KR101630499B1 - 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 및 이를 이용한 sfts 진단 방법 및 키트 - Google Patents

Abstract

각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 + 가닥 RNA 서열에 상응하는 - 가닥 RNA 서열을 갖는 중증열성혈소판감소증후군 (SFTS) 바이러스 및 이를 이용한 항원-항체 복합체 검출을 통한 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 항체 검출 방법 및 키트를 개시한다. 본원에 따른 SFTS 바이러스는 기존에 동전된 바이러스는 다른 유전형의 바이러스로 신종전염병으로 현재까지 전세계적으로 백신개발이 되지 않은 SFTS에 대한 진단법, 백신개발 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

중증열성혈소판감소증후군 바이러스 및 이를 이용한 SFTS 진단 방법 및 키트 {Viruses associated with Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome and Methods and Kits for diagnosing SFTS using the same}

본원은 바이러스를 이용한 질환의 진단에 관한 것이다.

중증열성혈소판감소증후군 (Severe fever with thrombocytopenia syndrome (SFTS))는 고열, 구토, 설사, 혈소판감소, 백혈구감소 및 다발성 장기부전과 같은 증상을 동반하며, 치사율이 6-30%에 이르는 심각한 질환이다 (Yu XJ et al., N. Engl. J. Med. 2011; 364:1523-32; Ding F et al Clin Infect Dis 2013; 56: 1682-3). SFTS는 분야바이러스 (Bunyavirus)에 속하는 SFTS 바이러스 (HB29 스트레인)에 의해 야기되며 2011년에 중국에서 최초로 보고되었다 (Yu XJ et al. ibid).

SFTS 바이러스는 작은소참진드기(Haemaphysalis longicornis)를 매개체로 하는 것으로, 상기 진드기는 한국에도 널리 퍼져 있는 것으로 알려져 있다 (Chae JS et al. J Vet Sci 2008; 9: 285-93; Kim CM et al. Appl Environ Microbiol 2006; 72: 5766-76).

SFTS 바이러스의 혈청전환 및 바이러스혈증이 염소, 양, 소, 돼지 및 개와 같은 사육동물에서 발견되었으며, 이러한 동물도 SFTS 바이러스가 퍼진 지역에서 중간 매개체로 작용하는 것으로 생각된다 (Zhao L et al. Emerg Infect Dis 2013; 18: 963-5; Niu G et al. Emerg Infect Dis 2013; 19: 756-63).

중국 공개 특허 공보 제102618669호는 SFTS 바이러스의 전체 서열 및 그 용도에 관한 것으로, 중국에서 동정된 SFTS 바이러스의 전체 서열을 개시하고 있다.

중국 공개 특허 공보 제102070704호는 SFTS 바이러스를 이용한 SFTS 바이러스 증폭 및 검출 키트를 개시하고 있다.

신종 SFTS 바이러스의 동정 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법 및 백신 개발이 요구되고 있다.

본원은 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 진단 또는 검출 방법, 키트 및 백신 조성물을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 L (Large), M (Medium) 및 S (Small) 단편이, 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 DNA 서열에 역 상보적인 마이너스 가닥 RNA 서열을 갖는 중증열성혈소판감소증후군 (SFTS) 바이러스를 제공한다.

다른 양태에서 본원은 또한 중증열성혈소판감소증후군 (SFTS) 바이러스 유래의 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 SFTS 유래의 DNA 분자 및 상기 DNA 분자가 갖는 서열에서 각 티미딘 (Thymidine, T)이 우라실 (Uracil, U)로 치환된 SFTS 유래의 RNA 분자를 제공하며, 상기 RNA 분자는 플러스 가닥 RNA 즉 cRNA에 해당된다.

또 다른 양태에서 본원은 또한 상기 RNA 또는 DNA에 의해서 코딩되는 폴리펩타이드를 제공한다. 본원에 따른 일 구현예에서 상기 폴리펩타이드의 서열은 서열번호 4 (L segment에 의해 코딩되는 폴리펩타이드), 서열번호 5 (M segment에 의해 코딩되는 폴리펩타이드) 및 서열번호 6 (L segment에 의해 코딩되는 폴리펩타이드)로 표시된다.

또 다른 양태에서 본원은 또한 상기 DNA 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 상기 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵세포를 제공한다.

