CN117126292A - 痘病毒重组嵌合抗原、包含其的免疫原性组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种针对痘病毒(特别是猴痘病毒)的重组嵌合抗原、包含其的免疫原性组合物及其应用。本发明的重组嵌合抗原包含两种免疫原：(1)猴痘病毒A35蛋白或其抗原性片段(或它们的衍生肽段)和(2)猴痘病毒M1蛋白或其抗原性片段(或它们的衍生肽段)，能够激发针对细胞内成熟病毒颗粒(IMV)和细胞外包膜病毒颗粒(EEV)两种感染性病毒颗粒的免疫反应，从而高效地激发针对猴痘病毒的特异性免疫保护效应；此外，本发明的痘病毒疫苗还具有良好的安全性、快速响应性和产能支撑，具有极好的临床应用前景。

Description

痘病毒重组嵌合抗原、包含其的免疫原性组合物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种痘病毒重组嵌合抗原、包含其的免疫原性组合物及其应用。
背景技术
以猴痘病毒为代表的痘病毒是一类核质大DNA病毒，其病毒基因组约为130-375kbp，能够编码多达200种病毒蛋白。除编码病毒蛋白繁复外，痘病毒的病毒颗粒也较为复杂，其具有两种形态不同的感染性病毒颗粒，称为细胞内成熟病毒(IMV)和细胞外包膜病毒(EEV)。其中IMV具有一层囊膜，其相较于EEV具有更高的稳定性，主要参与病毒在宿主间传播。而EEV则具有一层特殊的外膜结构，主要参与病毒在宿主体内的扩散。由于IMV和EEV具有不同的膜结构、膜组份和细胞感染机制，其表面中和抗原也截然不同。
猴痘是一种病毒性人畜共患病，由猴痘病毒(Mpoxvirus,MPXV)感染导致。猴痘病毒与天花病毒同属痘病毒科正痘病毒属，该属共包括四种人致病性病毒，分别是天花病毒(Variola virus,VARV)、猴痘病毒、牛痘病毒(Cowpox virus,CPXV)和痘苗病毒(Vacciniavirus,VACV)。猴痘病毒于1958年由丹麦科学家首次从实验室的猴子身上分离发现，并于1970年在刚果(金)发现首例人感染病例。在此之后，猴痘病毒长期在非洲中西部局部传播，并演化出西非和刚果盆地(中非)2个分支。中非支系传播能力和致病力较强，病死率约为10.6％，主要在加蓬、喀麦隆、刚果(金)、刚果(布)及苏丹等非洲国家流行；西非支系传播能力和致病力较弱，病死率约为3.6％，主要出现在尼日利亚、利比里亚、加纳和塞拉利昂等非洲西部和欧洲等非洲以外国家。自2022年5月份英国确诊了猴痘疫情的第一个病例以来，美国、意大利、瑞典、西班牙、葡萄牙、比利时、德国、澳大利亚等多个国家均陆续出现猴痘确诊病例，猴痘病毒呈全球流行趋势。当地时间2022年7月23日，世界卫生组织(WHO)正式宣布猴痘疫情构成“国际关注的突发公共卫生事件”(PHEIC)，这是WHO发出的一最高级别警报。截止2022年10月7日，此次疫情全球累计报告猴痘病例共计71237例，其中死亡病例26例，共涉及107个国家和地区。此外，天花病毒虽然已于上世纪80年代被消灭，但其病原体仍然存在，目前仍有再次威胁人类健康的可能。
目前，全球暂无特异性针对猴痘病毒研发的疫苗，只有2款疫苗可用于预防猴痘病毒感染，分别是安卡拉-巴伐利亚北欧公司(Bavarian Nordic)公司生产的JYNNEOSTM疫苗(也称为Imvamune或Imvanex)和赛诺菲公司生产(Sanofi Pasteur)的。这两种疫苗均为原本用于预防天花的弱毒活疫苗；其中，/>为第二代疫苗，在人体内具有复制能力，接种后有发生脑炎、心肌炎、进行性牛痘感染等的风险，同时不适宜幼儿、孕妇和免疫功能低下或受损人群的接种；JYNNEOSTM为第三代疫苗，由于其不能在人体内复制，相较于第一代和第二代疫苗，安全性上有所提升，但免疫效果也出现了一定程度的降低。值得注意的是，上述疫苗产品均获批于天花病毒根除之后，因此并未曾在人群中大范围接种，其对天花病毒、猴痘病毒传播的扼制和病毒的根除能力尚有待确定。
简言之，现有获批疫苗均为针对天花病毒研发的弱毒活疫苗，其对猴痘病毒传播的扼制能力仍有待验证；此外，弱毒活病毒存在明显的接种副作用，并可能面临突变导致病毒毒力回强的风险和不确定性。上述问题导致疫苗的接种人群受限，因而其不适宜幼儿、孕妇和免疫功能低下或受损人群的接种。
除接种人群受限和明确的接种副作用外，弱毒活疫苗还存在不确定性和安全隐患，一是潜在的疫苗株突变导致毒力回强带来的安全风险；二是痘病毒作为一种核质大DNA病毒，病毒基因组可以编码多达200种病毒蛋白，因此，活病毒疫苗携带的抗原成分极其复杂，有效免疫原和作用机制不明确，其中包括多种具有免疫抑制功能的病毒蛋白，会给疫苗的免疫和宿主的免疫系统带来负面影响。这些安全隐患和不确定性在免疫力低下的人群如老人、HIV携带者等中表现的尤其明显，这进一步限制了此类免疫弱势人群的疫苗接种。
不仅如此，弱毒活疫苗的活病毒本质导致其产能低、成本高，无法满足人群大范围接种和应急疫苗生产的需求。因此，鉴于现有疫苗的种种弊端，针对近期猴痘病毒的全球流行趋势以及天花等痘病毒未来可能的威胁，亟需借助新技术，开发免疫原成分清晰、作用机制明确、安全有效并可快速获得的新一代疫苗，助力疾病防控。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
发明目的
鉴于现有技术疫苗的种种弊端，本发明的目的在于提供一种能够高效地激发针对猴痘病毒的特异性免疫反应(例如，产生保护性抗体)的猴痘病毒重组嵌合抗原，其相关疫苗产品，其制备方法及应用；此外，基于该重组嵌合抗原的疫苗类产品还具有安全、有效、免疫原成分和保护机制清晰、高产能、低成本等优势，从而可满足应急疫苗人群大范围接种的安全性和产能需求。
解决方案
为实现本发明目的，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种痘病毒重组嵌合抗原，所述重组嵌合抗原包含：
(1)猴痘病毒A35蛋白(由猴痘病毒A35R基因编码)或其抗原性片段，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；和
(2)猴痘病毒M1蛋白(由猴痘病毒M1R基因编码)或其抗原性片段，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列。
在可行的实现方式中，所述A35蛋白的抗原性片段为该蛋白的胞外段或其一部分；和/或，所述M1蛋白的抗原性片段为该蛋白的胞外段或其一部分。
在一些实施方案中，所述重组嵌合抗原为单链形式，每条所述重组嵌合抗原链中，包含：2个以上所述猴痘病毒A35蛋白或其抗原性片段，其氨基酸序列相同或不同；和，1个以上所述猴痘病毒M1蛋白或其抗原性片段。
作为优选，所述重组嵌合抗原包含2个所述A35蛋白或其抗原性片段和1个所述M1蛋白或其抗原性片段；
