо- и штаммоспецифические для серологических реакций, производства ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Изолят вируса ящура был исследован в РСК с целью подтверждения его типовой принадлежности (таблица 3).

Приведенные в таблице 3 результаты свидетельствуют о том, что в вируссодержащем материале экспертизы №2356 в РСК определяется антиген вируса ящура типа Азия-1 в разведении 1:4.

Пример 2. Оценка биологических свойств штамма вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018 при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/2-17.

Штамм вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018 репродуцировали в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17. В качестве поддерживающей среды использовали раствор Эрла, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого (ФГМС), гидролизата белков крови сухого (ГБКС) и антибиотиков при рН среды 7,4-7,6. Клеточную линию заражали вирусом из расчета 0,001-0,1 ТЦД₅₀/клетка.

Культивирование вируса осуществляли при температуре 35-38°С. Цитопатическое действие вируса, соответствующее 90-100%, достигалось через 20-21 ч. После этого репродукцию вируса ящура прекращали, полученную суспензию контролировали на стерильность и содержание 146S компонента. Концентрация 146S компонентов вируса ящура в суспензии составляла 0,47-1,96 мкг/см³ в зависимости от концентрации клеток, температуры инкубирования и дозы заражения. Значения титра инфекционной активности вируса штамма вируса ящура Азия-1 №2356/14/2018 отражены в таблице 4, из данных которой видно, что при концентрации клеток ВНК-21/2-17, равной 2,5-4,0 млн клеток/см³, при дозе заражения 0,0001-0,1 ТЦД₅₀/клетка и продолжительности репродукции вируса 16-29 ч титр инфекционной активности возбудителя ящура находился в диапазоне 4,25-6,75 lgТЦД₅₀/см³, концентрация 146S компонента равна 0,47-1,96 мкг/см³.

Пример 3. Сравнительный анализ биологических свойств штамма Азия-1 №2356/14/2018 с производственными штаммами вируса ящура типа Азия-1.

При изучении свойств штамма Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура выявлены значительные преимущества в сравнении с другими используемыми производственными штаммами Азия-1 №2356/14/2018, Азия-1 №1946/Шамир 3/89, Азия-1 №2145/Таджикистан/2011, Азия-1 №1987/Амурский/2005. В качестве тест-системы для заражения использовали суспензию клеток линии ВНК-21 с концентрацией 3,0-3,5 млн клеток/см. Доза заражения составляла 0,005 ТЦД₅₀/клетка.

В таблице 5 приведены результаты культивирования вируса ящура представленных штаммов. Из данных приведенных в таблице 5 следует, что разрушение клеток ВНК-21 до 90-95% у штамма Азия-1 №2356/14/2018 наступает спустя 20,20±0,13 ч, при этом для штаммов Азия-1 №1946/Шамир 3/89, Азия-1 №2145/Таджикистан/2011, Азия-1 №1987/Амурский/2005 - это время снижено до 15,35±0,58, 15,6±0,53, 17,57±1,10 ч, соответственно. При этом результаты репродукции вируса ящура указанных штаммов свидетельствуют о преимуществах Азия-1 №2356/14/2018, поскольку для него характерны более высокие значения титра инфекционной активности (7,29±0,12 lg ТЦД₅₀/0,1 см³) по сравнению со штаммами Азия-1 №1946/Шамир 3/89, Азия-1 №2145/Таджикистан/2011, Азия-1 №1987/Амурский/2005, для которых значения титра инфекционности соответствовали показаниям 6,80±0,10, 6,83±0,10, 6,75±0,05 lg ТЦД₅₀/0,1 см. По итогам сравнительного анализа выявлено, что накопление 146S иммуногенного компонента для полученного штамма Азия-1 №2356/14/2018 составляла 1,94±0,03 мкг/см, что на 39,2, 34,00 и 31,4% выше по сравнению с репродукцией штаммов Азия-1 №1946/Шамир 3/89, Азия-1 №2145/Таджикистан/2011, Азия-1 №1987/Амурский/2005, соответственно.

