CN117942392A - 一种呼吸道合胞病毒核酸疫苗及其应用 - Google Patents

一种呼吸道合胞病毒核酸疫苗及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117942392A
CN117942392A CN202311522766.1A CN202311522766A CN117942392A CN 117942392 A CN117942392 A CN 117942392A CN 202311522766 A CN202311522766 A CN 202311522766A CN 117942392 A CN117942392 A CN 117942392A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rsv
protein
vaccine
seq
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311522766.1A
Other languages
English (en)
Inventor
高福
王奇慧
齐建勋
杜沛
马雪慧
李晶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Microbiology of CAS
Original Assignee
Institute of Microbiology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Microbiology of CAS filed Critical Institute of Microbiology of CAS
Priority to CN202311522766.1A priority Critical patent/CN117942392A/zh
Publication of CN117942392A publication Critical patent/CN117942392A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1027—Paramyxoviridae, e.g. respiratory syncytial virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及预防呼吸道合胞病毒感染的核酸疫苗及其应用。本发明基于RSV A、B两种亚型毒株的F蛋白序列，通过去除post‑F特有I、IV表位序列及pre‑F、post‑F共有的III表位部分序列，分别获得A、B两种亚型的mRNA疫苗；以及将A和B两种亚型的mRNA疫苗串联在一起形成串联二价的DNA疫苗或mRNA疫苗或者含所述DNA的病毒载体疫苗。本发明使用构建的核酸疫苗，能更好的应对目前不同的RSV病毒，且不产生VDE效应，减少炎症发生。在同一疫苗中使用两种不同的Pre‑F，能够使其免疫原性进行优势互补，更好的产生广谱的免疫反应。

Description

一种呼吸道合胞病毒核酸疫苗及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及预防呼吸道合胞病毒感染的核酸疫苗及其应用。
背景技术
呼吸道合胞病毒(RSV，Respiratory syncytial virus)是全球最常见的导致婴幼儿下呼吸道感染的病原微生物之一。RSV属于副粘病毒科、肺病毒属，其基因组为单股负链病毒，全长15.2Kb，编码11个病毒蛋白。根据RSV病毒的基因组序列，将其分为A和B两种亚型。RSV主要有A和B两种亚型，之前的疫苗大多是单亚型的，A和B的F蛋白也有多个氨基酸突变，对于其他毒株，其广谱性会大大降低。此外，mRNA疫苗可以将抗原转译到宿主细胞，同时促进不稳定抗原的有效表达，mRNA疫苗具有抗原表达效率高、安全性高、免疫原性强、同时激活体液免疫和细胞免疫的优点。
呼吸道合胞病毒入侵宿主的第一步是识别宿主细胞的表面抗原，通过病毒的粘附蛋白(attachment，简称G)和融合蛋白(Fusion，简称F)共同促进识别并结合宿主受体，然后通过此途径进入细胞。目前RSV疫苗大多以肌注免疫为主，但RSV病毒作为呼吸道病毒，容易引起上呼吸道和下呼吸道感染，所以更改免疫方式，提高机体的黏膜免疫反应将会促进免疫效果。因此我们在做两针mRNA疫苗肌注的同时，增加了mRNA肌注+蛋白滴鼻的免疫方式。该方式将会大大提高肺部黏膜免疫抗体的分泌，从而保护呼吸道避免病毒侵染。并且通过FI-RSV灭活苗作为对照，评价不同的免疫方式是否会降低RSV疫苗免疫后产生的VDE(Vaccine-enhanced disease)作用。
