RU2816943C1 - Штамм "Азия-1/G-V/2006" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа Азия-1/G-V для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура - Google Patents
Штамм "Азия-1/G-V/2006" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа Азия-1/G-V для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура Download PDFInfo
- Publication number
- RU2816943C1 RU2816943C1 RU2023133119A RU2023133119A RU2816943C1 RU 2816943 C1 RU2816943 C1 RU 2816943C1 RU 2023133119 A RU2023133119 A RU 2023133119A RU 2023133119 A RU2023133119 A RU 2023133119A RU 2816943 C1 RU2816943 C1 RU 2816943C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- foot
- mouth disease
- asia
- strain
- disease virus
- Prior art date
Links
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 title claims abstract description 152
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 title claims abstract description 40
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 241000710189 Aphthovirus Species 0.000 claims abstract description 4
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 claims abstract description 3
- 244000037640 animal pathogen Species 0.000 claims abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 20
- 239000000725 suspension Substances 0.000 abstract description 24
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract description 15
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 14
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 abstract description 8
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 abstract description 5
- 241001250094 Capra sibirica Species 0.000 abstract 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 30
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 19
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 7
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 7
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 7
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 4
- 208000002399 aphthous stomatitis Diseases 0.000 description 4
- ACGUYXCXAPNIKK-UHFFFAOYSA-N hexachlorophene Chemical compound OC1=C(Cl)C=C(Cl)C(Cl)=C1CC1=C(O)C(Cl)=CC(Cl)=C1Cl ACGUYXCXAPNIKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241001493546 Suina Species 0.000 description 3
- 101710140501 Sulfate adenylyltransferase subunit 2 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100030100 Sulfate anion transporter 1 Human genes 0.000 description 3
- 101710144481 Sulfate anion transporter 1 Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001573881 Corolla Species 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 101710173681 Sulfate adenylyltransferase subunit 2 2 Proteins 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000003 hoof Anatomy 0.000 description 2
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- LSDGFGPIFBOTJI-UHFFFAOYSA-N 2-(aziridin-1-yl)ethanamine Chemical compound NCCN1CC1 LSDGFGPIFBOTJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100031974 CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 4 Human genes 0.000 description 1
- 241001250090 Capra ibex Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000703754 Homo sapiens CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001144416 Picornavirales Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 1
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- BTWUORFYKAZQHW-UHFFFAOYSA-L disodium;2-hydroxy-3-[4-[4-[(2-hydroxy-3-sulfonatopropyl)amino]-3-methylphenyl]-2-methylanilino]propane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].C1=C(NCC(O)CS([O-])(=O)=O)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(NCC(O)CS([O-])(=O)=O)=CC=2)=C1 BTWUORFYKAZQHW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 1
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 230000008004 immune attack Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- -1 polyhexamethylene guanidine Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000000601 reactogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000004370 retrospective diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа Азия-1/G-V, семейства Picornaviridae, рода Aphthovirus, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №443 - деп. / 22-77 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» штамм «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V вируса ящура. Представленный штамм репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21). В перевиваемой суспензионной культуре клеток почки сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH в течение 9,65±0,47 часов инкубирования концентрация 146S компонента штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V вируса ящура имеет средние значения 4,65±0,16 мкг/см3 (83,10±0,75%), сохраняя исходные характеристики при пассировании в новой перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Представленный штамм «Азия-1/G-V/2006» может быть использован для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа Азия-1/G-V и для контроля антигенной активности противоящурных вакцин. 1 ил., 6 табл., 8 пр.
Description
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано для разработки и изготовления средств диагностики, специфической профилактики ящура генотипа Азия-1/G-V и контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин.
Ящур - особо опасное, карантинное, высококонтагиозное заболевание парнокопытных и мозоленогих животных, которое вызывает РНК(+)-содержащий вирус порядка Picorпavirales семейства Picorпaviridae рода Aphthovirus с длиной нуклеиновой кислоты около 8500 н.о., которая кодирует 4 структурных белка: VP1, VP2, VP3, VP4 и множество неструктурных протеинов [1, 2, 3]. Выделяют 7 различных серотипов вируса ящура: O, А, Азия-1, C и SAT-1, SAT-2, SAT-3, причем в странах Азиатского континента распространяются представители серотипа Азия-1 [1].
В пределах одного генотипа вируса ящура имеет место явление мутационной изменчивости генома и, как следствие, строения и функций белковых молекул, что приводит к возникновению новых изолятов, которые отличаются по степени вирулентности и иммуногенности от ранее выделенных штаммов вируса ящура.