본원에 따른 SFTS 바이러스 유래의 RNA 또는 DNA는 SFTS 바이러스의 검출을 위한 프라이머, 프로브 등의 제작 또는 RNA 바이러스의 생산을 위한 벡터 개발 등에 유용하게 사용될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 바이러스 항원을 포함하는 바이러스 시료를 검체와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 인비트로에서 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 항체 검출 또는 SFTS 감염여부 진단 방법을 제공한다. 본원에 따른 방법에 사용되는 검체는 전혈, 혈장 또는 혈청 중 하나 이상이 사용될 수 있다.

본원에 따른 방법은 정량적 또는 정성적 검출 또는 진단에 사용될 수 있다. 본원에 따른 방법에서 상기 항원-항체 복합체 검출은 방사상면역분석, 웨스턴블랏, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석을 통해 검출될 수 있으며, 일 구현예에서 ELISA는 이중항원 샌드위치 방식으로, 상기 항원은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중증열성혈소판감소증후군의 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 사용하여 수행될 수 있다.

본원에 따른 방법에서 항원은 방사능물질, 효소 및 형광물질로 구성되는 군으로부터 선택되는 표지로 표지될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 항체 검출 또는 진단 또는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 감염 진단 키트로, 상기 키트는 본원에 따른 바이러스 항원을 포함하는 바이러스 시료 및 상기 항원-항체 복합체 검출용 시약을 포함하는, 키트를 제공한다. 본원에 따른 키트에서 상기 항원-항체 복합체 검출용 시약은 방사상면역분석, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석용 시약을 포함한다.

또 다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 바이러스의 전부 또는 일부를 포함하는, 중증열성혈소판감소증후군 (SFTS) 바이러스에 대한 면역원성 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 아주번트를 추가로 포함할 수 있다.

본원에 따른 SFTS 바이러스는 기존에 중국에서 동정된 SFTS 바이러스와 다른 유전형을 가진 바이러스이다. SFTS 바이러스는 2011년 중국에서 처음으로 전세계적으로 발견된 바이러스이며, 아직까지 백신개발이 되지 않은 바이러스로, 이에 대한 진단법이나 백신개발 등에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 베로세포에서 관찰되는 세포변병효과를 광학 현미경, 200배로 관찰한 결과이다.
도 2는 DH82 세포에서 관찰되는 세포병변 효과를 광학 현미경, 400배로 관찰한 결과이다.
도 3은 본원에 따른 SFTS 바이러스로 감염된 Vero 세포 (화살표)의 투과전자현미경 사진으로, 스케일바는 500nm이다.
도 4는 본원에 따른 SFTS 바이러스의 RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) 유전자를 본 및 중국에서 분리 동정된 바이러스와 비교한 계통발생분석 결과이다. 분석은 neighbor-joining 방법을 이용하여 수행되었으며, 분리장소, 분리년도 및 GenBank 접근번호를 기재하였다. 브랜치의 길이는 진화 거리를 나타내며, 스케일바는 2.0% 서열 거리를 나타낸다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따라 배양된 바이러스를 항원으로 이용하여 환자의 혈청시료에 존재하는 바이러스 항체를 검출한 면역형광 분석의 현미경, 400배 배율로 관찰한 사진이다.

본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

본원은 신종 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 규명을 기반으로 한 것이다. 본원에서는 발열을 동반한 혈소판 감소증의 원인 바이러스를 분리하고 유전자를 분석한 것으로, 이는 중국에서 분리된 바이러스 (Yu XJ et al., N. Engl. J. Med. 2011) 와 상이한 유전자형의 바이러스이다.

따라서 한 양태에서 본원은 L (Large), M (Medium) 및 S (Small) 단편이, 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 DNA 서열에 역 상보적인 마이너스 가닥 RNA 서열을 갖는 중증열성혈소판감소증후군 (SFTS) 바이러스에 관한 것이다.

본원에서 SFTS 바이러스는 마이너스 단일가닥 RNA 바이러스로 Bunyaviridae과, phlebovirus 속에 속한다. 직경 80~100nm의 구형 바이러스로 작은소참진드기를 매개체로 하며, 유전체는 large(L). Medium(M). small(S) 세그먼트로 구성되어 있으며, RNA dependent RNA polymerase(RdRp), glycoprotein precursor(M), glycoprotein N(Gn), glycoprotein C(Gc), nucleocapsid protein(NP) 및 non-structural protein(NSs)의 6개의 단백질을 코딩한다.

마이너스 또는 안티센스 가닥 (바이러스 단백질을 코딩하는 센스 또는 플러스 가닥에 대한 안티센스)은 단백질 또는 유전자가 안티센스로서 코딩되며, 유전자의 단백질로의 발현을 위해 센스 또는 플러스 가닥 RNA 생성 후, 이로부터 번역을 수행하여 단백질이 생성된다.