Пример 4. Получение инактивированного антигена и исследование влияния инактивации и очистки антигенного материала с помощью АЭЭИ и ПГМГ на количество 146S компонента вируса ящура штамма Азия-1 №2356/14/2018.

Инактивированную эмульсионную вакцину для ранней защиты против ящура типа Азия-1 готовят из штамма Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура, выращенного в суспензионной перевиваемой клеточной линии ВНК-21.

Культивирование вируса осуществляли как указано в примере 3.

Результаты исследований по изучению влияния инактивации и очистки антигенного материала с помощью АЭЭИ и ПГМГ на количество 146S компонента вируса ящура штамма Азия-1 №2356/14/2018 отражены в таблице 6. Из данных таблицы 6 видно, что до инактивации среднее значение концентрации общего вирусного белка составило 2,41±0,05 мкг/см³, 146S компонента - 2,07±0,10 мкг/см³. После процесса инактивации средние показатели снизились на 21,20% по общему вирусному белку и на 18,49% по 146S компоненту, и составили для общего вирусного белка 1,90±0,05 мкг/см³, для 146S компонента (вирионов) - 1,69±0,10 мкг/см³. Таким образом, 146S иммуногенный компонент штамма Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура устойчив к инактивации и очистке.

Пример 5. Концентрирование антигена вируса ящура штамма Азия-1 №2356/14/2018 для получения вакцины.

Необходимую концентрацию 146S компонентов в прививной дозе эмульсионной вакцины из штамма Азия-1 №2356/14/2018 получают путем концентрирования антигена проточной ультрафильтрацией с применением ультрафильтров при давлением 1,5 атм. Полученный концентрат антигена хранят при температуре 4-6°С до момента использования. Получаемую вакцину расфасовывают в стеклянные или пластиковые флаконы и проводят контроль стерильности продукции в соответствии с ГОСТ 28085-89.

Пример 6. Процесс диспергирования антигена и адъюванта для получения инактивированной эмульсионной вакцины для ранней защиты против ящура из штамма Азия-1 №2356/14/2018.

Инактивированную эмульсионную вакцину для ранней защиты против ящура типа Азия-1 получают путем диспергирования концентрата антигена и масляного адъюванта при помощи гомогенизатора. В качестве адъюванта применяют Montanide ISA-206 производства фирмы «Seppic» (Франция, стандарт ИСО 9001).

При изготовлении эмульсионной вакцины на основе Montanide ISA-206 адъювант и антиген подогревают до температуры 25-30°С и на гомогенизаторе проводят их диспергирование в соотношении 1:1.

В результате получают вакцину инактивированную эмульсионную для ранней защиты против ящура из штамма Азия-1 №2356/14/2018, которая представляет собой молокоподобную жидкость, нерастворимую в воде. Вакцина имеет жидкую консистенцию, легко рассасывается в месте введения, не вызывает образования абсцессов, общей реакции в виде повышения температуры. Обладает выраженной иммуногенной активностью для КРС и свиней в прививной дозе 2 см³ через 21 день после введения. В 1 см³ должно содержаться не менее 3 мкг 146S компонента вируса ящура. Оптимальный компонентный состав полученной вакцины представлен на странице 9.

Пример 7. Оценка авирулентности и безвредности инактивированной эмульсионной вакцины для ранней защиты против ящура из штамма Азия-1 №2356/14/2018.

Для определения авирулентности вакцины на свиньях отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно по 0,1 см³ в две точки венчика на каждой конечности. В исследовании использовали свиней массой 35-40 кг. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Это свидетельствовало об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.

Контроль безвредности продукта на свиньях проводили путем внутримышечного введения вакцины в область верхней трети шеи в дозе 6 см³. Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после инокуляции температура тела животного может повышаться до 41°С и удерживаться на этом уровне в течение 1-3 суток.

