CN116426488A

CN116426488A - 一种猫杯状病毒阳性血清及其制备方法及应用

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Publication number: CN116426488A
Application number: CN202310488621.8A
Authority: CN
Inventors: 张贺楠; 李双男; 宗树成; 刘昕泽; 郭太宁
Original assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Current assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Priority date: 2023-05-04
Filing date: 2023-05-04
Publication date: 2023-07-14

Abstract

本发明公开了一种猫杯状病毒阳性血清及其制备方法。所述制备方法以豚鼠作为免疫动物，采用细胞的病毒液及FCV‑VP1亚单位疫苗作为猫杯状病毒抗原进行联合免疫。采用本发明所述工艺制备的猫杯状病毒阳性血清中和效价高达1：4096倍以上，本发明制备的猫杯状病毒阳性血清纯净性好，无菌、无支原体、无外源病毒污染，特异性好。同时，免疫动物为豚鼠，降低了成本，减少了用猫制备阳性血清因同源动物而引起的外源病毒污染风险。本发明制备的阳性血清可用于猫杯状病毒疫苗质量控制如特异性检验、鉴别检验和外源病毒检验以及诊断检测等用途。

Description

一种猫杯状病毒阳性血清及其制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术和动物病毒学领域，尤其涉及一种猫杯状病毒阳性血清的制备及应用。

背景技术

猫嵌杯状病毒(Feline calicivirus，FCV)曾属于小RNA病毒科杯状病毒属，国际病毒分类委员(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)1981年将其单独列为杯状病毒科。FCV具有高度传染性，其中在家猫的的感染率为32.85％，而在多猫环境中，例如流浪动物基地、猫舍等地，FCV感染率可达到40％。最早的FCV是1957年Fastier等在新西兰首次从猫病料中分离到的，主要在上呼吸道和口腔部位组织细胞中复制，引起眼鼻分泌物和口腔、鼻镜溃疡，发病率高但死亡率低，多为良性经过。FCV不断进化变异出毒力更强、组织噬性从上呼吸道扩散到下呼吸道的毒株。1998年以来，美国和欧洲相继出现以高死亡率及系列临床症状为特点的高毒性FCV毒株(VS-FCV)。2000年，Pedersen等分离的VS-FCV可引起猫严重全身性系统疾病，包括发热(40℃以上)、精神不振、呼吸道症状(眼鼻分泌物、口腔溃疡和结膜炎)、肺炎、脱毛、皮下水肿、不同程度的皮肤溃疡等症状，部分感染猫还会出现黄疸及病毒血症。近年来，我国也相继出现了FCV病例，从家猫身上分离出FCV。该病分布在我国从北到南多个地区，黑龙江、吉林、北京、河北、江苏、湖北、上海、广东、广西等多个省市均有发病报道。可见，FCV目前呈世界性分布，对世界和我国造成了严重的影响。

已发文章和专利中尚未有猫杯状病毒阳性血清制备方法的报道和专利，所涉及的猫杯状病毒阳性血清数据，多为猫免疫后的产生的抗体数据以及制备的卵黄抗体数据，但此种抗体效价低，且存在同源动物而引起同源其他外源病毒的污染，

发明内容

本发明通过对免疫程序的摸索，提供了一种针对猫杯状病毒高效价、高纯净性，特异性良好的阳性血清的制备工艺，所制备血清满足外源病毒检验、特异性检验等试验要求，以及为后期相关检测及预防产品的开发奠定了基础，对于兽用生物制品企业有重要的实际应用价值。

(一)要解决的技术问题

为了提升猫杯状病毒特异性阳性血清的效价，满足猫杯状病毒疫苗质量控制、诊断和预防技术需求，本发明提供了一种猫杯状病毒特异性阳性血清及其制备方法。

(二)技术方案

本发明首先提供了一种新的猫杯状病毒株,电镜观察病毒呈球形，无囊膜，粒子直径约为35nm左右，该分离株能够在F81细胞上增殖并产生典型的细胞病变。将该病毒进行蚀斑纯化并经细胞适应性传代，病毒滴度均不低于10^9.0TCID₅₀/ml，其分类命名为猫杯状病毒株,名称为FCV ZMV917，已于2023年1月6日保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.45385。