进一步优选地，所述重组嵌合抗原为单链二聚体结构。在具体实施方案中，所述重组嵌合抗原中的2个所述A35蛋白或其抗原性片段和1个所述M1蛋白或其抗原性片段直接串联或者通过适当的连接序列串联，形成单链多肽，所得单链多肽可在适当条件下形成稳定的单链二聚体结构(2个A35蛋白或其抗原性片段二聚化，从而形成二聚体)。
在一些具体实施方案中，所述重组嵌合抗原包括按照M-C1-A1-C2-A2样式排列的氨基酸序列，其中：
M表示猴痘病毒M1蛋白或其抗原性片段，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，
A1表示猴痘病毒A35蛋白或其抗原性片段I，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，
A2表示猴痘病毒A35蛋白或其抗原性片段II，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，
C1、C2各自独立地为无，或者连接序列(GGGGS)n，其中，n为1-10之间的任意整数；并且，
其中，
A1与A2相同或不同，
C1和C2相同或不同。
在一些优选的具体实施方案中，所述M表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
和/或，所述A1表示如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
和/或，所述A2表示如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列加上由其向A35蛋白的N端延伸1-30个氨基酸的片段的氨基酸序列，或者由上述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；优选地，所述A2表示如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或者如SEQID NO:3所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列。
进一步优选地，所述M表示如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述A1表示如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，并且，所述A2表示如SEQ ID NO:2或如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
优选地，所述C1、C2均为无；
更进一步优选地，所述重组嵌合抗原包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
作为优选，所述重组嵌合抗原的N端还包含信号肽序列；可选地，所述信号肽序列如SEQ ID NO:7所示；
作为优选，所述重组嵌合抗原的C端还包含标签序列；可选地，所述标签选自Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签、SUMO标签中的至少一种，优选为His标签。
本发明中，为了兼顾针对EEV和IMV两种病毒粒子的免疫保护效应，设计了同时包含EEV的中和抗原A35和IMV的中和抗原M1的重组嵌合抗原，两种中和抗原分别由猴痘病毒的A35R基因和M1R基因编码，与痘苗病毒A33R和L1R为同源基因。
第二方面，本发明提供了一种如上述第一方面所述重组嵌合抗原的制备方法，其包括以下步骤：
在编码如上述第一方面所述重组嵌合抗原的核苷酸序列的5’端加上Kozak序列以及信号肽的编码序列，3’端加上组氨酸标签的编码序列和终止密码子，进行克隆表达，筛选正确的重组子，然后将其转染表达系统细胞进行表达，收集细胞培养上清，从中分离获得所述重组嵌合抗原。
在上述制备方法的一种可行的实现方式中，所述表达系统的细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞；
可选地，所述哺乳动物细胞为HEK293T细胞、293F系列细胞或CHO细胞；进一步可选地，所述293F系列细胞为HEK293F细胞、Freestyle293F细胞或Expi293F细胞；
可选地，所述昆虫细胞为sf9细胞、Hi5细胞、sf21细胞或S2细胞；
可选地，所述酵母细胞为毕赤酵母细胞或者由其改造的酵母细胞；
可选地，所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。
第三方面，本发明提供了一种多核苷酸，其编码如上述第一方面所述的重组嵌合抗原。
在具体实施方案中，所述多核苷酸为经人源密码子优化的核苷酸序列，可以为DNA或mRNA；
优选地，所述多核苷酸为如SEQ ID NO:5所示的DNA序列；
优选地，所述多核苷酸为如SEQ ID NO:6所示的mRNA序列。
第四方面，本发明提供了一种核酸构建体，其包含如上述第三方面所述的多核苷酸，以及任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。
第五方面，本发明提供了一种表达载体，其包含如上述第四方面所述的核酸构建体。
第六方面，本发明提供了一种宿主细胞，其中转化或转染有如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体或如上述第五方面所述的表达载体。
第七方面，本发明提供了如上述第一方面所述的重组嵌合抗原、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体或如上述第六方面所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗痘病毒感染的药物中的应用；
优选地，所述痘病毒选自：猴痘病毒、天花病毒、牛痘病毒和/或痘苗病毒；
可选地，所述药物为疫苗，优选为重组蛋白疫苗；进一步优选地，所述重组蛋白疫苗采用选自以下的佐剂：铝佐剂、MF59佐剂和类MF59佐剂；
可选地，所述疫苗为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、颗粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂和膏剂；进一步优选地，所述片剂为舌下片；进一步优选地，所述颗粒剂为细粒剂；进一步优选地，所述粉末剂为散剂；进一步优选地，所述丸剂为小丸剂；
优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射制剂；进一步优选地，所述可注射制剂为可推注制剂。
第八方面，本发明提供了一种疫苗或免疫原性组合物，其包含如上述第一方面所述的重组嵌合抗原、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体或如上述第六方面所述的宿主细胞，以及生理学可接受的媒介物、佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂。
