CN115932238A - 一种用于sfts病毒核酸检测的探针和试纸条及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于SFTS病毒核酸检测的探针和试纸条及使用方法，包括探针H1和探针H2，用于特异性检测SFTS病毒；本发明还公开了一种用于SFTS病毒核酸检测的试纸条及使用方法，配合上述探针，通过层析法高效检测SFTS病毒。本发明通过特异性探针配合侧向免疫层析试纸条，对SFTS病毒进行检测，能够在15分钟内获得检测结果，无需RNA提取等繁琐步骤，操作方便高效，且特异性强，灵敏度高。

Description

一种用于SFTS病毒核酸检测的探针和试纸条及使用方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于SFTS病毒核酸检测的探针和试纸条及使用方法。

背景技术

严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)是一种新型布尼亚病毒。近年来，SFTSV感染病例数稳步增长。由于SFTSV可以在人与人之间传播，它将使公众面临感染风险。在2018年重点疾病蓝图清单年度审查中，世界卫生组织将SFTSV感染列为紧急情况下研发的重点疾病。然而，SFTSV的发病机制仍不清楚，还没有特定的治疗方法或疫苗来对抗SFTSV的感染。因此严重发热伴血小板减少综合征病毒的检测对SFTS感染防治具有重要意义，预防病症，控制病毒传播，有效管理患者。

目前，临床实验室检查主要以核酸检测和血清抗体检测为主。血清抗体检测主要用于严重发热伴血小板减少综合征的筛查，但是易出现假阴性结果。对于新型布尼亚病毒IgG抗体阳性者应进一步检SFTSV-RNA，以确定是否为现症感染，然而核酸PCR方法复杂，对于环境和技术人员要求严格。发热伴血小板减少综合征防治指南(2010版)指出，SFTSV的实验室检查仍然以SFTSV-RNA检测作为金标准，应用最为广泛的q-PCR方法虽然技术成熟，特异性高。但是，q-PCR需要在精密的大型荧光定量PCR仪上进行长时操作，对于操作人员有一定的技术要求，其仪器昂贵，耗时较长很难在小型医院及偏远地区开展检测，因此PCR很难实现现场即时检测(P OCT)。

发明内容

有鉴于此，本发明期望提供一种用于SFTS病毒核酸检测的探针和试纸条及使用方法，通过侧向免疫层析试纸条，无需RNA提取，在等温无酶环境下快速、高特异性、高灵敏度地检测SFTS核酸，实现SFTS现场即时检测。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种用于SFTS病毒核酸检测的探针H1和探针H2序列分别如下：

H1:CTGTTGACTCCTCTTTGTTCTTCAACAGTCACCCCAGAACAAAGA GGAG

H2:TTGTTCTGGGGTGACTGTTGAAGAACAAAGAGGAGTCAACAGTC ACCCC

进一步地，所述探针H1和探针H2均为发夹结构，探针H1的5’端由地高辛修饰，探针H2的5’端由生物素修饰。

进一步地，所述探针与目的检测序列混合，形成H1+H2杂交双链。

本发明还另外提供一种用于SFTS病毒核酸检测的试纸条，所述试纸条为侧向免疫层析试纸条，检测上述H1+H2杂交双链。

进一步地，所述试纸条依次设置样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫。

进一步地，所述结合垫上包被AlexaFluor647荧光素和亲和素双标记的纳米微球；所述硝酸纤维素膜标有检测线和质控线。

这里，检测线(test line)标记为“T”，质控线(control line)标记为“C”。

进一步地，所述样品垫、结合垫为玻璃纤维材质；所述吸收垫为纤维素材质。

进一步地，所述检测线上喷洒抗地高辛，所述质控线上涂抹生物素。

本发明还另外提供一种用于SFTS病毒核酸检测的试纸条的使用方法，使用上述试纸条，包括以下步骤：

1)层析：在样品垫滴加反应液，反应液随着层析作用缓慢向结合垫处流动；

2)荧光检测：15分钟后，使用荧光免疫定量分析仪进行读取，如在检测线检测到阳性信号，说明存在目标链，样本为阳性；如检测线处没有阳性信号，说明目标链不存在，样本为阴性。

这里，当目标序列存在时，反应液形成H1+H2杂交双链，此时，结合垫处标记的纳米微球捕获H2标记的生物素，形成亲和素-纳米微球-H1+H2 杂交双链复合物；反应液继续向前流动，在检测线处，包被的抗地高辛抗体捕获H1标记的地高辛，形成亲和素-纳米微球-H1+H2杂交双链-抗地高辛复合物，在试纸上形成荧光线，使用荧光免疫定量分析仪Getein1100进行读取，检测线和质控线均显示荧光，检测信号为阳性，说明存在目标链。当目标序列不存在时，两条探针不能结合，质控线处捕获H2探针，只有质控线处显示荧光，则样本为阴性，不存在目标链。