本发明又提供了所述猫杯状病毒株在制备猫杯状病毒特异性阳性血清中的应用。

本发明再提供一种猫杯状病毒特异性阳性血清的制备方法，包括以豚鼠作为免疫动物进行基础免疫，在进行基础免疫时，采用猫杯状病毒病毒液作为猫杯状病毒抗原进行基础免疫。

本发明发现，在按上述方案以豚鼠为免疫动物，可以较大地提升阳性血清的效价。

优选地，采用所述猫杯状病毒FCV ZMV917抗原对免疫动物进行基础免疫；更优选所述猫杯状病毒抗原的效价≥10^9.5TCID₅₀/ml。

进一步优选地，所述基础免疫的免疫次数为2次，间隔时间为7～14天。免疫剂量为2ml/只；免疫方式为肌肉或皮下注射，免疫部位腿部肌肉或背部皮下。

作为优选，所述免疫动物为体重450～700g的豚鼠。

在所述基础免疫中，所述猫杯状病毒抗原的具体制备过程如下：将猫杯状病毒FCVZMV917按总培养体积0.05％接种在传代细胞中后，培养至80～90％细胞出现病变时收获病毒液；

优选所述传代细胞为F81细胞或CRFK细胞。按照本领域常识，应当在细胞状态较好的时候接种病毒，优选在接种时，所述细胞呈致密单层的生长状态。而细胞的培养条件一般为37℃、5％CO₂。

在所述基础免疫之后，还包括加强免疫1，作为优选方案，所述加强免疫1具体包括：采用猫杯状病毒灭活疫苗对所述免疫动物进行加强免疫；

优选所述猫杯状病毒灭活疫苗的制备方法如下：将猫杯状病毒液灭活后，与佐剂混合制得；更优选在灭活前，所述猫杯状病毒液的病毒含量为≥10^9.5TCID₅₀/ml。

进一步优选地，所述加强免疫1的免疫次数为2次，间隔时间为7～14天。加强免疫1免疫剂量为2ml/只；免疫方式为肌肉或皮下注射；免疫部位腿部肌肉或背部皮下。

进一步优选地，所述灭活的具体过程如下：将β-丙内酯与所述猫杯状病毒液按体积比1：2000于4℃搅拌灭活24小时，再于37℃水浴条件下水解2小时，制得猫杯状病毒灭活抗原。

在所述加强免疫1之后，还包括加强免疫2，作为优选方案，所述加强免疫2具体包括：采用猫杯状病毒VP1蛋白亚单位疫苗对所述免疫动物进行加强免疫；

优选所述猫杯状病毒VP1蛋白亚单位疫苗疫苗的制备方法如下：将表达、纯化的猫杯状病毒VP1蛋白，与佐剂混合制得；更优选，所述猫杯状病毒液VP1蛋白抗原含量为的500μg/ml。优选的，所述猫杯状病毒VP1蛋白的氨基酸残疾序列如序列表中序列1所示。

进一步优选地，所述加强免疫的免疫次数为2次，间隔时间为7～14天。加强免疫2免疫剂量为2ml/只；免疫方式为肌肉或皮下注射；免疫部位腿部肌肉或背部皮下。

为了优化免疫效果，本发明进一步分别对豚鼠的接种方式进行了优化，得到如下优选方案：

作为一种优选方案，在以豚鼠为免疫动物时，免疫接种具体包括：

(1)基础免疫：分别对每只豚鼠皮下注射2ml的所述猫杯状病毒抗原，间隔7～14天，同样剂量同样方法进行再次免疫。

(2)加强免疫1：在进行所述基础免疫后，每隔7～14天分别对每只豚鼠皮下注射2ml所述猫杯状病毒灭活疫苗，共进行2次。

(3)加强免疫2：在进行所述加强免疫1后，每隔7～14天分别对每只豚鼠皮下注射1ml所述猫杯状病毒VP1蛋白亚单位疫苗，共进行2次。

在将佐剂与抗原进行混合时，一般是按照抗原液与佐剂按体积比1∶1混合，冰浴10分钟，4℃保存备用。

按照本领域常识，在所述免疫接种后，还包括采集血清和测定效价的步骤，其中，采集血清的时间一般根据免疫接种的间隔时间进行确定，在此不做进一步限定。

在本发明的一些实施方案中，一般在最后一次免疫后14～21天，无菌采集免疫动物血液，分离血清，测定血清中和抗体效价，效价在1：4096以上，即得猫杯状病毒阳性血清。