Каждый из семи серотипов генетически разделен на различные топотипы. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP1), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [1, 2, 3]. Данный белок вируса ящура является наиболее изменчивым по своему аминокислотному составу, поскольку на него приходится не менее 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями считаются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [4, 5]. Филогенетический анализ на основе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP1) широко используется для вывода эволюционной динамики, эпидемиологических отношений между генетическими линиями и для отслеживания происхождения и перемещения штаммов вируса ящура [6].
Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием поверхностных вирусных белков и факторов клеток-хозяев [5, 6].
Борьба с ящуром заключается в проведении своевременных профилактических мероприятий, таких как эффективный эпидемиологический контроль за болезнью; вакцинирование против ящура домашних и сельскохозяйственных животных; надзор за передвижением диких парнокопытных животных в приграничных районах, подверженных риску проникновения возбудителя из стран, неблагополучных по ящуру; мониторинговые исследования по оценке иммунного статуса сельскохозяйственного и домашнего скота, включая ретроспективную диагностику ящура.
По данным WRLFMD в серотип Азия-1 вируса ящура входят 8 охарактеризованных генетических линий G-I, G-II, G-III, G-IV, G-V, G-VI, G-VIII, Sindh-08 и некоторые изоляты, которые в настоящее время еще не отнесены ни к одной линии. Подразделения на сублинии не отмечается в настоящее время [3].
Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа Азия-1, в частности, генотипа Азия-1/G-V, представители которого распространяются на территории Азиатских странах. В результате возникает необходимость выделение новых актуальных штаммов ящура генотипа Азия-1, для дальнейшего их использования при разработке новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении ящура генотипа Азия-1/G-V.
На территории Юго-Восточной, Южной, Восточной Азии вспышки ящура генотипа Азия-1/G-V теперь имеют спорадический характер. Следует отметить, что в последние годы усилились торгово-экономические связи России со странами этого региона, в частности, Монголии, Китая, Индии и др. Исходя из этого, крайне высоки риски заноса изолятов данного генотипа на территорию Российской Федерации, что угрожает биологической безопасности нашей страны по ящуру.
На протяжении многих лет периодически фиксировали вспышки ящура генотипа Азия-1/G-V в странах Азии, в частности, в Индии в 2007, 2010 гг., Республике Союз Мьянма в 2005, 2009, 2017 гг. В настоящее время изоляты данного генотипа по-прежнему циркулируют среди поголовья скота по причине недостаточной экстренной вакцинации животных. Наличие тесных торговых отношений Российской Федерации с этими государствами является угрожающим фактором в отношении распространения возбудителя ящура на территории нашей страны и требует исследования штаммов данного генотипа для создания средств диагностики и специфической профилактики ящура генотипа Азия-1/G-V.
Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа Азия-1, которые применяются или использовались ранее в мире для производства средств специфической профилактики ящура:
- штамм «Asia1/AFG 1/2001» (генотип Азия-1/G-I),
- штамм «Asia1/IRN/10/2004» (генотип Азия-1/G-II),
- штамм «Asia1/IND/762-03» (генотип Азия-1/G-III),
- штамм «Asia1/HKN/19/1974» (генотип Азия-1/G-IV),
- штамм «Asia1/IND/18/80» (генотип Азия-1/G-V) (прототип),
- штамм «Asia1/IND/14/95» (генотип Азия-1/G-VI),
- штамм «Asia1/BAR/8/2009» (генотип Азия-1/G-VIII),
- штамм «Азия-1/Таджикистан/2011» (генотип Азия-1/Sindh-08).
Изолят вируса ящура был выделен в результате лабораторно-диагностических исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из патологического материала, отобранного от крупного рогатого скота на территории Тамбовского района Амурской области РФ в феврале 2006 г. При проведении научных исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» штамм был охарактеризован и получил название - штамм «Азия-1/G-V/2006».
По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм принадлежит к генотипу Азия-1/G-V вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа Азия-1, в том числе, от штамма «Asia1/IND/18/80» (прототип).
Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал производственных штаммов вируса ящура серотипа Азия-1, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде, пригодный для контроля антигенной и иммуногенной активности вакцин, изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностических тест-систем и высоко иммуногенных вакцинных препаратов путем получения штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа Азия-1/G-V.
Штамм вируса ящура «Азия-1/G-V/2006» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №443 - деп / 22-77 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура для изготовления средств диагностики и профилактики ящура генотипа Азия-1/G-V.