본원에서 규명된 SFTS 바이러스의 유전체는 따라서 서열번호 1 내지 3으로 표시되는, 플러스 또는 센스 가닥 RNA에 대응하는 DNA에 역 상보적 (reverse complementary) 서열을 갖는 RNA이다. 예를 들면 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 cDNA 서열의 상보적 서열을 5'-3' 방향으로 판독한 후, 티미딘을 우라실로 치환하면 수득할 수 있다.

본원에서 분리 동정된 바이러스는 기존에 동정된 바이러스와 상이한 유전자 형을 갖는 것으로, SFTS 바이러스의 검출 및 이를 이용한 SFTS 바이러스 감염여부 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

이러한 측면에서 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 바이러스 항원을 포함하는 상기 바이러스 시료를 생물학적 시료 또는 검체와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 인비트로 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 항체 검출 방법에 관한 것이다.

본원에서 바이러스 항원은 상기 바이러스 항원에 대하여 면역반응을 발생시킬 수 있는 바이러스의 전부 또는 그 일부를 일컫는 것으로, 불활성화된 전체 바이러스, 스플리트 바이러스, 변형된 바이러스, 바이러스유래 단백질, 바이러스유래 당단백질, 바이러스유래 표면 단백질을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에서 생물학적 시료 또는 검체란 바이러스의 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체, 특히 인간 유래의 세포, 조직 또는 체액, 예를 들면 전혈, 뇨, 혈장, 및 혈청을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 생물체에서 직접적으로 유래된 것은 물론 인비트로에서 배양된 세포 또는 조직을 포함한다. 본원에 따른 바이러스의 검출을 위해 다양한 시료가 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서는 전혈, 혈청 및/또는 혈장이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서는 SFTS가 발생한 또는 발생이 의심되거나 또는 SFTS 바이러스 감염 또는 감염이 의심되는 생물체에서 수득한 조직/세포 또는 인비트로 세포 배양물이 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 상기 혈액, 세포 또는 조직의 분획 또는 유도물을 포함하는 것이다. 세포 또는 조직을 이용하는 경우, 세포 자체 또는 세포 또는 조직의 융해물이 사용될 수 있다.

본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 바이러스 양 (titer)의 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본원에 따른 방법에서 항원-항체 복합체 검출은 공지된 다양한 방법을 통하여 수행될 수 있으며, 예를 들면 방사상면역분석, 웨스턴블랏, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석을 포함한다.

일 구현예에서는 직접 ELISA, 간접 ELISA, 이중항원 샌드위치 ELISA, 경쟁적 ELISA를 포함하는 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) 및 RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 면역분석법이 사용된다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1 항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 ³H 또는 ¹²⁵I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질은 정성 또는 정량적으로 검출 할 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서는 이중항원 샌드위치 ELISA가 사용된다. 이중항원 샌드위치 방식은 항원을 고상 기질에 고정시킨 후 여기에 항체를 결합하고, 상기 항체를 다시 형광물질 또는 바이오틴 등으로 표지된 항원과 결합시켜, 항체를 검출하는 방법으로, 항원으로는 본원에 따른 SFTS가 코딩하는 단백질 (재조합 단백질 포함)이 사용될 수 있으며, 예를 들면 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 뉴클레오캡시드 단백질이 사용될 수 있으며, 이는 특히, 본원에 따른 SFTS 바이러스를 HB29 스트레인의 SFTS 바이러스와 차별적으로 검출하는데, 유용하게 사용될 수 있다.

기타 다른 면역 반응 기반의 방법이 사용될 수 있으며 다른 구현예에서는 항원 항체 결합을 통해 항체 및/또는 항원을 간단하게 검출할 수 있는 Ouchterlony 플레이트, 웨스턴블랏, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE와 같은 면역 전기영동 (Immuno Electrophoresis)이 사용될 수 있다. 이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 항원-항체반응, 항원에 특이적으로 결합하는 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 복합체와 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자와의 반응을 통해 검출될 수 있거나, 또는 질량분석기를 이용할 수 있다. 상기 본원의 항원-항체 복합체와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)와 함께 사용될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 감염 여부를 진단할 수 있다.

본원에 따른 방법에서 바이러스 항원은 방사능물질, 효소 및 형광물질로 구성되는 군으로부터 선택되는 표지로 직접적 또는 샌드위치 형태로 간접적으로 표지될 수 있다. 직접적 표지방법의 경우, 어레이 등에 사용되는 혈청 시료는 Cy3 또는 Cy5와 같은 형광 표지로 표지된다. 샌드위치의 경우, 표지되지 않은 혈청 시료를 먼저 검출시약이 부착된 어레이와 반응시켜 결합시킨 후, 표적 단백질을 표지된 검출 항체와 결합시켜 검출한다. 샌드위치 방식의 경우, 민감도와 특이성을 높일 수 있어, pg/mL 수준까지 검출이 가능하다. 그 외 방사능 물질, 발색물질, 자기성입자 및 고밀도전자입자 등이 표지물질로 사용될 수 있다.

형광 광도는 스캐닝 콘포칼 현미경이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Affymetrix, Inc. 또는 Agilent Technologies, Inc 등에서 입수할 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 인비트로 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 항체 검출 키트에 관한 것으로, 상기 키트는 본원에 따른 바이러스 항원을 포함하는 바이러스 시료 및 상기 항원-항체 복합체 검출용 시약을 포함한다.

본원에 따른 키트에 포함되는 항원-항체 복합체 검출용 시약은 방사상면역분석, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석용에 사용되는 시약으로, 이에 대하여는 앞서 기술한 바를 참조한다.

또한 상술한 바와 같이 면역 반응의 검출을 위해 검출시약은 검출을 위해 직접적 또는 샌드위치 형태로 간접적으로 표지될 수 있다. 직접적 표지방법의 경우, 어레이 등에 사용되는 혈청 시료는 Cy3 또는 Cy5와 같은 형광 표지로 표지된다. 샌드위치의 경우, 표지되지 않은 혈청 시료를 먼저 검출시약이 부착된 어레이와 반응시켜 결합시킨 후, 표적 단백질을 표지된 검출 항체와 결합시켜 검출한다. 샌드위치 방식의 경우, 민감도와 특이성을 높일 수 있어, pg/mL 수준까지 검출이 가능하다. 그 외 방사능 물질, 발색물질, 자기성입자 및 고밀도전자입자 등이 표지물질로 사용될 수 있다. 형광 광도는 스캐닝 콘포칼 현미경이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Affymetrix, Inc. 또는 Agilent Technologies, Inc 등에서 입수할 수 있다.

본원의 키트는 추가로 결합분석에 필요한 하나 이상의 부가 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들면 결합 버퍼, 시료 준비에 필요한 시약, 혈액채취용 주사기 또는 음성 및/또는 양성대조군을 추가로 포함할 수 있다.

상기 다양한 검출시약을 포함할 수 있는 본원의 키트는 분석양태에 따라 ELISA 분석용, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석용, 마이크로어레이용, 유전자증폭용, 또는 면역분석용 등으로 제공될 수 있으며, 분석 양태에 맞추어 적절한 검출시약을 선별할 수 있을 것이다.

일 구현예에서는 ELISA 또는 딥스틱 래피드 키트가 사용되며, 이 경우 본원에 따른 바이러스 항원이 기질, 예를 들면 다중웰 플레이트의 웰 또는 유리 슬라이드의 표면 또는 나이트로셀룰로스에 부착되어 제공될 수 있다. 딥스틱의 경우, POCT (Point Of Care Testing) 분야에서 널리 이용되는 기술로, 본원에 따른 바이러스 항원이 나이트로셀룰로스와 같은 기질에 결합되어 있고, 이를 혈청과 같은 시료와 접촉시 예를 들면 딥스틱의 일 말단을 혈청시료와 접촉시, 시료가 모세관 현상에 의해 기질을 이동하여, 바이러스 항원과 결합시 발색하는 방식으로 검출하는 것이다.

본원에 따른 바이러스는 적절한 처리를 통해 백신으로 개발될 수 있다. 이러한 측면에서 본원은 본원에 따른 바이러스의 전부 또는 일부를 포함하는, 중증열성혈소판감소증후군 (SFTS) 바이러스에 대한 면역원성 조성물에 관한 것이다.

면역원성 조성물의 제조를 위해 본원에 따른 바이러스는 약독화 또는 불활성화되어 포함되며, 이에 대한 방법은 공지된 바와 같다 (Stanley A et al., Vaccine, 5^th Edition, Elsevier Inc. 2008 참조).

본원에 따른 바이러스는 일차적으로 SFTS 바이러스 감염의 우려가 있는 성인 또는 어린이에게 예방차원에서 투여될 수 있다.