这里，本发明通过特异性探针配合侧向免疫层析试纸条，对SFTS病毒进行检测，能够在15分钟内获得检测结果，无需提取RNA等繁琐步骤，操作方便高效，且特异性强，灵敏度高。

本发明有益效果如下：1)本发明通过特异性探针配合侧向免疫层析试纸条，高效地对SFTS病毒进行核酸检测，操作简单方便，降低了检测难度； 2)本发明方法检测过程中无需RNA提取，在等温无酶环境下即可快速、高特异性、高灵敏度地检测SFTS病毒，实现SFTS病毒即时检测，大大提高了检测效率。

附图说明

图1为本发明实施例1中探针H1和探针H2二级结构图；

图2为本发明实施例2中琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本发明实施例3中荧光定量PCR结果图；

图4为本发明实施例4中SFTS临床阳性样本荧光定量PCR结果图；

图5为本发明实施例5中一种用于SFTS病毒核酸检测的试纸条的结构示意图；

图6为本发明实施例5中使用试纸条进行SFTS病毒核酸的检测流程图；

其中，1是样品垫、2是结合垫、3是硝酸纤维素膜、4是吸收垫。

具体实施方式

为了能够更加详尽地了解本发明的特点与技术内容，下面结合附图对本发明的实现进行详细阐述，所附附图仅供参考说明之用，并非用来限定本发明。

实施例1探针检测管制备

S11、根据SFTSV-5’UTR保守区进行多序列比对，并选出含有21个碱基的保守序列作为目标检测序列(Target)，序列详细如下：

Target:AGAACAAAGAGGAGTCAACAG

S12、根据目标检测序列设计两条发夹探针H1和H2，其二级结构如图 1所示，序列分别为：

H1:CTGTTGACTCCTCTTTGTTCTTCAACAGTCACCCCAGAACAAA GAGGAG

H2:TTGTTCTGGGGTGACTGTTGAAGAACAAAGAGGAGTCAACA GTCACCCC

并分别用地高辛(Digoxin)修饰H1的5’端，生物素(Biotin)修饰H2的5’端，当目标检测序列存在时，由目标检测序列触发反应，依次打开发夹探针H1和探针H2，由于序列互补形成H1+H2杂交双链。

S13、将探针H1和H2分别用TNaK+Mg²⁺(20×10^-3M Tris，pH7.5；140 ×10^-3M NaCl；5×10^-3MKCl，5×10^-3MMgCl)缓冲液溶解至10μM，并进行退火，在95℃下处理10分钟后逐渐降至室温2小时，并放置-20℃冰箱备用。

实施例2电泳验证催化发夹自组装系统可行性

通过琼脂糖凝胶电泳验证系统进行验证，步骤如下：

S21、各取探针H1、探针H2和目标序列各10μL充分混匀，终浓度为 1μM，在37℃金属浴中反应30分钟，得到反应液；

S22、取S21中反应液10μL和loading buffer 2μL进行混合，取10μ L混合液上样进行电泳，电泳完毕后，取凝胶于凝胶成像系统中拍照并保存，电泳结果如图2所示，泳道1-4号条带从左到右依次为：H1+H2、H1+H2+T、 H1、H2，这里T为Target，下同。

如图2所示，不存在目标检测序列时，两个发夹探针H1和H2不能够互相结合，只有当目标检测序列与两种探针同时存在时，两个探针H1和H 2的发夹结构才能依次打开，并结合形成H1+H2杂交双链。

实施例3荧光双重验证催化发夹自组装系统可行性

通过q-PCR荧光双重验证系统进行验证，步骤如下：

S31、在H2暴露的5’端标记荧光素FAM，3’端标记淬灭基团BHQ-1。将探针H1、H2经过退火处理并将探针与目标检测序列稀释至10μM，设定 6个不同反应管，分别为：H1、H2、T、H1+H2、H1+T、H1+H2+T。反应体系为30μL，终浓度为1μM，再实时荧光定量PCR仪设定37℃恒温反应进行扩增，荧光定量PCR结果如图3所示。

图3表明，H1、T和H1+T曲线因为无标记序列，因此检测不到荧光值。H2由FAM和BHQ-1修饰，检测显示微弱荧光强度；没有目标检测链 T时，探针H1+H2反应曲线的荧光值与H2反应曲线没有明显差异，表明它们稳定共存并保持二级结构。在目标检测链T存在的情况下，触发与H1 末端暴露的toehold区域结合反应，当H1打开时，H2与其余暴露的碱基结构域结合形成H1-H2双链复合物。由于H2既标记有荧光基团FAM又标记淬灭基团BHQ-1，产生荧光能够被有效淬灭，但反应进行得很快，所以后期呈现稳定趋势。

实施例4催化发夹自组装系统检测SFTS临床阳性样本可行性验证

S41、收集2例SFTSV核酸检测阳性样本，各取10μL血清核酸提取样本，分别加入步骤S31的检测管中，充分混匀，在实时荧光定量PCR仪设定37℃恒温反应进行扩增。

