CN117535322A - 具有异源抗原的活的减毒黄病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含黄病毒序列的多核苷酸，其前面是编码黄病毒衣壳蛋白的N末端部分，免疫原性蛋白或其包含免疫原性肽的部分以及2A切割肽的序列，以及由这样的序列编码的病毒。本发明还涉及这样的多核苷酸和病毒作为疫苗的用途。

Description

具有异源抗原的活的减毒黄病毒
本申请是申请日为2018年10月5日、发明名称为“具有异源抗原的活的减毒黄病毒”的中国发明专利申请No.201880074973.6的分案申请。
发明背景
乙型肝炎病毒(HBV)是乙型肝炎的致病物，乙型肝炎是一种能够演变为慢性的肝疾病。慢性乙型肝炎的并发症包括肝硬化和肝细胞癌或肝癌。估计有2.4亿人(主要在亚洲和非洲)慢性感染HBV，每年有超过686000人由于与慢性HBV感染相关的并发症而死亡。HBV是肝DNA病毒科(hepadnaviridae)(具有部分双链基因组DNA的逆转录病毒家族)的成员。它最常见于从受感染的母亲的围产期传播，或通过无保护的性活动或静脉用药水平传播。
HBV感染肝细胞后，HBV核衣壳被转运至细胞核。在那里，遗传物质被修复并作为微型染色体(cccDNA)保留在细胞的细胞核中，在细胞核中它起着储库的作用。
大多数患者有效控制急性感染而没有出现任何明显的临床症状。但是，5-10％的受感染成年人(和>90％的受感染新生儿)无法清除所述病毒并发展慢性乙型肝炎。在清除所述病毒的那些人中，检测到Th1谱(IFN-γ的产生)的强烈和多特异性CD4和CD8 T细胞应答，对HBV核衣壳蛋白[也称为HBV核心抗原(HBcAg或HBc)]特异性的CD4 T细胞应答在HBV控制中是重要的，因为这刺激了CD8 T细胞的活化[Jung等人,(1995)J.Virol.69,3358-3368]。实际上，CD8 T细胞(或CTL)是负责解决所述感染的主要细胞子集，因为它们通过细胞溶解机制和非细胞溶解机制清除HBV感染的肝细胞。在那些不解决所述感染并发展慢性乙型肝炎的人中，所述应答较弱。事实上，已经证明了HBV特异性CTL的水平与HBV控制相关[Thimme等人,(2003)J.Virol.77,68-76]。
恢复强烈的CTL应答是治疗性HBV疫苗的主要目标。迫切期待这种疫苗，以便能够治愈数百万慢性乙型肝炎患者。黄热病疫苗(17D株)是目前可用的最安全和最有效的疫苗之一。接种疫苗的这些人中大约99％(单个剂量后)在数天至数周内产生终生免疫。该疫苗于1938年投入使用，并且从那时起已经分发了6亿多剂。重要的是要注意，YFV17D疫苗不仅诱导有效的中和抗体，而且诱导(i)强烈且广泛定向的CD8+T细胞应答，(ii)异常强烈的记忆T细胞应答以及(iii)有效的先天免疫系统的活化，尤其是树突状细胞。这样的特征可以为构建针对诸如由乙型肝炎病毒引起的那些慢性感染的治疗性疫苗提供理想的背景。
已经尝试克隆黄热病上游的抗原以获得融合蛋白，从而使用蛋白酶信号肽和泛素切割位点从病毒蛋白中释放抗原[Schoggins等人,(2012)Proc NatlAcadSci USA.109,14610-14615.]。
但是，如Bonaldo等人,(2014)Hum.Vaccine.Immunother 10,1256-1265)的综述文章所述，这样的构建体在几次传代后失去异源基因。需要替代的构建体来克服遗传不稳定性。
发明内容
本发明涉及包含黄热病病毒序列的多核苷酸，其中编码所述黄热病病毒的核苷酸序列前面是黄热病病毒衣壳蛋白的N末端部分，接着是T细胞抗原或其包含T细胞抗原的一部分，以及编码Thosea asigna 2A肽的序列。
通常，与全长黄热病病毒序列中的相应序列相比，衣壳基因的N末端部分的核苷酸序列具有一个或多个同义密码子。
在一个实施方案中，所述黄热病病毒衣壳的末端部分编码由序列MSGRKAQGKTLGVNMVRRGVR(SEQ ID NO：2)组成的肽。
在一个实施方案中，所述Thosea asigna 2A肽具有序列EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQID NO：16)。
在一个实施方案中，T2A肽的C末端氨基酸是Gly、Ala、Ser或Thr。
在一个实施方案中，其中所述抗原的密码子使用适合于在细菌中表达。
在一个实施方案中，具有同义密码子的序列是：
atgtctggtcgtaaagctcagggaaaaaccctgggcgtcaatatggtacgacgaggagttcgc(SEQID NO:14)
和
agcggccgcaaagcccagggtaagacactgggcgtgaacatggttcgtcgcggcgtccgg(SEQ IDNO:15)。
在一个实施方案中，所述黄热病病毒是YF 17D减毒病毒。
在一个实施方案中，所述多核苷酸是细菌人工染色体(Bacterial ArtificialChromosome)。
在一个实施方案中，所述BAC包含用于将所述BAC扩增至每个细菌细胞超过10个拷贝的诱导型细菌ori序列以及病毒表达盒，该病毒表达盒包含所述多核苷酸的cDNA并包含用于在哺乳动物细胞中转录所述病毒cDNA和用于将转录的RNA加工成感染性RNA病毒的顺式调节元件。
在一个实施方案中，所述T细胞抗原选自由HBC核心抗原、OVA和EBNA1组成的组，即所编码的T细胞抗原包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列或其包含T细胞表位的片段，所编码的T细胞抗原包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列或其包含T细胞表位的片段，所编码的T细胞抗原包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或其包含T细胞表位的片段；所编码的T细胞抗原包含SEQID NO：13的氨基酸序列。
这样的多核苷酸能够用作疫苗，更具体地用作预防由所述T细胞抗原或部分T细胞表位引起的感染的疫苗。
此外，上述多核苷酸能够用作同时预防由所述T细胞抗原或部分T细胞表位引起的感染和黄热病感染的疫苗。
本文公开了制备针对T细胞抗原的疫苗的方法，其包括步骤：
(a)提供一种BAC，其包含用于将所述BAC扩增至每个细菌细胞超过10个拷贝的诱导型细菌ori序列，以及
病毒表达盒，其包含如上面所描述的多核苷酸的cDNA，并包含用于在哺乳动物细胞中转录所述病毒cDNA和用于将转录的RNA加工成感染性RNA病毒的顺式调节元件
(b)用步骤(a)所述的BAC转染哺乳动物细胞
(c)验证步骤(b)的转染细胞所复制的病毒的毒力和产生针对所述T细胞抗原的抗体的能力，将步骤(c)中验证的病毒克隆到载体中，
将所述载体配制成疫苗制剂。
本文所述的载体是BAC，其可包含用于将所述BAC扩增至每个细菌细胞超过10个拷贝的诱导型细菌ori序列。
本发明同样适用于其他黄病毒(flavivirus)，其中T细胞抗原被克隆到衣壳蛋白的N末端。
本发明同样适用于嵌合黄热病株，其中YFV的prME基因被其他黄病毒(例如，日本脑炎或登革热)的prME基因取代。