在一些优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为猴痘病毒重组蛋白疫苗，其包括如上述第一方面所述的重组嵌合抗原和佐剂；
可选地，所述佐剂为选自以下佐剂中的一种或多种：铝佐剂、MF59佐剂和类MF59佐剂。
在另一些优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为猴痘病毒DNA疫苗，其包括：
(1)真核表达载体；和
(2)构建入所述真核表达载体中的、编码如上述第一方面所述的重组嵌合抗原的DNA序列，优选为如SEQ ID NO:5所示的DNA序列；
可选地，所述真核表达载体选自pGX0001、pVAX1、pCAGGS和pcDNA系列载体。
在另一些优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为猴痘病毒mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包括：
(I)编码如上述第一方面所述的重组嵌合抗原的mRNA序列，优选为如SEQ ID NO:6所示的mRNA序列；和
(II)脂质纳米颗粒。
在另一些优选的具体实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物为猴痘病毒-病毒载体疫苗，其包括：
(1)病毒骨架载体；和
(2)构建入所述病毒骨架载体中的、编码如上述第一方面所述的重组嵌合抗原的DNA序列，优选为如SEQ ID NO:5所示的DNA序列；
可选地，所述病毒骨架载体选自以下病毒载体中的一种或几种：腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体、腺相关病毒载体。
在可行的实现方式中，所述疫苗或免疫原性组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、颗粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂和膏剂；
进一步优选地，所述片剂为舌下片；
进一步优选地，所述颗粒剂为细粒剂；
进一步优选地，所述粉末剂为散剂；
进一步优选地，所述丸剂为小丸剂；
优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射制剂；进一步优选地，所述可注射制剂为可推注制剂。
第九方面，本发明提供了一种预防和/或治疗痘病毒感染的方法，所述方法包括：向有需要的受试者施用预防和/或治疗有效量的以下物质：如上述第一方面所述的重组嵌合抗原、如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体、如上述第五方面所述的表达载体、如上述第六方面所述的宿主细胞和/或如上述第八方面所述的疫苗或免疫原性组合物。
所述“预防和/或治疗有效量”可根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。
有益效果
本发明的发明人设计了一种针对痘病毒(特别是猴痘病毒)的重组嵌合抗原，其包含两种免疫原：(1)猴痘病毒A35蛋白或其抗原性片段(或它们的衍生肽段)，和(2)猴痘病毒M1蛋白或其抗原性片段(或它们的衍生肽段)；其中，前者为细胞内成熟病毒颗粒(IMV)上特有的中和抗原，后者为细胞外包膜病毒颗粒(EEV)上特有的中和抗原；包含二者的疫苗能够激发针对两种感染性病毒颗粒的免疫反应。
在具体实施方式中，本发明通过将两个以上的所述猴痘病毒A35蛋白或其抗原性片段与所述猴痘病毒M1蛋白或其抗原性片段直接串联或者通过适当的连接序列串联，从而形成单链形式的串联融合多价抗原。在该串联融合多价抗原中，A35形成稳定的二聚体形态，逆转了单独免疫时A35蛋白免疫原性缺失的问题；与两个蛋白单独免疫相比，串联融合多价抗原不但保留了两种抗原各自的抗原性，还能更高效地激活针对猴痘病毒的特异性保护性抗体。
与现有技术中的痘病毒疫苗相比，基于本发明的重组嵌合抗原的疫苗类产品具有以下优势：
1)亚单位疫苗具有更好的安全性，因而克服了现有的弱毒活病毒疫苗的安全性问题；同时，相比弱毒活病毒疫苗，亚单位疫苗具有生产成本低、能够快速响应和产能支撑优势；经实验验证，本发明的痘病毒疫苗具有良好的有效性；
2)运用猴痘病毒自身的抗原序列，对于猴痘病毒具有较高的特异性；现有的活病毒疫苗基本上均是以痘苗病毒为基础开发而成的，痘苗病毒虽与猴痘病毒同属痘病毒科，但二者的中和抗原序列和抗原表位仍存在一定差异，因此，其对猴痘病毒的保护效果尚待明确，而本发明的痘病毒疫苗是基于猴痘病毒的抗原表位开发的，因此，其对猴痘病毒的防治具有较高的特异性；
3)猴痘病毒中的蛋白种类繁多，其中绝大多数蛋白不能激发有效的抗病毒免疫反应，即为无效成分，此外，还有一些病毒蛋白具有免疫抑制作用；现有的活病毒疫苗无法去除上述无效和有害成分，因此存在接种风险和不确定性，而本发明的痘病毒疫苗只保留2种病毒中和抗原，实验数据表明，仅这2种抗原既可在小鼠模型中展现完全的保护效应。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1显示了本发明实施例2中所表达的免疫原蛋白AA和MAA的凝胶过滤层析洗脱曲线和SDS-PAGE鉴定结果。
图2显示了本发明实施例2中所表达的单一免疫原蛋白A35和M1的凝胶过滤层析洗脱曲线和SDS-PAGE鉴定结果。
图3显示了本发明实施例3中所检测的免疫原蛋白M1(A)、MAA(B)结合中和抗体7D11的亲和力分析结果。
图4显示了本发明实施例3中所检测的免疫原蛋白A35(A)、AA(B)和MAA(C)结合中和抗体A27D7的亲和力分析结果。
图5是本发明实施例4、实施例7中所采用的小鼠免疫和攻毒策略示意图。
图6显示了本发明实施例5中所检测的免疫小鼠血清中的特异性结合抗体滴度，其中，图6A为针对各免疫原的特异性抗体水平，图6B为针对M1和A35表位的特异性抗体水平。
图7显示了本发明实施例6中所检测的免疫小鼠血清对VACV活病毒的中和抗体滴度。
图8显示了本发明实施例7中记载的采用不同剂量VACV-WR病毒滴鼻感染BALB/c小鼠的预实验结果，其中，横坐标显示的是攻毒后天数，纵坐标显示的是小鼠的存活百分率。
图9显示了本发明实施例7中记载的各免疫原蛋白对于VACV-WR病毒滴鼻攻击BALB/c小鼠的保护效应，其中，横坐标显示的是攻毒后天数，纵坐标显示的是小鼠的体重变化百分比(A)和存活百分率(B)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1：免疫原设计
本实施例中，作为本发明的代表性实例，将两个EEV中和抗原A35与一个IMV中和抗原M1R按照从N端到C端依次为M1-A35-A35的排布方式进行串联，所形成的单链融合肽可形成A35-A35二聚化的单链三亚基结构，以下简称MAA，其代表本发明的重组嵌合抗原。