Сущность изобретения отражена на графическом изображении:
фиг. 1. - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического серотипа Азия-1. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VР1.
Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:
SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена белка VР1 штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура генотипа Азия-1/G-V;
SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот 1D-гена белка VР1 штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура генотипа Азия-1/G-V.
Штамм «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
Штамм «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура имеет следующую таксономию: сфера Riboviria, царство Orthornavirae, тип Pisuviricota, класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus, серотип Азия-1, генотип Азия-1/G-V. Штамм возбудителя обладает следующими морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 25 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP4, VP2, VP3, VP1.
Антигенные свойства
По антигенным свойствам штамм «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура относится к серотипу Азия-1. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой, не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются специфические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе и реакции микронейтрализации (РМН).
Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP1 штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура принадлежит к генотипу Азия-1/G-V (фиг. 1).
Антигенное родство (r1) штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура изучено в реакции микронейтрализации вируса, в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:
- штамм «Asia1/AFG 1/2001» (генотип Азия-1/G-I),
- штамм «Asia1/IRN/10/2004» (генотип Азия-1/G-II),
- штамм «Asia1/IND/762-03» (генотип Азия-1/G-III),
- штамм «Asia1/HKN/19/1974» (генотип Азия-1/G-IV),
- штамм «Asia1/IND/18/80» (генотип Азия-1/G-V) (прототип),
- штамм «Asia1/IND/14/95» (генотип Азия-1/G-VI),
- штамм «Asia1/BAR/8/2009» (генотип Азия-1/G-VIII),
- штамм «Азия-1/Таджикистан/2011» (генотип Азия-1/Sindh-08).
Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа Азия-1, против 102 ТЦД50 гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r1 определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7, 8, 9].
Значение r1 в РМН интерпретировали следующим образом:
при ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными;
при < 0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма.
Максимальное родство отмечается при значении r1 в РМН, стремящимся к 1,0.
Показатели антигенного родства при изучении штамма «Азия-1/G-V/2006» составили r1 от 0,01 до 0,28, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа Азия-1 (табл. 1).
Гено- и хемотаксономические характеристики
Штамм «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура является РНК(+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 8,085×106 Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,86×106 Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех структурных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.
Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,0% РНК и 69,0% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса, в том числе такой важный фермент как РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации РНК для сборки вирионов.
Физические свойства
Масса вириона составляет 8,46×10-18 г. Плавучая плотность 1,48 г/см3.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм «Азия-1-1/G-V/2006» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при pH 7,40-7,72. Сдвиги pH в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,5°С).
Дополнительные признаки и свойства
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.
Биотехнологические характеристики
Штамм «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).
При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Исследование биологических свойств штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура при репродукции в монослойных перевиваемых клеточных линиях
При выделении изолята вируса ящура с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура [7].
Биологические и вирусологические методы включали в себя метод выделения в клеточной линии и адаптацию изолята вируса ящура к ним.
Процесс выделения возбудителя ящура проводили в монослойных перевиваемых клеточных линиях ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 с последующей адаптацией в течение 5 последовательных пассажей. Культуры клеток выращивали в соответствующих питательных средах, в стационарных условиях во флаконах с площадью поверхности 25,0 см2, отмывали от ростовой среды и заражали 33%-ной суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД50 на клетку), приготовленной в растворе Хэнкса с 1,0% гидролизата лактальбумина. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов вирусную суспензию предварительно обрабатывали 10%-ным раствором хлороформа. После 30-минутного контакта вируса с клеточной культурой при температуре 37,0±0,1°C во флаконы вносили по 5,0 см3 поддерживающей среды и инкубировали при температуре 37,0±0,1°C до появления цитопатического действия (ЦПД) в культуре клеток, которое представлено в виде округления клеток, повышения их оптической плотности, дегенерации и отделении клеток от поверхности субстрата. При ЦПД не менее 95% клеток, флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 2700 g в течение 20 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение не менее 24 часов проявлялось 95-100% ЦПД в монослое клеточных культур. Адаптация эпизоотического изолята к различным клеточным линиям наступала на уровне пятого пассажа. Титр инфекционной активности вируса ящура определяли с помощью разработанной ранее методики [10].
Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 2, данные которой свидетельствуют о высокой адаптационной способности изолята вируса ящура к использованным клеточным линиям. В монослойной культуре клеток ПСГК-30 за 11 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,21±0,10 lg ТЦД50/см3. В монослойной культуре клеток IB-RS-2 за 14 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,10±0,10 lg ТЦД50/см3. В монослойной культуре клеток ВНК-21 за 18 ч получали вирусную суспензию с активностью в РСК 1:16 и титром инфекционной активности 7,14±0,10 lg ТЦД50/см3. Каждое исследование и культивирование проводили 10 раз. В итоге получен штамм «Азия-1/G-V/2006» с охарактеризованными биологическими культуральными свойствами, который далее использовали для исследования его свойств.
Пример 2. Исследование биологических свойств штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура на крупном рогатом скоте
Заражение КРС исходным штаммом вируса ящура проводили интрадермолингвально (I пассаж). Адаптацию и наработку штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура на КРС проводили в течение двух последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт на этапе второго пассажа на КРС получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР). Подготовленные разведения с 10-2 по 10-6 вводили интрадермолингвально в 4 точки по 0,1 см3 двум головам КРС. Учёт результатов титрования на животных проводили спустя 24 ч по наличию афт на месте введения разведений вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006». Титр инфекционной активности на КРС данного штамма вируса ящура на стадии первого пассажа на КРС составил 5,50 lg ИД50/0,1 см3, второго пассажа - 6,25 lg ИД50/0,1 см3. Таким образом, была получена 10%-ная афтозная суспензия вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006» (2 пассаж на КРС) с титром инфекционной активности 6,25 lg ИД50/0,1 см3.
Пример 3. Исследование биологических свойств штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура на свиньях
Заражение свиней исходным штаммом «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура проводили внутрикожно на стадии первого пассажа в область венчика передних конечностей. Адаптацию и наработку указанного штамма вируса ящура на свиньях вели в течение двух последовательных пассажей. С целью определения титра инфекционной активности адаптированного штамма из афт второго пассажа на свиньях получали 10%-ную вирусную суспензию, из которой готовили последовательные 10-кратные разведения с использованием в качестве растворителя 1/15 М ФБР. Подготовленные разведения с 10-2 по 10-6 вводили внутрикожно в венчики копытец по 0,1 см3 в 4 точки на каждый палец конечности одного разведения, из расчета 1 разведение на 2 копытца 1 конечности каждому из 2 подопытных подсвинков.
Учёт результатов титрования проводили через 24 ч по наличию афт на месте введения разведений. Титр инфекционной активности на свиньях для штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура на свиньях на стадии первого пассажа составил 6,00 lg ИД50/0,1 см3, второго - 6,50 lg ИД50/0,1 см3. Таким образом, была получена 10%-ная афтозная суспензия вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006» (2 пассаж на подсвинках) с титром инфекционной активности 6,50 lg ИД50/0,1 см3.
Пример 4. Исследование биологических свойств штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура при репродукции в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH
Штамм «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура репродуцировали в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH. В качестве поддерживающей среды использовали среду Игла, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого при рН среды 7,40-7,72. Клеточную линию заражали вирусом из расчета 0,005 ТЦД50/клетка.
Культивирование штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура осуществляли при температуре 37,0±0,1°С до достижения ЦПД вируса, соответствующего не менее 95%. Полученную вируссодержащую суспензию контролировали на стерильность и содержание 146S компонента и общего вирусного белка (ОВБ). Полученные суспензии были стерильными. Концентрация ОВБ в суспензии составляла 5,59±0,18 мкг/см3. Значения титра инфекционной активности вируса, а также процентное содержание 146S компонента штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура отражены в таблице 3, из данных которой видно, что при средней концентрации клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH, равной 3,89±0,12 млн клеток/см3, дозе заражения 0,005 ТЦД50/клетку и продолжительности репродукции вируса 9,65±0,47 ч средний титр инфекционной активности возбудителя ящура был равен 9,47±0,15 lg ТЦД50/см3. Концентрацию 146S компонента вируса ящура определяли с помощью ранее разработанной методики [11]. Содержание данного компонента составило 83,10±0,75 % (4,65±0,16 мкг/см3).
