CN118271460A

CN118271460A - 痘病毒多抗原嵌合疫苗及其用途

Info

Publication number: CN118271460A
Application number: CN202410371003.XA
Authority: CN
Inventors: 高福; 王奇慧; 杜沛; 孔天翔; 仵丽丽; 璩骁; 齐建勋; 马任义
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Filing date: 2022-12-02
Publication date: 2024-07-02

Abstract

本发明涉及一种针对痘病毒(特别是猴痘病毒)的多免疫原嵌合或混合抗原，其相关产品、制备方法和应用。本发明的嵌合或混合抗原包含三种免疫原：(1)猴痘病毒A35R蛋白或其抗原性片段(或它们的衍生肽段)、(2)猴痘病毒M1R蛋白或其抗原性片段(或它们的衍生肽段)和(3)猴痘病毒B6R蛋白或其抗原性片段(或它们的衍生肽段)，能够激发针对细胞内成熟病毒颗粒(IMV)和细胞外包膜病毒颗粒(EEV)两种感染性病毒颗粒的免疫反应，从而高效地激发针对猴痘病毒的特异性免疫保护效应；此外，本发明的痘病毒疫苗还具有良好的安全性、快速响应性和产能支撑，具有极好的临床应用前景。

Description

痘病毒多抗原嵌合疫苗及其用途

本申请是申请日为2022年12月2日，申请号为202211537702.4，发明名称为“痘病毒多抗原嵌合疫苗及其用途”的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种痘病毒多免疫原嵌合或混合疫苗及其用途。

背景技术

以猴痘病毒为代表的痘病毒是一类核质大DNA病毒，其病毒基因组约为130-375kbp，能够编码多达200种病毒蛋白。除编码病毒蛋白繁复外，痘病毒的病毒颗粒也较为复杂，其具有两种形态不同的感染性病毒颗粒，称为细胞内成熟病毒(IMV)和细胞外包膜病毒(EEV)。其中IMV具有一层囊膜，其相较于EEV具有更高的稳定性，主要参与病毒在宿主间传播。而EEV则具有一层特殊的外膜结构，主要参与病毒在宿主体内的扩散。由于IMV和EEV具有不同的膜结构、膜组份和细胞感染机制，其表面中和抗原也截然不同。

猴痘病毒(MPXV)属于痘病毒，与天花病毒高度同源，自1958年被发现以来，长期在非洲中西部局部传播，并演化出多个毒株。然而，2022年，MPXV出现全球流行趋势，至7月23日，已传播至75个国家，感染逾1.5万人，被世界卫生组织宣布为“国际关注的突发公共卫生事件”。虽然目前的疫苗具备对猴痘病毒的防御能力，但值得警惕的是，近期发现MPXV出现变异频率加快的趋势，有产生逃逸突变株的可能。

全球只有2款疫苗可用于预防猴痘病毒感染，分别是安卡拉-巴伐利亚北欧公司(Bavarian Nordic)公司生产的JYNNEOS^TM疫苗(也称为Imvamune或Imvanex)和赛诺菲公司生产(Sanofi Pasteur)的这两种疫苗均为原本用于预防天花的弱毒活疫苗，其中，为第二代疫苗，在人体内具有复制能力，接种后有发生脑炎、心肌炎、进行性牛痘感染等的风险，同时不适宜幼儿、孕妇和免疫功能低下或受损人群的接种；而JYNNEOS^TM为第三代疫苗，由于其不能在人体内复制，相较于第一代和第二代疫苗，安全性上有所提升，但免疫效果也出现了一定程度的降低。

活病毒疫苗存在以下共性缺点：(1)病毒来自活的病毒，经减毒、弱化培养获得，其完整保留了病毒的抗原，但存在弱化不完全，或经变异后毒力恢复的可能；(2)疫苗包含病毒的所有抗原，成分复杂，具有较高引起副作用的可能；(3)疫苗中有效免疫原成分占比较低，相同剂量接种产生的免疫原性较弱；(4)病毒的部分成分可能具有抑制宿主免疫的功能，会起到反作用，降低疫苗的免疫原性。成分清晰的疫苗(mRNA疫苗/重组蛋白疫苗等)可以解决以上问题。但是，对于痘病毒这类复杂的病毒，找到关键的成分作为免疫原是一个主要的技术瓶颈。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

发明目的

鉴于现有技术疫苗的种种弊端，本发明的目的在于提供一种能够高效地激发针对猴痘病毒(特别是猴痘病毒)的特异性免疫反应的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原，其相关疫苗产品，其制备方法及应用；此外，基于该嵌合或混合抗原的疫苗类产品还具有安全、有效、免疫原成分和保护机制清晰、高产能、低成本等优势，从而可满足应急疫苗人群大范围接种的安全性和产能需求。

解决方案

为实现本发明目的，本发明提供了以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原，所述嵌合或混合抗原包含：

免疫原I：猴痘病毒A35R蛋白或其抗原性片段，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；

免疫原II：猴痘病毒M1R蛋白或其抗原性片段，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；和

免疫原III：猴痘病毒B6R蛋白或其抗原性片段，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列。

在可行的实现方式中，所述A35R蛋白的抗原性片段为该蛋白的胞外段或其一部分，优选为具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列加上由其向A35R蛋白的N端延伸1-30个氨基酸的片段的氨基酸序列、优选如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的肽段；

和/或，所述M1R蛋白的抗原性片段为该蛋白的胞外段或其一部分，优选为具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的肽段；

和/或，所述B6R蛋白的抗原性片段为该蛋白的胞外段或其一部分，优选为具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的肽段。

在一些实施方案种，所述痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原为多免疫原混合抗原，所述混合抗原为免疫原I、II、III的混合物；

优选地，其中，所述免疫原I具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；

和/或，所述免疫原II具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；

和/或，所述免疫原III具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列、优选为如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

优选地，所述混合物中，所述免疫原I、II、III的的质量比为1：1：1。

在另一些实施方案中，所述痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原为多免疫原嵌合抗原，所述嵌合抗原为一个或多个免疫原I、II、III以串联方式形成的单链。在一些具体实施方案中，所述嵌合抗原包括按照A1-C₁-M-C₂-A2-C₃-B样式排列的氨基酸序列，其中：

A1表示猴痘病毒A35R蛋白或其抗原性片段I，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，

A2表示猴痘病毒A35R蛋白或其抗原性片段II，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，

M表示猴痘病毒M1R蛋白或其抗原性片段，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，

B表示猴痘病毒B6R蛋白或其抗原性片段，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，

C₁、C₂、C₃各自独立地为无，或者连接序列(GGGGS)m，其中，m为1-10之间的任意整数；并且，

其中，

A1与A2相同或不同。

在一些优选的具体实施方案中，所述A1表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；

和/或，所述A2表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列加上由其向A35R蛋白的N端延伸1-30个氨基酸的片段的氨基酸序列、优选为如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者由上述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；其中，氨基酸序列如SEQID NO:1所示的A35R肽段为功能性肽段，而其向N端延伸1-30个氨基酸的片段则起连接子(linker)的作用；

和/或，所述M表示如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；

和/或，所述B表示如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列、优选为如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

进一步优选地，所述A1表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述A2表示如SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述M表示如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述B表示如SEQ ID NO:4或如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

在一些优选的实施方案中，所述A1表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述A2表示如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述M表示如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述B表示如SEQ ID NO:4或如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

优选地，所述C₁、C₂、C₃均为无；

进一步优选地，所述嵌合抗原包含如SEQ ID NO:6所示或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

在另一些具体实施方案中，所述嵌合抗原包括按照A-C₁’-M-C₂’-B样式排列的氨基酸序列，其中：

A表示猴痘病毒A35R蛋白或其抗原性片段，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，

C₁’、C₂’各自独立地为无，或者连接序列(GGGGS)n，其中，n为1-10之间的任意整数。

在一些优选的具体实施方案中，所述A表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；

与SEQ ID NO:4的序列相比，SEQ ID NO:5中仅包含一个C140S突变；经此突变后，B6R肽段表面的C(半胱氨酸)由奇数个变为偶数个，降低了蛋白形成多聚体的概率，这是因为：肽链上的两个半胱氨酸可以形成二硫键，如果肽链上有偶数个C，会倾向于形成链内二硫键；如果肽链上有奇数个C，多余的一个C会和其它肽链上多余的C结合，从而形成多聚体。

进一步优选地，所述A表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述M表示如SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列，所述B表示如SEQ ID NO:4或如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

优选地，所述C₁’、C₂’均为无；

进一步优选地，所述嵌合抗原包含如SEQ ID NO:8所示或如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。

作为优选，所述嵌合抗原的N端还包含信号肽序列；可选地，所述信号肽序列如SEQID NO:19所示。

本发明中，为了兼顾针对EEV和IMV两种病毒粒子的免疫保护效应，设计了同时包含EEV的中和抗原A35R和B6R以及IMV的中和抗原M1R的多免疫原嵌合或混合抗原，这三种中和抗原分别由猴痘病毒的A35R基因、B6R基因和M1R基因编码，与痘苗病毒A33R、B5R和L1R为同源基因。

第二方面，本发明提供了一种如上述第一方面所述痘病毒多免疫原嵌合抗原的制备方法，其包括以下步骤：

在编码如上述第一方面所述痘病毒多免疫原嵌合抗原的核苷酸序列的5’端加上Kozak序列以及信号肽的编码序列，3’端加上组氨酸标签的编码序列和终止密码子，进行克隆表达，筛选正确的重组子，然后将其转染表达系统细胞进行表达，收集细胞培养上清，从中分离获得所述嵌合抗原。

在上述制备方法的一种可行的实现方式中，所述表达系统的细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞；

可选地，所述哺乳动物细胞为HEK293T细胞、293F系列细胞或CHO细胞；进一步可选地，所述293F系列细胞为HEK293F细胞、Freestyle293F细胞或Expi293F细胞；

可选地，所述昆虫细胞为sf9细胞、Hi5细胞、sf21细胞或S2细胞；

可选地，所述酵母细胞为毕赤酵母细胞或者由其改造的酵母细胞；

可选地，所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。

第三方面，本发明提供了一种多核苷酸，其编码如上述第一方面所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原。

在具体实施方案中，所述多核苷酸为经人源密码子优化的核苷酸序列，可以为DNA或mRNA；

当编码痘病毒多免疫原嵌合抗原时，优选地，所述多核苷酸为包含如SEQ ID NO:10、11、12或13之一所示的DNA序列，或由其组成的DNA分子；或者，所述多核苷酸为包含如SEQ ID NO:14、15、16或17之一所示的mRNA序列，或由其组成的mRNA分子；