以下序列均采用猴痘病毒分离株MPXV_USA_2022_MA001的序列，该病毒完整基因组的GenBank号为ON563414.3。
所述MAA中，M1肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且，两个A35中和抗原采用不同的A35蛋白片段，一个是A35蛋白的S90-T181肽段(其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)，另一个是A35蛋白的S64-T181肽段(其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)；由此，所述MAA的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在构建所述MAA的过程中，为了蛋白表达与纯化的需要，发明人还在如SEQ ID NO:4所示的MAA氨基酸序列的N端加上信号肽序列(如SEQ ID NO:7所示)，在其C端加上6个组氨酸标签，从而形成如下SEQ ID NO:8所示的完整构建体：
MAA完整构建体(SEQ ID NO:8)
(其中，最前面的下划线部分为信号肽序列，斜体部分为M1R肽段的氨基酸序列SEQ IDNO:1，斜体+下划线部分为第一个A35肽段的氨基酸序列SEQ ID NO:2，黑体部分为第二个A35R肽段的氨基酸序列SEQ ID NO:3所示，最后面的下划线部分为组氨酸标签序列)。
此外，作为对比，本实施例中还设计了仅由两个EEV中和抗原A35R串联形成的A35-A35单链二聚体结构，以下简称AA；所述AA构建中，除了不包含M1肽段外，其余序列与上述MAA构建的相同；同样地，为了蛋白表达与纯化的需要，发明人还在其N端加上信号肽序列(如SEQ ID NO:7所示)，在其C端加上6个组氨酸标签，从而形成如下SEQ ID NO:9所示的完整构建体：
AA完整构建体(SEQ ID NO:9)
(其中，最前面的下划线部分为信号肽序列，斜体+下划线部分为第一个A35R肽段的氨基酸序列，黑体部分为第二个A35R肽段的氨基酸序列，最后面的下划线部分为组氨酸标签序列)。
此外，作为对比，本实施例还设计了单一抗原M1和A35肽段的表达构建体，M1和A35肽段的氨基酸序列分别如下：
M1肽段的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)：
MGAAASIQTTVNTLSERISSKLEQEANASAQTKCDIEIGNFYIRQNHGCNITVKNMCSADADAQLDAVLSAATETYSGLTPEQKAYVPAMFTAALNIQTSVNTVVRDFENYVKQTCNSSAVVDNKLKIQNVIIDECYGAPGSPTNLEFINTGSSKGNCAIKALMQLTTKATTQIAPRQVAG；
A35肽段的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)：
MSTTQYDHKESCNGLYYQGSCYILHSDYKSFEDAKANCAAESSTLPNKSDVLTTWLIDYVEDTWGSDGNPITKTTSDYQDSDVSQEVRKYFCT。
实施例2：免疫原蛋白的表达与纯化
构建体MAA和AA的表达与纯化
对实施例1中所设计的构建体MAA和AA的氨基酸序列进行人源密码子优化，获得编码MAA、AA抗原的核苷酸序列，分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13所示；在这些核苷酸序列的5’端加入Kozak序列(GCCACC)、3’端加入翻译终止密码子，然后，人工合成这些DNA片段，将其克隆到pCAGGS载体的EcoRI和XhoI酶切位点之间，得到构建体MAA和AA的表达质粒。
将上述MAA和AA的表达质粒分别转染293F细胞，以进行体外重组表达；转染后5-7天，收集细胞上清，其中含有所表达的免疫原蛋白；然后，进行蛋白纯化；具体地，将含有免疫原蛋白的细胞上清经镍离子亲和层析(HisTrapTM HP(GE))粗纯，然后，再经凝胶过滤层析柱Superdex200 10/300GL(GE))进一步纯化，最后，通过SDS-PAGE鉴定蛋白纯度和分子量。
凝胶过滤层析的洗脱曲线及SDS-PAGE鉴定结果如图1所示，图1表明，经过两步纯化后，可获得高纯度AA和MAA蛋白，分子量分别为～25kDa和～50kDa，符合预期。
单一免疫原M1和A35的表达与纯化
将实施例1中设计的单一抗原M1和A35肽段的氨基酸序列进行人源密码子优化，获得编码M1、A35肽段的核苷酸序列，分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15所示；在这些核苷酸序列的3’端加入翻译终止密码子，然后，人工合成这些DNA片段，将其克隆到pET-28a表达载体中，得到M1和A35的表达质粒。
将上M1R和A35R的表达质粒通过大肠杆菌(E.coli)系统表达，所形成的包涵体经精氨酸稀释复性的方法，体外复性为活性蛋白M1和A35；然后，将复性所得M1或A35蛋白用凝胶过滤层析柱Superdex200 100/300GL进行纯化，最后，通过SDS-PAGE鉴定蛋白纯度和分子量。
凝胶过滤层析的洗脱曲线及SDS-PAGE鉴定结果如图2所示，由图2可知，经过上述凝胶过滤层析纯化后，可获得高纯度M1和A35蛋白；其中，M1蛋白的出峰位置和SDS-PAGE均显示为～20kDa，符合预期；A35蛋白的出峰位置对应分子量为25kDa，而SDS-PAGE显示为～12kDa，由此可知，A35蛋白为分子间互作力形成的二聚体，符合既往文献报道。
实施例3：免疫原的抗原性检测
为了检测本发明的重组嵌合抗原的各抗原表位的暴露情况及其抗原性，本实施例中，通过表面等离子共振(SPR)实验方法，分别检测了实施例2所表达和纯化的免疫原蛋白(包括单链融合免疫原蛋白MAA和AA以及单个抗原蛋白M1和A35)结合中和抗体7D11和A27D7的能力；7D11和A27D7抗体分别为痘苗病毒抗原L1和A33的中和抗体，有数据表明，它们可以交叉识别猴痘病毒的M1和A35抗原，其中，抗体A27D7能够识别A35的二聚体表位。
结果如图3和图4所示。
由图3A和3B可知，单个抗原蛋白M1与中和抗体7D11的亲和力为3.3nM，呈现慢结合慢解离的结合模式；而本发明的重组嵌合抗原MAA可以被7D11识别但亲和力略有降低，表明MAA上的M1表位暴露依旧暴露；
由图4A-C可知，单个抗原蛋白A35与抗体A27D7的亲和力为2.2μM，呈现快结合快解离的结合模式；单链融合免疫原AA与抗体A27D7的亲和力与单个抗原A35的相似；本发明的重组嵌合抗原MAA与抗体A27D7的亲和力与上面二者相似，表明MAA上的A35表位暴露，并呈稳定的二聚体形态。