Пример 5. Определение типовой специфичности и активности штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура
Исследование типовой специфичности и активности штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура проводили в реакции связывания комплемента (РСК). К полученному антигену штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура, взятому в объеме 0,4 см3 в цельном виде и в разведениях 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 добавляли по 0,1 см3 гомологичной и гетерологичных гипериммунных сывороток, полученных на вирус ящура в рабочем (удвоенном) титре и 0,1 см3 комплемента в рабочем разведении. Смесь выдерживали в водяной бане в течение 20 мин при температуре 37,0±0,1°С. Затем вносили по 0,2 см3 гемолитической системы и выдерживали 30 мин при температуре 37,0±0,1°С. Положительный результат реакции соответствовал 100%-ной задержке гемолиза эритроцитов барана («4 креста»). Параллельно проводили контрольные реакции без сыворотки, без комплемента и компонентов реакции.
В качестве реагентов в РСК использовали сыворотки ящурные типоспецифические гипериммунные морских свинок, полученные на производственные штаммы вируса ящура «А №2029/Турция/06», «Азия-1/G-V/2006» (предлагаемое изобретение), «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SAT-2/ETH/2/91», «О №2311/Забайкальский/2016» комплемент сухой для РСК, гемолизин (сыворотка гемолитическая), эритроциты барана 2% (взвесь на физиологическом растворе, рН = 7,05-7,15). В качестве контроля использовали антигены вируса ящура штаммов «А №2029/Турция/06», «Азия-1/G-V/2006», «Азия-1/Таджикистан/2011», «SAT-1 №96/62», «SAT-2/ETH/2/91», «О №2311/Забайкальский/2016».
Результаты исследования отражены в таблице 4, из которой следует, что штамм «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура обладает выраженной типовой специфичностью, относится к вирусу ящура серотипа Азия-1 и активен в РСК в разведении 1:32.
Пример 6. Получение, контроль качества и применение антигена штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа Азия-1/G-V
Для получения антигена штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура как компонента для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа Азия-1/G-V проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 7,00 lg ТЦД50/см3. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли за счет полигексаметиленгуанидина.
Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 40 мин. при 5000 об/мин и 4±2°С на центрифуге типа Bekman J2-21 (Beckman Coulter, USA) или аналоге. Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 Д (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 9% и хлорид натрия (сухой) до конечной концентрации 0,85%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2°С в течение 20±1 ч. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин., осадок растворяли в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе, концентрируя в 8 раз (1/8 от первоначального объёма).
К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура. Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле.
Для получения очищенного антигена штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50%. Инактивированную суспензию вируса ящура наливали по 10 мл в центрифужные пробирки, затем последовательно подслаивали растворы сахарозы, начиная с 10%-го и заканчивая 50%-м раствором. Пробирки помещали в металлические центрифужные стаканы и после тщательно выполненного уравновешивания центрифугировали при скорости 50 000 об/мин и температуре 4±2°С в течение 4 часов. Фракционирование градиента сахарозы производили с помощью перистальтического насоса, отбирая фракции по 1 мл в отдельные пробирки. Опалесцирующий слой, содержащий очищенный антиген вируса ящура, располагается приблизительно в 30%-м слое сахарозы. Данную фракцию переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 50 000 об/мин. и температуре 4±2°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.
Результаты спектрометрического исследования полученных фракций штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура как компонента для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа Азия-1/G-V представлены в таблице 5. Анализ проводили для всех фракций, высокие значения оптической плотности наблюдали для 3-12 фракции с максимальными значениями для 6-9 пиков.
Проведен электрофорез полученных фракций в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях для отобранной фракции. Полученные результаты свидетельствовали, что 8-кратный антиген вируса ящура не содержал примесных белков.
С помощью реакции связывания комплемента определили концентрацию 146S компонента в полученном антигене, которая составила 37,20±0,04 мкг/см3 (n = 3, p<0,005), что достаточно для использования при изготовлении диагностических наборов для выявления антигена и антител против вируса ящура, а также для изготовления специфических препаратов для профилактики данного заболевания.
Таким образом, получен и проведен контроль качества антигена штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа Азия-1/G-V.
Полученный антиген использовали в качестве биопрепарата для проведения реакции связывания комплемента для детекции антигена вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006» в исследуемых пробах при изготовлении вакцинных препаратов. Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 752 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. По результатам проведения реакции связывания комплемента (РСК) доказали, что из 752 образцов сывороток крови все определены в качестве положительных. Для исследования специфичности реакции тестировали 204 отрицательных проб. В результате исследования с помощью РСК, что из 204 отрицательных проб все определены в качестве отрицательных. Пользуясь статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,51-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,21-100,00%, k-критерий - 1,000; общая точность (DAc) - 99,61-100,00%.
Таким образом, полученный антиген штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура применим для использования в качестве биопрепарата в диагностических тест-системах.