当编码痘病毒多免疫原混合抗原时，优选地，所述多核苷酸为多核苷酸组，所述多核苷酸组包括以下DNA分子或由其组成：包含如SEQ ID NO:22所示的DNA序列的DNA分子，包含如SEQ ID NO:23所示的DNA序列的DNA分子，和包含如SEQ ID NO:24所示的DNA序列的DNA分子；或者，所述多核苷酸组包括以下mRNA分子或由其组成：包含如SEQ ID NO:25所示的mRNA序列的mRNA分子，包含如SEQ ID NO:26所示的mRNA序列的mRNA分子，和包含如SEQ IDNO:27所示的mRNA序列的mRNA分子。

第四方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含如上述第三方面所述的多核苷酸，以及任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。

第五方面，本发明提供了一种表达载体，其包含如上述第四方面所述的核酸构建体。

第六方面，本发明提供了一种宿主细胞，其中转化或转染有如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体或如上述第五方面所述的表达载体。

第七方面，本发明提供了如上述第一方面所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体或如上述第六方面所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗痘病毒感染的药物中的应用；

优选地，所述痘病毒选自：猴痘病毒、天花病毒、牛痘病毒和/或痘苗病毒；

可选地，所述药物为疫苗，例如为基于真核表达载体或者病毒载体的DNA疫苗、mRNA疫苗或重组蛋白疫苗，优选为mRNA疫苗；

可选地，所述疫苗为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；

优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；

优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、颗粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂和膏剂；进一步优选地，所述片剂为舌下片；进一步优选地，所述颗粒剂为细粒剂；进一步优选地，所述粉末剂为散剂；进一步优选地，所述丸剂为小丸剂；

优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射制剂；进一步优选地，所述可注射制剂为可推注制剂。

第八方面，本发明提供了一种疫苗或免疫原性组合物，其包含如上述第一方面所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体或如上述第六方面所述的宿主细胞，以及生理学可接受的媒介物、佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂。

在一些优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为痘病毒重组蛋白疫苗，其包括如上述第一方面所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原和佐剂；

可选地，所述佐剂为选自以下佐剂中的一种或多种：铝佐剂、MF59佐剂和类MF59佐剂。

在另一些优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为痘病毒DNA疫苗，其包括：

(1)真核表达载体；和

(2)构建入所述真核表达载体中的、编码如上述第一方面所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原的DNA序列；

优选地，当为痘病毒多免疫原嵌合抗原时，构建入所述真核表达载体中的DNA序列为如SEQ ID NO:10、11、12或13之一所示的DNA序列；

优选地，当为痘病毒多免疫原混合抗原时，所述DNA疫苗包含三种真核表达构建体，每种真核表达构建体中的DNA序列分别如SEQ ID NO:22、23、24所示；

可选地，所述真核表达载体选自pGX0001、pVAX1、pCAGGS和pcDNA系列载体。

在另一些优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为痘病毒mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包括：

(I)编码如上述第一方面所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原的mRNA分子；和

(II)脂质纳米颗粒。

优选地，当为痘病毒多免疫原嵌合抗原时，所述mRNA分子具有如SEQ ID NO:14、15、16或17之一所示的mRNA序列；

优选地，当为痘病毒多免疫原混合抗原时，所述mRNA疫苗包含三种脂质纳米颗粒包装的mRNA分子，其分别具有SEQ ID NO:25、26、27所示的mRNA序列。在另一些优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为痘病毒-病毒载体疫苗，其包括：

(1)病毒骨架载体；和

(2)构建入所述病毒骨架载体中的、编码如上述第一方面所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原的DNA序列；

优选地，当为痘病毒多免疫原嵌合抗原时，构建入所述病毒骨架载体中的DNA序列为如SEQ ID NO:10、11、12或13之一所示的DNA序列；

优选地，当为痘病毒多免疫原混合抗原时，痘病毒-病毒载体疫苗包含三种病毒载体构建体，每种病毒载体构建体中的DNA序列分别如SEQ ID NO:22、23、24所示。

可选地，所述病毒骨架载体选自以下病毒载体中的一种或几种：腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体、腺相关病毒载体。

在可行的实现方式中，所述疫苗或免疫原性组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；

优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；

优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、颗粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂和膏剂；

进一步优选地，所述片剂为舌下片；

进一步优选地，所述颗粒剂为细粒剂；

进一步优选地，所述粉末剂为散剂；

进一步优选地，所述丸剂为小丸剂；

第九方面，本发明提供了一种预防和/或治疗痘病毒感染的方法，所述方法包括：向有需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的以下物质：如上述第一方面所述的多免疫原嵌合或混合抗原、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体、如上述第六方面所述的宿主细胞和/或如上述第八方面所述的疫苗或免疫原性组合物。

所述“预防和/或治疗有效量”可根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。

有益效果

本发明的发明人设计了一种针对痘病毒(特别是猴痘病毒)的多免疫原嵌合或混合抗原，其包含三种免疫原：(1)猴痘病毒A35R蛋白或其抗原性片段(或它们的衍生肽段)，(2)猴痘病毒M1R蛋白或其抗原性片段(或它们的衍生肽段)，和(3)猴痘病毒B6R蛋白或其抗原性片段(或它们的衍生肽段)；其中，A35R、B6R为细胞内成熟病毒颗粒(IMV)上特有的中和抗原，M1R为细胞外包膜病毒颗粒(EEV)上特有的中和抗原；包含这三种免疫原的疫苗能够激发针对两种感染性病毒颗粒的免疫反应。

在一些具体实施方式中，本发明通过将一个或多个所述猴痘病毒A35R蛋白或其抗原性片段、所述猴痘病毒M1R蛋白或其抗原性片段与所述猴痘病毒B6R蛋白或其抗原性片段直接串联或者通过适当的连接序列串联，从而形成单链多肽，所得单链多肽不但保留了三种免疫原各自的免疫原性，还能更高效地激活针对猴痘病毒的特异性保护性抗体。

与现有技术中的痘病毒疫苗相比，基于本发明的嵌合或混合抗原的疫苗类产品具有以下优势：

1)克服了现有的弱毒活病毒疫苗的安全性问题；经实验验证，本发明的痘病毒疫苗具有良好的有效性、安全性和快速响应性；

2)对于猴痘病毒具有较高的特异性；现有的活病毒疫苗基本上均是以痘苗病毒为基础开发而成的，痘苗病毒虽与猴痘病毒同属痘病毒科，但二者的中和抗原序列仍存在一定差异，因此，其对猴痘病毒的保护效果尚待明确，而本发明的痘病毒疫苗是基于猴痘病毒的抗原表位开发的，因此，其对猴痘病毒的防治具有较高的特异性；

3)猴痘病毒中的蛋白种类繁多，其中绝大多数蛋白不能激发有效的抗病毒免疫反应，即为无效成分，此外，还有一些病毒蛋白具有免疫抑制作用；现有的活病毒疫苗无法去除上述无效和有害成分，因此存在接种风险和不确定性，而本发明的痘病毒疫苗去除了原始免疫原中对激发宿主有效免疫反应无用和有害的成分，避免了减毒疫苗固有的安全性问题，并且，实验数据表明，本发明的仅包含上述3种免疫原的嵌合或混合疫苗即可在小鼠模型中展现完全的保护效应。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1显示了本发明实施例1中记载的，通过Western Blot检测所构建的嵌合mRNA在细胞内的表达效果。

图2是本发明实施例2中所采用的免疫程序和血清采样程序示意图。

图3显示了本发明实施例3中所记载的，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测的各嵌合mRNA疫苗免疫程序第13天(图3a)和第27天(图3b)采集的小鼠血清针对A35R、M1R和B6R抗原蛋白的特异性结合抗体滴度检测结果。

图4显示了本发明实施例4中所检测的各嵌合mRNA疫苗免疫程序第27天所采集的小鼠血清的蚀斑中和结果。

图5显示了本发明实施例5中所检测的各嵌合mRNA疫苗对于VACV-WR病毒滴鼻攻击BALB/c小鼠的保护效应，其中，横坐标显示的是攻毒后天数，纵坐标显示的是小鼠的体重变化百分比(a)和存活百分率(b)。

图6显示了本发明实施例5中所检测的混合mRNA疫苗“A/M/B”对于VACV-WR病毒滴鼻攻击BALB/c小鼠的保护效应，其中，横坐标显示的是攻毒后天数，纵坐标显示的是小鼠的体重变化百分比(a)和存活百分率(b)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

实施例1：痘病毒多免疫原嵌合或混合mRNA疫苗的抗原设计、体外制备、细胞内表达检验与脂质纳米颗粒包装

mRNA疫苗的抗原设计：

本实施例中设计并制备了以下嵌合mRNA疫苗，作为本发明的代表性实例：

“AMAB”：从N端到C端，依次为A35R-M1R-A35R-B6R的排布，其中，从N端起第一个A35R肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，第二个A35R肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；M1R的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；B6R的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

“AMAB-C140S”：从N端到C端，依次为A35R-M1R-A35R-B6R’的排布，其中，从N端起第一个A35R肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，第二个A35R肽段的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示；M1R的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；B6R’的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

“AMB-C140S”：从N端到C端，依次为A35R-M1R-B6R’的排布，其中，A35R的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；M1R的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；B6R’的氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示。

另外，本实施例中还设计并制备了A35R、M1R和B6R mRNA疫苗的混合苗(以下简称“A/M/B”)，即，分别制备并包装A35R、M1R、B6R单一免疫原的mRNA疫苗，并将三者按1：1：1的质量比混和而得；其中，所述A35R、M1R、B6R单一免疫原分别为如SEQ ID NO:1所示的A35R肽段、如SEQ ID NO:3所示的M1R肽段以及如SEQ ID NO:4所示的B6R肽段。

体外制备、细胞内表达检验与脂质纳米颗粒包装：

1)mRNA疫苗的体外转录和加帽

本实施例中，用于体外转录mRNA疫苗的基础质粒为pUC57，由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。

在基础质粒pUC57上，通过常规分子生物学手段引入mRNA疫苗的DNA表达元件，包括：(1)T7启动子，(2)mRNA疫苗的DNA编码区(“AMAB”、“AMAB-C140S”、“AMB-C140S”嵌合mRNA疫苗的DNA编码序列分别如SEQ ID NO:10、11、13所示，“A35R”、“M1R”、“B6R”单一mRNA疫苗的DNA编码序列分别如SEQ ID NO:22、23、24所示)，(3)在编码区上游的5’端UTR序列(如SEQID NO:18所示)，(4)信号肽(如SEQ ID NO:19所示)的编码序列(即SP，如SEQ ID NO:20所示)，和(5)下游的3’端UTR序列(如SEQ ID NO:21所示)，和多聚腺苷酸尾(Poly-A-tail)。