取反应15分钟的荧光值进行对比，结果如图4所示，测得2例阳性样本荧光值均与阴性均值存在倍数差异。结果表明该检测方法可用于检测SF TS临床样本。

实施例5用于SFTS病毒核酸检测的试纸条检测SFTS临床阳性样本

本实施例提供一种用于SFTS病毒核酸检测的试纸条，所述试纸条为侧向免疫层析试纸条，其结构示意图如图5所示，从左到右依次设置样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，样品垫上设置加样孔；所述结合垫上包被AlexaFluor647荧光素和亲和素双标记的纳米微球；所述硝酸纤维素膜标有检测线和质控线；所述检测线上喷洒抗地高辛，所述质控线上涂抹生物素；所述样品垫、结合垫为玻璃纤维材质；所述吸收垫为纤维素材质。

本实施例中，检测线(test line)标记为“T”，质控线(control line)标记为“C”。

检测时，选取一例临床阳性样本和阴性样本制备反应液：取10μL血清样本和阴性样本分别加入90μL H1与H2浓度比为1:3的检测液中。这里，所述检测液包括如下组分：1μMH1,3μM H2,20×10^-3m Tris,pH 7.5；140 ×10^-3m NaCl；5×10^-3m KCl；5mM MgCl₂，充分混匀，在37℃水浴锅中反应 30分钟得到反应液，分别取80μL反应液滴加在样品垫上，反应液随着层析作用缓慢向结合垫处流动。

一方面，阳性存在目标链target，其反应原理如图6所示，形成H1+H2 杂交双链，此时，结合垫处标记的纳米微球捕获H2标记的生物素，形成亲和素-纳米微球-H1+H2杂交双链复合物；反应液继续向前流动，在检测线处，包被的抗地高辛抗体捕获H1标记的地高辛，形成亲和素-纳米微球 -H1+H2杂交双链-抗地高辛复合物。

本实施例中，在滴加反应液样本1min后，检测到试纸条上的荧光值很低，这是因为滴加的80μL反应液未能全部流动至检测窗口，还有残余液体未能与包被物结合。

随着层析时间的增加，检测线处及质控线处能检出的荧光值逐渐上升，并在15min左右荧光值趋于稳定，反应达到平台期。结果表明，试纸条上发生的抗原抗体反应需要一定的时间，检测反应在滴定后15min左右才能全部完成，因此，将反应液滴定至LFIA试纸条上静置15min再读取荧光值，是较为合适的。

另一方面，阴性样本不存在目标序列，两条探针不能结合，质控线处捕获H2探针，只有质控线处能检测到阳性信号，检测线处无阳性信号。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。以上所涉及仪器的具体型号不作限制及详细描述，作为公知常识，本领域的技术人员能够理解。以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于SFTS病毒核酸检测的探针，其特征在于，包括探针H1和探针H2，序列分别如下：

H1:CTGTTGACTCCTCTTTGTTCTTCAACAGTCACCCCAGAACAAAGAGGAG

H2:TTGTTCTGGGGTGACTGTTGAAGAACAAAGAGGAGTCAACAGTCACCCC。

2.根据权利要求1所述的一种用于SFTS病毒核酸检测的探针，其特征在于，所述探针H1和探针H2均为发夹结构，探针H1的5’端由地高辛修饰，探针H2的5’端由生物素修饰。

3.根据权利要求1或2所述的一种用于SFTS病毒核酸检测的探针，其特征在于，所述探针与目的检测序列混合，形成H1+H2杂交双链。

4.一种用于SFTS病毒核酸检测的试纸条，其特征在于，所述试纸条为侧向免疫层析试纸条，检测如权利要求3所述的H1+H2杂交双链。

5.根据权利要求4所述的一种用于SFTS病毒核酸检测的试纸条，其特征在于，所述试纸条依次设置样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫。

6.根据权利要求5所述的一种用于SFTS病毒核酸检测的试纸条，其特征在于，所述结合垫上包被AlexaFluor647荧光素和亲和素双标记的纳米微球；所述硝酸纤维素膜标有检测线和质控线。

7.根据权利要求5所述的一种用于SFTS病毒核酸检测的试纸条，其特征在于，所述样品垫、结合垫为玻璃纤维材质；所述吸收垫为纤维素材质。

8.根据权利要求6所述的一种用于SFTS病毒核酸检测的试纸条，其特征在于，所述检测线上喷洒抗地高辛，所述质控线上涂抹生物素。

9.一种用于SFTS病毒核酸检测的试纸条的使用方法，其特征在于，使用如权利要求8所述的试纸条，包括以下步骤：

1)层析：在样品垫滴加反应液，反应液随着层析作用缓慢向结合垫处流动；

2)荧光检测：15分钟后，使用荧光免疫定量分析仪进行读取，如在检测线检测到阳性信号，说明存在目标链，样本为阳性；如检测线处没有阳性信号，说明目标链不存在，样本为阴性。

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