由于呼吸道合胞病毒具有AB两种亚型，而且国内不同地区A和B亚型的感染率也不同，如2014-2015年重庆的呼吸道合胞病毒流调感染情况，A亚型71例(35.5％),B亚型129例(64.5％)。因此新的RSV疫苗需要包含A和B亚型抗原，以此来增加疫苗的广谱性，避免免疫逃逸。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明人通过研究在于RSVF蛋白序列进行改造而获得核酸疫苗进而完成本发明。
本发明主要目的是提高疫苗的免疫原性，通过去除了post-F特有的I、IV表位及pre-F、post-F共有的III表位部分，保留Pre-F的表位，提高疫苗诱导抗体的效率；同时利用核酸疫苗的特性，诱导相对于重组蛋白疫苗更强的细胞免疫反应。
本发明提供一种呼吸道合胞病毒核酸疫苗，所述核酸疫苗是DNA疫苗、mRNA疫苗或病毒载体疫苗(优选腺病毒载体疫苗)，所述核酸疫苗对应编码下述蛋白：对RSV A2毒株的F蛋白去除了post-F特有的I、IV表位及pre-F、post-F共有的III表位部分的RSV F蛋白单体；具体是，去除了post-F特有的I、IV表位及pre-F、post-F共有的III表位部分的RSV A、RSV B两种亚型毒株的F蛋白单体；
或者其以两个或多个蛋白单体串联在一起得到串联蛋白；具体是所述RSV A的F蛋白单体多个(例如，二个、三个、四个、五个、六个)串联得到串联蛋白；具体是所述RSV B的F蛋白单体多个(例如，二个、三个、四个、五个、六个)串联得到串联蛋白；或者所述RSV A的F蛋白单体一个或多个(例如，二个、三个、四个、五个、六个)与所述RSV B的F蛋白单体一个或多个(例如，二个、三个、四个、五个、六个)串联在一起得到的串联蛋白。
在具体实施方式中，根据RSV A毒株的F蛋白序列(优选地其如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，从N27开始，前M1-Q26为信号肽)，去除了N104-V144段(具体是如SEQ ID NO：2所示)和V308-S552段(具体是如SEQ ID NO：3所示)；将T103与G145之间插入linker序列(例如GS两个氨基酸)链接，将S35突变为T，C37突变为A，E92突变为D，S215突变为P，得到包含pre-F特有的V和表位以及pre-F、post-F共有的II表位和只含有V40-L45(VSKGYL)氨基酸序列的III表位的RSV A2 F蛋白单体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
或者，将RSV B9320毒株的F序列(如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列，从N27开始，前M1-Q26为信号肽)同样处理，去除了N104-L142段(如SEQ ID NO：8所示)和V308-S552段(如SEQ ID NO：9所示)；将C37突变为A，T97突变为M，S197突变为N，Q202突变为R，K226突变为M，得到包含pre-F特有的V和表位以及pre-F、post-F共有的II表位和只含有V40-L45(VSKGYL)氨基酸序列的III表位的RSV B毒株F蛋白单体(具体的，如SEQ ID NO：10所示)。
更具体地，所述RSV A毒株F蛋白单体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述RSVB毒株F蛋白单体的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
在一个具体实施方式中，所述串联蛋白是将所获得的RSV A毒株F蛋白单体的氨基酸序列以两个串联在一起得到；
或者所述串联蛋白是将所获得的RSV A毒株F蛋白单体的氨基酸序列和RSV B毒株F蛋白单体的氨基酸序列串联在一起得到；
或者所述串联蛋白是将RSV B毒株F蛋白单体的氨基酸序列以两个串联在一起得到。
在一个极具体的实施方式中，所述串联蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13所示。