首先，使用限制性内切酶BamHI对上述各mRNA的体外转录质粒进行酶切，将其线性化；使用常规DNA纯化方法进行纯化，获得体外转录的模板；然后，基于该模板，使用T7RNA体外转录试剂盒(E131-01A，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)进行体外转录，获得体外转录的mRNA；最后，使用氯化锂回收试剂盒(S125，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)，通过氯化锂沉淀法对mRNA进行纯化，获得提纯的体外转录的各mRNA。

然后，使用加帽酶试剂盒Cap1加帽酶试剂盒(M082-01B，苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)，对上述提纯的体外转录mRNA进行5’端Cap1加帽，使其满足在真核细胞内被翻译的条件；其后，使用与上述相同的氯化锂沉淀法对mRNA进行再次纯化，获得纯化的经5’端加帽修饰的各mRNA。

2)嵌合mRNA的细胞内表达效果检验

对于由上述步骤1)获得的mRNA，通过如下程序检验了其在细胞内的表达情况：

(1)mRNA转染

在12孔板中铺HEK293T细胞，使第二天细胞密度至50％左右；分别将1μgAMAB、AMAB-C140S或AMB-C140S的mRNA与TransIT-mRNA试剂(2μl)和增强试剂(2μl)一起加入100μl无血清Opti-MEM中，孵育3分钟，然后滴加到12孔板中；转染后36小时，收集细胞。

(2)Western Blot

将步骤(1)所得细胞用细胞裂解液进行裂解，然后将细胞裂解物与含有二硫苏糖醇(DTT)的loading buffer混合，通过10％SDS-PAGE分离；分离完成后进行转膜，以将蛋白转移到PVDF膜上；然后，在5％脱脂牛奶中封闭PVDF膜，用免疫了AMAB-C140S的小鼠血清作为一抗，用山羊抗鼠IgG-HRP(EASYBio)作为二抗，先后孵育PVDF膜各1小时；最后，使用BeyotimeBeyo ECL Plus显色液显色。

Western Blot结果如图1所示，图1显示了各mRNA在细胞内的表达情况；由图1可知，AMAB、AMAB-C140S或AMB-C140SmRNA在细胞内均可正常表达，且其表达产物只有单一条带，说明其为单一免疫原。

3)脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticle,LNP)包装mRNA

将阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG脂质按照50：10：38.5：1.5的比例进行混合，然后使用Precision Nano Systems公司生产的Nanoassemblr Benchtop纳米脂质体包装仪，将其与上述5’端加帽修饰的各mRNA(包括“AMAB”、“AMAB-C140S”、“AMB-C140S”嵌合mRNA，以及“A35R”、“M1R”、“B6R”单一mRNA)分别进行混合、包装。包装完成后，使用离心或透析的方法更换缓冲溶液为PBS。完成包装后，使用Thermo Fisher公司的Quan-iTRibogreenRNA reagent试剂盒，对mRNA包装效率进行鉴定，包装效率符合mRNA疫苗的标准。

为制备A35R、M1R和B6R mRNA混合苗“A/M/B”，将通过上述方法制备和包装的“A35R”、“M1R”、“B6R”单一mRNA疫苗按1：1：1的质量比进行混和。

实施例2：实验动物免疫和样品采集

本实施例中，使用6-8周龄的BALB/c品系的雌性小鼠(购自维通利华)进行动物实验；实验组分为mRNA疫苗免疫组和阴性对照组，其中，mRNA疫苗免疫组包括AMAB、AMAB-C140S和AMB-C140S mRNA疫苗免疫组，所述阴性对照组为LNP免疫组。

mRNA疫苗免疫组的所有小鼠在第0天和第14天分别免疫接种一剂实施例1中所制备的嵌合mRNA疫苗：AMAB、AMAB-C140S或AMB-C140S mRNA疫苗，或者施例1中所制备的mRNA混合苗“A/M/B”；阴性对照组的小鼠则在同样的时间、注射相同量的空的LNP。接种方法均为肌肉注射，接种剂量为每只小鼠每次7.5μg mRNA疫苗或空LNP。分别在第13天和第27天采集小鼠血清样本，用于检验免疫血清的结合抗体滴度和假病毒中和抗体滴度。此外，还在第21天采集小鼠脾脏样本，用于检验T细胞免疫。

mRNA疫苗免疫小鼠及采样程序如图2所示。

实施例3：痘病毒嵌合mRNA疫苗免疫小鼠血清的特异性结合抗体滴度检测

用0.2μg/ml猴痘病毒A35R、M1R或B6R抗原蛋白(其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、3、4所示)分别包被ELISA板，将包被好的ELISA板在5％脱脂牛奶中封闭1小时；然后，将实施例2中的、由各实验组小鼠采集的血清在56℃孵育30分钟，进行灭活；将经过灭活的血清样本从1:200或1:1000开始进行三倍梯度稀释，然后将稀释液加入每个孔，随后将ELISA板在37℃下孵育1小时；将山羊抗小鼠IgG-HRP抗体(购自柏奥易杰(EASYBio))添加到板中作为二抗，并在37℃下再次孵育1小时；最后，用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物进行显色，显色完成后用2M盐酸终止反应，使用酶标仪(PerkinElmer)测量450nm和630nm处的吸光度。通过从同一孔的450nm处的吸光度减去630nm处的吸光度，来计算吸光度值。终点滴度定义为：血清产生的吸光度(如上所述，450nm的吸光度减去630nm的吸光度)大于背景值2.1倍时对应的血清稀释倍数。低于检测限的抗体滴度定义为检测限的三分之一。

免疫小鼠血清的抗体滴度检测结果如图3所示，图3的每个柱形图上方的数字代表该几何平均值相比LNP组对应抗原几何平均值的提升倍数；图3显示：3种mRNA疫苗一免(a)和二免(b)后的血清均含有可结合A35、M1和B6抗原蛋白的特异性抗体，其中，二免后的血清相比一免血清抗体滴度提升1～2个数量级。

以上结果说明：AMAB、AMAB-C140S或AMB-C140S mRNA疫苗均可诱导针对A35R、M1R和B6R抗原蛋白的高水平的特异性结合抗体。

实施例4：免疫小鼠血清蚀斑中和实验

痘苗病毒(Vacciniavirus,VACV)是一种可在生物安全二级实验室操作的正痘病毒，也是正痘病毒属的模式病毒。鉴于VACV与其他正痘病毒种间差异较小，国际上常用VACV评价正痘病毒疫苗的细胞和动物水平。因此，我们采用国际上经常使用的痘苗病毒小鼠适应株Western Reserve(VACV-WR)，检测mRNA疫苗在细胞水平的活病毒中和能力。

具体地，在12孔板中铺好Vero细胞，一天后，用2％ FBSDMEM培养基在深孔板中稀释实施例2中于免疫程序第27天所采集的免疫小鼠血清，连续2倍比稀释，共10个稀释度。使用等体积100PFU的VACV病毒与稀释后血清混合，37℃孵育1h。弃掉细胞培养上清，加入血清-病毒混合液，37℃孵育2h。弃去上清，PBS漂洗1次，使用羧甲基纤维素钠和2x DMEM1：1混合覆盖细胞，37℃培养48h。添加4％多聚甲醛，室温固定3h，弃去混合液。使用结晶紫染色120min，使用ELISpot计数设备对显示的斑点计数，根据不同血清稀释梯度下的斑点相比阳性对照减少的比例绘制抑制率曲线，以该曲线的IC50(半抑制浓度)值作为该血清样品的PRNT₅₀Titer值。

结果如图4所示，图4显示：AMAB、AMAB-C140S或AMB-C140S mRNA疫苗均能诱导产生针对猴痘病毒的高水平的中和抗体，GMT(几何平均滴度)分别为780、280和550。

实施例5：攻毒保护实验

基于发明人前期的实验数据，在VACV-WR攻毒量为1.9×10⁵PFU时，小鼠在感染后7天全部死亡，因此，本实施例中采用该病毒量作为动物实验的攻毒剂量。

本实施例中，分别对实施例2中的嵌合mRNA疫苗免疫组、混合mRNA疫苗免疫组和LNP免疫组小鼠进行VACV-WR滴鼻攻毒，攻毒时间为第一次免疫后第29天，攻毒剂量为1.9×10⁵PFU。通过观察mRNA疫苗免疫组和阴性对照组小鼠的存活率及体重变化，评价各mRNA疫苗对小鼠的活病毒攻读保护效果。

结果如图5和图6所示。

图5显示：本发明的嵌合mRNA疫苗AMAB、AMAB-C140S和AMB-C140S均能对VACV-WR感染小鼠起到100％的保护效果，且小鼠体重未出现明显下降，与之相比，未免疫组小鼠在4天内体重持续下降，直至全部死亡。

图6显示：本发明的A35R肽段、M1R肽段和B6R肽段的mRNA混合疫苗(即，“A/M/B”)也均能对VACV-WR感染小鼠起到100％的保护效果，且小鼠体重未出现明显下降，或轻微下降后迅速恢复。与之相比，未免疫组小鼠在4天内体重持续下降，直至全部死亡。

综上，本发明的多抗原嵌合疫苗可以高效激发针对痘病毒(特别是猴痘病毒)的特异性免疫反应，因而，有望被开发成痘病毒(特别是猴痘病毒)的预防和/或治疗性疫苗产品，具有极大的临床应用前景。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明技术方案的精神和范围。

本申请所涉及的序列：

SEQ ID NO:1(A35R抗原性片段I的氨基酸序列)

STTQYDHKESCNGLYYQGSCYILHSDYKSFEDAKANCAAESSTLPNKSDVLTTWLIDYVEDTWGSDGNPITKTTSDYQDSDVSQEVRKYFCT

SEQ ID NO:2(A35R抗原性片段II的氨基酸序列)

SANKAAITDSAVAVAAASSTHRKVVSSTTQYDHKESCNGLYYQGSCYILHSDYKSFEDAKANCAAESSTLPNKSDVLTTWLIDYVEDTWGSDGNPITKTTSDYQDSDVSQEVRKYFCT

SEQ ID NO:3(M1R肽段的氨基酸序列)

AAASIQTTVNTLSERISSKLEQEANASAQTKCDIEIGNFYIRQNHGCNITVKNMCSADADAQLDAVLSAATETYSGLTPEQKAYVPAMFTAALNIQTSVNTVVRDFENYVKQTCNSSAVVDNKLKIQNVIIDECYGAPGSPTNLEFINTGSSKGNCAIKALMQLTTKATTQIAPRQVAG

SEQ ID NO:4(B6R肽段的氨基酸序列)