본원에 따른 면역원성 조성물은 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 당업자라면 공지된, 조성물의 제조에 사용되는 다양한 물질을 본원에 따른 면역원성 조성물의 제조에 채용할 수 있을 것이다. 예를 들면 Remington's Pharmaceutical Sciences (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa.을 참조할 수 있다. 예를 들면 본원에 따른 바이러스를 7.5% 락토스 및 2.5% 인간 혈청 알부민을 포함하는 MEME (Minimum Essential Medium Eagle's Salt) 또는 10% 솔비톨을 포함하는 MEME를 이용하여 제형화 할 수 있다. 또한 바이러스는 생리적으로 허용가능한, 멸균된 생리적 식염수로 희석하여 사용될 수 있다.

본원에 따른 면역원성 조성물은 공지된 다양한 방법을 이용하여 투여될 수 있으며, 투여량도 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들면 본원에 따른 바이러스는 10² 내지 10⁷ 감염 유니트 (또는 PFU (plaque-forming unit) 또는 조직배양물 감염도즈 (tissue culture infectious dose))를 포함하는 0.1 내지 1.0 ml의 멸균된 액상 용액으로 제형화되어, 근육내, 피하, 진피내 경로로 투여될 수 있다.

또한 본원에 따른 조성물은 일회 투여되거나 또는 초기 프라임 투여 후, 수개월 후에 부스터로 투여될 수 있으며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있을 것이다.

본원에 따른 조성물은 또한 아주번트를 추가로 포함할 수 있다. 당업자라면 당업계에 공지된 아주번트는 중 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 아주번트는 본원에 따른 바이러스의 면역원성을 향상시키기 위해 사용되는 것으로서, 리포좀, 합성 아주번트 예를 들면 QS21, 뮤라밀 다이펩타이드, 모노포스포릴 리피드 A, 또는 폴리포스파진을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 부가하여 필요한 경우, 아주번트 활성을 갖는 사이토카인 예를 들면 GM-CSF, IL-2, IL-5, IL-12 또는 IL-13을 코딩하는 유전자를 바이러스 유전체에 삽입할 수 있다. 또한 기타 면역원성의 향상을 위한 다른 유전자, 또는 세포성 또는 체액성 면역을 유도를 위한 다른 유전자와 함께 도입될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 바이러스의 분리

바이러스를 분리한 환자의 상태를 요약하면 다음과 같다. 바이러스는 발병 전까지 건강했던 63세의 대한민국 강원도 춘천시에 거주하는 여자 환자에게서 분리하였다. 환자는 발열 2주전에 곤충에게 물린 것으로 보고되었으며, 발병 한달전부터 해외여행이나 가축과의 접촉은 없는 것으로 확인되었다. 발병 3일째부터 하루 6회 설사가 동반되었으며, 4일째, 혈소판 및 백혈구 감소가 관찰 되었다. 발병 10일째 다수의 장기 부전으로 사망하였다.

상기 환자로부터 발병 8일째에 항응고 상태로 혈액을 채취하여 -70에 보관하였다. 7개월 후에 상기 혈액을 단층으로 배양된 Vero 세포 (아프리카 녹색 원숭이의 신장 유래, 한국세포주 은행 KCLB No. 10081)에 감염한 후 37℃, 5% CO₂ 조건에서 2% FBS를 포함한 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 13일 후에 배양액을 회수하여 유전자 분석을 수행하였다. 또한 상기 회수된 배지를 DH82 세포 (개의 악성 히스티오사이토시스 대식세포 유래, ATCC CRL-10389)에 접종 한 후 5일간 배양하고, 이어 광학도립현미경으로 바이러스에 감염되어 나타난 세포에서 관찰되는 세포병변 효과를 관찰하였다. 베로세포에서 관찰되는 세포변병효과는 정상세포의 변형이나 파괴로 나타나는 것으로, 배양플라스크에서 세포가 떨어져 나오게 된다(도 1). DH82 세포에서 관찰되는 세포병변 효과는 바이러스를 탐식한 세포가 정상세포보다 커지고, 다수의 공포(vacuoles)를 포함한 세포로 변형되게 되며, 위족(pseudopods)이 뻗어나오게 된다(도 2)

실시예 2 바이러스 유전적 분석

바이러스의 형태적 분석을 위해 SFTS 바이러스로 감염된 Vero 세포는 기존에 개시된 방법 (Popov VL et al. J Med Microbiol 1995; 43:411-21)대로 고정하였다. 고정 후 울트라마이크로톰(RMC MT-XL)을 이용하여 65 nm 두께로 절편을 만든 후 포화된 4% 유라닐 아세테이트 및 4% 레드 (lead) 사이트레이트로 염색한 후, 투과전자현미경 (HITACHI-7100, Hitachi High-Technologies, Japan)으로 75 kV에서 관찰하였다. 결과는 도 1에 기재되어 있다.