本发明也提供所述的核酸疫苗为有效成分和脂质体组成的核酸疫苗组合物；优选地，通过脂质体包裹所述mRNA得到。
本发明还提供所述的核酸疫苗在制备用于免疫动物获得针对呼吸道合胞病毒抗体的试剂中的应用。
本发明进一步提供含有编码所述核酸疫苗的DNA分子或其重组表达载体在制备预防或治疗呼吸道合胞病毒感染的核酸疫苗中的应用；
优选地，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：12或SEQ IDNO：14所示。
在具体实施方式中，所述重组表达载体为哺乳动物细胞表达载体如pCAGGS载体；优选地，通过将其导入重组宿主细胞进行表达获得核酸疫苗；更优选地，所述重组宿主细胞哺乳动物细胞如293F细胞。
本发明还提供含有所述的核酸疫苗的重组宿主细胞在制备预防或治疗呼吸道合胞病毒感染的核酸疫苗中的应用；所述重组宿主细胞哺乳动物细胞如293F细胞。
与现有技术例如FI-RSV疫苗相比，本发明的优点在于使用多种构建序列，能更好的应对目前不同的RSV病毒，且不产生VDE效应，减少炎症发生。同时，在同一疫苗中使用两种不同的Pre-F，能够使其免疫原性进行优势互补，更好的产生广谱的免疫反应。此外，我们使用不同的免疫方式比较了两针肌注和一针肌注加一剂滴鼻对小鼠的免疫效果。结果显示含滴鼻的免疫方式对小鼠肺部的保护效果更好。
附图说明
图1为免疫原设计构建。其中，AA，AB，BB，DS-Cav1是对照组。
图2为AA，AB，BB，DS-Cav1 mRNA转染后表达验证。
图3为免疫程序和时间线。
图4为AA，AB，BB mRNA疫苗在第一针免疫第28天后产生结合A和B的抗体。
图5为AA，AB，BB mRNA疫苗在第一针免疫第28天后激发针对A，B以及DS-Cav1多肽的细胞免疫。
图6为AA，AB，BB mRNA疫苗在第一针免疫第28天后产生有效的针对A和B病毒的中和抗体。
图7为AA，AB，BB mRNA疫苗在二免14天攻毒五天后的小鼠肺和鼻进行RT-qPCR检测病毒载量。
图8为滴鼻in和肌注im不同免疫方式的AB，DS-Cav1，FI-RSV，LNP组二免14天后的血清对RSV-Long-GFP株的中和实验结果。
图9滴鼻in和肌注im不同免疫方式的AB，DS-Cav1，FI-RSV，LNP组在攻毒后对小鼠体重进行5天监测结果。
图10为攻毒后第5天取肺组织进行研磨后提RNA进行RT-qPCR检测肺部病毒载量。
图11为攻毒后第五天取肺组织进行流式抗体染色后检测肺部嗜酸性粒细胞结果。
图12为攻毒后第五天取肺组织进行流式抗体染色后检测肺部CD4细胞结果。
图13为攻毒后第五天取肺组织进行流式抗体染色后检测肺部CD8细胞结果。
图14为攻毒后第五天取肺组织并立即泡入4％组织固定液中进行HE染色检测肺部病理状态图。
图15为根据HE染色后的病理状态进行肺部损伤评分。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明，但并不应理解为对本发明的限制。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域技术人员所熟知的常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一：RSVF mRNA疫苗序列和制备
1)根据RSV A2毒株的F蛋白序列(如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，从N27开始，前M1-Q26为信号肽)，去除了N104-V144段(如SEQ ID NO：2所示)和V308-A552段(如SEQ IDNO：3所示)；将T103与G145之间插入linker序列(GS两个氨基酸)链接，将S35突变为T，C37突变为A，E92突变为D，S215突变为P，得到包含pre-F特有的V和表位以及pre-F、post-F共有的II表位和只含有V40-L45(VSKGYL)氨基酸序列的III表位的RSV A2F蛋白单体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示(如SEQ ID NO：4所示)，再将所获得的新的RSVF蛋白单体的氨基酸序列以两个串联在一起(如SEQ ID NO：5所示)，经密码子优化后得到呼吸道合胞病毒抗原编码基因(如SEQ ID NO：6所示)。相应mRNA疫苗称为AA mRNA疫苗。