TCTVPTMNNAKLTSTETSFNDKQKVTFTCDSGYHSLDPNAVCETDKWKYENPCKKMCTVSDYVSELYDKPLYEVNSTMTLSCNGETKYFRCEEKNGNTSWNDTVTCPNAECQPLQLEHGSCQPVKEKYSFGEYMTINCDVGYEVIGVSYISCTANSWNVIPSCQQKCDIPSLSNGLISGSTFSIGGVIHLSCKSGFTLTGSPSSTCIDGKWNPILPTCVRSNEEFDPVDDGPDDETDLSKLSKDVVQYEQEIESLEATYH

SEQ ID NO:5(B6R肽段的含C140S突变的氨基酸序列)

TCTVPTMNNAKLTSTETSFNDKQKVTFTCDSGYHSLDPNAVCETDKWKYENPCKKMCTVSDYVSELYDKPLYEVNSTMTLSCNGETKYFRCEEKNGNTSWNDTVTCPNAECQPLQLEHGSSQPVKEKYSFGEYMTINCDVGYEVIGVSYISCTANSWNVIPSCQQKCDIPSLSNGLISGSTFSIGGVIHLSCKSGFTLTGSPSSTCIDGKWNPILPTCVRSNEEFDPVDDGPDDETDLSKLSKDVVQYEQEIESLEATYH

SEQ ID NO:6(AMAB的氨基酸序列)

STTQYDHKESCNGLYYQGSCYILHSDYKSFEDAKANCAAESSTLPNKSDVLTTWLIDYVEDTWGSDGNPITKTTSDYQDSDVSQEVRKYFCTAAASIQTTVNTLSERISSKLEQEANASAQTKCDIEIGNFYIRQNHGCNITVKNMCSADADAQLDAVLSAATETYSGLTPEQKAYVPAMFTAALNIQTSVNTVVRDFENYVKQTCNSSAVVDNKLKIQNVIIDECYGAPGSPTNLEFINTGSSKGNCAIKALMQLTTKATTQIAPRQVAGSANKAAITDSAVAVAAASSTHRKVVSSTTQYDHKESCNGLYYQGSCYILHSDYKSFEDAKANCAAESSTLPNKSDVLTTWLIDYVEDTWGSDGNPITKTTSDYQDSDVSQEVRKYFCTTCTVPTMNNAKLTSTETSFNDKQKVTFTCDSGYHSLDPNAVCETDKWKYENPCKKMCTVSDYVSELYDKPLYEVNSTMTLSCNGETKYFRCEEKNGNTSWNDTVTCPNAECQPLQLEHGSCQPVKEKYSFGEYMTINCDVGYEVIGVSYISCTANSWNVIPSCQQKCDIPSLSNGLISGSTFSIGGVIHLSCKSGFTLTGSPSSTCIDGKWNPILPTCVRSNEEFDPVDDGPDDETDLSKLSKDVVQYEQEIESLEATYH

SEQ ID NO:7(AMAB-C140S的氨基酸序列)

STTQYDHKESCNGLYYQGSCYILHSDYKSFEDAKANCAAESSTLPNKSDVLTTWLIDYVEDTWGSDGNPITKTTSDYQDSDVSQEVRKYFCTAAASIQTTVNTLSERISSKLEQEANASAQTKCDIEIGNFYIRQNHGCNITVKNMCSADADAQLDAVLSAATETYSGLTPEQKAYVPAMFTAALNIQTSVNTVVRDFENYVKQTCNSSAVVDNKLKIQNVIIDECYGAPGSPTNLEFINTGSSKGNCAIKALMQLTTKATTQIAPRQVAGSANKAAITDSAVAVAAASSTHRKVVSSTTQYDHKESCNGLYYQGSCYILHSDYKSFEDAKANCAAESSTLPNKSDVLTTWLIDYVEDTWGSDGNPITKTTSDYQDSDVSQEVRKYFCTTCTVPTMNNAKLTSTETSFNDKQKVTFTCDSGYHSLDPNAVCETDKWKYENPCKKMCTVSDYVSELYDKPLYEVNSTMTLSCNGETKYFRCEEKNGNTSWNDTVTCPNAECQPLQLEHGSSQPVKEKYSFGEYMTINCDVGYEVIGVSYISCTANSWNVIPSCQQKCDIPSLSNGLISGSTFSIGGVIHLSCKSGFTLTGSPSSTCIDGKWNPILPTCVRSNEEFDPVDDGPDDETDLSKLSKDVVQYEQEIESLEATYH

SEQ ID NO:8(AMB的氨基酸序列)

STTQYDHKESCNGLYYQGSCYILHSDYKSFEDAKANCAAESSTLPNKSDVLTTWLIDYVEDTWGSDGNPITKTTSDYQDSDVSQEVRKYFCTAAASIQTTVNTLSERISSKLEQEANASAQTKCDIEIGNFYIRQNHGCNITVKNMCSADADAQLDAVLSAATETYSGLTPEQKAYVPAMFTAALNIQTSVNTVVRDFENYVKQTCNSSAVVDNKLKIQNVIIDECYGAPGSPTNLEFINTGSSKGNCAIKALMQLTTKATTQIAPRQVAGTCTVPTMNNAKLTSTETSFNDKQKVTFTCDSGYHSLDPNAVCETDKWKYENPCKKMCTVSDYVSELYDKPLYEVNSTMTLSCNGETKYFRCEEKNGNTSWNDTVTCPNAECQPLQLEHGSCQPVKEKYSFGEYMTINCDVGYEVIGVSYISCTANSWNVIPSCQQKCDIPSLSNGLISGSTFSIGGVIHLSCKSGFTLTGSPSSTCIDGKWNPILPTCVRSNEEFDPVDDGPDDETDLSKLSKDVVQYEQEIESLEATYH

SEQ ID NO:9(AMB-C140S的氨基酸序列)STTQYDHKESCNGLYYQGSCYILHSDYKSFEDAKANCAAESSTLPNKSDVLTTWLIDYVEDTWGSDGNPITKTTSDYQDSDVSQEVRKYFCTAAASIQTTVNTLSERISSKLEQEANASAQTKCDIEIGNFYIRQNHGCNITVKNMCSADADAQLDAVLSAATETYSGLTPEQKAYVPAMFTAALNIQTSVNTVVRDFENYVKQTCNSSAVVDNKLKIQNVIIDECYGAPGSPTNLEFINTGSSKGNCAIKALMQLTTKATTQIAPRQVAGTCTVPTMNNAKLTSTETSFNDKQKVTFTCDSGYHSLDPNAVCETDKWKYENPCKKMCTVSDYVSELYDKPLYEVNSTMTLSCNGETKYFRCEEKNGNTSWNDTVTCPNAECQPLQLEHGSSQPVKEKYSFGEYMTINCDVGYEVIGVSYISCTANSWNVIPSCQQKCDIPSLSNGLISGSTFSIGGVIHLSCKSGFTLTGSPSSTCIDGKWNPILPTCVRSNEEFDPVDDGPDDETDLSKLSKDVVQYEQEIESLEATYH

SEQ ID NO:10(AMAB的DNA序列)

AGCACCACCCAGTACGACCACAAAGAGAGCTGCAACGGCCTGTACTACCAAGGCTCTTGTTACATCCTGCACAGCGACTATAAGAGCTTCGAGGATGCTAAGGCCAATTGCGCCGCCGAGAGCAGCACACTGCCTAACAAGTCCGACGTGCTGACCACCTGGCTGATCGACTACGTGGAAGATACATGGGGAAGCGACGGCAACCCCATCACAAAAACCACAAGCGATTATCAGGACAGCGACGTGTCTCAGGAGGTTAGAAAGTACTTTTGCACCGCCGCCGCCTCTATCCAGACCACAGTGAACACCCTGAGCGAGCGGATCAGCTCCAAGCTGGAGCAGGAGGCAAACGCAAGCGCCCAGACAAAGTGCGACATCGAGATCGGCAATTTCTACATCAGACAGAACCACGGCTGCAATATCACCGTGAAGAATATGTGCTCCGCCGACGCAGATGCACAGCTGGATGCCGTGCTGTCCGCCGCAACCGAGACATACTCTGGCCTGACCCCTGAGCAGAAGGCCTATGTGCCAGCCATGTTCACAGCCGCCCTGAACATCCAGACCAGCGTGAATACAGTGGTGCGGGACTTTGAGAACTACGTGAAGCAGACCTGCAATTCTAGCGCCGTGGTGGACAACAAGCTGAAGATCCAGAATGTGATCATCGATGAGTGTTATGGAGCACCAGGCTCCCCTACCAACCTGGAGTTCATCAATACAGGCTCCTCTAAGGGCAACTGCGCCATCAAGGCCCTGATGCAGCTGACCACAAAGGCCACCACACAGATCGCACCTAGGCAGGTGGCAGGCTCCGCCAATAAGGCAGCCATCACCGACTCTGCCGTGGCAGTGGCAGCAGCCAGCTCCACACACCGCAAGGTGGTGTCTAGCACCACACAGTACGATCACAAGGAATCCTGTAATGGCCTGTACTATCAGGGCTCCTGTTACATCCTGCACTCTGACTATAAGAGCTTTGAGGATGCCAAGGCCAACTGTGCCGCCGAGTCCTCTACCCTGCCAAATAAGAGCGACGTGCTGACCACATGGCTGATCGACTATGTGGAGGATACCTGGGGCTCTGATGGCAACCCCATCACAAAGACCACATCTGATTACCAGGACAGCGACGTGAGCCAGGAGGTGCGGAAGTATTTCTGCACCACGTGCACGGTGCCCACGATGAACAACGCGAAGTTGACGTCCACGGAAACCTCTTTCAATGATAAACAAAAAGTCACGTTCACATGTGACTCCGGATACCACTCTTTGGACCCGAACGCAGTTTGTGAAACAGATAAGTGGAAGTACGAGAATCCGTGCAAGAAAATGTGCACGGTGTCGGATTATGTATCAGAGTTGTACGACAAGCCGTTGTACGAGGTTAATAGTACCATGACCTTGTCGTGCAACGGCGAAACCAAGTATTTCCGTTGTGAAGAGAAAAACGGGAACACGTCGTGGAACGACACGGTAACCTGCCCCAACGCGGAGTGTCAACCTCTGCAGTTGGAGCACGGCTCTTGTCAGCCGGTGAAGGAAAAATATTCCTTCGGCGAGTACATGACTATAAACTGTGATGTGGGGTACGAGGTTATAGGCGTATCCTACATTAGCTGCACCGCTAATAGTTGGAACGTCATCCCCTCGTGCCAGCAGAAATGCGACATTCCGTCTCTGTCAAATGGCCTGATCTCCGGGTCGACCTTCTCGATAGGTGGGGTTATTCATTTGTCCTGTAAGAGTGGGTTCACTCTTACAGGCTCCCCATCTTCGACCTGCATAGATGGGAAGTGGAACCCCATCCTTCCCACTTGTGTCAGGTCGAACGAGGAATTCGATCCGGTAGATGACGGCCCTGACGACGAGACGGATCTGTCGAAGCTGTCCAAAGACGTGGTTCAGTATGAGCAGGAGATAGAATCTCTTGAGGCTACTTACCAC