По результатам исследований вакцина была признана безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.

Пример 8. Оценка гуморального иммунитета у свиней при использовании противоящурной вакцины для ранней защиты из штамма Азия-1 №2356/14/2018 против гомологичного штамма и гетерологичных штаммов Азия-1 №1946/Шамир 3/89, Азия-1 №2145/Таджикистан/2011, Азия-1 №1987/Амурский/2005.

Проведена оценка гуморального иммунитета у свиней, привитых инактивированной противоящурной эмульсионной вакциной для ранней защиты из штамма Азия-1 №2356/14/2018 против гомологичного штамма и гетерологичных штаммов Азия-1 №1946/Шамир 3/89, Азия-1 №2145/Таджикистан/2011, Азия-1 №1987/Амурский/2005.

Проведены испытания эмульсионной вакцины против ящура типа Азия-1, изготовленной так, как описано в примерах 2, 4, 5, 6 и содержащей, мкг в 2 см³:

авирулентный и очищенный
антигенный материал из штамма
Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура типа Азия-1	32,80
масляный адъювант ISA-206	1100000,0.

Испытание провели на 5 головах свиней. Эмульсионную вакцину вводили внутримышечно в дозе 2,0 см³. Результаты исследований представлены в таблице 7, из данных которой видно, что эмульсионная вакцина стимулировала у свиней выработку вируснейтрализующих антител (ВНА) против гомологичного штамма Азия-1 №2356/14/2018 на 4 сутки после вакцинации в количестве 3,85±0,23 log₂, против гетерологичных штаммов Азия-1 №1946/Шамир 3/89, Азия-1 №2145/Таджикистан/2011, Азия-1 №1987/Амурский/2005 - 2,10±0,32 log₂, 2,25±0,22 и 2,05±0,18 log₂, что в 3,03-3,48 раза ниже, чем против штамма Азия-1 №2356/14/2018.

Пример 9. Оценка гуморального иммунитета у КРС при использовании противоящурной вакцины для ранней защиты из штамма Азия-1 №2356/14/2018 против гомологичного штамма и гетерологичных штаммов Азия-1 №1946/Шамир 3/89, Азия-1 №2145/Таджикистан/2011, Азия-1 №1987/Амурский/2005.

Проведена оценка гуморального иммунитета у КРС, привитых инактивированной противоящурной эмульсионной вакциной для ранней защиты из штамма Азия-1 №2356/14/2018 против гомологичного штамма и гетерологичных штаммов Азия-1 №1946/Шамир 3/89, Азия-1 №2145/Таджикистан/2011, Азия-1 №1987/Амурский/2005.

Проведены испытания эмульсионной вакцины для ранней защиты против ящура типа Азия-1, изготовленной так, как описано в примерах 2, 4, 5, 6 и содержащей, мкг в 2 см³:

авирулентный и очищенный
антигенный материал из штамма
Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура типа Азия-1	32,80
масляный адъювант ISA-206	1100000,0

Испытание провели на 5 головах КРС. Эмульсионную вакцину вводили внутримышечно в дозе 2,0 см³. Результаты исследований представлены в таблице 8, из данных которой видно, что эмульсионная вакцина для ранней защиты стимулировала у КРС выработку вируснейтрализующих антител против гомологичного штамма Азия-1 №2356/14/2018 на 4 сутки после вакцинации в количестве 3,50±0,37 log₂, против гетерологичных штаммов Азия-1 №1946/Шамир 3/89, Азия-1 №2145/Таджикистан/2011, Азия-1 №1987/Амурский/2005 - 1,35±0,13, 1,80±0,10 и 2,00±0,22 log₂, что в 2,55-3,99 раза ниже, чем против штамма Азия-1 №2356/14/2018.

Пример 10. Оценка иммуногенной активности эмульсионной вакцины для ранней защиты против ящура из штамма Азия-1 №2356/14/2018 на естественно восприимчивых животных против гомологичного штамма.