2)根据RSV A2F蛋白单体的氨基酸序列(如SEQ ID NO：4所示)，将RSV B9320毒株的F序列(如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列，从N27开始，前M1-Q26为信号肽)同样处理，去除了N104-L142段(如SEQ ID NO：8所示)和V308-S552段(如SEQ ID NO：9所示)；将C37突变为A，T97突变为M，S197突变为N，Q202突变为R，K226突变为M，得到包含pre-F特有的V和表位以及pre-F、post-F共有的II表位和只含有V40-L45(VSKGYL)氨基酸序列的III表位的RSVB9320 F蛋白单体。
获得不包含post-F特有的I、IV表位及pre-F、post-F共有的III表位部分的RSV BF蛋白单体的氨基酸序列(如SEQ ID NO：10所示),将这两个AB单体氨基酸序列串联在一起(如SEQ ID NO：11所示)，经密码子优化后得到RSV F蛋白串联的编码基因(如SEQ ID NO：12所示)，相应的mRNA疫苗称为AB mRNA疫苗。
3)根据RSV B9320毒株的F蛋白序列(如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列，从N27开始，前M1-Q26为信号肽)，得到包含pre-F特有的V和表位以及pre-F、post-F共有的II表位和只含有V40-L45(VSKGYL)氨基酸序列的III表位的蛋白单体的氨基酸序列(如SEQ ID NO：10所示)，所获得的新的RSV B F蛋白单体的氨基酸序列以两个串联在一起(如SEQ ID NO：13所示)经密码子优化后得到RSV F蛋白串联的编码基因(如SEQ ID NO：14所示)。相应mRNA疫苗称为BB mRNA疫苗(图1)。
4)mRNA疫苗的体外转录和加帽
实施例1中制备的体外转录质粒上包括mRNA疫苗的编码DNA，包括编码二聚体RBD免疫原的编码区，在编码区上游的5’端UTR序列，下游的3’UTR序列和多聚腺苷酸尾(Poly-Atail)。
首先，使用限制性内切酶对包含有体外转录质粒进行酶切，将其线性化；使用常规DNA纯化方法进行纯化，获得体外转录的模板；然后，使用体外转录试剂盒进行体外转录，具体实验操作见苏州近岸蛋白质科技股份有限公司生产的T7RNA转录试剂盒(E131-01A)说明书。获得体外转录的mRNA。最后，使用常规RNA纯化方法，如氯化锂沉淀法对mRNA进行纯化。具体操作见苏州近岸蛋白质科技股份有限公司生产的氯化锂回收试剂盒(S125)。获得提纯的体外转录mRNA，使用加帽酶试剂盒对mRNA进行5’端Cap1加帽，使其满足在真核细胞内被翻译的条件。具体实验操作见苏州近岸蛋白质科技股份有限公司生产的Cap1加帽酶试剂盒(M082-01B)说明书。最后，使用上述相同的氯化锂沉淀法对mRNA进行再次纯化。
5)纳米脂质体(Lipid nanoparticle,LNP)包装mRNA
将阳离子脂质、磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG脂质按照50：10：38.5：1.5的比例进行混合，使用Precision Nano Systems公司生产的Nanoassemblr Benchtop纳米脂质体包装仪与修饰的mRNA进行混合、包装。包装完成后，使用离心或透析的方法更换缓冲溶液为PBS。完成包装后使用Thermo Fisher公司的Quan-iT Ribogreen RNA reagent试剂盒对mRNA包装效率进行鉴定。
通过上述方法获得纳米脂质体包装的AA mRNA、AB mRNA和BB mRNA，用于后续实验。
6)mRNA表达验证
用TransIT-mRNA(Mirus Bio)转染HEK293T细胞。将mRNA(1μg)与TransIT-mRNA试剂(2μl)和增强试剂(2μl)一起加入到100ul无血清的Opti-MEM中。混合物室温放置2min，然后滴加入在12孔板的HEK293T细胞。转染36h后收集上清液，并在-20℃保存至使用。免疫印迹时，上清样品与含DTT的loading混合煮沸10min，用10％SDS-PAGE分离，用转膜槽转移到PVDF膜上。随后，用PBST缓冲液稀释的5％脱脂牛奶封闭膜，用AM22一抗孵育1小时，用山羊抗人IgG-HRP二抗孵育1小时。最后，使用Beyotime BeyoECL Plus(Beyotime)对该膜显色(图2)。
实施例2：实验动物免疫和样品采集