유전적 분석은 다음과 같이 수행되었다. 상기 채취한 혈액 및 상기 혈액으로 감염된 Vero 세포로부터 QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)을 제조자의 방법대로 사용하여 RNA를 추출하였다. 이어 상기 RNA를 이용하여 종전에 기재된 바와 같이 (Liu Y et al. Vector Borne Zoonotic Dis. 2012; 12:156-60) 역전사 PCR(reverse transcript PCR, RT-PCR)을 수행하여 부분적 L 단편을 증폭하였다. RT-PCR 결과, SFTS 바이러스 양성인 것으로 확인되어, PCR 산물을 직접적 염기서열법으로 분석하였다. SFTS 바이러스의 전체 염기서열분석을 위해 종전에 GenBank에 공개되어 있는 SFTS 바이러스의 염기서열 중에서 공통 염기서열 및 L 단편의 염기서열 중에서 가장 유사하였던 염기서열을 보였던 유전형인 AH12형(GenBank Accession no. HQ116417)의 염기서열을 이용하여 프라이머를 고안하였다(Yu XJ et al., N Engl J Med 364;16:1523-1532.). L, M 및 S 단편 각각에 대해 RT-PCR을 수행한 뒤 PCR 산물을 직접적 염기서열법으로 분석하였다. 각 단편의 말단부위는 cRNA의 3' 말단을 폴리아데닐화 한 후, cDNA 말단을 래피드 증폭법을 사용하여 증폭한 뒤, 직접 염기서열법으로 염기서열을 결정하였다. 분석된 L, M 및 S 의 cDNA 서열은 각각 서열번호 1, 2 및 3의 서열로 표시되며, 이는 각각 GenBank에 Accession Nos. KF358691, KF358692 및 KF358693로 기탁되었다.

블라스트 분석 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 결과 SFTS 바이러스 이외에 유사 서열을 존재하지 않는 것으로 나타났다. 상동성 검색 결과 본원에서 규명된 바이러스는 종전에 규명된 SFTS 바이러스와 L, M, 및 S 단편이 각각 95.8%-99.8%, 94.1%-99.9%, 및 94.8%-99.7%의 상동성을 갖는 것으로 나타났다.

RNA-dependent RNA 폴리머라제 염기서열을 이용하여 neighbor-joining 방법으로 기존에 알려진 중국 및 일본의 SFTS 바이러스와 계통발생학분석을 수행한 결과, 이들 바이러스와 동일하지 않으며, 95.9%-99.9% 서열 관련성을 가지고 있는 것으로 나타났다 (도 2 참조).

실시예 3 배양된 바이러스를 항원으로 이용한 면역형광 분석

배양된 바이러스를 항원으로 이용한, 아래와 같은 면역형광법을 통해 중증열성혈소판감소증후군으로 확진된 다른 환자를 진단하였다.

구체적으로 3% 소혈청알부민(Bovine serum albumin)에 환자 혈청을 1:4로 혼합하여 혈청 1:4 희석용액을 제조하고 연속적으로 희석하여 1:32 희석용액까지 제조하였다. 이어 아세톤으로 고정한 배양된 바이러스가 항원으로 도포되어 있는 슬라이드에 희석혈청을 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 순으로 10 μL씩 분주하고 마지막으로 음성대조군으로 소혈청알부민만을 분주하였다. 면역형광법 슬라이드를 37℃ 항온기에서 30분간 반응한 뒤 인산염완충식염수로 5분간 3회 세척하였다. 상온에서 슬라이드를 건조 후 형광물질 이소치오시아네이트(fluorescein isothiocyanate)-접합 염소항인감마면역글로불린항체 IgM과 IgG를 각각 분주한 후, 37℃ 항온기에서 30분간 반응 후 인산염완충식염수로 5분씩 3회 세척 후 형광용액으로 반응시킨 뒤 현미경으로 판독하였다. 결과는 도 5에 기재되어 있으며, 이에 나타난 바와 같이, 배양된 바이러스를 항원으로 이용하여 회복기 환자의 혈청에서 면역형광법을 이용한 진단을 시행하였을 때, IgG 항체에 대해 1:160 희석 혈청에서 강한 양성으로 확인되었다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고 문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