Пример 7. Применение антигена вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006» для получения сывороток кролика против антигена штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура
Для получения сыворотки кролика против антигена штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура как биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа Азия-1/G-V применяли 20 клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.
Для гипериммунизации животных применяли антиген вируса ящура, полученный как описано в примере 6, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-28 VG («Seppic», Р. Франция) (в соотношении адъювант/антиген = 65/35 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 21 и 42 дни в объеме 0,5 см3. Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливали и получали сыворотку крови, содержащую антитела против антигена штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре 2-8°С.
Полученные 20 сывороток крови кроликов проверяли в реакции связывания комплемента и определили, что их активность составила 1:10000-1:11000. Данные показатели являются высокими и достаточными для изготовления диагностических наборов по выявлению антигена и антител против вируса ящура.
Изготовленные сыворотки объединили в общий пул, провели лиофильную сушку и, таким образом, получили биопрепарат, который использовали для проведения реакции связывания комплемента для детекции антигена вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006». Для определения диагностической чувствительности реакции анализировали 589 проб антигена, которые являлись заведомо положительными. По результатам проведения реакции связывания комплемента (РСК) доказали, что из 589 образцов сывороток крови все определены в качестве положительных. Для исследования специфичности реакции тестировали 200 отрицательных проб. В результате исследования с помощью РСК, что из 200 отрицательных проб все определены в качестве отрицательных. Пользуясь статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,38-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,17-100,00%, k-критерий - 1,000; общая точность (DAc) - 99,53-100,00%.
Таким образом, полученный антиген вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006» применен для иммунизации животных как биопрепарат. Получен и проведен контроль качества сывороток кролика против антигена штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура, а также показано применение полученной сыворотки как биопрепарата для диагностики ящура генотипа Азия-1/G-V.
Пример 8. Применение антигена вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006» для получения вакцины.
Из полученного антигена (по примеру 6), приготовили сорбированную вакцину для крупного рогатого скота. Провели иммунизацию вакциной в цельном виде 5 голов КРС. На 21 сутки после иммунизации отобрали кровь, из которой получили сыворотки крови, и исследовали на наличие антител к структурным белкам вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006» в реакции микронейтрализации (РМН) и ИФА. Результаты исследования отражены в таблице 6, из которой следует, что среднее значение титра вируснейтрализующих антител в РМН составило 7,75±0,25 log2 SN50 (положительно, ≥5,5 log2 SN50). В ИФА процент ингибиции был более 50%, что свидетельствует о том, что все сыворотки были положительными. Таким образом, по двум реакциям получили согласованные результаты о наличии защитного количества антител против заражения вируса ящура гомологичным штаммом «Азия-1/G-V/2006». Следовательно, полученный антиген из штамма «Азия-1/G-V/2006» можно применять для изготовления биопрепарата для специфической профилактики ящура, обеспечивающей защиту от ящура указанного штамма.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа Азия-1/G-V для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура».
1. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th еd. Paris, 2022. - Ch. 3.1.8.
2. Пономарев А.П., Узюмов В.Л. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.
3. Alexandersen, S. The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease / S. Alexsandersen, Z. Zhang, A.L. Donaldson // J. Compr. Pathol. - 2003. - V. 129. - P. 268-282.
4. Жильцова М.В. Биологические свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типов А, О и Азия-1: Автореф. дис. кан. наук. - Владимир: 2008. - 23 с.
5. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. / Под ред. А.Н. Бурдова. - М., Агропромиздат, 1990, 320 с.
6. Анализ эпизоотической ситуации по ящуру в России с 2010 г. по март 2019 г. / В. П. Семакина, Т. П. Акимова, В. А. Мищенко, А. К. Караулов // Ветеринария. - 2019. - № 11. - С. 16-20.
7. Методические рекомендации по выделению и идентификации штаммов вируса ящура /А. А. Гусев, В. М. Захаров, Ж. А. Шажко и др.; ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир. 2002. - 31 с.
8. Методические рекомендации по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации /С. Р. Кременчугская, М. В. Жильцова, Т. К. Майорова; ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2012. - 36 с.
9. Эпизоотологические особенности ящура типа А, вызванного гетерологичными штаммами вируса / А. В. Мищенко, В. А. Мищенко, В. В. Дрыгин [и др.] // Ветеринария. - 2014. - № 11. - С. 20-24.
10. Патент № 2674076 C1 Российская Федерация, МПК А61К 39/135 С12Q 1/68. Способ определения титра инфекционной активности вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: № 2017145889: заявл. 25.12.2017: опубл. 04.12.2018 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").