以上数据均表明：本发明的重组嵌合抗原MAA上的A35和M1抗原表位均能较好地暴露，具有较高的抗原性；特别是，其中的A35二聚体表位的抗原性较单一抗原蛋白A35或其二聚体AA有了极大的提高。
实施例4：小鼠免疫实验
为验证本发明的重组嵌合抗原的免疫保护效力，发明人将实施例2中获得的各免疫原蛋白分别与AddaVaxTM佐剂混合乳化，按照图5的策略免疫小鼠。可复制型痘苗病毒天坛株(VACV-VTT)用作弱毒活疫苗对照组。
免疫实验中，小鼠全部采用雌性BALB/c小鼠，周龄为6-8周，平均体重为15-20g。每个实验组采用6只小鼠。如图4所示，小鼠分别在第0天，第21天和第42天接受免疫，共计3次，每次剂量为10μg/只；接种方式为肌肉注射，注射位置位于小鼠大腿处，左右腿各注射50μL。
VACV-VTT则采用尾根部划痕方式免疫小鼠，具体地，在第0天进行免疫，共免疫一次，免疫剂量为107PFU/只。
在二免、三免和攻毒前两天(即，第19、第40和第54天)，对所有组别小鼠分别进行眼眶采血。通过静置凝血后1500rpm离心10分钟，获得小鼠血清，立刻将小鼠血清分装并置于-80℃冰箱保存，用于后续特异性抗体滴度的ELISA检测和活病毒中和能力测定。
实施例5：ELISA实验检测疫苗诱导的特异性抗体效价
将用于小鼠免疫的各免疫原蛋白(即，单一抗原蛋白A35R和M1R，单链融合免疫原AA和MAA，由实施例2制备)用ELISA包被液(索莱宝，C1050)稀释到2μg/mL，向96孔ELISA板(Corning，3590)每孔加入100μL上述稀释好的免疫原蛋白或痘苗天坛株感染后的细胞裂解物(用于弱毒活疫苗免疫组的抗体效价检测)，4℃静置过夜；弃掉包被液，加入PBS洗去残留包被液，加入100μL ELISA封闭液(PBST配制的10％脱脂奶粉)，室温静置1小时以进行封闭。封闭期间，将免疫小鼠血清用ELISA封闭液进行稀释，从200倍起进行3倍倍比稀释，每个样品做11个稀释度；待封闭完成后，去除封闭液，将用封闭液10倍稀释的免疫小鼠血清加入到ELISA板中，每个稀释度100μL，室温孵育1小时，之后用PBST洗3遍；然后，加入用封闭液1:4000稀释的HRP标记的山羊抗鼠二抗(Abcam，ab6789)，室温孵育1小时，之后用PBST洗5-6遍，加入TMB显色液显色，反应适当时间后加入2M盐酸终止反应。在酶标仪上检测OD450读数。OD450值大于阴性对照2.5倍判定为阳性，以判定为阳性的血清最高稀释倍数定义为血清抗体效价(Endpointtiter)。当最低稀释倍数的反应值仍小于阴性对照2.5倍时，该样品的效价定义为最低稀释倍数的一半，即Log10＝1。
各免疫原蛋白所免疫小鼠的血清特异性抗体效价检测结果如图6所示，其中，图6A为针对各免疫原的特异性抗体水平，图6B为针对M1和A35表位的特异性抗体水平；由图6A可知：本发明的单链融合抗原MAA在第一次免疫后即能很好地激发出特异性抗体，并且，在每次免疫后的特异性抗体滴度均优于包括弱毒活疫苗免疫在内的所有对照组；值得一提的是，就A35表位而言，A35蛋白单独免疫无法激发特异性抗体，免疫原性缺失，而单链融合改造后的AA和MAA则能够有效地激发针对A35表位的特异性抗体反应，具有较好的免疫原性(图6B)；并且，MAA能够同时高水平地激发针对A35和M1表位的特异性抗体反应，其中A35表位抗体激发能力优于改造后的AA单独免疫，M1表位激发能力与M1单独免疫相似(图6B)；
实施例6：免疫血清的VACV活病毒中和能力测定
痘苗病毒(Vacciniavirus,VACV)是痘病毒属的模式病毒，由于痘病毒属的主要免疫原间具有较高的同源性，国际上通常将生物安全等级较低、易于操作的痘苗病毒用于其他痘病毒疫苗的细胞水平中和能力评价和小鼠模型中的保护效力评价。因此，本实施例中，采用国际上经常使用的痘苗病毒小鼠适应株Western Reserve(VACV-WR)，进行各免疫原蛋白的细胞水平的活病毒中和能力测定。
将实施例4获得的免疫小鼠血清用含2％灭活血清的培养基(DMEM)稀释，从20倍起进行2倍倍比稀释，每个样品做10个稀释度。VACV-WR病毒也用相同的稀释液稀释到500PFU/mL。取200μL稀释好的免疫小鼠血清(不含免疫小鼠血清的稀释液用作对照孔)与200μL稀释好的病毒液混合，37℃孵育1小时。Vero细胞提前一天种于12孔板中，第二天密度约为95％时为最佳密度。将12孔板中的培养基弃去，用PBS洗去残留的培养基后，将孵育好的血清-病毒混合液加入到12孔板中，37℃感染2小时。感染后，去除病毒-血清混合液，用PBS洗去残留病毒，加入配置好的羧甲基纤维素-DMEM混合液(2％的羧甲基纤维素和2×DMEM按照1:1混合)，37℃培养48-60小时。显微镜下观察到明显的CPE后，加入4％多聚甲醛固定液，室温固定2小时后，结晶紫染色，计数。
PRNT50计算方法如下：将只含有病毒的孔作为对照孔，所有实验孔计数后的空斑数除以对照孔的空斑数，即为每个实验孔血清对于病毒的抑制率，然后通过GraphPad软件中的log(inhibitor)vs.normalized response--Variable slope公式计算出PRNT50。
结果见图7。
由于活病毒中和实验采用的毒株VACV-WR株，其几乎不产生EEV，因此我们的中和实验均使用IMV。
如图7所示，由于A35不存在于IMV病毒粒子上，因此A35和AA免疫组在活病毒的中和水平上不能体现出中和能力；而M1、MAA和VACV-VTT免疫组均能产生针对IMV病毒粒子的中和抗体，其中，MAA的中和抗体激发能力明显高于M1以及弱毒活疫苗VACV-VTT免疫组。
实施例7：攻毒保护实验
VACV-WR病毒株滴鼻感染BALB/c小鼠时，可导致小鼠死亡。为确定合适的攻毒剂量，我们首先对17-19周龄(与三次免疫后攻毒时周龄一致)的BALB/c小鼠进行不同剂量VACV-WR病毒的滴鼻感染预实验，以测定我们实验体系下VACV-WR感染BALB/c小鼠的LD50。预实验结果如图8所示，在攻毒量为2×105PFU时，小鼠在感染后7天内全部死亡，通过计算，此时的病毒量为7LD50，我们后续采用该病毒量作为动物实验的攻毒剂量。
如图5所示，实施例4中三次免疫的小鼠在三免后两周，即，第56天进行7LD50的VACV-WR病毒滴鼻攻毒实验，以评价疫苗在动物模型中的保护效果，各攻毒实验组小鼠的体重变化百分比和存活百分率结果分别见图9A和图9B。
图9A和9B的结果表明，单一抗原A35免疫组对VACV-WR病毒感染的小鼠无保护效果，全部小鼠在攻毒后6天全部死亡，这与其不能有效的激发出特异性抗体结果一致；单一抗原M1和单链融合免疫原AA尽管在实施例4中可见较高水平的特异性抗体水平，且在实施例5中可见较高水平中和抗体激发能力，但是其只能保护60％的小鼠免于VACV-WR感染致死，存活小鼠也表现出很大程度的体重下降；相比以上各组，本发明的单链融合免疫原MAA能对VACV-WR感染小鼠起到100％的保护效果，且未出现明显的体重变化。