本发明中的血清经过纯净性、支原体、外源病毒检测合格后，分装，贴上标签，注明血清名称、规格、日期等，-20℃以下保存。可用于鉴别检验、外源病毒检验和诊断等方面。

本领域人员可对本发明的优选方案进行组合，得到本发明的较佳实施例。

(三)有益效果

(1)本发明所制得的猫杯状病毒特异性阳性血清效价高达1：4096倍以上，比直接免疫猫所得血清效价高，可满足猫杯状病毒诊断技术和疫苗质量控制的要求。

(2)本发明中免疫动物为豚鼠，降低了成本，避免了用猫制备阳性血清所带来的符合要求的试验动物不易获得并且因同源动物所引起的其他外源病毒污染的风险。

(3)本发明制备的猫杯状病毒阳性血清纯净性好，无菌、无支原体、无外源病毒污染，特异性好。

(4)本发明制备的阳性血清可用于猫杯状病毒疫苗质量控制如特异性检验、鉴别检验和外源病毒检验以及诊断检测等用途。

附图说明

图1为FCV RT-PCR检测结果。

M:2000DNA Marker；1：样品扩增产物；2：FCV阳性对照；3：阴性对照

图2为分离株电镜观察(50nm)。

图3分离株致病性感染猫肺部照片。

生物材料保藏

名称为猫杯状病毒株FCV ZMV917，分类命名为猫杯状病毒株,保藏时间为2023年1月6日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.45385。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1、猫杯状病毒FCV ZMV917的获得及鉴定

样品处理：从某宠物医院发病猫采集口、鼻、眼、拭子，该发病猫表现为口炎、结膜炎、并伴有发热等临床症状。样品处理后，经0.22μm滤膜过滤除菌，分装并做标记，-70℃以下保存。

PCR鉴定：提取病毒基因组RNA，经RT-PCR扩增后(引物序列DB22/T2591-2016)，凝胶电泳结果显示，待检样品扩增出特异性的大小约为926bp目的片段，与阳性对照一致，并且阴性对照无目的条带，结果见图1。对收集的鼻拭子进行RT-PCR鉴定，为猫杯状病毒阳性。

病毒分离培养：将处理后的样品上清，按10％的比例接种于长满单层F81细胞的6孔板中，200μl/孔，置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育2小时，然后弃上清，加入含2％胎牛血清的DMEM维持液，2ml/孔，置于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养，逐日观察细胞病变，当细胞病变达80％以上收获培养物，-70℃以下保存。如此方法，连续盲传2代。对分离毒进行三轮蚀斑纯化后，通过PCR、中和试验方法验证病毒纯化效果良好。通过电镜观察病毒粒子，电子显微镜下可以观察到分离株粒子直径在35nm左右，呈球形的，没有囊膜包裹，形态与其它杯状状病毒的形态基本相同，符合FCV形态特征，见图2。该分离株能够在F81细胞上增殖并产生典型的细胞病变。

毒株适应性传代：将纯化病毒液按0.1～0.5％比例接种到长满单层F81细胞培养瓶中，置37℃、5％CO₂培养箱中孵育2小时，然后弃掉培养液，加入含2％胎牛血清的DMEM维持液，放入培养箱继续培养，每日观察细胞病变情况，当病变达80％以上时，收获培养物。

病毒含量测定：将病毒液用DMEM作10倍系列稀释，取10^-1～10^-9稀释度，接种96孔细胞培养板，每个稀释度8孔，每孔100μl，然后每孔加入消化分散的F81细胞液(浓度为5×10⁵cells/ml)100μl，并设正常细胞对照，置37℃、5％CO₂培养箱中，连续观察5～7天，逐孔观察细胞病变(CPE)，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID₅₀。各培养病毒液病毒效价均大于等于10^9.0TCDI₅₀/ml。

理化特性试验：对病毒液进行乙醚敏感性试验，对氯仿敏感性试验，抗胰蛋白酶试验，对酸的敏感试验，对碱的敏感试验，温度敏感性试验。病毒理化特性研究显示，该病毒对乙醚、氯仿、胰蛋白酶均不敏感；对酸敏感；不耐碱，当pH值达到8以上时，病毒含量降低明显；对高温敏感。

致病性测定(动物回归试验)：将病毒液(病毒含量10^8.5TCID₅₀/ml)攻击10～14周龄健康易感猫5只，每只滴鼻接种1.0ml，左右鼻孔各0.5ml，同时设对照猫5只，接种后隔离饲养，连续观察14日，统计发病情况。攻击动物攻毒后第5天开始表现出临床症状，临床症状逐渐加重，表现为:发热、部分猫则体温降低，攻毒组均精神萎靡、食欲减退、鼻分泌物增多等。剖检肺脏肉变，边缘有坏死等。

间接免疫荧光试验证明，该分离株能够与FCV抗体发生特异性的反应，产生特异性的绿色荧光，说明该病毒为FCV毒株。

蛋白印迹实验结果证明，该分离株在感染的F81细胞中有FCV VP1表达。

通过全长基因组序列比较显示，FCV ZMV917株与不同地区的40株FCV参考序列同源性为76.34％至84.88％。主要衣壳蛋白VP1氨基酸序列与不同地区的40株FCV VP1参考序列同源性81.94％至92.09％，遗传进化树显示FCV ZMV917株FCV中国分离株在一小分支，与所有疫苗株均不在一分支。该猫杯状病毒株FCV ZMV917，已于2023年1月6日保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.45385。

通过以上试验研究，我们最终确定本次分离病毒为猫杯状病毒，并命名为FCVZMV917株。

实施例2、猫杯状病毒阳性血清制备方法及其效果验证

1、猫杯状病毒抗原的制备

1)将猫杯状病毒FCV ZMV917株接种生长致密单层的传代细胞F81细胞，37℃、5％CO₂条件下进行培养，当80～90％细胞出现病变时收获毒液，作为基础免疫中的猫杯状病毒抗原。

2)抗原浓缩与纯化：将上述制备好的猫杯状病毒抗原，离心去除细胞碎片，然后采用300KD中空纤维超滤浓缩系统纯化浓缩3倍去除小分子杂蛋白，收集猫杯状病毒抗原液，-70℃保存备用。

所得猫杯状病毒抗原的病毒含量不低于10^9.5TCID₅₀/ml。

2、猫杯状病毒灭活疫苗的制备

1)灭活：用β-丙内酯对猫杯状病毒FCV ZMV917毒液进行灭活，灭活方法为：用1:2000β-丙内酯于4℃搅拌灭活24小时，再于37℃水浴条件下水解2小时。

2)佐剂的配制：

按软脂酸∶角鳖烯∶吐温80∶司盘85＝15：15：7：63比例称取，于恒温磁力搅拌水浴锅(80℃)中加热融化，搅拌均匀得油相。再按0.1％称取壳聚糖，溶于柠檬酸缓冲液(10mmol/L，pH 6.5)中，于80℃水浴中加热得水相。在磁力搅拌下，将油相加入热的水相中。待搅拌均匀后，使用高剪切仪于12000r/min转速下剪切5分钟得到粗分散佐剂。然后使用超声破碎仪在300W振幅下破碎20分钟得初乳化佐剂。

3)疫苗配制：抗原液与初乳佐剂按体积比1∶1混合，12000r/min转速下剪切1分钟，冰水浴10分钟，固化得所需疫苗。

3、猫杯状病毒亚单位疫苗的制备

1)将表达、纯化的猫杯状病毒VP1蛋白(序列如序列表中序列1所示)方法：人工合成FCV-VP1基因序列，克隆于pET30a载体，IPTG37℃诱导4小时，采用SDS-PAGE和WestenBlot进行蛋白鉴定，对获得的蛋白液采用Ni亲和层析柱进行蛋白纯化，对纯化后的蛋白液进行浓度测定，使得VP1蛋白含量为500μg/ml。

2)佐剂的配制：

4、免疫接种。

1)基础免疫：分别对每只豚鼠皮下注射2ml的猫杯状病毒抗原，7～14天后，同样剂量同样方法进行再次免疫。

2)加强免疫1：基础免疫后每14天后分别对每只豚鼠进行皮下注射2ml猫杯状病毒灭活疫苗，免疫2次。

3)加强免疫2：加强免疫1后每隔14天后分别对每只豚鼠进行皮下注射1ml猫杯状病毒亚单位灭活疫苗，免疫2次。

5、采集血清。

最后一次免疫后14天后，无菌采集免疫动物血液，分离血清。

血清的检验：对上述制备的阳性血清样品分别进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、中和效价测定、特异性检验。特异性检验主要针对猫泛白细胞减少症病毒、猫鼻气管炎病毒等常见猫病原。结果显示所制备的阳性血清均为淡黄色澄清稍液体，无明显溶血或异物；无菌、无支原体、无外源病毒污染；未检测到猫泛白细胞减少症病毒、猫鼻气管炎病毒抗体，特异性良好。检验合格的血清混合，分装，贴上标签，注明血清名称、规格、日期等，-20℃以下保存。

按照现行《中国兽药典》规定的方法进行中和试验测定血清中和100TCID₅₀猫杯状病毒FCV ZMV917的中和效价,效价为1：4096。

实施例3、猫杯状病毒阳性血清制备方法2

1、猫杯状病毒抗原的制备

2)抗原浓缩与纯化：将上述制备好的猫杯状病毒抗原，离心去除细胞碎片，然后采用100KD中空纤维超滤浓缩系统纯化浓缩3倍去除小分子杂蛋白，收集猫杯状病毒抗原液，-70℃保存备用。

所得猫杯状病毒抗原的病毒含量不低于10^9.5TCID₅₀/ml。

2、猫杯状病毒灭活疫苗的制备。

1)灭活：用β-丙内酯对猫杯状病毒毒液进行灭活，灭活方法为：用1:2000β-丙内酯于4℃搅拌灭活24小时，再于37℃水浴条件下水解2小时。

2)佐剂的配制：

3、免疫接种。

基础免疫：分别对每只兔皮下或肌肉注射2ml的猫杯状病毒抗原，7～14天后，同样剂量同样方法进行再次免疫。

加强免疫：基础免疫后每隔14天分别对每只兔进行皮下或肌肉注射8ml猫杯状病毒灭活疫苗，免疫4次。

4、采集血清

最后一次免疫后14天，无菌采集免疫动物血液，分离血清。

按照现行《中国兽药典》规定的方法进行中和试验测定血清中和100TCID₅₀猫杯状病毒FCV ZMV917株的中和效价,效价为1：1024。

实施例4、猫杯状病毒阳性血清制备方法3

1、猫杯状病毒抗原的制备

所得猫杯状病毒抗原的病毒含量不低于10^9.5TCID₅₀/ml。

2、猫杯状病毒灭活疫苗的制备。

2)佐剂的配制：

3、免疫接种。

基础免疫：分别对每只豚鼠皮下或肌肉注射2ml的猫杯状病毒抗原，7～14天后，同样剂量同样方法进行再次免疫。

加强免疫：基础免疫后每隔14天分别对每只豚鼠进行皮下或肌肉注射2ml猫杯状病毒灭活疫苗，免疫4次。

4、采集血清

最后一次免疫后14天，无菌采集免疫动物血液，分离血清。

按照现行《中国兽药典》规定的方法进行中和试验测定血清中和100TCID₅₀猫杯状病毒FCV ZMV917株的中和效价,效价为1：2048。

实施例5、阳性血清在猫杯状病毒外源病毒检验中的应用

选取本发明实施例2制备的中和效价为1:4096的阳性血清分别用于猫杯状病毒的外源病毒检验(病毒含量分别为10^9.5TCID₅₀/mL、10^10.0TCID₅₀/mL)。按照现行《中国兽药典》三部附录方法，取1mL稀释病毒液与阳性血清进行中和，然后进行外源病毒检验。结果：所有样品均未出现中和不完全的现象，且阳性血清未造成细胞毒性。

实施例6、阳性血清在猫杯状病毒鉴别检验中的应用

将F81细胞铺于激光共聚焦专用培养皿，37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，待其长满单层。将猫杯状病毒FCV ZMV917 F5代病毒液接种于F81细胞，每孔200μl，设置3个重复及对照组，将细胞培养皿置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育90分钟，弃上清，加入500μl 2％FBS的DMEM维持液，置于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养24小时，弃上清，每孔加入200μl 4％多聚甲醛室温固定10分钟，弃去固定液，PBS(0.01mol/L,pH7.2～7.4)洗涤3次，每孔加入200μl1％ Triton X-100，置于室温下静止15分钟；弃去Triton X-100，PBS(0.01mol/L,pH7.2～7.4)洗涤3次，每孔加入200μl 5％ BSA，置于室温下封闭30分钟；弃去封闭液，FCV阳性血清用一抗稀释液以1:200比例稀释，每孔加入200μl 4℃孵育过夜；弃去一抗，PBS(0.01mol/L,pH7.2～7.4)洗涤5次，鼠抗兔IgG-FITC用PBS(0.01mol/L,pH7.2～7.4)以1:100比例稀释，每孔加入200μl，置于37℃、5％CO₂培养箱避光孵育1小时；弃去二抗，PBS(0.01mol/L,pH7.2～7.4)洗涤5次，每孔加入100μl抗荧光碎灭剂(含DAPI)，激光共聚焦显微镜下观察结果，并采集照片。

结果如表1所示，结果表明，本发明的阳性血清可以用于鉴别检验猫杯状病毒，血清效价高，纯净性好，中和完全。

表1.阳性血清鉴别检验猫杯状病毒中的结果

毒株名称	间接免疫荧光鉴定结果
		ZM-FCV-1	+
ZM-FCV-2	+
		ZM-FCV-3	+
ZM-FCV-4	+
		ZM-FCV-5	+

Claims

1.一种猫杯状病毒,其特征在于：其分类命名为猫杯状病毒，名称为FCV ZMV917，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.45385。

2.权利要求1所述的猫杯状病毒在制备猫杯状病毒高效价阳性血清中的应用。

3.一种猫杯状病毒阳性血清的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：用猫杯状病毒抗原对免疫动物进行基础免疫；采集免疫动物血液并制备血清，得到猫杯状病毒阳性血清；所述免疫动物为豚鼠；所述猫杯状病毒为权利要求1所述的猫杯状病毒。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述基础免疫的免疫次数为2次，间隔时间为7～14天。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述免疫动物为体重450～700g的豚鼠；所述猫杯状病毒抗原的效价≥10^9.5TCID₅₀/ml。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述猫杯状病毒抗原的具体制备过程如下：所述猫杯状病毒抗原的获得方法为：将猫杯状病毒按总培养体积0.05％接种在传代细胞中后，培养至80～90％细胞出现病变时收获病毒液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述传代细胞为F81细胞或CRFK细胞。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在所述基础免疫之后，还包括加强免疫1，作为优选方案，所述加强免疫1具体包括：采用猫杯状病毒灭活疫苗对所述免疫动物进行加强免疫；

优选的，所述猫杯状病毒灭活疫苗的制备方法如下：将猫杯状病毒液灭活后，与佐剂混合制得；更优选在灭活前，所述猫杯状病毒液的效价状病毒抗原含量为≥10^9.5TCID₅₀/ml；

进一步优选地，所述加强免疫1的免疫次数为2次，间隔时间为7～14天。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：在所述强免疫1之后，还包括加强免疫2，作为优选方案，所述加强免疫2具体包括：采用猫杯状病毒VP1蛋白亚单位疫苗对所述免疫动物进行加强免疫；

优选所述猫杯状病毒VP1蛋白亚单位疫苗疫苗的制备方法如下：将表达、纯化的猫杯状病毒VP1蛋白，与佐剂混合制得；

更优选，所述猫杯状病毒液VP1蛋白抗原含量为的500μg/ml；

进一步优选地，所述加强免疫的免疫次数为2次，间隔时间为7～14天。

10.权利要求3-9中任意一项所述的方法制备的猫杯状病毒阳性血清。