11. Патент № 2712769 C1 Российская Федерация, МПК G01M 33/58, C12Q 1/68. Способ спектрометрического определения концентрации 146S частиц вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины по оценке количества молекул вирусной РНК, выделенной после иммунного захвата вирионов: № 2019116272: заявл. 27.05.2019: опубл. 31.01.2020 / Д.А. Лозовой, Д.В. Михалишин [и др.]; заявитель Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ").
Таблица 1
Антигенное соответствие (r1) штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура с производственными штаммами вируса ящура серотипа Азия-1 в реакции микронейтрализации
Исследуемые штаммы вируса ящура |
Значения показателя r
1
в реакции микронейтрализации с производственными штаммами вируса ящура для штамма
«Азия-1/G-V/2006» |
«Asia1/AFG 1/2001» (генотип Азия-1/G-I) | 0,12 |
«Asia1/IRN/10/2004» (генотип Азия-1/G-II) | 0,14 |
«Asia1/IND/762-03» (генотип Азия-1/G-III) | 0,17 |
«Asia1/HKN/19/1974» (генотип Азия-1/G-IV) | 0,19 |
«Asia1/IND/18/80» (генотип Азия-1/G-V) (прототип) | 0,28 |
«Asia1/IND/14/95» (генотип Азия-1/G-VI) | 0,04 |
«Asia1/BAR/8/2009» (генотип Азия-1/G-VIII) | 0,01 |
«Азия-1/Таджикистан/2011» (генотип Азия-1/Sindh-08) | 0,09 |
Таблица 2
Биологические свойства штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура при культивировании в клеточных линиях (предлагаемое изобретение)
(n=10)
Наименование клеточной линии |
Время проявления
биологической активности, ч |
Количество адаптационных пассажей | Характеристика адаптированного материала | |
Активность в РСК | Титр инфекционной активности вируса, lg ТЦД 50 /см 3 | |||
ПСГК-30 | 11 | 5 | 1:16 | 7,21±0,10 |
IB-RS-2 | 14 | 5 | 1:16 | 7,10±0,10 |
ВНК-21 | 18 | 5 | 1:16 | 7,14±0,10 |
Таблица 3
Оценка стабильности репродукции штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура (предлагаемое изобретение) в суспензионной перевиваемой культуре клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH
(n=10, p<0,05)
№ п/п | Концентрация клеток, млн/см 3 | Доза заражения, ТЦД 50 /кл. | Длительность репродукции, ч |
Титр инфекционной активности вируса,
lg ТЦД 50 /см 3 |
Концент-рация ОВБ, мкг/см 3 |
Концентрация
146S компонента, мкг/см 3 |
Содержание 146S компонента, % |
1 | 3,9 | 0,005 | 9,5 | 9,40 | 5,52 | 4,65 | 84,2 |
2 | 3,9 | 0,005 | 9,0 | 9,40 | 5,50 | 4,53 | 82,3 |
3 | 4,0 | 0,005 | 10,0 | 9,46 | 5,62 | 4,63 | 82,3 |
4 | 3,9 | 0,005 | 10,0 | 9,39 | 5,51 | 4,64 | 84,1 |
5 | 3,9 | 0,005 | 9,0 | 9,35 | 5,42 | 4,51 | 83,2 |
6 | 4,0 | 0,005 | 9,5 | 9,75 | 5,89 | 4,93 | 83,6 |
7 | 3,9 | 0,005 | 10,5 | 9,39 | 5,50 | 4,57 | 83,0 |
8 | 3,9 | 0,005 | 10,0 | 9,35 | 5,40 | 4,43 | 82,0 |
9 | 4,2 | 0,005 | 9,5 | 9,75 | 5,90 | 4,90 | 82,9 |
10 | 4,2 | 0,005 | 9,5 | 9,50 | 5,61 | 4,68 | 83,4 |
M±m | 3,89±0,12 | 0,005 | 9,65±0,47 | 9,47±0,15 | 5,59±0,18 | 4,65±0,16 | 83,10±0,75 |
Примечание: ОВБ - общий вирусный белок,
146S - иммуногенный компонент,
ТЦД - тканевая цитопатическая доза.
Таблица 5
Результаты спектрометрического исследования полученных фракций штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура (предлагаемое изобретение) как компонента биопрепарата для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа Азия-1/G-V
(n = 3, p<0,005)
№ фракции п/п | Значение оптической плотности, у.е. |
1 | 0,010±0,001 |
2 | 0,302±0,001 |
3 | 0,845±0,001 |
4 | 1,522±0,001 |
5 | 1,899±0,001 |
6 | 2,056±0,001 |
7 | 2,568±0,002 |
8 | 2,899±0,002 |
9 | 2,602±0,001 |
10 | 1,899±0,001 |
11 | 1,456±0,001 |
12 | 0,788±0,002 |
13 | 0,512±0,001 |
14 | 0,013±0,001 |
Claims (1)
- Штамм «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа Азия-1/G-V, семейства Picornaviridae, рода Aphthоvirus, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №443 - деп. / 22-77 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа Азия-1/G-V.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2816943C1 true RU2816943C1 (ru) | 2024-04-08 |
Family
ID=
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2744791C1 (ru) * | 2020-05-26 | 2021-03-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровью животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Штамм Азия-1 N 2356/14/2018 вируса ящура Aphtae epizooticae типа Азия-1 для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа Азия-1 |
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2744791C1 (ru) * | 2020-05-26 | 2021-03-15 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровью животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") | Штамм Азия-1 N 2356/14/2018 вируса ящура Aphtae epizooticae типа Азия-1 для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа Азия-1 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
ALEXANDERSEN, S. The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease, J. Compr. Pathol., 2003, v. 129, p. 268-282. * |
VALARCHER, J.F. et al. Recent spread of FMD virus serotype Asia 1, J Veterinary Record, 2005, 157(1), 30-30. doi:10.1136/vr.157.1.30. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN113564130B (zh) | 柯萨奇病毒a10型毒株及其应用 | |
CN114774372A (zh) | 柯萨奇病毒a10型毒株及其疫苗和应用 | |
CN113564133B (zh) | 柯萨奇病毒a16型毒株及其免疫原性组合物和应用 | |
CN111057682B (zh) | 一株禽源h9n2亚型禽流感毒株分离鉴定及应用 | |
RU2699671C1 (ru) | Вакцина для ранней защиты против ящура типа О инактивированная эмульсионная | |
Kono et al. | An epidemic of Getah virus infection among racehorses: properties of the virus | |
RU2816943C1 (ru) | Штамм "Азия-1/G-V/2006" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа Азия-1/G-V для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура | |
RU2817257C1 (ru) | Штамм "SAT-2/XIV/2023" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-2/XIV для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура | |
RU2811585C1 (ru) | Штамм "O/ARRIAH/Mya-98" вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура | |
Lin et al. | Characterization of turkey coronavirus from turkey poults with acute enteritis | |
RU2817031C1 (ru) | Штамм "О N 2222/Тайвань/1/2012" вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура | |
RU2817256C1 (ru) | Штамм А/Египет/EURO-SA/2022 вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа A/EURO-SA | |
RU2806606C1 (ru) | Штамм "О N 2620/Оренбургский/2021" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа O/ME-SA/Ind-2001e для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура | |
RU2799601C1 (ru) | Штамм А/Афганистан/2017 вируса ящура Aphtae epizooticae типа А для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А | |
RU2809223C1 (ru) | Штамм "O N 2241/Эфиопия/2011" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа О/ЕА-3 для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура | |
CN113736749A (zh) | 一株禽流感病毒毒株及其应用 | |
RU2799602C1 (ru) | Штамм А/Иран/2018 вируса ящура Aphtae epizooticae типа А для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А | |
RU2806602C1 (ru) | Штамм "SAT-2/Кения/19/2017" вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления средств диагностики и профилактики ящура генотипа SAT-2/IV | |
RU2807038C1 (ru) | Штамм вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-1/X | |
RU2804634C1 (ru) | Штамм "SAT-1/Кения/2017" вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-1/NWZ | |
RU2808493C1 (ru) | Штамм вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/VII | |
RU2793828C1 (ru) | Штамм "О/Кения/2017" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа O/EA-2 для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа O/EA-2 | |
RU2773659C1 (ru) | Штамм А 2205/G IV вируса ящура Aphtae epizooticae типа А для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А | |
RU2799606C1 (ru) | Штамм "SAT-1/Танзания/2012" вируса ящура Aphtae epizooticae генотипа SAT-1/I для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-1/I | |
RU2804875C1 (ru) | Вакцина против ящура генотипа SAT-2/VII из штамма "SAT-2/Eritrea/1998" культуральная инактивированная сорбированная |