上述结果表明：本发明的单链融合免疫原MAA在小鼠模型中呈现出极佳的保护效果。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明技术方案的精神和范围。
本申请所涉及的序列：
SEQ ID NO:1(MAA中的M1的氨基酸序列)
SEQ ID NO:2(MAA中的第一个A35的氨基酸序列)
SEQ ID NO:3(MAA中的第二个A35的氨基酸序列)
SEQ ID NO:4(MAA的氨基酸序列)
SEQ ID NO:5(编码如SEQ ID NO:4所示的MAA的DNA序列)
GCCGCTGCCTCTATCCAAACAACCGTGAATACCCTGAGCGAGAGAATCTCCTCCAAGCTTGAGC
AGGAGGCCAACGCCAGCGCTCAGACAAAGTGCGACATCGAGATCGGCAACTTCTACATCAGAC
AGAACCACGGCTGCAATATCACCGTGAAGAACATGTGCAGCGCTGACGCCGACGCCCAGCTGG
ACGCCGTGCTGTCTGCCGCTACCGAAACCTACAGCGGCCTGACACCTGAGCAGAAAGCCTACG
TTCCTGCCATGTTCACCGCCGCCCTGAACATTCAGACAAGCGTGAACACCGTGGTGCGGGACT
TCGAGAACTACGTGAAGCAGACCTGTAACAGCAGCGCCGTGGTGGACAACAAGCTGAAGATC
CAGAATGTGATCATCGACGAGTGCTACGGCGCTCCCGGCAGCCCTACCAACCTGGAGTTCATCA
ACACAGGCTCTAGCAAGGGCAATTGCGCTATCAAGGCCCTGATGCAGCTGACCACAAAAGCCA
CAACCCAAATTGCCCCAAGACAGGTGGCTGGCTCTACCACACAGTACGATCACAAGGAAAGCT
GTAACGGCCTGTATTACCAGGGCAGCTGCTACATCCTGCATTCTGACTACAAGTCATTTGAGGAT
GCCAAGGCCAACTGCGCCGCCGAGAGCAGCACCCTGCCTAACAAGTCCGACGTGCTGACCAC
CTGGCTGATCGACTACGTGGAAGATACCTGGGGAAGCGATGGCAACCCCATCACCAAGACCAC
ATCCGACTATCAGGATAGCGACGTGTCTCAGGAGGTGCGCAAGTACTTTTGTACCAGCGCAAAT
AAAGCCGCCATCACAGACAGCGCTGTCGCCGTGGCCGCCGCCAGCTCAACACACAGAAAAGT
GGTGTCCAGTACGACCCAGTACGACCACAAGGAATCTTGTAATGGCCTGTACTACCAGGGATCT
TGCTACATCCTGCACAGCGACTACAAGAGCTTCGAGGATGCCAAGGCCAACTGCGCCGCCGAA
AGCAGCACCCTGCCCAACAAGAGCGATGTGCTGACAACCTGGCTCATCGACTATGTCGAGGAC
ACCTGGGGCAGCGACGGTAACCCTATCACCAAAACCACAAGCGATTACCAGGACTCTGATGTG
TCCCAAGAAGTGCGGAAGTACTTCTGCACC
SEQ ID NO:6(编码如SEQ ID NO:4所示的MAA的mRNA序列)
GCCGCUGCCUCUAUCCAAACAACCGUGAAUACCCUGAGCGAGAGAAUCUCCUCCAAGCUUG
AGCAGGAGGCCAACGCCAGCGCUCAGACAAAGUGCGACAUCGAGAUCGGCAACUUCUACAU
CAGACAGAACCACGGCUGCAAUAUCACCGUGAAGAACAUGUGCAGCGCUGACGCCGACGCC
CAGCUGGACGCCGUGCUGUCUGCCGCUACCGAAACCUACAGCGGCCUGACACCUGAGCAGA
AAGCCUACGUUCCUGCCAUGUUCACCGCCGCCCUGAACAUUCAGACAAGCGUGAACACCGU
GGUGCGGGACUUCGAGAACUACGUGAAGCAGACCUGUAACAGCAGCGCCGUGGUGGACAA
CAAGCUGAAGAUCCAGAAUGUGAUCAUCGACGAGUGCUACGGCGCUCCCGGCAGCCCUACC
AACCUGGAGUUCAUCAACACAGGCUCUAGCAAGGGCAAUUGCGCUAUCAAGGCCCUGAUGC
AGCUGACCACAAAAGCCACAACCCAAAUUGCCCCAAGACAGGUGGCUGGCUCUACCACACA
GUACGAUCACAAGGAAAGCUGUAACGGCCUGUAUUACCAGGGCAGCUGCUACAUCCUGCAU
UCUGACUACAAGUCAUUUGAGGAUGCCAAGGCCAACUGCGCCGCCGAGAGCAGCACCCUGC
CUAACAAGUCCGACGUGCUGACCACCUGGCUGAUCGACUACGUGGAAGAUACCUGGGGAAG
CGAUGGCAACCCCAUCACCAAGACCACAUCCGACUAUCAGGAUAGCGACGUGUCUCAGGAG
GUGCGCAAGUACUUUUGUACCAGCGCAAAUAAAGCCGCCAUCACAGACAGCGCUGUCGCCG
UGGCCGCCGCCAGCUCAACACACAGAAAAGUGGUGUCCAGUACGACCCAGUACGACCACAA
GGAAUCUUGUAAUGGCCUGUACUACCAGGGAUCUUGCUACAUCCUGCACAGCGACUACAAG
AGCUUCGAGGAUGCCAAGGCCAACUGCGCCGCCGAAAGCAGCACCCUGCCCAACAAGAGCG
AUGUGCUGACAACCUGGCUCAUCGACUAUGUCGAGGACACCUGGGGCAGCGACGGUAACCC
UAUCACCAAAACCACAAGCGAUUACCAGGACUCUGAUGUGUCCCAAGAAGUGCGGAAGUAC
UUCUGCACC
SEQ ID NO:7(信号肽的氨基酸序列)
SEQ ID NO:8(实施例1中的MAA完整构建体的氨基酸序列)
SEQ ID NO:9(实施例1中的AA完整构建体的氨基酸序列)
SEQ ID NO:10(实施例1中的单一抗原M1肽段的氨基酸序列)
MGAAASIQTTVNTLSERISSKLEQEANASAQTKCDIEIGNFYIRQNHGCNITVKNMCS
ADADAQLDAVLSAATETYSGLTPEQKAYVPAMFTAALNIQTSVNTVVRDFENYVKQT