两针肌注：使用6-8周龄的BALB/c品系的雌性小鼠进行动物实验，实验分组为免疫组和对照组。图3为免疫程序，免疫组的所有小鼠在第0天和第14天分别免疫同一种设计的mRNA疫苗，对照组的小鼠在同样的时间注射空的LNP。接种方法为肌肉注射，接种剂量为每只小鼠每次5μg mRNA疫苗。血清样本分别在第14天和第28天采集，用于检验血清抗体滴度和假病毒中和。脾脏样本在第21天采集，用于检验T细胞免疫。第35天进行攻毒1*106PFU/只，5天后取肺和鼻甲骨，进行病毒载量检测。
一针mRNA肌注+一次蛋白滴鼻：使用6-8周龄的BALB/c品系的雌性小鼠进行动物实验，实验分组为免疫组和对照组。免疫组的所有小鼠在第0天分别肌肉注射免疫AB，DS-Cav1的mRNA疫苗，以及FI-RSV灭活苗，对照组的小鼠在同样的时间注射空的LNP。接种剂量为每只小鼠每次5μg mRNA疫苗以及FI-RSV 2*106PFU/只。第14天分别滴鼻AB，DS-Cav1的蛋白苗，以及FI-RSV灭活苗，对照组的小鼠在同样的时间滴鼻PBS。小鼠每次5μg蛋白疫苗以及FI-RSV 2*106PFU/只。血清样本分别在第14天和第28天采集，用于检验血清抗体滴度和假病毒中和。第35天进行攻毒1*106PFU/只。5天后取肺，进行病毒载量检测，HE病理检测，流式分析。
实施例3：小鼠血清抗体滴度的检验
1)ELISA检测抗体滴度
用呼吸道合胞病毒的2种亚型(A2，B)的pre-F重组蛋白AA，AB，BB，DS-Cav1(2μg/ml)包被ELISA板。将包被好的板在5％脱脂牛奶中封闭。然后，将所有实验组的小鼠采集的血清在56℃孵育30分钟进行灭活。血清样本从1:200或1:1000开始进行三倍梯度稀释，然后加入每个孔，随后将板在37℃下孵育1小时。将山羊抗小鼠IgG-HRP抗体添加到板中作为二抗，并在37℃下再次孵育1小时。最后，用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物进行显色，显色完成后用2M盐酸终止反应，使用酶标仪(PerkinElmer)测量450nm和630nm处的吸光度。通过从同一孔的450nm处的吸光度减去630nm处的吸光度来计算吸光度值。终点滴度定义为血清的最高倒数稀释度以产生大于背景值2.1倍的吸光度。低于检测限的抗体滴度定义为检测限的三分之一。图4是AA，AB，BB的小鼠结合抗体滴度的检验，其中可知AA，AB，BB mRNA疫苗在第一针免疫第28天后，能产生结合A和B的抗体(相比阴性对照LNP组提升>1000倍)。
2)ELISA检测所需的蛋白表达纯化
将所得到呼吸道合胞病毒抗原编码基因序列克隆到pCAGGS载体，得到pCAGGS-新F抗原二聚体质粒。再将质粒转染到293F细胞表达系统进行表达。使用Superdex200Increase10/300(GE)分子筛进行层析，收集13.5ml附近的洗脱峰进行SDS-PAGE分析。洗脱体积13.5ml附近的蛋白在非还原条件下(不加DTT)和还原条件下(加DTT)大小均约为55Kd，证明该洗脱峰获得的蛋白质AA，AB，BB，DS-Cav1。该蛋白作为抗原包被ELISA板。
实施例4：mRNA疫苗诱导细胞免疫水平的评价
1)小鼠脾脏样品处理
用细胞匀浆器在1ml无血清DMEM中将小鼠脾脏细胞制备成单细胞匀浆，用40μm细胞过滤器过滤，用红细胞裂解缓冲液裂解红细胞。细胞经过清洗后，用AOPI溶液染色，使用Count star自动细胞计数器进行计数。
2)ELISpot检验
将新鲜的小鼠脾脏单细胞悬液(3×105/孔)加入96孔板，用RSV病毒A2和B两种亚型的Pre-F构造的肽库刺激细胞18-21小时(每种肽2μg/ml)。阳性对照孔用植物血凝素(PMA)刺激产生非特异细胞免疫反应，阴性对照孔不用肽库刺激。然后，丢弃细胞，并用生物素化的IFNγ抗体、链霉亲和素-HRP抗体和显色底物先后孵育96孔板。当板底显现斑点后，用去离子水彻底冲洗样品，停止显色。最后，使用Immuno Capture 6.5.0拍照并对斑点数量进行计数。结果如图5，二免后实验组AA，AB，BB，DS-Cav1的IFNγ分泌水平达到102，且水平相当，而LNP组几乎为0。
实施例5：呼吸道合胞病毒血清活毒中和
1)小鼠血清对假病毒抑制效果评价