SEQ ID NO:11(AMAB-C140S的DNA序列)

AGCACCACCCAGTACGACCACAAAGAGAGCTGCAACGGCCTGTACTACCAAGGCTCTTGTTACATCCTGCACAGCGACTATAAGAGCTTCGAGGATGCTAAGGCCAATTGCGCCGCCGAGAGCAGCACACTGCCTAACAAGTCCGACGTGCTGACCACCTGGCTGATCGACTACGTGGAAGATACATGGGGAAGCGACGGCAACCCCATCACAAAAACCACAAGCGATTATCAGGACAGCGACGTGTCTCAGGAGGTTAGAAAGTACTTTTGCACCGCCGCCGCCTCTATCCAGACCACAGTGAACACCCTGAGCGAGCGGATCAGCTCCAAGCTGGAGCAGGAGGCAAACGCAAGCGCCCAGACAAAGTGCGACATCGAGATCGGCAATTTCTACATCAGACAGAACCACGGCTGCAATATCACCGTGAAGAATATGTGCTCCGCCGACGCAGATGCACAGCTGGATGCCGTGCTGTCCGCCGCAACCGAGACATACTCTGGCCTGACCCCTGAGCAGAAGGCCTATGTGCCAGCCATGTTCACAGCCGCCCTGAACATCCAGACCAGCGTGAATACAGTGGTGCGGGACTTTGAGAACTACGTGAAGCAGACCTGCAATTCTAGCGCCGTGGTGGACAACAAGCTGAAGATCCAGAATGTGATCATCGATGAGTGTTATGGAGCACCAGGCTCCCCTACCAACCTGGAGTTCATCAATACAGGCTCCTCTAAGGGCAACTGCGCCATCAAGGCCCTGATGCAGCTGACCACAAAGGCCACCACACAGATCGCACCTAGGCAGGTGGCAGGCTCCGCCAATAAGGCAGCCATCACCGACTCTGCCGTGGCAGTGGCAGCAGCCAGCTCCACACACCGCAAGGTGGTGTCTAGCACCACACAGTACGATCACAAGGAATCCTGTAATGGCCTGTACTATCAGGGCTCCTGTTACATCCTGCACTCTGACTATAAGAGCTTTGAGGATGCCAAGGCCAACTGTGCCGCCGAGTCCTCTACCCTGCCAAATAAGAGCGACGTGCTGACCACATGGCTGATCGACTATGTGGAGGATACCTGGGGCTCTGATGGCAACCCCATCACAAAGACCACATCTGATTACCAGGACAGCGACGTGAGCCAGGAGGTGCGGAAGTATTTCTGCACCACGTGCACGGTGCCCACGATGAACAACGCGAAGTTGACGTCCACGGAAACCTCTTTCAATGATAAACAAAAAGTCACGTTCACATGTGACTCCGGATACCACTCTTTGGACCCGAACGCAGTTTGTGAAACAGATAAGTGGAAGTACGAGAATCCGTGCAAGAAAATGTGCACGGTGTCGGATTATGTATCAGAGTTGTACGACAAGCCGTTGTACGAGGTTAATAGTACCATGACCTTGTCGTGCAACGGCGAAACCAAGTATTTCCGTTGTGAAGAGAAAAACGGGAACACGTCGTGGAACGACACGGTAACCTGCCCCAACGCGGAGTGTCAACCTCTGCAGTTGGAGCACGGCTCTTCTCAGCCGGTGAAGGAAAAATATTCCTTCGGCGAGTACATGACTATAAACTGTGATGTGGGGTACGAGGTTATAGGCGTATCCTACATTAGCTGCACCGCTAATAGTTGGAACGTCATCCCCTCGTGCCAGCAGAAATGCGACATTCCGTCTCTGTCAAATGGCCTGATCTCCGGGTCGACCTTCTCGATAGGTGGGGTTATTCATTTGTCCTGTAAGAGTGGGTTCACTCTTACAGGCTCCCCATCTTCGACCTGCATAGATGGGAAGTGGAACCCCATCCTTCCCACTTGTGTCAGGTCGAACGAGGAATTCGATCCGGTAGATGACGGCCCTGACGACGAGACGGATCTGTCGAAGCTGTCCAAAGACGTGGTTCAGTATGAGCAGGAGATAGAATCTCTTGAGGCTACTTACCAC

SEQ ID NO:12(AMB的DNA序列)

AGCACCACCCAGTACGACCACAAAGAGAGCTGCAACGGCCTGTACTACCAAGGCTCTTGTTACATCCTGCACAGCGACTATAAGAGCTTCGAGGATGCTAAGGCCAATTGCGCCGCCGAGAGCAGCACACTGCCTAACAAGTCCGACGTGCTGACCACCTGGCTGATCGACTACGTGGAAGATACATGGGGAAGCGACGGCAACCCCATCACAAAAACCACAAGCGATTATCAGGACAGCGACGTGTCTCAGGAGGTTAGAAAGTACTTTTGCACCGCCGCCGCCTCTATCCAGACCACAGTGAACACCCTGAGCGAGCGGATCAGCTCCAAGCTGGAGCAGGAGGCAAACGCAAGCGCCCAGACAAAGTGCGACATCGAGATCGGCAATTTCTACATCAGACAGAACCACGGCTGCAATATCACCGTGAAGAATATGTGCTCCGCCGACGCAGATGCACAGCTGGATGCCGTGCTGTCCGCCGCAACCGAGACATACTCTGGCCTGACCCCTGAGCAGAAGGCCTATGTGCCAGCCATGTTCACAGCCGCCCTGAACATCCAGACCAGCGTGAATACAGTGGTGCGGGACTTTGAGAACTACGTGAAGCAGACCTGCAATTCTAGCGCCGTGGTGGACAACAAGCTGAAGATCCAGAATGTGATCATCGATGAGTGTTATGGAGCACCAGGCTCCCCTACCAACCTGGAGTTCATCAATACAGGCTCCTCTAAGGGCAACTGCGCCATCAAGGCCCTGATGCAGCTGACCACAAAGGCCACCACACAGATCGCACCTAGGCAGGTGGCAGGCACGTGCACGGTGCCCACGATGAACAACGCGAAGTTGACGTCCACGGAAACCTCTTTCAATGATAAACAAAAAGTCACGTTCACATGTGACTCCGGATACCACTCTTTGGACCCGAACGCAGTTTGTGAAACAGATAAGTGGAAGTACGAGAATCCGTGCAAGAAAATGTGCACGGTGTCGGATTATGTATCAGAGTTGTACGACAAGCCGTTGTACGAGGTTAATAGTACCATGACCTTGTCGTGCAACGGCGAAACCAAGTATTTCCGTTGTGAAGAGAAAAACGGGAACACGTCGTGGAACGACACGGTAACCTGCCCCAACGCGGAGTGTCAACCTCTGCAGTTGGAGCACGGCTCTTGTCAGCCGGTGAAGGAAAAATATTCCTTCGGCGAGTACATGACTATAAACTGTGATGTGGGGTACGAGGTTATAGGCGTATCCTACATTAGCTGCACCGCTAATAGTTGGAACGTCATCCCCTCGTGCCAGCAGAAATGCGACATTCCGTCTCTGTCAAATGGCCTGATCTCCGGGTCGACCTTCTCGATAGGTGGGGTTATTCATTTGTCCTGTAAGAGTGGGTTCACTCTTACAGGCTCCCCATCTTCGACCTGCATAGATGGGAAGTGGAACCCCATCCTTCCCACTTGTGTCAGGTCGAACGAGGAATTCGATCCGGTAGATGACGGCCCTGACGACGAGACGGATCTGTCGAAGCTGTCCAAAGACGTGGTTCAGTATGAGCAGGAGATAGAATCTCTTGAGGCTACTTACCAC

SEQ ID NO:13(AMB-C140S的DNA序列)

AGCACCACCCAGTACGACCACAAAGAGAGCTGCAACGGCCTGTACTACCAAGGCTCTTGTTACATCCTGCACAGCGACTATAAGAGCTTCGAGGATGCTAAGGCCAATTGCGCCGCCGAGAGCAGCACACTGCCTAACAAGTCCGACGTGCTGACCACCTGGCTGATCGACTACGTGGAAGATACATGGGGAAGCGACGGCAACCCCATCACAAAAACCACAAGCGATTATCAGGACAGCGACGTGTCTCAGGAGGTTAGAAAGTACTTTTGCACCGCCGCCGCCTCTATCCAGACCACAGTGAACACCCTGAGCGAGCGGATCAGCTCCAAGCTGGAGCAGGAGGCAAACGCAAGCGCCCAGACAAAGTGCGACATCGAGATCGGCAATTTCTACATCAGACAGAACCACGGCTGCAATATCACCGTGAAGAATATGTGCTCCGCCGACGCAGATGCACAGCTGGATGCCGTGCTGTCCGCCGCAACCGAGACATACTCTGGCCTGACCCCTGAGCAGAAGGCCTATGTGCCAGCCATGTTCACAGCCGCCCTGAACATCCAGACCAGCGTGAATACAGTGGTGCGGGACTTTGAGAACTACGTGAAGCAGACCTGCAATTCTAGCGCCGTGGTGGACAACAAGCTGAAGATCCAGAATGTGATCATCGATGAGTGTTATGGAGCACCAGGCTCCCCTACCAACCTGGAGTTCATCAATACAGGCTCCTCTAAGGGCAACTGCGCCATCAAGGCCCTGATGCAGCTGACCACAAAGGCCACCACACAGATCGCACCTAGGCAGGTGGCAGGCACGTGCACGGTGCCCACGATGAACAACGCGAAGTTGACGTCCACGGAAACCTCTTTCAATGATAAACAAAAAGTCACGTTCACATGTGACTCCGGATACCACTCTTTGGACCCGAACGCAGTTTGTGAAACAGATAAGTGGAAGTACGAGAATCCGTGCAAGAAAATGTGCACGGTGTCGGATTATGTATCAGAGTTGTACGACAAGCCGTTGTACGAGGTTAATAGTACCATGACCTTGTCGTGCAACGGCGAAACCAAGTATTTCCGTTGTGAAGAGAAAAACGGGAACACGTCGTGGAACGACACGGTAACCTGCCCCAACGCGGAGTGTCAACCTCTGCAGTTGGAGCACGGCTCTTCTCAGCCGGTGAAGGAAAAATATTCCTTCGGCGAGTACATGACTATAAACTGTGATGTGGGGTACGAGGTTATAGGCGTATCCTACATTAGCTGCACCGCTAATAGTTGGAACGTCATCCCCTCGTGCCAGCAGAAATGCGACATTCCGTCTCTGTCAAATGGCCTGATCTCCGGGTCGACCTTCTCGATAGGTGGGGTTATTCATTTGTCCTGTAAGAGTGGGTTCACTCTTACAGGCTCCCCATCTTCGACCTGCATAGATGGGAAGTGGAACCCCATCCTTCCCACTTGTGTCAGGTCGAACGAGGAATTCGATCCGGTAGATGACGGCCCTGACGACGAGACGGATCTGTCGAAGCTGTCCAAAGACGTGGTTCAGTATGAGCAGGAGATAGAATCTCTTGAGGCTACTTACCAC

SEQ ID NO:14(AMAB的mRNA序列)

AGCACCACCCAGUACGACCACAAAGAGAGCUGCAACGGCCUGUACUACCAAGGCUCUUGUUACAUCCUGCACAGCGACUAUAAGAGCUUCGAGGAUGCUAAGGCCAAUUGCGCCGCCGAGAGCAGCACACUGCCUAACAAGUCCGACGUGCUGACCACCUGGCUGAUCGACUACGUGGAAGAUACAUGGGGAAGCGACGGCAACCCCAUCACAAAAACCACAAGCGAUUAUCAGGACAGCGACGUGUCUCAGGAGGUUAGAAAGUACUUUUGCACCGCCGCCGCCUCUAUCCAGACCACAGUGAACACCCUGAGCGAGCGGAUCAGCUCCAAGCUGGAGCAGGAGGCAAACGCAAGCGCCCAGACAAAGUGCGACAUCGAGAUCGGCAAUUUCUACAUCAGACAGAACCACGGCUGCAAUAUCACCGUGAAGAAUAUGUGCUCCGCCGACGCAGAUGCACAGCUGGAUGCCGUGCUGUCCGCCGCAACCGAGACAUACUCUGGCCUGACCCCUGAGCAGAAGGCCUAUGUGCCAGCCAUGUUCACAGCCGCCCUGAACAUCCAGACCAGCGUGAAUACAGUGGUGCGGGACUUUGAGAACUACGUGAAGCAGACCUGCAAUUCUAGCGCCGUGGUGGACAACAAGCUGAAGAUCCAGAAUGUGAUCAUCGAUGAGUGUUAUGGAGCACCAGGCUCCCCUACCAACCUGGAGUUCAUCAAUACAGGCUCCUCUAAGGGCAACUGCGCCAUCAAGGCCCUGAUGCAGCUGACCACAAAGGCCACCACACAGAUCGCACCUAGGCAGGUGGCAGGCUCCGCCAAUAAGGCAGCCAUCACCGACUCUGCCGUGGCAGUGGCAGCAGCCAGCUCCACACACCGCAAGGUGGUGUCUAGCACCACACAGUACGAUCACAAGGAAUCCUGUAAUGGCCUGUACUAUCAGGGCUCCUGUUACAUCCUGCACUCUGACUAUAAGAGCUUUGAGGAUGCCAAGGCCAACUGUGCCGCCGAGUCCUCUACCCUGCCAAAUAAGAGCGACGUGCUGACCACAUGGCUGAUCGACUAUGUGGAGGAUACCUGGGGCUCUGAUGGCAACCCCAUCACAAAGACCACAUCUGAUUACCAGGACAGCGACGUGAGCCAGGAGGUGCGGAAGUAUUUCUGCACCACGUGCACGGUGCCCACGAUGAACAACGCGAAGUUGACGUCCACGGAAACCUCUUUCAAUGAUAAACAAAAAGUCACGUUCACAUGUGACUCCGGAUACCACUCUUUGGACCCGAACGCAGUUUGUGAAACAGAUAAGUGGAAGUACGAGAAUCCGUGCAAGAAAAUGUGCACGGUGUCGGAUUAUGUAUCAGAGUUGUACGACAAGCCGUUGUACGAGGUUAAUAGUACCAUGACCUUGUCGUGCAACGGCGAAACCAAGUAUUUCCGUUGUGAAGAGAAAAACGGGAACACGUCGUGGAACGACACGGUAACCUGCCCCAACGCGGAGUGUCAACCUCUGCAGUUGGAGCACGGCUCUUGUCAGCCGGUGAAGGAAAAAUAUUCCUUCGGCGAGUACAUGACUAUAAACUGUGAUGUGGGGUACGAGGUUAUAGGCGUAUCCUACAUUAGCUGCACCGCUAAUAGUUGGAACGUCAUCCCCUCGUGCCAGCAGAAAUGCGACAUUCCGUCUCUGUCAAAUGGCCUGAUCUCCGGGUCGACCUUCUCGAUAGGUGGGGUUAUUCAUUUGUCCUGUAAGAGUGGGUUCACUCUUACAGGCUCCCCAUCUUCGACCUGCAUAGAUGGGAAGUGGAACCCCAUCCUUCCCACUUGUGUCAGGUCGAACGAGGAAUUCGAUCCGGUAGAUGACGGCCCUGACGACGAGACGGAUCUGUCGAAGCUGUCCAAAGACGUGGUUCAGUAUGAGCAGGAGAUAGAAUCUCUUGAGGCUACUUACCAC

SEQ ID NO:15(AMAB-C140S的mRNA序列)

AGCACCACCCAGUACGACCACAAAGAGAGCUGCAACGGCCUGUACUACCAAGGCUCUUGUUACAUCCUGCACAGCGACUAUAAGAGCUUCGAGGAUGCUAAGGCCAAUUGCGCCGCCGAGAGCAGCACACUGCCUAACAAGUCCGACGUGCUGACCACCUGGCUGAUCGACUACGUGGAAGAUACAUGGGGAAGCGACGGCAACCCCAUCACAAAAACCACAAGCGAUUAUCAGGACAGCGACGUGUCUCAGGAGGUUAGAAAGUACUUUUGCACCGCCGCCGCCUCUAUCCAGACCACAGUGAACACCCUGAGCGAGCGGAUCAGCUCCAAGCUGGAGCAGGAGGCAAACGCAAGCGCCCAGACAAAGUGCGACAUCGAGAUCGGCAAUUUCUACAUCAGACAGAACCACGGCUGCAAUAUCACCGUGAAGAAUAUGUGCUCCGCCGACGCAGAUGCACAGCUGGAUGCCGUGCUGUCCGCCGCAACCGAGACAUACUCUGGCCUGACCCCUGAGCAGAAGGCCUAUGUGCCAGCCAUGUUCACAGCCGCCCUGAACAUCCAGACCAGCGUGAAUACAGUGGUGCGGGACUUUGAGAACUACGUGAAGCAGACCUGCAAUUCUAGCGCCGUGGUGGACAACAAGCUGAAGAUCCAGAAUGUGAUCAUCGAUGAGUGUUAUGGAGCACCAGGCUCCCCUACCAACCUGGAGUUCAUCAAUACAGGCUCCUCUAAGGGCAACUGCGCCAUCAAGGCCCUGAUGCAGCUGACCACAAAGGCCACCACACAGAUCGCACCUAGGCAGGUGGCAGGCUCCGCCAAUAAGGCAGCCAUCACCGACUCUGCCGUGGCAGUGGCAGCAGCCAGCUCCACACACCGCAAGGUGGUGUCUAGCACCACACAGUACGAUCACAAGGAAUCCUGUAAUGGCCUGUACUAUCAGGGCUCCUGUUACAUCCUGCACUCUGACUAUAAGAGCUUUGAGGAUGCCAAGGCCAACUGUGCCGCCGAGUCCUCUACCCUGCCAAAUAAGAGCGACGUGCUGACCACAUGGCUGAUCGACUAUGUGGAGGAUACCUGGGGCUCUGAUGGCAACCCCAUCACAAAGACCACAUCUGAUUACCAGGACAGCGACGUGAGCCAGGAGGUGCGGAAGUAUUUCUGCACCACGUGCACGGUGCCCACGAUGAACAACGCGAAGUUGACGUCCACGGAAACCUCUUUCAAUGAUAAACAAAAAGUCACGUUCACAUGUGACUCCGGAUACCACUCUUUGGACCCGAACGCAGUUUGUGAAACAGAUAAGUGGAAGUACGAGAAUCCGUGCAAGAAAAUGUGCACGGUGUCGGAUUAUGUAUCAGAGUUGUACGACAAGCCGUUGUACGAGGUUAAUAGUACCAUGACCUUGUCGUGCAACGGCGAAACCAAGUAUUUCCGUUGUGAAGAGAAAAACGGGAACACGUCGUGGAACGACACGGUAACCUGCCCCAACGCGGAGUGUCAACCUCUGCAGUUGGAGCACGGCUCUUCUCAGCCGGUGAAGGAAAAAUAUUCCUUCGGCGAGUACAUGACUAUAAACUGUGAUGUGGGGUACGAGGUUAUAGGCGUAUCCUACAUUAGCUGCACCGCUAAUAGUUGGAACGUCAUCCCCUCGUGCCAGCAGAAAUGCGACAUUCCGUCUCUGUCAAAUGGCCUGAUCUCCGGGUCGACCUUCUCGAUAGGUGGGGUUAUUCAUUUGUCCUGUAAGAGUGGGUUCACUCUUACAGGCUCCCCAUCUUCGACCUGCAUAGAUGGGAAGUGGAACCCCAUCCUUCCCACUUGUGUCAGGUCGAACGAGGAAUUCGAUCCGGUAGAUGACGGCCCUGACGACGAGACGGAUCUGUCGAAGCUGUCCAAAGACGUGGUUCAGUAUGAGCAGGAGAUAGAAUCUCUUGAGGCUACUUACCAC

SEQ ID NO:16(AMB的mRNA序列)