Проведены испытания эмульсионной вакцины для ранней защиты против ящура типа Азия-1, изготовленной так, как описано в примере 6 и содержащей, мкг в 2 см³:

Испытания провели на 17 головах подсвинках и 17 головах КРС результаты исследований указаны в таблицах 9 и 10. Эмульсионную вакцину вводили в дозе 2 см³.

Из данных таблиц 9 и 10 следует, что разработанная инактивированная эмульсионная противоящурная вакцина для ранней защиты из штамма Азия-1 №2356/14/2018 обеспечивает защиту против гомологичного штамма вируса ящура типа Азия-1.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура типа Азия-1, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма Азия-1 №2356/14/2018 в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить раннюю эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура типа Азия-1, циркулирующего в странах Центральной и Юго-Восточной Азии.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина для ранней защиты против ящура типа Азия-1 эмульсионная инактивированная»:

1. Annual OIE/FAO FMD Reference Laboratory Network Report / N. Ferris, N. Knowles [et al.]. - Pirbright, 2007. - URL: http://vvrsvw.wrlfmd.org/ref_labs/nrid_ref_lab_rep

2. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals -24th Ed. - Paris, 2015-Vol. 1, Chapter 2.1.5.-P. 166-169.

3. Бурдов A.H., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.

4. Пономарев А.П., Узюмов В.Л., Груздев К.Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

5. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.MZ Garland, R.P. Kitching [et. al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

6. Brown F. A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strateies: Proc. Jnt. Symp. 2-5. June 2002, Lyons, France. - Paris, 2003. - p. 13-21.

7. Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in 7 days and partial protection in 4 days: Use in emergency outbreak response / T.G. William, J.M. Pachecoa, T. Doel [et. al.] // Vaccine. - December 2005. - V. 23. - P. 5775-5782.

8. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et. al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

9. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

10. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. - V. 16. - P. 746-754.

11. Рахманов A.M. Современная эпизоотическая ситуация в мире по ящуру и меры ее контроля. // Ветеринарная медицина мiжвiд. тем. наук. Харкiв, 2013. - С. 37-38.

12. Ререр X. Ящур. - М., 1971. - 432 с.

13. The field effectiveness of routine and emergency vaccination with an inactivated vaccine against foot and mouth disease // E. Elnekave, Y. Li, L. Zamir [et. al.] / Vaccine. - January 2013. -V. 31. - P. 879-885.

14. Экспертная оценка риска заноса ящура на территорию Российской Федерации из неблагополучных государств / В.М. Гуленкин, А.К. Караулов, Д.А. Лозовой, В.М. Захаров // Ветеринария сегодня. - 2018. - №2. - С. 36-41.

15. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017. - 24 с.

16. Патент РФ №594771, A61K 39/12, 07.07.93 г.

17. Патент РФ №2054039, C12N 7/02, A61K 39/35, 10.02.1996.

18. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Утв. 21.09.17.

19. Методические рекомендации по выделению и идентификации штаммов вируса ящура / А.А. Гусев, В.М. Захаров, Ж.А. Шажко и др.; ФГУ "ВНИИЗЖ". - Владимир. 2002. - 31 с.

--->

Перечень последовательностей

<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») Federal Governmental Budgetary Institution «Federal Centre for Animal Health» (FGBI «ARRIAH»)

<120> Вакцина для ранней защиты против ящура типа Азия-1 инактивированная эмульсионная