将灭活后的血清样本进行稀释，从1:80开始进行2倍梯度稀释。然后，将每种病毒与等体积的稀释后血清混合，在37℃下孵育1小时。取100μl病毒-血清混合物加入到96孔板中预铺板的Hep2细胞上。37℃孵育1小时后，去除混合物，用2％甲基纤维素和2×DMEM 1:1混合物替换，每孔100μl，继续培育三天。随后去除该混合物，PBS清洗一遍后，用4％组织固定液室温固定30分钟，去除固定液后用PBS清洗一遍，再用5％脱脂牛奶封闭37℃1h。随后用AM22作为一抗孵育，浓度为2ug/ml，37℃1h后PBS洗三遍，加入抗人的二抗HRP，37℃孵育1h后PBS洗三遍，最后，用沉淀型3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物进行显色，通过数孔中的斑点，计算其血清的中和效果。如图6是两针肌注二免14天后血清中和评价，表明AA，AB，DS-Cav1具有较强的中和作用，对于不同毒株的中和水平显示达到103左右，具有显著的广谱性，而BB中和能力弱于其他组，其中和能力在102.5左右。
图8是AB，DS-Cav1以及FI-RSV灭活苗的两针肌注和一针肌注+滴鼻的免疫方式二免后的血清中和，结果表明AB和DS-Cav1组中和能力显著高于FI-RSV组10倍左右，对于AB滴鼻组，其中和水平略高于两针肌注组5倍左右。
实施例6：mRNA疫苗免疫后攻毒的评价
1)病毒载量检测
在二免后第三周，通过滴鼻小鼠进行RSV A(1*106/只)的感染，感染五天后，取小鼠的肺和鼻称重后加培养基至0.1g/mL进行研磨，8000rpm离心后取上清，取200uL上清通过试剂盒提病毒RNA。随后，使用TaKaRa一步法RT-PCR试剂盒对病毒RNA进行检测，通过QuantStudioTMDesign&Analysis对肺和鼻部的RNA进行定量分析。图7为两针肌注AA，AB，BB，DS-Cav1以及LNP组攻毒后肺和鼻的病毒载量检测，结果表明AA，AB，BB，DS-Cav1组在肺部的保护水平相当，相比LNP组下降了约100-500倍，对于鼻部的保护，AA组比AB，BB，DS-Cav1组下降了约5倍。
图10是AB，DS-Cav1以及FI-RSV灭活苗的两针肌注和一针肌注+滴鼻的免疫方式二免后攻毒检测肺部病毒载量，结果表明AB和DS-Cav1相对LNP组病毒载量下降了约1000倍，且保护效果显著强于FI-RSV组。另外AB和DS-Cav1滴鼻组的保护效果好于两针肌注,病毒载量下降了约5-10倍。
2)体重监测
攻毒后每天对小鼠体重进行称重，结果显示，FI-RSV的肌注和滴鼻组的体重下降最为明显，肌注FI-RSV组下降20％，滴鼻FI-RSV组下降约15％，而AB和DS-Cav1组体重下降趋势与LNP组类似，下降5％左右(图9)。
3)流式分析
将肺取出后，在1640培养基中剪碎，随后用消化液在37度摇床消化30分钟，将其放在70um的筛网上按压过滤，制备单细胞悬液。首先用CD16/32对其非特异性位点进行封闭，再用标记CD4、CD8、以及嗜酸性粒细胞的流式抗体分别对每个样品进行染色30分钟，经三次PBS洗涤后用400uL PBS重悬，在BD Fortessa上进行流式分析，最后在Flow jo软件进行数据处理。
图11为嗜酸性粒细胞分选比例，肌注FI-RSV组的嗜酸性粒细胞比例是LNP组和其他实验组的2-3倍。图12为CD4细胞的比例，结果表明，FI-RSV肌注组和滴鼻组CD4细胞比例高于其他实验组20-30％，图13是CD8细胞比例，结果显示该比例是其他实验组的1/2，这些结果表明FI-RSV会导致小鼠攻毒后炎症增强。
4)HE病理检测
将肺取出后，立即将肺叶泡入1.5mL 4％组织固定液中，并用棉花放在管内压住肺叶避免肺上浮。室温48h送往公司进行HE染色处理。病理扫片结果呈现出FI-RSV的滴鼻和肌注组都有严重的病理损伤，而LNP和其他实验组没有显著损伤，所以FI-RSV有VDE现象，而实验组AB，DS-Cav1没有VDE(图14)。
根据HE染色的病理损伤，通过对小鼠肺细支气管、血管炎症浸润以及肺部间质性肺炎进行评估，分为四个等级,分别是1级、2级、3级和4级。其中，1级表示小鼠肺部没有任何损伤，2级表示小鼠肺部有轻微的损伤，3级表示小鼠肺部中度损伤，4级表示小鼠肺部有重度的损伤。图15表明FI-RSV的肺部损伤最严重，而相对于肌注组，AB DS-Cav1滴鼻组的肺部损伤相对较轻，即AB和DS-Cav1的滴鼻组保护效果优于肌注组。

Claims (10)

1.一种呼吸道合胞病毒的核酸疫苗，所述核酸疫苗是DNA疫苗、mRNA疫苗或病毒载体疫苗（优选腺病毒载体疫苗），其特征在于，所述核酸疫苗中对应编码下述蛋白：对RSV A2毒株的F蛋白去除了post-F特有的I、IV表位及pre-F、post-F共有的III表位部分的RSV F蛋白单体；具体是，去除了post-F特有的I、IV表位及pre-F、post-F共有的III表位部分的RSV A、RSV B两种亚型毒株的F蛋白单体；