AGCACCACCCAGUACGACCACAAAGAGAGCUGCAACGGCCUGUACUACCAAGGCUCUUGUUACAUCCUGCACAGCGACUAUAAGAGCUUCGAGGAUGCUAAGGCCAAUUGCGCCGCCGAGAGCAGCACACUGCCUAACAAGUCCGACGUGCUGACCACCUGGCUGAUCGACUACGUGGAAGAUACAUGGGGAAGCGACGGCAACCCCAUCACAAAAACCACAAGCGAUUAUCAGGACAGCGACGUGUCUCAGGAGGUUAGAAAGUACUUUUGCACCGCCGCCGCCUCUAUCCAGACCACAGUGAACACCCUGAGCGAGCGGAUCAGCUCCAAGCUGGAGCAGGAGGCAAACGCAAGCGCCCAGACAAAGUGCGACAUCGAGAUCGGCAAUUUCUACAUCAGACAGAACCACGGCUGCAAUAUCACCGUGAAGAAUAUGUGCUCCGCCGACGCAGAUGCACAGCUGGAUGCCGUGCUGUCCGCCGCAACCGAGACAUACUCUGGCCUGACCCCUGAGCAGAAGGCCUAUGUGCCAGCCAUGUUCACAGCCGCCCUGAACAUCCAGACCAGCGUGAAUACAGUGGUGCGGGACUUUGAGAACUACGUGAAGCAGACCUGCAAUUCUAGCGCCGUGGUGGACAACAAGCUGAAGAUCCAGAAUGUGAUCAUCGAUGAGUGUUAUGGAGCACCAGGCUCCCCUACCAACCUGGAGUUCAUCAAUACAGGCUCCUCUAAGGGCAACUGCGCCAUCAAGGCCCUGAUGCAGCUGACCACAAAGGCCACCACACAGAUCGCACCUAGGCAGGUGGCAGGCACGUGCACGGUGCCCACGAUGAACAACGCGAAGUUGACGUCCACGGAAACCUCUUUCAAUGAUAAACAAAAAGUCACGUUCACAUGUGACUCCGGAUACCACUCUUUGGACCCGAACGCAGUUUGUGAAACAGAUAAGUGGAAGUACGAGAAUCCGUGCAAGAAAAUGUGCACGGUGUCGGAUUAUGUAUCAGAGUUGUACGACAAGCCGUUGUACGAGGUUAAUAGUACCAUGACCUUGUCGUGCAACGGCGAAACCAAGUAUUUCCGUUGUGAAGAGAAAAACGGGAACACGUCGUGGAACGACACGGUAACCUGCCCCAACGCGGAGUGUCAACCUCUGCAGUUGGAGCACGGCUCUUGUCAGCCGGUGAAGGAAAAAUAUUCCUUCGGCGAGUACAUGACUAUAAACUGUGAUGUGGGGUACGAGGUUAUAGGCGUAUCCUACAUUAGCUGCACCGCUAAUAGUUGGAACGUCAUCCCCUCGUGCCAGCAGAAAUGCGACAUUCCGUCUCUGUCAAAUGGCCUGAUCUCCGGGUCGACCUUCUCGAUAGGUGGGGUUAUUCAUUUGUCCUGUAAGAGUGGGUUCACUCUUACAGGCUCCCCAUCUUCGACCUGCAUAGAUGGGAAGUGGAACCCCAUCCUUCCCACUUGUGUCAGGUCGAACGAGGAAUUCGAUCCGGUAGAUGACGGCCCUGACGACGAGACGGAUCUGUCGAAGCUGUCCAAAGACGUGGUUCAGUAUGAGCAGGAGAUAGAAUCUCUUGAGGCUACUUACCAC

SEQ ID NO:17(AMB-C140S的mRNA序列)

AGCACCACCCAGUACGACCACAAAGAGAGCUGCAACGGCCUGUACUACCAAGGCUCUUGUUACAUCCUGCACAGCGACUAUAAGAGCUUCGAGGAUGCUAAGGCCAAUUGCGCCGCCGAGAGCAGCACACUGCCUAACAAGUCCGACGUGCUGACCACCUGGCUGAUCGACUACGUGGAAGAUACAUGGGGAAGCGACGGCAACCCCAUCACAAAAACCACAAGCGAUUAUCAGGACAGCGACGUGUCUCAGGAGGUUAGAAAGUACUUUUGCACCGCCGCCGCCUCUAUCCAGACCACAGUGAACACCCUGAGCGAGCGGAUCAGCUCCAAGCUGGAGCAGGAGGCAAACGCAAGCGCCCAGACAAAGUGCGACAUCGAGAUCGGCAAUUUCUACAUCAGACAGAACCACGGCUGCAAUAUCACCGUGAAGAAUAUGUGCUCCGCCGACGCAGAUGCACAGCUGGAUGCCGUGCUGUCCGCCGCAACCGAGACAUACUCUGGCCUGACCCCUGAGCAGAAGGCCUAUGUGCCAGCCAUGUUCACAGCCGCCCUGAACAUCCAGACCAGCGUGAAUACAGUGGUGCGGGACUUUGAGAACUACGUGAAGCAGACCUGCAAUUCUAGCGCCGUGGUGGACAACAAGCUGAAGAUCCAGAAUGUGAUCAUCGAUGAGUGUUAUGGAGCACCAGGCUCCCCUACCAACCUGGAGUUCAUCAAUACAGGCUCCUCUAAGGGCAACUGCGCCAUCAAGGCCCUGAUGCAGCUGACCACAAAGGCCACCACACAGAUCGCACCUAGGCAGGUGGCAGGCACGUGCACGGUGCCCACGAUGAACAACGCGAAGUUGACGUCCACGGAAACCUCUUUCAAUGAUAAACAAAAAGUCACGUUCACAUGUGACUCCGGAUACCACUCUUUGGACCCGAACGCAGUUUGUGAAACAGAUAAGUGGAAGUACGAGAAUCCGUGCAAGAAAAUGUGCACGGUGUCGGAUUAUGUAUCAGAGUUGUACGACAAGCCGUUGUACGAGGUUAAUAGUACCAUGACCUUGUCGUGCAACGGCGAAACCAAGUAUUUCCGUUGUGAAGAGAAAAACGGGAACACGUCGUGGAACGACACGGUAACCUGCCCCAACGCGGAGUGUCAACCUCUGCAGUUGGAGCACGGCUCUUCUCAGCCGGUGAAGGAAAAAUAUUCCUUCGGCGAGUACAUGACUAUAAACUGUGAUGUGGGGUACGAGGUUAUAGGCGUAUCCUACAUUAGCUGCACCGCUAAUAGUUGGAACGUCAUCCCCUCGUGCCAGCAGAAAUGCGACAUUCCGUCUCUGUCAAAUGGCCUGAUCUCCGGGUCGACCUUCUCGAUAGGUGGGGUUAUUCAUUUGUCCUGUAAGAGUGGGUUCACUCUUACAGGCUCCCCAUCUUCGACCUGCAUAGAUGGGAAGUGGAACCCCAUCCUUCCCACUUGUGUCAGGUCGAACGAGGAAUUCGAUCCGGUAGAUGACGGCCCUGACGACGAGACGGAUCUGUCGAAGCUGUCCAAAGACGUGGUUCAGUAUGAGCAGGAGAUAGAAUCUCUUGAGGCUACUUACCAC

SEQ ID NO:18(5’端UTR序列)

GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC

SEQ ID NO:19(信号肽序列)

METDTLLLWVLLLWVPGSTG

SEQ ID NO:20(信号肽的编码序列)

ATGGAAACAGACACCCTGCTGCTGTGGGTCCTGCTGCTCTGGGTGCCTGGCAGCACCGGC

SEQ ID NO:21(3’端UTR序列)

TGATAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGA

SEQ ID NO:22(A35R肽段的DNA序列)

AGCACCACCCAGTACGACCACAAAGAGAGCTGCAACGGCCTGTACTACCAAGGCTCTTGTTACATCCTG CACAGCGACTATAAGAGCTTCGAGGATGCTAAGGCCAATTGCGCCGCCGAGAGCAGCACACTGCCTAACAAGTCCGA CGTGCTGACCACCTGGCTGATCGACTACGTGGAAGATACATGGGGAAGCGACGGCAACCCCATCACAAAAACCACAA GCGATTATCAGGACAGCGACGTGTCTCAGGAGGTTAGAAAGTACTTTTGCACC

SEQ ID NO:23(M1R肽段的DNA序列)

GCCGCCGCCTCTATCCAGACCACAGTGAACACCCTGAGCGAGCGGATCAGCTCCAAGCTGGAGCAGGAG GCAAACGCAAGCGCCCAGACAAAGTGCGACATCGAGATCGGCAATTTCTACATCAGACAGAACCACGGCTGCAATAT CACCGTGAAGAATATGTGCTCCGCCGACGCAGATGCACAGCTGGATGCCGTGCTGTCCGCCGCAACCGAGACATACT CTGGCCTGACCCCTGAGCAGAAGGCCTATGTGCCAGCCATGTTCACAGCCGCCCTGAACATCCAGACCAGCGTGAAT ACAGTGGTGCGGGACTTTGAGAACTACGTGAAGCAGACCTGCAATTCTAGCGCCGTGGTGGACAACAAGCTGAAGAT CCAGAATGTGATCATCGATGAGTGTTATGGAGCACCAGGCTCCCCTACCAACCTGGAGTTCATCAATACAGGCTCCT CTAAGGGCAACTGCGCCATCAAGGCCCTGATGCAGCTGACCACAAAGGCCACCACACAGATCGCACCTAGGCAGGTG GCAGGC

SEQ ID NO:24(B6R肽段的DNA序列)

ACGTGCACGGTGCCCACGATGAACAACGCGAAGTTGACGTCCACGGAAACCTCTTTCAATGATAAACAAAAAGTCACGTTCACATGTGACTCCGGATACCACTCTTTGGACCCGAACGCAGTTTGTGAAACAGATAAGTGGAAGTACGAGAATCCGTGCAAGAAAATGTGCACGGTGTCGGATTATGTATCAGAGTTGTACGACAAGCCGTTGTACGAGGTTAATAGTACCATGACCTTGTCGTGCAACGGCGAAACCAAGTATTTCCGTTGTGAAGAGAAAAACGGGAACACGTCGTGGAACGACACGGTAACCTGCCCCAACGCGGAGTGTCAACCTCTGCAGTTGGAGCACGGCTCTTGTCAGCCGGTGAAGGAAAAATATTCCTTCGGCGAGTACATGACTATAAACTGTGATGTGGGGTACGAGGTTATAGGCGTATCCTACATTAGCTGCACCGCTAATAGTTGGAACGTCATCCCCTCGTGCCAGCAGAAATGCGACATTCCGTCTCTGTCAAATGGCCTGATCTCCGGGTCGACCTTCTCGATAGGTGGGGTTATTCATTTGTCCTGTAAGAGTGGGTTCACTCTTACAGGCTCCCCATCTTCGACCTGCATAGATGGGAAGTGGAACCCCATCCTTCCCACTTGTGTCAGGTCGAACGAGGAATTCGATCCGGTAGATGACGGCCCTGACGACGAGACGGATCTGTCGAAGCTGTCCAAAGACGTGGTTCAGTATGAGCAGGAGATAGAATCTCTTGAGGCTACTTACCAC