CNSSAVVDNKLKIQNVIIDECYGAPGSPTNLEFINTGSSKGNCAIKALMQLTTKATTQI
APRQVAG
SEQ ID NO:11(实施例1中的单一抗原A35肽段的氨基酸序列)
MSTTQYDHKESCNGLYYQGSCYILHSDYKSFEDAKANCAAESSTLPNKSDVLTTWLI
DYVEDTWGSDGNPITKTTSDYQDSDVSQEVRKYFCT
SEQ ID NO:12(编码MAA完整构建体的核苷酸序列)
SEQ ID NO:13(编码AA完整构建体的核苷酸序列)
/>
SEQ ID NO:14(编码单一抗原M1肽段(即，SEQ ID NO:10)的核苷酸序列)
atgggagcagctgcgtcaatacaaacaactgtaaacaccctgagcgaacgtattagctccaaacttgagcaagaggcaaacgcgagcgcgcaaacgaaatgcgatattgagatcggcaacttctatatccgccaaaatcacggttgtaatattaccgtcaagaacatgtgcagcgcggacgcggacgcgcagctggacgccgttttgtctgcagcgaccgaaacctattccggtctgaccccggagcagaaagcgtacgttccggctatgttcaccgcagcactcaatatccaaaccagcgtcaataccgttgttcgtgattttgaaaattacgtgaagcagacgtgcaactcctcggcggtggtggataacaaactgaagatccaaaacgtgattatcgacgaatgttacggcgctccgggttctccgaccaacttggagtttatcaacactggcagcagcaaaggcaactgcgctattaaggcgctgatgcagctgactacaaaggcgaccacgcagatcgccccacgtcaggtggccggt
SEQ ID NO:15(编码单一抗原A35肽段(即，SEQ ID NO:11)的核苷酸序列)
atgtcaactacacaatatgatcacaaagaaagttgcaacggcttatattatcagggttcttgttatatcctgcacagcgactacaagtcttttgaggatgcgaaagctaactgcgcggcagaaagcagcaccctgccgaataagtccgacgtgttgaccacgtggctgatcgattacgtggaagatacctggggttccgacggcaacccgattaccaaaactacgagcgactaccaggatagcgacgtttcgcaagaggttcgtaaatacttctgcacc

Claims (22)

1.一种痘病毒重组嵌合抗原，其特征在于，所述重组嵌合抗原包含：
(1)猴痘病毒A35蛋白或其抗原性片段，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；和
(2)猴痘病毒M1蛋白或其抗原性片段，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的痘病毒重组嵌合抗原，其特征在于，所述A35蛋白的抗原性片段为该蛋白的胞外段或其一部分；
和/或，所述M1蛋白的抗原性片段为该蛋白的胞外段或其一部分。
3.根据权利要求1或2所述的痘病毒重组嵌合抗原，其特征在于，所述重组嵌合抗原为单链形式，每条所述重组嵌合抗原链中，包含：2个以上所述猴痘病毒A35蛋白或其抗原性片段，其氨基酸序列相同或不同；和，1个以上所述猴痘病毒M1蛋白或其抗原性片段。
4.根据权利要求3所述的痘病毒重组嵌合抗原，其特征在于，所述重组嵌合抗原包含2个所述A35蛋白或其抗原性片段和1个所述M1蛋白或其抗原性片段；
优选地，所述重组嵌合抗原为单链二聚体结构。
5.根据权利要求4所述的痘病毒重组嵌合抗原，其特征在于，所述重组嵌合抗原包括按照M-C1-A1-C2-A2样式排列的氨基酸序列，其中：
M表示猴痘病毒M1蛋白或其抗原性片段，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，
A1表示猴痘病毒A35蛋白或其抗原性片段I，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，
A2表示猴痘病毒A35蛋白或其抗原性片段II，或与其具有至少90％，92％，95％，96％，97％，98％或99％同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，
C1、C2各自独立地为无，或者连接序列(GGGGS)n，其中，n为1-10之间的任意整数；并且，
其中，
A1与A2相同或不同，
C1和C2相同或不同。
6.根据权利要求5所述的痘病毒重组嵌合抗原，其特征在于，所述M表示如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
和/或，所述A1表示如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
和/或，所述A2表示如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列加上由其向A35R蛋白的N端延伸1-30个氨基酸的片段的氨基酸序列，或者由上述氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；优选地，所述A2表示如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或者如SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的、与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的痘病毒重组嵌合抗原，其特征在于，所述M表示如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列，所述A1表示如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，并且，所述A2表示如SEQID NO:2或如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
优选地，所述C1、C2均为无；
进一步优选地，所述重组嵌合抗原包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求1-7任一项所述的痘病毒重组嵌合抗原，其特征在于，所述重组嵌合抗原的N端还包含信号肽序列；可选地，所述信号肽序列如SEQ ID NO:7所示；
和/或，所述重组嵌合抗原的C端还包含标签序列；可选地，所述标签选自Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签、SUMO标签中的至少一种，优选为His标签。