或者其以两个或多个蛋白单体串联在一起得到串联蛋白；具体是所述RSV A的F蛋白单体多个（例如，二个、三个、四个、五个、六个）串联得到串联蛋白；具体是所述RSV B的F蛋白单体多个（例如，二个、三个、四个、五个、六个）串联得到串联蛋白；或者所述RSV A的F蛋白单体一个或多个（例如，二个、三个、四个、五个、六个）与所述RSV B的F蛋白单体一个或多个（例如，二个、三个、四个、五个、六个）串联在一起得到的串联蛋白。
2.如权利要求1所述的核酸疫苗，其特征在于，
根据RSV A毒株的 F蛋白序列（优选地其如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，从N27开始，前M1-Q26为信号肽），去除了N104-V144段（具体是如SEQ ID NO：2所示）和V308-S552段（具体是如SEQ ID NO：3所示）；将T103与G145之间插入linker序列（例如GS两个氨基酸）链接，将S35突变为T，C37突变为A，E92突变为D，S215突变为P，得到包含pre-F特有的V和ø表位以及pre-F、post-F共有的II表位和只含有V40-L45(VSKGYL)氨基酸序列的III表位的RSV A毒株F蛋白单体；
优选地，去除了post-F特有的I、IV表位的氨基酸序列为F387-D392(FNPKYD)和K427-S436(KNRGIIKTFS)，及pre-F、post-F共有的III表位中的氨基酸序列为V40-L45(VSKGYL)以外的部分，RSV A毒株F蛋白单体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
或者，将RSV B9320毒株的F序列（如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列，从N27开始，前M1-Q26为信号肽）同样处理，去除了N104-L142段（如SEQ ID NO：8所示）和V308-S552段（如SEQID NO：9所示）；将C37突变为A，T97突变为M，S197突变为N，Q202突变为R，K226突变为M，得到包含pre-F特有的V和ø表位、pre-F、post-F共有的II表位和只含有V40-L45(VSKGYL)氨基酸序列的III表位的RSV B毒株F蛋白单体（具体的，如SEQ ID NO：10所示）。
3.如权利要求2所述的核酸疫苗，其特征在于，
所述RSV A毒株F蛋白单体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述RSV B毒株F蛋白单体的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
4.如权利要求2所述的核酸疫苗，其特征在于，
所述串联蛋白是将所获得的RSV A毒株F蛋白单体的氨基酸序列以两个串联在一起得到；
或者所述串联蛋白是将所获得的RSV A毒株F蛋白单体的氨基酸序列和RSV B毒株F蛋白单体的氨基酸序列串联在一起得到；
或者所述串联蛋白是将RSV B毒株F蛋白单体的氨基酸序列以两个串联在一起得到。
5.如权利要求4所述的核酸疫苗，其特征在于，所述串联蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13所示。
6.以如权利要求1至5任一项所述的核酸疫苗为有效成分和脂质体组成的核酸疫苗组合物；优选地，通过脂质体包裹所述mRNA得到。
7.如权利要求1至5任一项所述的核酸疫苗在制备用于免疫动物获得针对呼吸道合胞病毒抗体的试剂中的应用。
8.含有编码权利要求1至5中任一项所述的核酸疫苗的DNA分子或其重组表达载体在制备预防或治疗呼吸道合胞病毒感染的核酸疫苗中的应用；
优选地，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14所示。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，重组表达载体为哺乳动物细胞表达载体如pCAGGS载体；优选地，通过将其导入重组宿主细胞进行表达获得核酸疫苗；更优选地，所述重组宿主细胞哺乳动物细胞如293F细胞。