在以下声明中进一步总结了本发明：
1.包含黄病毒序列的多核苷酸，其特征在于编码所述黄病毒的核苷酸序列前面是编码以下的序列：
-黄病毒衣壳蛋白的部分，其包含黄病毒衣壳蛋白的N末端部分或由黄病毒衣壳蛋白的N末端部分组成，
-免疫原性蛋白质，或其包含免疫原性肽的部分，以及
-2A切割肽。
为了疫苗接种的目的，这些黄病毒通常是活的感染性减毒病毒。
2.根据声明1所述的多核苷酸，其中所述黄病毒衣壳蛋白的部分包含黄病毒衣壳蛋白的21个N末端氨基酸或由黄病毒衣壳蛋白的21个N末端氨基酸组成。
21个AA的实施方案基于用YFV进行的实施例，但是根据黄病毒的类型可以有所不同，并且对于日本脑炎病毒能够短至16个氨基酸。
除了16至21个氨基酸的最小必需N末端外，取决于所考虑的黄病毒，嵌合病毒可在插入位点之前包含衣壳蛋白的另一部分，使得衣壳的N末端片段可具有25、30、35、40或50个氨基酸的长度，因为已经描述了具有34个氨基酸的N末端片段的登革热病毒构建体(Fischl&Bartenschlager(2013)Methods Mol.Biol.1030,205-219)。
3.根据声明1或2所述的多核苷酸，其中编码衣壳基因的N末端部分的核苷酸序列与全长病毒序列中的相应序列相比具有一个或多个同义密码子。
4.根据声明1、2或3所述的多核苷酸，其中所述黄病毒是黄热病病毒。
5.根据声明1至4中任一项所述的多核苷酸，其中黄热病病毒衣壳的末端部分由序列MSGRKAQGKTLGVNMVRRGVR(SEQ ID NO：2)组成。
6.根据声明1至5中任一项所述的多核苷酸，其中所述2A切割肽包含序列DXEXNPGP[SEQ ID NO：46]。
7.根据声明1至5中任一项所述的多核苷酸，其中所述2A切割肽包含序列LxxxGDVExPGP[SEQ ID NO：17]。
8.根据声明1至7中任一项所述的多核苷酸，其中所述2A切割肽包含序列LLTCGDVEENPGP[SEQ ID NO：18]。
9.根据声明1至8中任一项所述的多核苷酸，其中所述2A切割肽是具有氨基酸序列EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：16)的Thosea asigna 2A肽。
10.根据声明1至9中任一项所述的多核苷酸，其中所述2A切割肽的C末端氨基酸是Gly、Ala、Ser或Thr。
11.根据声明1至10中任一项所述的多核苷酸，其中所述免疫原性蛋白质是T细胞抗原且其免疫原性片段包含T细胞表位。
12.根据声明1至11中任一项所述的多核苷酸，其中编码所述免疫原性蛋白质或其片段的序列的5'的编码衣壳蛋白的核苷酸序列具有野生型黄病毒的核苷酸序列。
13.根据声明1至11中任一项所述的多核苷酸，其中所述免疫原性蛋白质或其免疫原性片段的密码子使用适合于在细菌中表达。
14.根据声明1至12中任一项所述的多核苷酸，其中具有同义密码子的序列是：
atgtctggtcgtaaagctcagggaaaaaccctgggcgtcaatatggtacgacgaggagttcgc(SEQID NO:14)
和
agcggccgcaaagcccagggtaagacactgggcgtgaacatggttcgtcgcggcgtccgg(SEQ IDNO:15)。
15.根据声明1至14中任一项所述的多核苷酸，其中所述黄热病病毒是YF 17D减毒病毒。
16.根据声明1至15中任一项所述的多核苷酸，其是细菌人工染色体。
17.根据声明16所述的多核苷酸，其中所述BAC包含用于将所述BAC扩增至每个细菌细胞超过10个拷贝的诱导型细菌ori序列以及病毒表达盒，该病毒表达盒包含所述多核苷酸的cDNA并包含用于在哺乳动物细胞中转录所述病毒cDNA和用于将转录的RNA加工成感染性RNA病毒的顺式调节元件。
18.根据声明1至17中任一项所述的多核苷酸，其中所述T细胞抗原选自由HBC核心抗原、OVA和EBNA1组成的组。
19.根据声明1至18中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的T细胞抗原包含SEQID NO：3的氨基酸序列或其包含T细胞表位的片段。
20.根据声明1至18中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的T细胞抗原包含SEQID NO：7的氨基酸序列或其包含T细胞表位的片段。
21.根据声明1至18中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的T细胞抗原包含SEQID NO：10的氨基酸序列或其包含T细胞表位的片段。
22.根据声明1至18中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的T细胞抗原包含SEQID NO：13的氨基酸序列。
23.一种黄病毒融合构建体，其特征在于所述黄病毒在其氨基末端前面是：
-黄病毒衣壳蛋白的部分，其包含黄病毒衣壳蛋白的N末端部分或由黄病毒衣壳蛋白的N末端部分组成，
-免疫原性蛋白质，或其包含免疫原性肽的部分，以及
-2A切割肽。
为了疫苗接种的目的，这些黄病毒通常是活的感染性减毒病毒。
24.根据声明23所述的黄病毒融合构建体，其中所述黄病毒衣壳蛋白的部分包含黄病毒衣壳蛋白的21个N末端氨基酸或由黄病毒衣壳蛋白的21个N末端氨基酸组成。
25.根据声明23或24所述的黄病毒融合构建体，其中所述黄病毒是黄热病病毒。
26.根据声明23、24或25所述的黄病毒融合构建体，其中黄热病病毒衣壳的末端部分由序列MSGRKAQGKTLGVNMVRRGVR(SEQ ID NO：2)组成。
27.根据声明23至25中任一项所述的多核苷酸，其中所述2A切割肽包含序列DXEXNPGP[SEQ ID NO：46]。
28.根据声明23至26中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中所述2A切割肽包含序列LxxxGDVExPGP[SEQ ID NO：17]
29.根据声明23至28中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中所述2A切割肽包含序列LLTCGDVEENPGP[SEQ ID NO：18]。
30.根据声明23至28中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中所述2A切割肽是具有氨基酸序列EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：16)的Thosea asigna 2A肽。
31.根据声明23至30中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中所述2A切割肽的C末端氨基酸是Gly、Ala、Ser或Thr。
32.根据声明23至31中任一项所述的黄病毒融合构建体多核苷酸，其中所述免疫原性蛋白质是T细胞抗原且其免疫原性片段包含T细胞表位。
33.根据声明23至32中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中所述黄热病病毒是YF 17D减毒病毒。
34.根据声明23至32中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中所述免疫原性蛋白质选自由HBC核心抗原、OVA和EBNA1组成的组。
35.根据声明23至32中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中HBC抗原包含SEQ IDNO：7的氨基酸序列或其包含T细胞表位的片段。
36.根据声明1至22中任一项所述的多核苷酸，其用作疫苗。
37.根据声明36的用作疫苗的多核苷酸，其预防由所述免疫原性蛋白质或其免疫原性肽片段引起的感染。
38.根据声明36的用作疫苗的多核苷酸，其同时预防由所述免疫原性蛋白质或其免疫原性肽片段引起的感染和黄病毒感染。
39.根据声明23至35中任一项所述的黄病毒融合构建体，其用作疫苗。
40.根据声明39的用作疫苗的黄病毒融合构建体，其预防由所述免疫原性蛋白质或其免疫原性肽片段引起的感染。
41.根据声明40的用作疫苗的黄病毒融合构建体，其同时预防由所述免疫原性蛋白质或其免疫原性肽片段引起的感染和黄病毒感染。
42.根据声明40的用作疫苗的黄病毒融合构建体，其同时预防由所述T细胞抗原或部分T细胞表位引起的感染和黄热病感染。
43.一种药物，其包含根据声明1至22中任一项所述的多核苷酸和药学上可接受的载体。
44.一种药物，其包含根据声明23至35中任一项所述的黄病毒融合构建体和药学上可接受的载体。
45.一种制备针对免疫原性蛋白质或其肽片段的疫苗的方法，其包括以下步骤：
(a)提供一种BAC，其包含用于将所述BAC扩增至每个细菌细胞超过10个拷贝的诱导型细菌ori序列，以及
病毒表达盒，其包含根据声明1至22中任一项所述的多核苷酸的cDNA，并包含用于在哺乳动物细胞中转录所述cDNA和用于将转录的RNA加工成感染性RNA病毒的顺式调节元件
(b)用步骤(a)所述的BAC转染哺乳动物细胞
(c)验证步骤(b)的转染细胞所复制的病毒的毒力和产生针对所述T细胞抗原的抗体的能力，将步骤(c)中验证的病毒克隆到载体中，
将所述载体配制成疫苗制剂。
46.根据声明45所述的方法，其中所述载体是BAC，其包含用于将所述BAC扩增至每个细菌细胞超过10个拷贝的诱导型细菌ori序列。
47.一种引发对免疫原性蛋白质的免疫应答的方法，其包括以下步骤：施用有效量的根据声明1至22中任一项所述的多核苷酸或根据声明23至35中任一项所述的黄病毒融合构建体。
详细说明
图1：YFV17D/HBc多蛋白的详细信息。HBc(血清型ayw)的前155个氨基酸的前面是上游YFV17D衣壳(氨基酸1-21)，以及接着是下游Thosea asigna 2A肽和全长YFV17D多蛋白，包括衣壳蛋白。
图2：显示本发明的cDNA构建体的示意图。将目标抗原(Antigen Of Interest(AOI)；例如，HBV核心抗原)作为翻译融合体插入到YFV 17D ORF中的C基因的前21个N末端密码子(C基因N-末端1-21)，在新引入的符合读码框的BamH1限制性内切核酸酶位点之后。AOI在C末端融合到一个密码子优化的Thosea asigna病毒2A“切割”肽(co T2A肽)，接着是YFV 17D C基因的2-21个密码子(C*基因N-末端2-21)的密码子经修饰的重复。在后一个cDNA元件的下游，该构建体以真正的YFV 17D cDNA继续。
(A)中的野生型YFV 17D ORF的前21个密码子(wt-YF17D C基因N末端)与其编码C*基因N-末端2-21的经修饰的重复(Modified repeat)的序列比对。小写字母表示相对于wt-YF17D C基因N末端引入的核苷酸变化。新引入的Not1限制性内切核酸酶位点(gcGGcCGc)以黑色突出显示。
图3：YFV17D/HBc传代和YFV17D的免疫荧光成像。红色：HBc，绿色：YFV抗原。
图4：YFV17D/HBc的体外表征。A)YFV17D噬斑，B)YFV17D/HBc，C)YFV17D和YFV17D/HBc的生长曲线。
图5：小鼠IFN-γELISPOT。用衍生自HBcAg(A)和HBsAg(B)的肽刺激从YFV17D/HBc免疫的AG129小鼠中分离的脾细胞。用HBcAg和HBsAg刺激的YFV17D/HBc和Chimerivax-JE免疫的小鼠的脾细胞的斑点形成单位(SFU)(C)。
图6：使用YFV17D/HBc免疫前后收集的血清的免疫荧光测定的荧光强度。
图7：小鼠IFN-γELISPOT。用衍生自HBcAg的肽刺激(+)或不刺激(-)分离自用YFV17D/HBc免疫一次(1X)或两次(2X)或用免疫两次的AG129小鼠的脾细胞(3x105)的SFU。
图8：小鼠IFN-γELISPOT。A)用衍生自HBcAg的肽刺激(+)或不刺激(-)分离自用YFV17D/HBc或用pDNA-YFV17D/HBc和PEI免疫的AG129小鼠的脾细胞(3x105)的SFU。B)分离自用YFV17D/HBc或用pDNA-YFV17D/HBc和PEI免疫的AG129小鼠的脾细胞相对于背景的倍数(HBc肽刺激相对于不刺激)。
图9：小鼠IFN-γELISPOT。A)用衍生自鸡卵清蛋白的肽刺激(+OVA)或不刺激(-pept)分离自用YFV17D/OVA(和YFV17D/HBc作为阴性对照)免疫的AG129小鼠的脾细胞(3x105)的SFU。B)用衍生自EBNA1的肽混合物刺激(+EBNA1)或不刺激(-pept)分离自用YFV17D/EBNA1(和YFV17D/HBc作为阴性对照)免疫的AG129小鼠的脾细胞(3x105)的SFU。
本发明使用以下一种或多种修改克服现有技术问题。
已经使用了更有效的切割肽，即Thosea asigna病毒2A肽(T2A)[Donnelly等人,(2001)J Gen Virol 82,1027-1041]，这个肽的使用还克服了进一步包含泛素切割序列的需要。
除了Thosea asigna以外，其他病毒2A肽也能够用于本发明的复合物和方法。其示例在例如Chng等人,(2015)MAbs 7,403-41中进行了描述，即口蹄疫病毒的APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP[SEQ ID NO：38]，猪捷申病毒-1(porcine teschovirus-1)的ATNFSLLKQAGDVEENPGP[SEQ ID NO:39]和来自马鼻炎A病毒的QCTNYALLKLAGDVESNPGP[SEQID NO：40]。这些肽具有保守的LxxxGDVExNPGP基序[SEQ ID NO：17]。具有这个共有序列的肽能够用于本发明的化合物。由共有序列DXEXNPGP[SEQ ID NO：46]代表的病毒2A切割肽的其他合适的示例公开于Souza-Moreira等人,(2018)FEMS Yeast Res.8月1日。Donnelly(2001)J Gen Virol.82,1027-1041中公开了来自小RNA病毒以及来自昆虫病毒、C型轮状病毒、锥虫和细菌(T.maritima)的2A切割肽的其他合适示例。
用黄热病例示了本发明，但是能够使用基于其他黄病毒的构建体同样地进行本发明，例如但不限于日本脑炎病毒、登革热病毒、墨累谷脑炎(Murray Valley Encephalitis,MVE)病毒、圣路易斯脑炎(St.Louis Encephalitis,SLE)病毒、西尼罗河(WN)病毒、蜱媒脑炎(TBE)病毒、俄罗斯春夏脑炎(RSSE)病毒、昆津(Kunjin)病毒、玻瓦桑(Powassan)病毒、科萨努尔森林病(Kyasanur Forest Disease)病毒、寨卡(Zika)病毒、乌苏图(Usutu)病毒、韦塞尔斯布朗(Wesselsbron)和鄂木斯克出血热(Omsk hemorrhagic fever)病毒。
病毒融合构建体还含有衣壳蛋白N末端部分的重复。在本发明中，该重复具有相同的氨基酸序列，但是DNA序列已被修饰为包括同义密码子，导致相对于所使用的21个密码子[此处密码子1是起始ATG]最大～75％的核苷酸序列同一性。如Samsa等人,(2012)J.Virol.201286,1046-1058所证明的，衣壳N末端部分可以不限于21个AA衣壳N末端部分，并且可以包含例如额外的5、10、15、20或25个氨基酸。现有技术仅突变来自重复的顺式作用RNA结构元件[Stoyanov(2010)Vaccine 28,4644-4652]。因此，本发明所述的方法也消除了同源重组的任何可能性，这导致非常稳定的病毒融合构建体。
在典型的实施方案中，位于编码表位或抗原的序列的5′的编码衣壳蛋白N末端部分的核苷酸序列与用于产生构建体的病毒的序列相同。为避免重组而引入的突变被引入位于编码表位或抗原的序列的3'的编码衣壳蛋白N末端部分的核苷酸序列中。
此外，在编码衣壳的C基因的重复中，序列仅从第二个密码子开始，这可能影响从T2A的切割；T2A切割在本发明所述的构建体中是有利的，因为T2A“切割”位点(NPG/P)[SEQID NO：47]的c末端氨基酸(aa)是小aa，即丝氨酸(NPG/PS)[SEQ ID NO：48]或备选地Gly、Ala或Thr而不是原始衣壳蛋白中的起始甲硫氨酸。
此外，还将密码子优化的cDNA用于克隆的黄病毒构建体的抗原。
总体而言，上述一种或多种修改最小化了在载体中插入额外的“货物”的复制负担，否则其将不可避免地对YFV复制造成适应性成本。
用包含T细胞表位的免疫原性蛋白质例示了本发明，但是本发明适用于诱导体液和/或细胞介导的免疫应答的任何免疫原性蛋白质，并且包括包含例如B细胞表位或NKT表位的蛋白质。免疫原性蛋白质可以是例如引起自身免疫疾病的人类蛋白质或肿瘤抗原，以及引起过敏或感染的动物、植物、细菌、真菌或病毒抗原。
本发明涉及用于疫苗接种目的的(i)编码含有HBcAg的编码序列的全长重组YFV17D基因组的质粒DNA分子，(ii)在所述质粒DNA上编码的感染性RNA分子和(iii)从用所述质粒DNA转染的细胞培养物中获得的重组减毒活病毒。本发明还包括(i)在细菌或酵母中制备质粒DNA和(ii)从体外细胞培养物或啮齿动物组织制备重组减毒活病毒。
本文描述了用于疫苗接种目的的编码全长重组减毒活黄热病病毒基因组及其衍生物的质粒DNA分子。通过在体外细胞培养物中转染所述质粒DNA而获得的重组减毒活病毒表达乙型肝炎病毒核心抗原，并在缺乏I型和II型干扰素受体的小鼠中产生体液和细胞免疫应答。
在减毒之前所述嵌合构建体以及减毒之后构建体的cDNA的繁殖需要所述构建体的防错复制。细菌人工染色体的使用，以及尤其是如本发明人在WO2014174078中公开的诱导型BAC的使用，特别适合于RNA病毒(例如，本发明的嵌合构建体)的cDNA的高产、高质量扩增。
如本公开BAC中描述的BAC包含：
-诱导型细菌ori序列，其用于将所述BAC扩增至每个细菌细胞超过10个拷贝，以及
-病毒表达盒，其包含RNA病毒基因组的cDNA，并包含用于在哺乳动物细胞中转录所述病毒cDNA和用于将转录的RNA加工成感染性RNA病毒的顺式调节元件。
在本发明的情况中，所述RNA病毒基因组是两个病毒基因组的嵌合病毒cDNA构建体。
在这些BAC中，所述病毒表达盒包含正链RNA病毒基因组的cDNA，通常
-在所述cDNA的5′末端之前的RNA聚合酶驱动的启动子，其用于启动所述cDNA的转录，以及
-在所述cDNA的3′末端之后用于RNA自切割的元件，其用于在设定位置切割所述病毒cDNA的RNA转录物。
所述BAC可进一步包含酵母自主复制序列用于穿梭至酵母并维持酵母中的所述细菌人工染色体。酵母ori序列的示例是2μ质粒起点或ARS1(自主复制序列1)或其功能同源衍生物。
本发明第一方面所述的RNA聚合酶驱动的启动子可以是RNA聚合酶II启动子，例如，巨细胞病毒立即早期(CMV-IE)启动子或猿猴病毒40启动子或其功能同源衍生物。
所述RNA聚合酶驱动的启动子同样可以是RNA聚合酶I或III启动子。
所述BAC还可以包含用于RNA自切割的元件，例如，丁型肝炎病毒的基因组核酶的cDNA或功能同源的RNA元件。
将DNA配制成疫苗制剂是本领域已知的，并且例如在Methods in MolecularMedicine第6章至第10章"DNA Vaccines"，第127卷,(2006)Springer Saltzman,Shen和Brandsma(编辑)Humana Press.Totoma,N.J.和Vaccines(第6版)的第61章Alternativevaccine delivery methods,第1200-1231页,(2013)(Plotkin等人,编辑)中进行了详细描述。适于制备DNA疫苗的可接受的载体、稀释剂、赋形剂和佐剂的细节也能够在WO2005042014中找到，如下所示。
“可接受的载体、稀释剂或赋形剂”是指在人和/或兽医学中(特别是在免疫疗法方面)可接受使用的另外的物质。
举例来说，可接受的载体、稀释剂或赋形剂可以是可安全用于全身或局部施用的固体或液体填充物、稀释剂或包封物质。取决于特定的施用途径，可以使用本领域众所周知的各种载体。这些载体可以选自包括下列各项的组：糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙和碳酸盐、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水和盐(例如，无机酸盐(包括盐酸盐)、溴化物和硫酸盐)、有机酸(例如，乙酸盐、丙酸盐和丙二酸盐)以及无热原水。
描述药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的有用参考文献是Remington'sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA,(1991))，其通过引用并入本文。
可以采用任何安全的施用途径为患者提供所述DNA疫苗。例如，可以采用口服、直肠、肠胃外、舌下、含服、静脉内、关节内、肌内、真皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脑室内、透皮等。肌内和皮下注射可能是合适的，例如，用于免疫治疗组合物、蛋白质疫苗和核酸疫苗的施用。还涵盖微粒轰击或电穿孔对于核酸疫苗的递送可能特别有用。
剂型包括片剂、分散剂、混悬剂、注射剂、溶液、糖浆剂、锭剂、胶囊、栓剂、气雾剂、透皮贴片等。这些剂型还可包括注射或植入专门为此目设计的控制释放装置或经修饰来以这种方式额外起作用的其他形式的植入物。治疗剂的控制释放可以通过用例如疏水性聚合物(包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸)和某些纤维素衍生物(例如，羟丙基甲基纤维素)涂覆它们来实现。另外，可通过使用其他聚合物基质、脂质体和/或微球体来实现所述控制释放。
适合口服或肠胃外施用的DNA疫苗可以呈现为离散单元，例如，胶囊、小袋或片剂，每个单元包含预定量的质粒DNA，作为粉剂或颗粒剂或作为在水性液体、非水性液体中的溶液或混悬剂、水包油乳剂或油包水液体乳剂。这样的组合物可以通过任何药学方法制备，但是所有方法都包括使如上面所描述的一种或多种试剂与构成一种或多种必需成分的载体联合的步骤。通常，通过将所述DNA质粒与液体载体或精细分开的固体载体或两者均匀且紧密地混合，以及然后，如果需要，将产物成型为所需的外观来制备所述组合物。
上面的组合物可以以与剂量制剂相容的方式和以有效量施用。给患者施用的剂量应足以在适当的时间段内在患者中产生有益的应答。要施用的一种或多种试剂的量可取决于待治疗的受试者(包括其年龄、性别、体重和总体健康状况)、将取决于从业者的判断的因素。
此外，DNA疫苗可以通过细菌转导来递送，如使用用所述DNA质粒转化的沙门氏菌(Salmonella)的减毒活菌株，例如Darji等人,(2000)FEMS Immunol.Med.Microbiol.27,341-349和Cicin-Sain等人,(2003)J.Virol.77,8249-8255，其给出作为参考。
通常，DNA疫苗用于人类的预防性或治疗性免疫，但是对于某些病毒，也能够应用于脊椎动物(通常是哺乳动物、鸟类和鱼类)，包括家畜(例如，牲畜和伴侣动物)。涵盖进行疫苗接种的动物是病毒活库(人畜共患病)，例如，猴、小鼠、大鼠、鸟类和蝙蝠。
在某些实施方案中，疫苗可包括佐剂，即增强疫苗组合物的免疫原性和/或效力的一种或多种物质。但是，生命疫苗最终可能被可以刺激先天免疫应答而不依赖于病毒复制的佐剂损害。合适的佐剂的非限制性示例包括角鲨烷和角鲨烯(或其他动物来源的油)；嵌段共聚物；去污剂(例如，Tween-80)；Quill A，矿物油(例如，Drakeol或Marcol)，植物油(例如，花生油)；棒状杆菌(Corynebacterium)衍生的佐剂(例如，短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum))；丙酸杆菌(Propionibacterium)衍生的佐剂(例如，疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acne))；牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(BacilleCalmette和Guerin或BCG)；白介素(例如，白介素2和白介素12)；单核因子(例如，白介素1)；肿瘤坏死因子；干扰素(例如，γ干扰素)；诸如皂苷-氢氧化铝或Quil-A氢氧化铝的组合；脂质体；ISCOMt)和ISCOMATRIX(B)佐剂；分枝杆菌细胞壁提取物；合成糖肽(例如，胞壁酰二肽或其他衍生物；阿夫立定(Avridine)；脂质A衍生物；硫酸葡聚糖；DEAE-葡聚糖或带有磷酸铝；羧聚乙烯(例如，Carbopol'EMA)；丙烯酸共聚物乳液(例如，Neocryl A640)；牛痘或动物痘病毒蛋白；亚病毒颗粒佐剂(例如，霍乱毒素或其混合物)。
实施例1.材料和方法
间接免疫荧光测定：为了检测从YFV-HBc表达的HBcAg，用PLLAV-YFV-HBc转染幼仓鼠肾细胞株21J(BHK21J)。8-腔室玻片(EZ玻片，Millipore)的每个腔室接种50000个BHK21J细胞，并在第二天用在9μl无血清培养基中的100ng PLLAV-YFV-HBc和0.3μl-LT1转染试剂(/>Bio LLC,US)的混合物转染。两天后，将细胞用在PBS中的3.7％甲醛固定，用在PBS中的0.1％Triton X-100透化，并且随后与针对YFV抗原培育的多克隆小鼠抗体和针对HBcAg培育的多克隆兔抗体以1：500的稀释度温育。YFV抗原和HBcAg分别用/>488缀合的山羊抗小鼠IgG和/>647缀合的驴抗兔IgG检测。
噬斑测定：为了病毒噬斑的可视化，使用5x105 BHK21J细胞接种12孔聚苯乙烯微孔板(Falcon，Corning)的每个孔。第二天，将这些单层与1ml连续稀释的病毒温育1小时，并且随后用在dH2O中的1％LMP琼脂糖和MEM 2X培养基的1：1混合物覆盖。在37℃和5％CO2下温育5天后，将细胞用在PBS中的8％甲醛固定。去除琼脂糖覆盖后，通过用在PBS中的1％亚甲蓝和10％乙醇对细胞染色来使噬斑可视化。
ELISPOT：为了评估YFV-HBc是否可以刺激经免疫小鼠的脾细胞分泌IFN-γ，按照制造商的实验方案，进行酶联免疫斑点(ELISPOT)测定(小鼠IFNγELISPOTeBioscience)。简而言之，将聚偏二氟乙烯支持的96孔平板(Millipore)用结合IFN-γ的捕获抗体包被并在4℃下储存过夜。以每孔4×105个细胞的密度一式三份添加脾细胞。肽(5μg/ml)用于刺激所述细胞。将平板在37℃和5％CO2下温育24小时。洗涤平板并添加生物素化的检测抗体。2小时后，将亲和素-HRP加入孔中并再次温育45分钟，然后加入底物AEC(3-氨基-9-乙基咔唑)。10分钟后，通过用dH2O洗涤平板来停止比色反应。用AID ELISPOT读数器(Autoimmun Diagnostika GmbH,Germany)对斑点进行计数。
实施例2.重组黄热病17D病毒的构建和体外表征
表达HBc的YFV17D(YFV17D/HBc)的构建基于一个取得专利权的反向遗传系统，其包含全长YFV17D cDNA作为细菌人工染色体(BAC)上的表达盒[Dallmeier&Neyts，WO2014/174078A1]，该BAC下文称为pShuttle/YFV17D.WO2014174078A1。病毒cDNA被修饰为编码乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)，血清型ayw，核苷酸1-465。将这个序列符合读码框地插入YFV17D cDNA中，其前面是上游63个核苷酸(编码YFV17D衣壳蛋白的前21个氨基酸)，以及紧接着是下游Thosea asigna病毒2A肽(以确保从YFV17D多肽进行翻译后切割)和其余的病毒多蛋白(包括全长衣壳基因，核苷酸2-10862)[[Stoyanov(2010)Vaccine 28,4644-4652]。为了防止编码YFV17D衣壳上游和HBc下游的两个序列之间的重组，使用了同义密码子(图1)。下文将表达YFV17D/HBc的这个BAC称为pShuttle/YFV17D/HBc。为了构建pShuttle/YFV17D/HBc，进行了以下克隆步骤(图2中的示意图)。首先，我们在YFV17D衣壳基因的上游插入URA3基因表达盒，其侧翼为TEF启动子和TEF终止子(分别为URA3基因上游和下游)。其背后的基本原理是通过引入选择标记URA3(能够用5-氟乳清酸(5-FOA)进行反选择)来创建一种提供更易于克隆的载体。该盒前面是上游63个核苷酸(编码YFV17D衣壳蛋白的前21个氨基酸)，以及紧接着是下游Thosea asigna病毒2A肽(T2A肽)和其余的病毒多蛋白。编码这个表达盒的定制合成DNA片段(gBlock,Integrated DNA Technologies,Leuven,Belgium)通过PCR用引物#3和#4(对于所有引物序列，请参见表1)进行扩增，并将得到的PCR产物在随后的PCR中用引物对#5&#6、#7&#15和#15&#17进行进一步的延长。目的质粒在YFV17D衣壳基因的相同位点编码红色荧光蛋白mCherry(pShuttle/YFV17D/mCherry)，在该质粒的独特位点用限制性酶NotI消化。将PCR产物和限制性目的质粒(具有重叠末端)两者都转化到酵母细胞(酿酒酵母(S.cerevisiae)，菌株YPH500)中，并通过重叠末端的同源重组在这些细胞中重组成pShuttle/YFV17D/URA3。其次，我们使用URA3基因侧翼的两个PmeI位点再从pShuttle/YFV17D/URA3中切除URA3，并将这个打开的载体和编码HBc的前155个氨基酸的PCR扩增的gBlock(在随后的PCR中用引物对#8&#16、#5&#6、#15&#7和#15&#17进行扩增和延长)[或编码HBc的前155个氨基酸，然后是绿色荧光蛋白LOV的编码序列[Buckley(2015)Curr.opinion chem.biol.27,39-45](在随后的PCR中用引物对#8&#9、#5&#6、#15&#7和#15&#17进行扩增和延长)]一起转化回酵母。通过PCR产物和消化的载体在酵母中的重叠末端的同源重组，得到了pShuttle/YFV17D/HBc。
通过将pDNA-YFV17D/HBc转染到BHK21J细胞中来评估YFV17D/HBc的活力和转基因表达。免疫荧光染色显示除YFV17D抗原外，HBc的表达稳定。为了确定得到的病毒YFV17D/HBc是否稳定表达转基因，每3天连续传代一次。免疫荧光染色显示完整的HBc稳定表达达到第4代(图3)。
将pDNA-YFV17D/HBc转染后的上清液用于噬斑测定以研究是否产生感染性病毒，并与亲本YFV17D并排比较。感染后五天，由重组YFV17D/HBc产生的噬斑明显小于由YFV17D产生的那些(图4A和4B)。通过感染BHK21J细胞(MOI 0.01)并滴定在5天的过程中收集的上清液，通过生成YFV17D/HBc和YFV17D的生长曲线来研究病毒复制的动力学(图4C)。
实施例3.用YFV17D/HBc免疫的小鼠中的细胞免疫应答
为了确定YFV17D/HBc是否可以在体内引发免疫应答，用4.5×104噬斑形成单位(PFU)腹膜内免疫三只AG129小鼠(缺乏I型和II型干扰素(IFN)受体)，并在两周后用4.5×104PFU加强。由于用YFV17D注射的AG129通常不能存活，将嵌合YFV/日本脑炎病毒疫苗株(Chimerivax-JE)的单次注射(9×104PFU)用作阴性对照(2只小鼠)。为了检测由肽刺激的T细胞分泌HBc特异性IFN-γ的水平，在第一次注射后7周处死小鼠，并将它们的脾细胞用于小鼠IFN-γ酶联免疫斑点测定(ELISPOT)。用衍生自HBcAg或HBsAg的肽刺激脾细胞。当用HBcAg衍生的肽刺激来自YFV17D/HBc免疫的小鼠的脾细胞时，与用HBsAg衍生的肽刺激来自YFV17D/HBc免疫的小鼠的脾细胞或用两者中的任一个肽刺激来自阴性对照组的脾细胞相比，斑点计数明显更高(图5A和5B)。
实施例4.用YFV17D/HBc免疫的小鼠中的体液免疫应答
为了研究用YFV17D/HBc免疫是否可以引发针对HBc转基因的抗体应答，用7.5×104PFU的YFV17D/HBc腹膜内免疫三只AG129小鼠，并在五周后加强(4.5×104PFU)。在第一次注射前和加强后三周，收集血清并用于HBV感染的人肝癌细胞的免疫荧光测定。与使用前血清(preserum)相比，使用免疫后收集的血清导致荧光强度显著增加(图6)。
实施例5.YFV17D/HBc的同源初免-加强
为了确定递送同源加强剂量的YFV17D/HBc对HBc特异性T细胞水平的重要性，用104pfu的YFV17D/HBc接种小鼠一次或两次(第一剂量后两周)。在第一剂YFV17D/HBc后四周收获脾细胞，并在小鼠IFNγELISPOT测定中用HBc衍生的肽刺激。YFV17D/HBc双接种的小鼠的斑点计数没有显著高于单接种的小鼠的斑点计数。以10μg(InvivoGen,SanDiego,CA,USA)为佐剂的10μg重组HBc(rHBc,American Research Products Inc,Waltham,MA,USA)的两次注射没有引发比我们的候选疫苗更高水平的分泌IFNγ的T细胞(图7)。
实施例6.通过用pDNA-YFV17D/HBc接种的HBc特异性T细胞应答的引发
如上所述，BHK21J中编码YFV17D/HBc的质粒DNA(pDNA-YFV17D/HBc)的转染导致细胞培养上清液中感染性病毒(YFV17D/HBc)的释放，其能够直接用于接种小鼠。我们已经通过两次腹膜内注射这个质粒(3μg)和体内转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)的混合物(间隔一周)来向AG129小鼠施用pDNA-YFV17D/HBc。第一次注射后两周，处死小鼠并将它们的脾细胞用于小鼠IFNγELISPOT测定，其表明pDNA-YFV17D/HBc引发了HBc特异性T细胞(图8)。
实施例7.针对从YFV17D的衣壳基因表达的其他抗原的特异性T细胞应答的引发。
如上面所描述的，将其他T细胞抗原(即全长鸡卵清蛋白(OVA)和全长Epstein-Barr病毒核抗原1(EBNA1))克隆到YFV17D衣壳基因的位点。
通过PCR用引物#1和#2(对于所有引物序列，参见表1)从gBlock(Integrated DNATechnologies,Leuven,Belgium)中扩增OVA插入物，该gBlock含有全长鸡卵清蛋白的编码序列，侧翼为在其5'末端的YFV17D衣壳蛋白的前21个氨基酸的编码序列，以及在其3'末端的T2A肽的编码序列，并通过随后的PCR用引物对#5&#7和#15&#17进行延长。然后，如对于pShuttle/YFV17D/HBc所描述的，通过在酵母中的PCR插入物和PmeI限制性pShuttle/YFV17D/URA3目的质粒的同源重组来制备pShuttle/YFV17D/OVA。
通过PCR用引物#9和#10从包含全长EBNA1的编码序列的质粒(由苏黎世大学的Christian Münz教授友情提供)中扩增EBNA1插入物，并通过随后的PCR用引物对#5&#6和#15&#17进行延长。然后，如对于pShuttle/YFV17D/HBc所描述的，通过在酵母中的PCR插入物和PmeI限制性pShuttle/YFV17D/URA3目的质粒的同源重组来制备pShuttle/YFV17D/EBNA1。
如对于pShuttle/YFV17D/HBc所描述的，将pShuttle/YFV17D/OVA和pShuttle/YFV17D/EBNA1两者转染到BHK21J中，其导致上清液中感染性病毒的释放，下文分别称为YFV17D/OVA和YFV17D/EBNA1。
为了研究YFV17D/OVA和YFV17D/EBNA1在体内引发的T细胞应答，三只AG129小鼠用1×106TCID50的YFV17D/OVA腹膜内免疫一次，以及三只AG129小鼠用1×106TCID50的YFV17D/EBNA1腹膜内免疫一次。单次注射(1×106TCID50)YFV17D/HBc用作阴性对照(3只AG129小鼠)。为了检测由肽刺激的T细胞分泌HBc特异性IFN-γ的水平，五周后处死小鼠并将它们的脾细胞用于小鼠IFNγELISPOT。对于用YFV17D/OVA接种的小鼠，用5μg衍生自EBNA1的肽混合物(由苏黎世大学的Christian Münz教授友情提供)刺激脾细胞。YFV17D/OVA和YFV17D/EBNA1分别引发对卵清蛋白和EBNA1肽的强烈和特异性IFNγ应答(图9)。
表1：引物序列
/>
pShuttle/YFV17D/URA3的目标序列
图例：
SEQ ID NO:1
pShuttle/YFV17D/HBc的目标序列
图例：
大写字母 YFV17D 5’-UTR
加下划线的大写字母 YFV17D衣壳蛋白的前21个氨基酸的编码序列
小写斜体 BamHI位点
粗体大写 HBc编码序列
加下划线的小写字母 T2A(Thosea asigna 2A)肽的编码序列
小写字母 YFV17D基因组的编码序列，从氨基酸#2开始
SEQ ID NO:5
SEQ ID NO:7
pShuttle/YFV17D/OVA的目标序列
图例：
大写字母 YFV17D 5’-UTR
加下划线的大写字母 YFV17D衣壳蛋白的前21个氨基酸的编码序列
小写斜体 BamHI位点
粗体大写 OVA编码序列
加下划线的小写字母 T2A((Thosea asigna 2A)肽的编码序列
小写字母 YFV17D基因组的编码序列，从氨基酸#2开始
SEQ ID NO:8
SEQ ID NO:10
pShuttle/YFV17D/EBNA1的目标序列
图例：
SEQ ID NO:11
SEQ ID NO:13
衣壳同义密码子序列:
atgtctggtcgtaaagctcagggaaaaaccctgggcgtcaatatggtacgacgaggagttcgc(SEQID NO:14)
agcggccgcaaagcccagggtaagacactgggcgtgaacatggttcgtcgcggcgtccgg.(SEQ IDNO:15)

Claims (52)

1.包含黄病毒序列的多核苷酸，其特征在于编码所述黄病毒的核苷酸序列前面是编码以下的序列：
-黄病毒衣壳蛋白的部分，其包含黄病毒衣壳蛋白的N末端部分或由黄病毒衣壳蛋白的N末端部分组成，
-免疫原性蛋白质，或其包含免疫原性肽的部分，以及
-2A切割肽，
其中所述多核苷酸不包含泛素切割序列。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述黄病毒衣壳蛋白的部分包含黄病毒衣壳蛋白的21个N末端氨基酸或由黄病毒衣壳蛋白的21个N末端氨基酸组成。
3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其中编码衣壳基因的N末端部分的核苷酸序列与全长病毒序列中的相应序列相比具有一个或多个同义密码子。
4.根据权利要求1、2或3所述的多核苷酸，其中所述黄病毒是黄热病病毒或日本脑炎病毒。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸，其中黄热病病毒衣壳的末端部分由序列MSGRKAQGKTLGVNMVRRGVR(SEQ ID NO：2)组成。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的多核苷酸，其中所述2A切割肽包含序列DXEXNPGP(SEQ ID NO：46)。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的多核苷酸，其中所述2A切割肽包含序列LXXXGDVEXNPGP(SEQ ID NO：17)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的多核苷酸，其中所述2A切割肽包含序列LLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：18)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的多核苷酸，其中所述2A切割肽是具有氨基酸序列EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：16)的Thosea asigna 2A肽。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸，其中所述2A切割肽的C末端氨基酸是Gly、Ala、Ser或Thr。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的多核苷酸，其中所述免疫原性蛋白质是T细胞抗原且其免疫原性片段包含T细胞表位。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的多核苷酸，其中编码所述免疫原性蛋白质或其片段的序列的5'的编码衣壳蛋白的核苷酸序列具有野生型黄病毒的核苷酸序列。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的多核苷酸，其中所述免疫原性蛋白质或其免疫原性片段的密码子使用适合于在细菌中表达。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的多核苷酸，其中具有同义密码子的序列是：
atgtctggtcgtaaagctcagggaaaaaccctgggcgtcaatatggtacgacgaggagttc gc(SEQ IDNO：14)
和
agcggccgcaaagcccagggtaagacactgggcgtgaacatggttcgtcgcggcgtccgg(SEQ ID NO:15)。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的多核苷酸，其中所述黄热病病毒是YF 17D减毒病毒。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的多核苷酸，其是细菌人工染色体(BAC)。