<110> SNU R&DB Foundation <120> Viruses associated with Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome and Methods and Kits for diagnosing SFTS using the same <130> DP201308004P <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 6368 <212> DNA <213> Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus <220> <221> precursor_RNA <222> (1)..(6368) <223> L segment <220> <221> misc_feature <222> (17)..(6271) <223> RNA-dependent RNA polymerase <400> 1 acacagagac gcccagauga acttggaagt gctttgtggt aggataaacg tggagaatgg 60 gttgtctctt ggagaaccag gcctgtacga ccaaatctac gacaggccag ggctcccaga 120 cctagatgta actgtcgatg ccacaggtgt gacagtggac ataggggctg tgccagactc 180 agcatcacaa ctgggttcat caatcaatgc tgggttgatc acaatccagc tctctgaagc 240 atataagatc aatcatgact tcacgttttc tggtctgtca aagacaacag accgacgcct 300 ctcagaggta ttccccatta cccatgatgg ttctgatggg atgacccctg atgtgattca 360 caccagattg gatggaacca ttgtggtggt tgaattttca accactagga gccataacat 420 tgggggcctg gaggcagcat ataggacaaa gatagaaaaa tatagggacc caatctcaag 480 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<210> 2 <211> 3378 <212> DNA <213> Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus <220> <221> precursor_RNA <222> (1)..(3378) <223> M segment <220> <221> misc_feature <222> (19)..(3240) <223> membrane glycoprotein polyprotein <400> 2 acacagagac ggccaacaat gatgaaagtc atctggttct cctctctgat ctgctttgtc 60 attcaatgca gtggggactc gggcccaatc atctgcgcag gacccatcca ctcaaacaag 120 agtgctgaca tacctcacct gctgggttac tctgagaaga tatgtcagat agatcggctg 180 atacatgttt cgtcatggct cagaaaccac tcacaatttc agggctacgt agggcagcga 240 ggtggacgct ctcaggtgag ctactaccca gctgaaaatt cttactcaag gtggagtggg 300 cttctaagcc cctgtgatgc tgattggctt gggatgcttg tcgtgaagaa ggccaagggg 360 tctgatatga tagttcctgg gccttcatac aaggggaaag tcttttttga gcggccaact 420 tttgatggat atgtaggctg gggttgtggc agtgggaagt ctaggacaga gtcaggagag 480 ctctgcagtt cagactcagg gactagctct ggtcttctgc cctcagatag ggttctctgg 540 ataggtgatg ttgcttgtca gcctatgaca cccatccctg aagagacatt tctggagctg 600 aagagtttta gccaaagtga attcccagac atatgcaaaa ttgatggcat 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ggctggcccc 1320 actgggagat actcctttaa ggctgctgct gcagcacatg tccaagtggg gaggctctgc 1380 gctaccctta caggggtgat tgagagcctg gtctctgccc tctcaaccag tccatatttc 1440 tcctggagcg ccatcaacct cttagaccct gagtttgaca tcttccctga tgccttgacg 1500 atcttattgc ctcgagtcag ggcaaagaca atgatgaact tggtgtcctt cacccagtca 1560 tctccacctg tctccttcag cttcttgatg atcaaagcag gatcaaggcc ttcataggcc 1620 agctctctcg caaaatcctc aagctcagtc aaattgagct gctgctcacc aaactccact 1680 gcaatcctgg accactctga catgatcact cctttgcgtc tttccttttt tgggggttct 1740 ttgtgt 1746 <210> 4 <211> 2084 <212> PRT <213> Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(2084) <223> RNA-dependent RNA polymerase <400> 4 Met Asn Leu Glu Val Leu Cys Gly Arg Ile Asn Val Glu Asn Gly Leu 1 5 10 15 Ser Leu Gly Glu Pro Gly Leu Tyr Asp Gln Ile Tyr Asp Arg Pro Gly 20 25 30 Leu Pro Asp Leu Asp Val Thr Val Asp Ala Thr Gly Val Thr Val Asp 35 40 45 Ile Gly Ala Val Pro Asp Ser Ala Ser Gln Leu Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Ala Gly Leu Ile 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Gln Gly Ile Asp Asn Arg Ala Met Gly Asn Ile Phe Arg 1905 1910 1915 1920 Asp Cys Leu Glu Gly Ser Leu Arg Lys Gln Gly Leu Met Arg Ser Lys 1925 1930 1935 Leu Thr Glu Met Val Glu Lys Asn Val Val Pro Leu Thr Thr Gln Glu 1940 1945 1950 Leu Val Asp Ile Leu Glu Glu Asp Ile Asp Phe Ser Asp Val Ile Ala 1955 1960 1965 Val Glu Leu Ser Glu Gly Ser Leu Asp Ile Glu Ser Ile Phe Asp Gly 1970 1975 1980 Ala Pro Ile Leu Trp Ser Ala Glu Val Glu Glu Phe Gly Glu Gly Val 1985 1990 1995 2000 Val Ala Val Ser Tyr Ser Ser Lys Tyr Tyr His Leu Thr Leu Met Asp 2005 2010 2015 Gln Ala Ala Ile Thr Met Cys Ala Ile Met Gly Lys Glu Gly Cys Arg 2020 2025 2030 Gly Leu Leu Thr Glu Lys Arg Cys Met Ala Ala Ile Arg Glu Gln Val 2035 2040 2045 Arg Pro Phe Leu Ile Phe Leu Gln Ile Pro Glu Asp Ser Ile Ser Trp 2050 2055 2060 Val Ser Asp Gln Phe Cys Asp Ser Arg Gly Leu Asp Glu Glu Ser Thr 2065 2070 2075 2080 Ile Met Trp Gly <210> 5 <211> 1073 <212> PRT <213> Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(1073) <223> membrane glycoprotein polyprotein <400> 5 Met Met Lys Val Ile Trp Phe Ser Ser Leu Ile Cys Phe Val Ile Gln 1 5 10 15 Cys Ser Gly Asp Ser Gly Pro Ile Ile Cys Ala Gly Pro Ile His Ser 20 25 30 Asn Lys Ser Ala Asp Ile Pro His Leu Leu Gly Tyr Ser Glu Lys Ile 35 40 45 Cys Gln Ile Asp Arg Leu Ile His Val Ser Ser Trp Leu Arg Asn His 50 55 60 Ser Gln Phe Gln Gly Tyr Val Gly Gln Arg Gly Gly Arg Ser Gln Val 65 70 75 80 Ser Tyr Tyr Pro Ala Glu Asn Ser Tyr Ser Arg Trp Ser Gly Leu Leu 85 90 95 Ser Pro Cys Asp Ala Asp Trp Leu Gly Met Leu Val Val Lys Lys Ala 100 105 110 Lys Gly Ser Asp Met Ile Val Pro Gly Pro Ser Tyr Lys Gly Lys Val 115 120 125 Phe Phe Glu Arg Pro Thr Phe Asp Gly Tyr Val Gly Trp Gly Cys Gly 130 135 140 Ser Gly Lys Ser Arg Thr Glu Ser Gly Glu Leu Cys Ser Ser Asp Ser 145 150 155 160 Gly Thr Ser Ser Gly Leu Leu Pro Ser Asp Arg Val Leu Trp Ile Gly 165 170 175 Asp Val Ala Cys Gln Pro Met Thr Pro Ile Pro Glu Glu Thr Phe Leu 180 185 190 Glu Leu Lys Ser Phe Ser Gln Ser Glu 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Claims (14)

1. L (Large), M (Medium) 및 S (Small) 단편이, 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 DNA 서열에 역 상보적인 RNA 서열을 갖는 중증열성혈소판감소증후군 (SFTS) 바이러스.
   
2. 제 1 항에 따른 바이러스를 항원으로 포함하는 바이러스 시료를 검체와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 인비트로에서 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 항체 검출 방법.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 검체는 전혈, 혈장 또는 혈청 중 하나 이상인 방법.
   
4. 제 2 항에 있어서, 상기 검출은 정량적 또는 정성적 검출인, 방법.
   
5. 제 2 항에 있어서, 상기 항원-항체 복합체 검출은 방사상면역분석, 웨스턴블랏, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석을 통해 검출되는 되는 것인, 방법.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 ELISA는 이중항원 샌드위치 방식으로, 상기 항원은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질인, 방법.
   
7. 제 2 항에 있어서, 상기 항원은 방사능물질, 효소 및 형광물질로 구성되는 군으로부터 선택되는 표지로 표지된 것인, 방법.
   
8. 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 항체 검출 또는 진단 또는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 감염 진단 키트로, 상기 키트는 제 1 항에 따른 바이러스를 항원으로 포함하는 바이러스 시료 및 상기 항원-항체 복합체 검출용 시약을 포함하는, 키트.
   
9. 제 8 항에 있어서, 상기 항원-항체 복합체 검출용 시약은 방사상면역분석, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석용 시약인, 키트.
   
10. 제 1 항에 따른 바이러스를 포함하는, 중증열성혈소판감소증후군 (SFTS) 바이러스에 대한 면역원성 조성물.
    
11. 제 10 항에 있어서, 상기 조성물은 아주번트를 추가로 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
    
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