9.一种如权利要求1-7任一项所述重组嵌合抗原的制备方法，其包括以下步骤：在编码如权利要求1-7任一项所述重组嵌合抗原的核苷酸序列的5’端加上Kozak序列以及信号肽的编码序列，3’端加上组氨酸标签的编码序列和终止密码子，进行克隆表达，筛选正确的重组子，然后将其转染表达系统细胞进行表达，收集细胞培养上清，从中分离获得所述重组嵌合抗原。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述表达系统细胞为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞；
可选地，所述哺乳动物细胞为HEK293T细胞、293F系列细胞或CHO细胞；进一步可选地，所述293F系列细胞为HEK293F细胞、Freestyle293F细胞或Expi293F细胞；
可选地，所述昆虫细胞为sf9细胞、Hi5细胞、sf21细胞或S2细胞；
可选地，所述酵母细胞为毕赤酵母细胞或者由其改造的酵母细胞；
可选地，所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。
11.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-8任一项所述的重组嵌合抗原。
12.根据权利要求11所述的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸为DNA或mRNA；
优选地，所述多核苷酸包含如SEQ ID NO:5所示的DNA序列；
优选地，所述多核苷酸包含如SEQ ID NO:6所示的mRNA序列。
13.一种核酸构建体，其包含如权利要求11或12所述的多核苷酸，以及任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。
14.一种表达载体，其包含如权利要求13所述的核酸构建体。
15.一种宿主细胞，其中转化或转染有如权利要求11或12所述的多核苷酸、如权利要求13所述的核酸构建体或如权利要求14所述的表达载体。
16.如权利要求1-8任一项所述的重组嵌合抗原、如权利要求11或12所述的多核苷酸、如权利要求13所述的核酸构建体、如权利要求14所述的表达载体或如权利要求15所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗痘病毒感染的药物中的应用；
优选地，所述痘病毒选自：猴痘病毒、天花病毒、牛痘病毒和/或痘苗病毒；
可选地，所述药物为疫苗，优选为重组蛋白疫苗；进一步优选地，所述重组蛋白疫苗采用选自以下的佐剂：铝佐剂、MF59佐剂和类MF59佐剂；
可选地，所述疫苗为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、颗粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂和膏剂；进一步优选地，所述片剂为舌下片；进一步优选地，所述颗粒剂为细粒剂；进一步优选地，所述粉末剂为散剂；进一步优选地，所述丸剂为小丸剂；
优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射制剂；进一步优选地，所述可注射制剂为可推注制剂。
17.一种疫苗或免疫原性组合物，其包含如权利要求1-8任一项所述的重组嵌合抗原、如权利要求11或12所述的多核苷酸、如权利要求13所述的核酸构建体、如权利要求14所述的表达载体或如权利要求15所述的宿主细胞，以及生理学可接受的媒介物、佐剂、赋形剂、载体和/或稀释剂。
18.根据权利要求17所述的疫苗或免疫原性组合物，其为猴痘病毒重组蛋白疫苗，其包括如权利要求1-8任一项所述的重组嵌合抗原和佐剂；
可选地，所述佐剂为选自以下佐剂中的一种或多种：铝佐剂、MF59佐剂和类MF59佐剂。
19.根据权利要求17所述的疫苗或免疫原性组合物，其为猴痘病毒DNA疫苗，所述DNA疫苗包括：
(1)真核表达载体；和
(2)构建入所述真核表达载体中的、编码如权利要求1-8任一项所述的重组嵌合抗原的DNA序列，优选为如SEQ ID NO:5所示的DNA序列；
可选地，所述真核表达载体选自pGX0001、pVAX1、pCAGGS和pcDNA系列载体。
20.根据权利要求17所述的疫苗或免疫原性组合物，其为猴痘病毒mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包括：
(I)编码如权利要求1-8任一项所述的重组嵌合抗原的mRNA序列，优选为如SEQ IDNO:6所示的mRNA序列；和
(II)脂质纳米颗粒。
21.根据权利要求17所述的疫苗或免疫原性组合物，其为猴痘病毒-病毒载体疫苗，其包括：
(1)病毒骨架载体；和
(2)构建入所述病毒骨架载体中的、编码如权利要求1-8任一项所述的重组嵌合抗原的DNA序列，优选为如SEQ ID NO:5所示的DNA序列；
可选地，所述病毒骨架载体选自以下病毒载体中的一种或几种：腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体、腺相关病毒载体。
22.根据权利要求17-21任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其特征在于，所述疫苗或免疫原性组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式；
优选地，所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂；
优选地，所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、颗粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂和膏剂；
进一步优选地，所述片剂为舌下片；
进一步优选地，所述颗粒剂为细粒剂；
进一步优选地，所述粉末剂为散剂；
进一步优选地，所述丸剂为小丸剂；
优选地，所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射制剂；进一步优选地，所述可注射制剂为可推注制剂。
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CN117756949A (zh) * 2024-02-21 2024-03-26 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种正痘病毒属融合抗原及应用

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