SEQ ID NO:25(A35R肽段的mRNA序列)

AGCACCACCCAGUACGACCACAAAGAGAGCUGCAACGGCCUGUACUACCAAGGCUCUUGUUACAUCCUGCACAGCGACUAUAAGAGCUUCGAGGAUGCUAAGGCCAAUUGCGCCGCCGAGAGCAGCACACUGCCUAACAAGUCCGACGUGCUGACCACCUGGCUGAUCGACUACGUGGAAGAUACAUGGGGAAGCGACGGCAACCCCAUCACAAAAACCACAAGCGAUUAUCAGGACAGCGACGUGUCUCAGGAGGUUAGAAAGUACUUUUGCACC

SEQ ID NO:26(M1R肽段的mRNA序列)

GCCGCCGCCUCUAUCCAGACCACAGUGAACACCCUGAGCGAGCGGAUCAGCUCCAAGCUGGAGCAGGAGGCAAACGCAAGCGCCCAGACAAAGUGCGACAUCGAGAUCGGCAAUUUCUACAUCAGACAGAACCACGGCUGCAAUAUCACCGUGAAGAAUAUGUGCUCCGCCGACGCAGAUGCACAGCUGGAUGCCGUGCUGUCCGCCGCAACCGAGACAUACUCUGGCCUGACCCCUGAGCAGAAGGCCUAUGUGCCAGCCAUGUUCACAGCCGCCCUGAACAUCCAGACCAGCGUGAAUACAGUGGUGCGGGACUUUGAGAACUACGUGAAGCAGACCUGCAAUUCUAGCGCCGUGGUGGACAACAAGCUGAAGAUCCAGAAUGUGAUCAUCGAUGAGUGUUAUGGAGCACCAGGCUCCCCUACCAACCUGGAGUUCAUCAAUACAGGCUCCUCUAAGGGCAACUGCGCCAUCAAGGCCCUGAUGCAGCUGACCACAAAGGCCACCACACAGAUCGCACCUAGGCAGGUGGCAGGC

SEQ ID NO:27(B6R肽段的mRNA序列)

ACGUGCACGGUGCCCACGAUGAACAACGCGAAGUUGACGUCCACGGAAACCUCUUUCAAUGAUAAACAAAAAGUCACGUUCACAUGUGACUCCGGAUACCACUCUUUGGACCCGAACGCAGUUUGUGAAACAGAUAAGUGGAAGUACGAGAAUCCGUGCAAGAAAAUGUGCACGGUGUCGGAUUAUGUAUCAGAGUUGUACGACAAGCCGUUGUACGAGGUUAAUAGUACCAUGACCUUGUCGUGCAACGGCGAAACCAAGUAUUUCCGUUGUGAAGAGAAAAACGGGAACACGUCGUGGAACGACACGGUAACCUGCCCCAACGCGGAGUGUCAACCUCUGCAGUUGGAGCACGGCUCUUGUCAGCCGGUGAAGGAAAAAUAUUCCUUCGGCGAGUACAUGACUAUAAACUGUGAUGUGGGGUACGAGGUUAUAGGCGUAUCCUACAUUAGCUGCACCGCUAAUAGUUGGAACGUCAUCCCCUCGUGCCAGCAGAAAUGCGACAUUCCGUCUCUGUCAAAUGGCCUGAUCUCCGGGUCGACCUUCUCGAUAGGUGGGGUUAUUCAUUUGUCCUGUAAGAGUGGGUUCACUCUUACAGGCUCCCCAUCUUCGACCUGCAUAGAUGGGAAGUGGAACCCCAUCCUUCCCACUUGUGUCAGGUCGAACGAGGAAUUCGAUCCGGUAGAUGACGGCCCUGACGACGAGACGGAUCUGUCGAAGCUGUCCAAAGACGUGGUUCAGUAUGAGCAGGAGAUAGAAUCUCUUGAGGCUACUUACCAC。

Claims

1.一种痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原，其特征在于，所述嵌合或混合抗原包含：

2.根据权利要求1所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原，其特征在于，所述A35R蛋白的抗原性片段为该蛋白的胞外段或其一部分，优选为具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列加上由其向A35R蛋白的N端延伸1-30个氨基酸的片段的氨基酸序列、优选如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的肽段；

和/或，所述M1R蛋白的抗原性片段为该蛋白的胞外段或其一部分，优选为具有如SEQID NO:3所示的氨基酸序列的肽段；

和/或，所述B6R蛋白的抗原性片段为该蛋白的胞外段或其一部分，优选为具有如SEQID NO:4所示的氨基酸序列的肽段。

3.根据权利要求1或2所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原，其特征在于，其为多免疫原混合抗原，所述混合抗原为免疫原I、II、III的混合物；

4.根据权利要求1或2所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原，其特征在于，其为多免疫原嵌合抗原，所述嵌合抗原为一个或多个免疫原I、II、III以串联方式形成的单链。

5.根据权利要求4所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原，其特征在于，所述嵌合抗原包括按照A1-C₁-M-C₂-A2-C₃-B样式排列的氨基酸序列，其中：

其中，

A1与A2相同或不同。

6.根据权利要求5所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原，其特征在于，所述A1表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；

和/或，所述A2表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列加上由其向A35R蛋白的N端延伸1-30个氨基酸的片段的氨基酸序列、优选为如SEQID NO:2所示的氨基酸序列，或者由上述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；

7.根据权利要求6所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原，其特征在于，所述A1表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述A2表示如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述M表示如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述B表示如SEQ IDNO:4或如SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列；

优选地，所述A1表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述A2表示如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述M表示如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述B表示如SEQ ID NO:4或如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

优选地，所述C₁、C₂、C₃均为无；

8.根据权利要求4所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原，其特征在于，所述嵌合抗原包括按照A-C₁’-M-C₂’-B样式排列的氨基酸序列，其中：

9.根据权利要求8所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原，其特征在于，所述A表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；

10.根据权利要求9所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原，其特征在于，所述A表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述M表示如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述B表示如SEQ ID NO:4或如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

优选地，所述C₁’、C₂’均为无；

11.根据权利要求4-10任一项所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原，其特征在于，所述嵌合抗原的N端还包含信号肽序列；可选地，所述信号肽序列如SEQ ID NO:19所示。

12.一种如权利要求4-10任一项所述痘病毒多免疫原嵌合抗原的制备方法，其包括以下步骤：在编码如权利要求4-10任一项所述嵌合抗原的核苷酸序列的5’端加上Kozak序列以及信号肽的编码序列，3’端加上组氨酸标签的编码序列和终止密码子，进行克隆表达，筛选正确的重组子，然后将其转染表达系统细胞进行表达，收集细胞培养上清，从中分离获得所述嵌合抗原。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于：所述表达系统细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞；

可选地，所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。

14.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-11任一项所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原。

15.根据权利要求14所述的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸为DNA或mRNA；

当编码痘病毒多免疫原嵌合抗原时，优选地，所述多核苷酸为包含如SEQ ID NO:10、11、12或13之一所示的DNA序列，或由其组成的DNA分子；或者，所述多核苷酸为包含如SEQID NO:14、15、16或17之一所示的mRNA序列，或由其组成的mRNA分子；

当编码痘病毒多免疫原混合抗原时，优选地，所述多核苷酸为多核苷酸组，所述多核苷酸组包括以下DNA分子或由其组成：包含如SEQ ID NO:22所示的DNA序列的DNA分子，包含如SEQ ID NO:23所示的DNA序列的DNA分子，和包含如SEQ ID NO:24所示的DNA序列的DNA分子；或者，所述多核苷酸组包括以下mRNA分子或由其组成：包含如SEQ ID NO:25所示的mRNA序列的mRNA分子，包含如SEQ ID NO:26所示的mRNA序列的mRNA分子，和包含如SEQ ID NO:27所示的mRNA序列的mRNA分子。

16.一种核酸构建体，其包含如权利要求14或15所述的多核苷酸，以及任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。

17.一种表达载体，其包含如权利要求16所述的核酸构建体。

18.一种宿主细胞，其中转化或转染有如权利要求14或15所述的多核苷酸、如权利要求16所述的核酸构建体或如权利要求17所述的表达载体。

19.如权利要求1-11任一项所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原、如权利要求14或15所述的多核苷酸、如权利要求16所述的核酸构建体、如权利要求17所述的表达载体或如权利要求18所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗痘病毒感染的药物中的应用；

可选地，所述药物为疫苗，优选为mRNA疫苗；

优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；

20.一种疫苗或免疫原性组合物，其包含如权利要求1-11任一项所述的痘病毒嵌合或混合抗原、如权利要求14或15所述的多核苷酸、如权利要求16所述的核酸构建体、如权利要求17所述的表达载体或如权利要求18所述的宿主细胞，以及生理学可接受的媒介物、佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂。

21.根据权利要求20所述的疫苗或免疫原性组合物，其为痘病毒重组蛋白疫苗，其包括如权利要求1-11任一项所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原和佐剂；

22.根据权利要求20所述的疫苗或免疫原性组合物，其为痘病毒DNA疫苗，所述DNA疫苗包括：

(1)真核表达载体；和

(2)构建入所述真核表达载体中的、编码如权利要求1-11任一项所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原的DNA序列；

23.根据权利要求20所述的疫苗或免疫原性组合物，其为痘病毒mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包括：

(I)编码如权利要求1-11任一项所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原的mRNA分子；和

(II)脂质纳米颗粒；

优选地，当为痘病毒多免疫原混合抗原时，所述mRNA疫苗包含三种脂质纳米颗粒包装的mRNA分子，其分别具有SEQ ID NO:25、26、27所示的mRNA序列。

24.根据权利要求20所述的疫苗或免疫原性组合物，其为痘病毒-病毒载体疫苗，其包括：

(1)病毒骨架载体；和

(2)构建入所述病毒骨架载体中的、编码如权利要求1-11任一项所述的痘病毒多免疫原嵌合或混合抗原的DNA序列；

优选地，当为痘病毒多免疫原混合抗原时，痘病毒-病毒载体疫苗包含三种病毒载体构建体，每种病毒载体构建体中的DNA序列分别如SEQ ID NO:22、23、24所示；

25.根据权利要求20-24任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其特征在于，所述疫苗或免疫原性组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；

优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；

进一步优选地，所述片剂为舌下片；

进一步优选地，所述颗粒剂为细粒剂；

进一步优选地，所述粉末剂为散剂；

进一步优选地，所述丸剂为小丸剂；