17.根据权利要求16所述的多核苷酸，其中所述BAC包含用于将所述BAC扩增至每个细菌细胞超过10个拷贝的诱导型细菌ori序列以及病毒表达盒，该病毒表达盒包含所述多核苷酸的cDNA并包含用于在哺乳动物细胞中转录所述病毒cDNA和用于将转录的RNA加工成感染性RNA病毒的顺式调节元件。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的多核苷酸，其中所述T细胞抗原选自由乙型肝炎病毒核心抗原(HBC)、卵清蛋白(OVA)和Epstein-Barr病毒核抗原1(EBNA1)组成的组。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的T细胞抗原包含SEQID NO：3的氨基酸序列或其包含T细胞表位的片段。
20.根据权利要求1至18中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的T细胞抗原包含SEQID NO：7的氨基酸序列或其包含T细胞表位的片段。
21.根据权利要求1至18中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的T细胞抗原包含SEQID NO：10的氨基酸序列或其包含T细胞表位的片段。
22.根据权利要求1至18中任一项所述的多核苷酸，其中所编码的T细胞抗原包含SEQID NO：13的氨基酸序列。
23.一种黄病毒融合构建体，其特征在于所述黄病毒在其氨基末端前面是：
-黄病毒衣壳蛋白的部分，其包含黄病毒衣壳蛋白的N末端部分或由黄病毒衣壳蛋白的N末端部分组成，
-免疫原性蛋白质，或其包含免疫原性肽的部分，以及
-2A切割肽，
其中所述黄病毒融合构建体不包含泛素切割序列。
24.权利要求23的黄病毒融合构建体，其中所述黄病毒衣壳蛋白的部分包含黄病毒衣壳蛋白的21个N末端氨基酸或由黄病毒衣壳蛋白的21个N末端氨基酸组成。
25.根据权利要求23或24所述的黄病毒融合构建体，其中所述黄病毒是黄热病病毒。
26.权利要求23、24或25所述的黄病毒融合构建体，其中黄热病病毒衣壳的末端部分由序列MSGRKAQGKTLGVNMVRRGVR(SEQ ID NO：2)组成。
27.根据权利要求23至25中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中所述2A切割肽包含序列DXEXNPGP(SEQ ID NO：46)。
28.根据权利要求23至26中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中所述2A切割肽包含序列LXXXGDVEXNPGP(SEQ ID NO：17)。
29.根据权利要求23至28中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中所述2A切割肽包含序列LLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：18)。
30.根据权利要求23至28中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中所述2A切割肽是具有氨基酸序列EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：16)的Thosea asigna 2A肽。
31.根据权利要求23至30中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中所述2A切割肽的C末端氨基酸是Gly、Ala、Ser或Thr。
32.根据权利要求23至31中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中所述免疫原性蛋白质是T细胞抗原且其免疫原性片段包含T细胞表位。
33.根据权利要求23至32中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中所述黄热病病毒是YF 17D减毒病毒。
34.根据权利要求23至32中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中所述免疫原性蛋白质选自由乙型肝炎病毒核心抗原(HBC)、卵清蛋白(OVA)和Epstein-Barr病毒核抗原1(EBNA1)组成的组。
35.根据权利要求23至32中任一项所述的黄病毒融合构建体，其中HBC抗原包含SEQ IDNO：7的氨基酸序列或其包含T细胞表位的片段。
36.根据权利要求1-22中任一项所述的多核苷酸在制备疫苗中的用途。
37.根据权利要求36所述的用途，其用于制备针对由所述免疫原性蛋白质或其免疫原性肽片段引起的感染的疫苗。
38.根据权利要求36所述的用途，其用于制备同时针对由所述免疫原性蛋白质或其免疫原性肽片段引起的感染和黄病毒感染的疫苗。
39.根据权利要求37所述的用途，其用于制备针对由乙型肝炎病毒或Epstein-Barr病毒引起的感染的疫苗。
40.根据权利要求38所述的用途，其用于制备针对由(a)乙型肝炎病毒或Epstein-Barr病毒、以及(b)黄病毒引起的同时感染的疫苗。
41.根据权利要求23至35中任一项所述的黄病毒融合构建体在制备疫苗中的用途。
42.根据权利要求41所述的用途，其用于制备针对由所述免疫原性蛋白质或其免疫原性肽片段引起的感染的疫苗。
43.根据权利要求42所述的用途，其用于制备同时预防由所述免疫原性蛋白质或其免疫原性肽片段引起的感染和黄病毒感染的疫苗。
44.根据权利要求42所述的用途，其用于制备同时针对由所述T细胞抗原或部分T细胞表位引起的感染和黄热病病毒感染的疫苗。
45.根据权利要求42所述的用途，其用于制备针对由乙型肝炎病毒或Epstein-Barr病毒引起的感染的疫苗。
46.根据权利要求43所述的用途，其用于制备针对由(a)乙型肝炎病毒或Epstein-Barr病毒、以及(b)黄病毒引起的同时感染的疫苗。
47.一种药物，其包含根据权利要求1至22中任一项所述的多核苷酸和药学上可接受的载体。
48.一种药物，其包含根据权利要求23至35中任一项所述的黄病毒融合构建体和药学上可接受的载体。
49.一种制备针对免疫原性蛋白质或其肽片段的疫苗的方法，其包括以下步骤：
(a)提供一种BAC，其包含用于将所述BAC扩增至每个细菌细胞超过10个拷贝的诱导型细菌ori序列，以及
病毒表达盒，其包含根据权利要求1至22中任一项所述的多核苷酸的cDNA，并包含用于在哺乳动物细胞中转录所述cDNA和用于将转录的RNA加工成感染性RNA病毒的顺式调节元件
(b)用步骤(a)所述的BAC转染哺乳动物细胞
(c)验证步骤(b)的转染细胞所复制的病毒的毒力和产生针对所述T细胞抗原的抗体的能力，
(d)将步骤(c)中验证的病毒克隆到载体中，和
(e)将所述载体配制成疫苗制剂。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述载体是BAC，其包含用于将所述BAC扩增至每个细菌细胞超过10个拷贝的诱导型细菌ori序列。
51.根据权利要求1至22中任一项所述的多核苷酸在制备用于引发对免疫原性蛋白质或其包含免疫原性肽的部分的免疫应答的药物中的用途。
52.根据权利要求23至35中任一项所述的黄病毒融合构建体在制备用于引发对免疫原性蛋白质或其包含免疫原性肽的部分的免疫应答的药物中的用途。
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