<160> 2

<210> 1

<211> 633

<212> РНК

<213> вирус ящура

<400> 1

ACCACCACCG CTGGCGAGTC AGCAGACCCA GTCACAACCA CGGTTGAGAA CTACGGAGGA 60

GAGACTCAGA CAGCTAGACG GCTTCACACC GACGTCGGCT TTGTTCTTGA CAGGTTCGTG 120

AAAATCACAA ACCCTAAGGC CACTCAGACC CTTGACCTCA TGCAGATTCC CCCACACACG 180

TTGGTTGGGG CGTTGCTTCG GTCTGCGACG TACTACTTCT CAGACCTGGA GGTCGCGCTC 240

GTCCACACAG GCCCGGTCAC GTGGGTGCCC AACGGCGCGC CCAAGACCGC CTTGGACTGC 300

CAGACCAACC CAACTGCTTA CCAGAAGCAG CCCATCACAC GCCTGGCCCT CCCTTACACC 360

GCTCCCCACC GTGTGCTAGC GACAGTGTAC AACGGGAAAA CAGCCTACGG GTCGGAGGCC 420

CCAAGGCGCG GTGACCTTGC AACCATTGCG CAGAGGGTGA GCACCAGCTT GCCCACTTCC 480

TTCAACTACG GCGCAGTCAA GGCTGAAACC ATCACTGAGC TGTTGATCCG CATGAAACGT 540

GCGGAGACAT ACTGCCCCAG GCCTTTGCTG GCTCTTGATA CCACCCAGGA CCGCCGCAAA 600

CAGGAGATCA TCGCACCCGA AAAGCAGGTG TTA 633

<210> 2

<211> 211

<212> ПРТ

<213> вирус ящура

<400> 2

1 Thr Thr Thr Ala Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val 15

16 Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Thr Ala Arg Arg Leu His Thr 30

31 Asp Val Gly Phe Val Leu Asp Arg Phe Val Lys Ile Thr Asn Pro 45

46 Lys Ala Thr Gln Thr Leu Asp Leu Met Gln Ile Pro Pro His 60

61 Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Ser Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp 75

76 Leu Glu Val Ala Leu Val His Thr Gly Pro Val Thr Trp Val Pro 90

91 Asn Gly Ala Pro Lys Thr Ala Leu Asp Cys Gln Thr Asn Pro Th 105

106 Ala Tyr Gln Lys Gln Pro Ile Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr 120

121 Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Lys Thr Al 135

136 Tyr Gly Ser Glu Ala Pro Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile Ala 150

151 Gln Arg Val Ser Thr Ser Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Al 165

166 Val Lys Ala Glu Thr Ile Thr Glu Leu Leu Ile Arg Met Lys Arg 180

181 Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Leu Asp Thr Thr 195

196 Gln Asp Arg Arg Lys Gln Glu Ile Ile Ala Pro Glu Lys Gln Val 210

211 Leu 211

<---

Claims

1. Вакцина для ранней защиты против ящура типа Азия-1 инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество и адъюванты, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма вируса Aphtae epizooticae «Азия-1 №2356/14/2018», сем. Picornaviridae, рода Aphthovirus, типа Азия-1, депонированого в Коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером: №176 - деп/19-66 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», в эффективном количестве.

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма Азия-1 №2356/14/2018, полученный в чувствительной биологической системе и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура типа Азия-1.

3. Вакцина по п. 2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма Азия-1 №2356/14/2018, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура типа Азия-1.

4. Вакцина по п. 3, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма Азия-1 №2356/14/2018, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура типа Азия-1 в количестве не менее 3,0 мкг в 1 см³ готового препарата.

5. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве адъюванта она содержит масляный адъювант Montanide ISA-206.

6. Вакцина по п. 5, отличающаяся тем, что она содержит масляный адъювант Montanide ISA-206 предпочтительно в количестве 500000,0-575000,0 мкг в 1 см³ готового препарата.

7. Вакцина по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма Азия-1 №2356/14/2018, полученный предпочтительно в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура типа Азия-1, масляный адъювант Montanide ISA-206 в соотношении, мкг 1 см готового препарата:

Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма Азия-1 №2356/14/2018 вируса ящура типа Азия-1 не менее 3,0 Масляный адъювант Montanide ISA-206 500000,0-575000,0