10.含有权利要求1至5任一项所述的核酸疫苗的重组宿主细胞在制备预防或治疗呼吸道合胞病毒感染的核酸疫苗中的应用；所述重组宿主细胞哺乳动物细胞如293F细胞。
CN202311522766.1A 2023-11-15 2023-11-15 一种呼吸道合胞病毒核酸疫苗及其应用 Pending CN117942392A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311522766.1A CN117942392A (zh) 2023-11-15 2023-11-15 一种呼吸道合胞病毒核酸疫苗及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311522766.1A CN117942392A (zh) 2023-11-15 2023-11-15 一种呼吸道合胞病毒核酸疫苗及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117942392A true CN117942392A (zh) 2024-04-30

Family

ID=90793456

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311522766.1A Pending CN117942392A (zh) 2023-11-15 2023-11-15 一种呼吸道合胞病毒核酸疫苗及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117942392A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN116143938B (zh) 一种covid-19亚单位疫苗及其制备方法与应用
CN110054668B (zh) 一种呼吸道合胞病毒融合前f蛋白及其应用
EP0437604B1 (en) Recombinant poxvirus and streptococcal m protein vaccine
CN115925822B (zh) 一种重组蛋白及其在制备呼吸道合胞病毒疫苗中的应用
CN116286913B (zh) 痘病毒mRNA疫苗及用途
CN115947872B (zh) 新冠病毒三聚体嵌合疫苗及其用途
CN111548395A (zh) 一种口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒及其应用
CN116410992A (zh) 预防和/或治疗新型冠状病毒的mRNA、疫苗及其制备方法和应用
CN115725612A (zh) Rna、rna组合及其应用、多价猴痘疫苗
CN114702556A (zh) 一种冠状病毒rbd变异体及其应用
CN117964778A (zh) 一种非洲猪瘟病毒p14.5蛋白纳米颗粒及其制备方法和应用
CN116462754B (zh) 一种识别犬瘟热病毒n蛋白的单克隆抗体、检测试剂及应用
CN116024237A (zh) 一种用于预防裂谷热的mRNA疫苗及其制备方法
CN117942392A (zh) 一种呼吸道合胞病毒核酸疫苗及其应用
CN115725613A (zh) 针对新型冠状病毒delta突变株的mRNA疫苗及其制备方法和应用
CN114106157A (zh) 犬细小病毒纳米抗体cpv-vhh-e3及其应用
CN111166881A (zh) 一种重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗及其制备方法和应用
WO2024055273A1 (zh) 一种狂犬病mRNA疫苗、其制备及应用
CN118064456B (zh) 一种针对人合胞病毒的新型的RSV B mRNA疫苗
CN112250768B (zh) 牛副流感病毒重组抗原及其应用
CN118085043B (zh) 结核分枝杆菌多免疫原抗原、编码其的多核苷酸、应用
CN117357643B (zh) 一种用于预防呼吸道合胞病毒的疫苗及制备方法
CN118406158B (zh) 一种犬瘟热病毒抗原表位融合蛋白及其免疫球蛋白制备方法和应用
CN111676244B (zh) 以麻疹病毒为载体的麻疹、风疹联合疫苗
CN118440937A (zh) 新型的人合胞病毒RSV B mRNA疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination