CN110198736B

CN110198736B - 带状疱疹疫苗组合物

Info

Publication number: CN110198736B
Application number: CN201780080915.XA
Authority: CN
Inventors: 南效廷; 金恩美; 辛德香; S·G·里德; 刘强一; 洪性凖
Original assignee: Advanced Medical Access Research Institute; Mogam Institute for Biomedical Research
Current assignee: Advanced Medical Access Research Institute; Mogam Institute for Biomedical Research
Priority date: 2016-12-26
Filing date: 2017-12-20
Publication date: 2023-12-22
Anticipated expiration: 2037-12-20
Also published as: CA3048608A1; KR102034234B1; CA3048608C; KR20180075409A; BR112019013284A2; MA46310B1; JP2021054854A; KR20190117462A; US10940198B2; UA124397C2; PE20191547A1; JP6815521B2; JP2020512297A; KR102363359B1; CN110198736A; EP3560512A4; AU2017389221B2; EA201991575A1; PH12019550106A1; CO2019007795A2

Abstract

本发明涉及带状疱疹疫苗组合物，所述组合物包含水痘‑带状疱疹病毒的糖蛋白E、吡喃葡萄糖脂质佐剂和可代谢的油，所述组合物能选择性地增加细胞介导的免疫反应，并且没有减毒活疫苗的缺点，因此表现出高度安全性和对带状疱疹的高预防作用。

Description

带状疱疹疫苗组合物

技术领域

本发明涉及一种预防带状疱疹的疫苗组合物。

背景技术

初次感染水痘-带状疱疹病毒(VZV)引起水痘，特征为主要在面部和躯干上具有高度传染性的皮疹。在最初感染后，病毒DNA可以在宿主神经元细胞的细胞质中保持休眠多年。病毒可以重新激活，导致成人带状疱疹(带状疱疹或带状的疱疹)。

带状疱疹引起的皮疹与原发感染期间产生的皮疹不同。皮疹伴有剧烈疼痛，可能导致更严重的情况，如带状疱疹后神经痛(PHN)。

水痘-带状疱疹病毒(VZV)，也称为人疱疹病毒3(HHV-3)，是疱疹病毒科的α疱疹病毒亚科的成员。VZV是包膜病毒，具有约125,000个核苷酸的双链DNA基因组。VZV的基因组被二十面体核衣壳包围。位于核衣壳和病毒包膜之间的空间中的病毒被膜(tegument)(皮膜)是由病毒编码的蛋白质和酶组成的结构。病毒包膜来自宿主细胞膜并含有病毒编码的糖蛋白。

VZV基因组编码七十(70)个或更多个开放阅读框(ORF)，其中九个(9)开放阅读框编码被认为是在病毒复制周期的不同阶段起作用的糖蛋白(gE，gI，gB，gH，gK，gN，gL，gC和gM)。

糖蛋白E(gE)对于病毒复制是必需的(Mallory等人(1997)J.Virol.71:8279-8288)和Mo等人(2002)Virology 304:176-186)，并且是在被感染细胞和成熟病毒体中发现的最丰富的糖蛋白(Grose,2002,主要的水痘-带状疱疹病毒gE和gI糖蛋白复合物，与人类致病病毒的结构与功能的关系,Holzenburg和Bogner(编辑),Kluwer Academic/Plenum出版社,纽约,NY)。

糖蛋白I(gI)在感染细胞中与gE形成复合物，进而促进两种糖蛋白被内吞，并将其递送至反式高尔基体，在那里得到最终的病毒包膜(Olson和Grose(1998)J.Virol.72:1542-1551)。

糖蛋白B(gB)被认为在病毒进入细胞中起重要作用，具有被病毒中和抗体识别的表位，是病毒体表面上第二多的糖蛋白(Arvin(1996)Clin.Microbiol.Rev.9:361-381)。

糖蛋白H(gH)被认为具有促进病毒在细胞间传播的融合功能。

目前，通常用于预防水痘或带状疱疹的减毒活疫苗有几个缺点。首先，有一些证据表明抗VZV感染的免疫力随时间降低，并且出现疫苗失效(Chaves等人(2007)N.Engl.J.Med.356:1121-1129)。因此，接种疫苗的受试者可能仍然对带状疱疹易感，这是一种由VZV引起的病情更严重的疾病。此外，减毒活疫苗使用致病性较弱的活病毒制造，因此疫苗接种受试者可能因接种疫苗而对水痘或带状疱疹易感。事实上，报道存在数例带状疱疹是由疫苗中使用的病毒株引起的(Matsubara等人(1995)Acta Paediatr Jpn 37:648-50；及Hammerschlag等人(1989)J Infect Dis.160:535-7)。另外，由于疫苗中存在减毒活病毒，对于免疫功能降低的受试者，疫苗的使用可能是受限制的。

为了加强针对病毒休眠后沿神经细胞再次出现的带状疱疹的预防效果，重要的是显著增强针对VZV抗原的细胞介导的免疫(CMI)的激活，而非体液免疫的激活。为此，重要的是通过促进辅助性T细胞Th1和Th2中Th1的活化来增加Th1/Th2比率。

综上所述，有必要开发一种新型的、可以选择性地增加细胞介导的免疫应答，且不具有减毒活疫苗的缺点的带状疱疹疫苗组合物。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种疫苗组合物，具有高安全性和优异的预防带状疱疹的功效，能够选择性地增加细胞介导的免疫应答且没有减毒活疫苗的缺点。

解决方案

1.一种针对水痘或带状疱疹的疫苗组合物，包括以下组分：

水痘-带状疱疹病毒的糖蛋白E；

如下结构式1的吡喃葡萄糖基脂质佐剂；以及

可代谢的油；

[式I]

其中，R¹、R³、R⁵和R⁶各自独立地为C₁₀-C₁₂烷基；而R²和R⁴各自独立地为C₈-C₁₄烷基。

2.如上述项目1所述的疫苗组合物，其中吡喃葡萄糖基脂质佐剂是结构式1中的一种，其中R¹，R³、R⁵和R⁶是C₁₁烷基。

3.如上述项目1所述的疫苗组合物，其中吡喃葡萄糖基脂质佐剂是结构式1中的一种，其中R²和R⁴是C₁₃烷基。

4.如上述项目1所述的疫苗组合物，其中吡喃葡萄糖基脂质佐剂是结构式1中的一种，其中R²和R⁴是C₉烷基。

5.如上述项目1所述的疫苗组合物，其中可代谢的油是角鲨烯。

6.如上述项目5所述的疫苗组合物，其中角鲨烯的含量为总疫苗组合物的1％(v/v)至7％(v/v)。

7.如上述项目6所述的疫苗组合物，其中角鲨烯的含量为总疫苗组合物的1％(v/v)至4％(v/v)。

8.如上述项目1所述的疫苗组合物，其中在单剂量的疫苗组合物中，糖蛋白E的含量为5μg至100μg。

9.如上述项目1所述的疫苗组合物，其中在单剂量的疫苗组合物中，吡喃葡萄糖基脂质佐剂的含量为7.5μg至20μg。

10.如上述项目9所述的疫苗组合物，其中在单剂量的疫苗组合物中，吡喃葡萄糖基脂质佐剂的含量为9μg至18μg。

11.一种预防或治疗水痘或带状疱疹的方法，包括：给受试者施用上述项目1-10中任一项的组合物。

本发明的带状疱疹疫苗组合物的主要优点包括：

本发明的疫苗组合物，具有优异的预防带状疱疹效果。

本发明的疫苗组合物，与其体液免疫应答相比，显著增加细胞介导的对VZV抗原的免疫应答。

本发明的疫苗组合物，及其显著地增加产生两种或多种Th1特异性细胞因子的Th1细胞的数量。

本发明的疫苗组合物，与IgG1的产生相比，极其显著地增加IgG2c的产生。

本发明的疫苗组合物，消除了通过接种疫苗而使受试者感染带状疱疹的可能性。

本发明的疫苗组合物，甚至可以施用于免疫功能降低的受试者。

本发明的疫苗组合物，具有长效的预防效果。

附图说明

图1显示了在实施例3中，特异性针对gE抗原的IgG的生成情况。

图2显示了在实施例3中，特异性针对gE抗原的IgG2c和IgG1的生成情况。

图3显示了在实施例4中，特异性针对gE蛋白分泌IFN-γ的T细胞数量。

图4显示了在实施例4中，特异性针对gE重叠肽分泌IFN-γ的T细胞数量。

图5显示了在实施例4中，特异性针对完整的VZV分泌IFN-γ的T细胞数量。

图6显示了在实施例5中，特异性针对gE抗原的辅助T细胞分泌的各种不同的细胞因子数量。

图7显示了在实施例6中，特异性针对gE抗原分泌细胞因子的细胞分布情况。

图8显示了在实施例7中，特异性针对VZV抗原的IgG的生成情况。

图9显示了在实施例7中，特异性针对VZV抗原的IgG2c和IgG1的生成情况。

图10显示了在实施例8中，特异性针对完整的VZV分泌的IFN-γ的含量。

图11显示了在实施例9中，特异性针对VZV抗原分泌细胞因子的细胞的分布情况。

图12显示了在实施例10中，特异性针对VZV抗原的IgG的生成情况，以及在实施例2-2中，特异性针对gE或者完整VZV的T细胞数量。

图13显示了在实施例11中，特异性针对gE抗原的IgG的生成情况。

图14显示了在实施例11中，特异性针对gE抗原的IgG2c和IgG1的生成情况。

图15显示了在实施例12中，特异性针对gE蛋白分泌IFN-γ的T细胞数量。

图16显示了在实施例12中，特异性针对gE重叠肽分泌IFN-γ的T细胞数量。

图17显示了在实施例12中，特异性针对VZV抗原分泌IFN-γ的T细胞数量。

图18显示了在实施例13中，gE蛋白刺激所导致分泌的IFN-γ含量。

图19显示了在实施例13中，gE重叠肽刺激所导致分泌的IFN-γ含量。

图20显示了在实施例14中，特异性针对gE蛋白分泌IFN-γ的T细胞数量。

图21显示了在实施例14中，特异性针对完整VZV分泌IFN-γ的T细胞数量。

最佳实施方式

本发明涉及带状疱疹疫苗组合物，所述组合物包含水痘-带状疱疹病毒的糖蛋白E、吡喃葡萄糖脂质佐剂和可代谢的油；所述组合物具有高安全性，能通过选择性地增加细胞介导的免疫反应而表现出对带状疱疹的优异的预防效果，并且没有减毒活疫苗的缺点。

以下，对本发明进行详细地描述。

本发明的疫苗组合物，包括以下组分：

水痘-带状疱疹病毒的糖蛋白E；

如下结构式1的吡喃葡萄糖基脂质佐剂；以及

可代谢的油：

[结构式1]

其中，R¹、R³、R⁵和R⁶各自独立地为C₁₀-C₁₂烷基；R²和R⁴各自独立地为C₈-C₁₄烷基。

本发明的疫苗组合物包含VZV的糖蛋白E(gE)。本发明中的糖蛋白E(gE)是指VZV的糖蛋白E或其疫原性衍生物。本发明中的免疫原性衍生物可以是其中一部分糖蛋白E被修饰的衍生物。例如，它可以是如下形成的衍生物：糖蛋白E的一部分被切除，糖蛋白E的一个或多个氨基酸被另一个氨基酸取代，糖蛋白E的一个或多个氨基酸被去除、将一个或多个氨基酸添加至糖蛋白E，或糖蛋白E的一个或多个氨基酸是被化学修饰的。例如，本发明的糖蛋白E可以由SEQ ID NO：1的序列表示。

本发明的疫苗组合物包含下式1的吡喃葡萄糖基脂质佐剂和可代谢的油：

[结构式1]

其中，R¹、R³、R⁵和R⁶各自独立地为C₁₀-C₁₂烷基；而R²和R⁴各自独立地为C₈-C₁₄烷基。例如，R²和R⁴可以是C₈烷基、C₉烷基、C₁₀烷基、C₁₁烷基、C₁₂烷基、C₁₃烷基或C₁₄烷基。根据更具体的实例，R²和R⁴可以是C₉烷基或C₁₃烷基。例如，R²和R⁴可以是C₉烷基。

如本文所用，术语“可代谢的油”是指一种油，其结构可通过代谢改变，其中包括植物油、鱼油、动物油和合成油，它们没有生物毒性并且在代谢过程时可发生结构变化。

在本发明的一个优选例中，本发明的可代谢的油是角鲨烯。角鲨烯是具有30个碳的三萜骨架的烃。可以使用本领域公知的用作可代谢的油或乳液的各种角鲨烯，例如来自鲨鱼肝油的角鲨烯。在Fox CB等人，(2013)Vaccine 31(49):5848-55中，描述了角鲨烯的示例性组合物。

为了增加预防带状疱疹的效果，重要的是显著增强针对VZV抗原的细胞介导免疫(CMI)的激活，同时使体液免疫的激活最小化。

高水平的Th2特异性细胞因子有利于诱导针对所提供的抗原的体液免疫应答，而高水平的Th1特异性细胞因子倾向于优先诱导针对所提供的抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)。因此，产生的Th1特异性细胞因子比Th2特异性细胞因子越多，那么细胞介导的免疫应答的活化程度就越高于体液免疫应答的活化程度。

此外，同时产生IFN-γ、TNF-α和IL-2中两种或多种细胞因子的细胞数量越多，那么细胞介导的免疫应答的活化程度就越高。

另外，随着细胞介导的免疫应答的活化程度变得高于体液免疫应答的活化程度，则与IgG1抗体相比，IgG2c抗体的产生大大增加。

本发明的疫苗组合物可以极大地增加受试者体内的细胞介导的免疫应答的活化程度，而不是体液免疫应答的活化程度。

例如，与在体内产生Th2特异性细胞因子(例如，白细胞介素-4(IL-4)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-10(IL-10)等)相比，本发明的疫苗组合物可以显著增加受试者体内的Th1特异性细胞因子(例如，干扰素-γ(IFN-γ)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-2(IL-2))的产生。

同样，例如，与仅产生细胞因子IFN-γ，TNF-α和IL-2中一种细胞因子的活化Th1细胞相比，本发明的疫苗组合物能够大大增加在活化的Th1细胞群中同时产生两种或多种上述细胞因子的细胞数量。

另外，例如本发明的疫苗组合物可以极大地增加受试者体内gE特异性IgG抗体的产生，并且相较于gE特异性IgG1抗体，尤其可以大大增加gE特异性IgG2c抗体的产生。

本发明的疫苗组合物可以在单剂量中含有5μg至100μg的糖蛋白E。例如，可以在单剂量中含有5μg至80μg，具体地是5μg至70μg，更具体地5μg至60μg，以及最具体地，5μg至50μg的糖蛋白E。

本发明的疫苗组合物可以在单剂量中含有7.5μg至20μg，具体是9μg至18μg，更具体地，9μg至16μg，最具体是10μg至15μg的吡喃葡萄糖基脂质佐剂。根据本发明的另一实施例，本发明的疫苗组合物可以在单剂量中含有13μg至17μg的吡喃葡萄糖基脂佐剂。当吡喃葡萄糖基脂质佐剂包括在上述范围内时，可以选择性地最大化细胞介导的免疫应答。

本发明的疫苗组合物可以在单剂量中含有1至7％(v/v)，更具体地1至5％(v/v)，最特别是1至4％(v/v)的可代谢油。

除了糖蛋白E、吡喃葡萄糖基脂质佐剂和可代谢的油之外，本发明的疫苗组合物还可包括药学上可接受的赋形剂，载体等。例如，本发明的疫苗组合物可含有生理盐水或PBS(磷酸盐缓冲液)。

本发明的疫苗组合物可以以各种形式配制和包装。根据一个实施例，含有糖蛋白E但不包含吡喃葡萄糖基脂质佐剂和可代谢油的第一小瓶，和含有吡喃葡萄糖基脂质佐剂和可代谢油但不包含糖蛋白E的第二小瓶，可以单独包装，并在使用之前混合(病床边混合)。根据另一个实施例，包含所有的糖蛋白E、吡喃葡萄糖基脂质佐剂和代谢油的疫苗组合物，可以包装在小瓶、注射器(预填充注射器)或类似装置中。

发明实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

试验实施例1：免疫

由于人类具有水痘感染史，为了模拟小鼠中的水痘感染，将减毒活疫苗(LAV，3000pfu)一次皮下注射到雌性C57BL/6小鼠中，以进行初次免疫(LAV初免)。在LAV初免(第0天)起的28天后，通过肌内注射施用具有或不具有VZV蛋白免疫原或佐剂的各种VZV疫苗组合物，以进行二次免疫。

为了测量对VZV的体液免疫应答，分别在LAV初免时间点和之后28天和42天(第0天，第28天和第42天)采集一次血样，并在LAV初免之后的42天(第42天)从脾样品中采集白细胞，以检测针对VZV的CMI(细胞介导的免疫应答)。

初步免疫(LAV初免)，二次免疫(免疫)和免疫应答测量的实验设计总结示于下表1。在下表1中，gE是指SEQ ID NO：1的VZV糖蛋白E，LAV是指减毒活病毒，SLA是指式1的吡喃葡萄糖基脂佐剂，其中R²和R⁴是C₉烷基，SE是角鲨烯。SLA和角鲨烯分别从传染病研究所(美国西雅图)和Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州)获得。

氢氧化铝(Alum hydroxide)是氢氧化铝(aluminum hydroxide)；是一种基于角鲨烯的水包油型纳米乳液；Pam3CSK4是TLR1/2激动剂，CAS号为112208-00-1的合成的三酰化脂蛋白；polyIC是聚肌苷—聚胞苷酸；MPL是单磷酰脂质A；和ODN1826是B类CpG寡核苷酸—鼠TLR9配体。另外，免疫、血液样品采集和脾脏样品采集的天数，从LAV初免当天(第0天)起计算。

[表1]

试验实施例2：实验方法

试验实施例2-1：测量VZV抗原特异性IgG效价的方法(VZV特异性IgG效价)

在进行初次免疫和二次免疫后，进行ELISA(酶联免疫吸附测定)以测量VZV抗原特异性IgG效价。将重组gE蛋白或VZV抗原(1μg/mL)包被在ELISA板上并在4℃温育过夜。将ELISA板洗涤三次，并用含有2％BSA(牛血清白蛋白)的PBS(磷酸盐缓冲液)溶液进行封闭1小时。洗涤ELISA板后，向其中加入稀释的血清样品并温育2小时。向其中加入HRP(辣根过氧化物酶)偶联的山羊抗小鼠IgG，IgG1或IgG2c的抗体并孵育1小时。最后温育后，洗涤ELISA板并通过加入TMB(3,3'，5,5'-四甲基联苯胺)底物诱导HRP反应。通过添加ELISA终止溶液来停止HRP反应，并使用光谱仪在450nm的波长下测量光密度(OD)。

试验实施例2-2：使用酶联免疫斑点测定法(ELISPOT测定法)测量VZV抗原特异性细胞介导的免疫应答的方法

在进行初次免疫和二次免疫后，进行小鼠IFN-γELISPOT(酶联免疫斑点)测定，以确认VZV抗原特异性细胞介导的免疫应答(CMI)。将IFN-γ捕获抗体(5μg/mL)包被在ELISPOT平板上并在4℃温育过夜。将ELISPOT板洗涤3次，并用含有10％FBS(胎牛血清)的培养基封闭1小时。洗涤ELISPOT平板后，向其中加入从经免疫的小鼠收集的白细胞和gE蛋白、gE OLP(重叠肽)或VZV裂解物，并孵育24小时以进行白细胞刺激。完成白细胞刺激后，洗涤ELISPOT板，并向其中加入生物素化的小鼠IFN-γ检测抗体(2μg/mL)并孵育。洗涤板后，向其中加入链亲和素-HRP并再次温育。然后，在洗涤ELISPOT板后，在室温下向其中加入AEC底物混合物以诱导反应。通过用水洗涤ELISPOT板来终止反应，并将板干燥。用装置计数所得斑点的数量。

试验实施例2-3：鉴定抗原刺激分泌的细胞因子的方法(CBA测定)

在进行初次免疫和二次免疫后，进行CBA(细胞计数珠阵列)测定，以鉴定由于抗原刺激而造成的T细胞分泌的细胞因子的类型。用gE蛋白或VZV裂解物刺激从小鼠收集的白细胞3天，然后离心以获得上清液，然后用小鼠Th1/Th2/Th17CBA试剂盒测定细胞因子。七种细胞因子(IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，IFN-γ，TNF和IL-17A)捕获珠、上清液样品和细胞因子检测珠一起反应2小时，洗涤珠子，测定上清液中细胞因子的量。

试验实施例2-4：确定细胞因子分泌型细胞的分布的方法(ICS测定)

在进行初次免疫和二次免疫后，通过ICS(细胞内细胞因子染色)测定法测量Th1特异性细胞因子的分泌，以确认抗原特异性细胞介导的免疫应答。用gE蛋白刺激从小鼠收集的白细胞过夜，此时还加入GolgiStop(BFA)/GolgiPlug(莫能菌素)以防止细胞中的细胞因子分泌到外面。洗涤刺激过的白细胞后，用抗体(7-AAD，CD3-FITC，CD4-V500)标记白细胞的细胞表面以鉴定T细胞。在反应完成后，将白细胞洗涤，渗透化，并与可与细胞因子结合的抗体(TNF-α-PE，IFN-γ-APC，IL-2-V450)进行反应，以确认细胞中细胞因子的存在。在反应后，洗涤并固定白细胞，并分析抗原刺激引起分泌细胞因子的细胞的分布。

试验实验例2-5：测定gE抗原刺激导致分泌的IFN-γ细胞因子的方法(IFN-γELISA)

在进行初次免疫和二次免疫后，进行IFN-γELISA测定以确定IFN-γ的分泌量。IFN-γ是T细胞受抗原刺激分泌的典型效应子的细胞因子。用gE蛋白或gE重叠肽刺激收集自小鼠白细胞，3天后离心以获得上清液，然后用小鼠IFN-γELISA试剂盒分析。将IFN-γ捕获抗体(4μg/mL)包被在ELISA板上并在室温下温育过夜。将ELISA板洗涤三次，并用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS进行封闭1小时。洗涤ELISA板后，加入通过刺激白细胞得到的上清液，在室温下培养2小时。洗涤ELISA板后，加入生物素化的小鼠IFN-γ检测抗体(400ng/mL)，在室温下培养2小时。洗涤后，向其中加入链亲和素-HRP并再次温育20分钟。温育后，洗涤ELISA板并在室温下与底物溶液反应20分钟。在用终止溶液终止反应后，使用仪器在450nm下测量光密度。

试验实验例3：gE抗原特异性IgG效价的测量(gE特异性IgG效价)

按照试验实施例2-1的方法测量gE抗原特异性IgG效价，并将实验结果总结于图1和2中。

如图1所示，gE+SLA-SE组中gE抗原特异性IgG的产生大大增加。

如图2所示，gE+SLA-SE组中IgG2c的产生大大增加，特别是IgG2c的产生与IgG1相比大大增加。在图2中，基于横轴“0”的右侧条形图表示IgG2c的产生，左侧的条形图表示IgG1的产生。

结合图1和2的结果，证实使用包含gE、SLA和SE的组合物显著增加了IgG的总产量和IgG2c的产生，特别是与IgG1相比，IgG2c的产生大大增加。这些结果意味着：包含gE、SLA和SE的组合物(其同时满足高IgG2c产生和高IgG2c/IgG1比率)具有最大的预防带状疱疹的作用。

试验实施例4：测量gE或VZV抗原特异性的细胞介导的免疫应答(ELISPOT测定)

根据试验实施例2-2(IFN-γELISPOT测定)的方法测量gE蛋白、gE OLP或VZV裂解物特异性的细胞介导的免疫应答，实验结果总结在图3、4和5中。

如图3所示，ELISPOT试验证实了二次免疫后与gE蛋白特异性反应的T细胞数量的关系，可以看出，当使用gE、SLA和SE(gE+SLA-SE)的组合时，分泌IFN-γ(一种代表性的Th1细胞因子)的T细胞数量增加。

如图4所示，ELISPOT试验证实了二次免疫后对gE重叠肽特异的T细胞数量的关系，可以看出，与图3的结果类似，与其他组合物相比，包含gE、SLA和SE的组合物显示出显著增加的抗原特异性CMI。

如图5所示，ELISPOT试验证实了用gE抗原免疫后用VZV裂解物刺激诱导的完整VZV特异性的T细胞数量的关系，已表明：gE、SLA和SE的组合增加了对完整VZV以及gE抗原的特异分泌效应细胞因子的T细胞数量。

结合图3、4和5的结果，证实包含gE、SLA和SE(gE+SLA-SE)的组合物可以最大程度地增加VZV抗原特异性CMI以及gE特异性CMI。这意味着gE+SLA-SE组合物比其他组合物具有更好的预防带状疱疹的效果。

试验实施例5：确认抗原刺激所导致分泌的细胞因子的量(CBA测定)

按照试验实施例2-3的方法进行抗原刺激(CBA测定)分泌的细胞因子的确认，实验结果总结在图6中。在图6中，IFN-g表示IFN-γ。

如图6所示，包含gE、SLA和SE的组合物所导致分泌的各种不同的Th细胞因子以及一种代表性的Th1细胞因子IFN-γ(从前数第四位)，大大增加，而Th2细胞因子，IL-4(从前数第二个)和IL-6(从前数第三个)，或Th17细胞因子，IL-17A(前面的第六个)的分泌是减少的。这表明：包含gE、SLA和SE的组合物比其他组合物具有更好的预防带状疱疹的效果。

试验实施例6：确认细胞因子分泌型细胞的分布

按照试验实施例2-4的方法进行抗原刺激(ICS测定)以确认分泌细胞因子的细胞分布的测定，并且实验结果总结在图7中。

如图7所示，在gE+SLA-SE组的情况下，同时分泌两种或更多种Th1特异性细胞因子的T细胞数显著增加(69％)，这表明用gE+SLA-SE进行免疫，可诱导高质量的抗原特异性T细胞。这意味着包含gE、SLA和SE的组合物比其他组合物具有更好的预防带状疱疹的效果。

试验实施例7：VZV抗原特异性IgG效价的测量(抗VZV糖蛋白特异性IgG效价)

除了，以与试验实施例2-1中相同的方式测定取决于使用SLA-SE的各种VZV抗原特异性IgG效价，不同点在于：在二次免疫中使用gE、gI、IE63、gB、gC和gL中的任何一种作为抗原以及使用SLA-SE作为佐剂。结果总结在图8和9中。

如图8所示，在gE+SLA-SE组中VZV抗原特异性IgG的产生显著增加。

如图9所示，gE+SLA-SE组中IgG2c的产生大大增加，特别是IgG2c的产生与IgG1相比显著增加。在图9中，基于横轴“0”的右侧条形图表示IgG2c的产生，左侧的条形图表示IgG1的产生。

结合图8和9的结果，证实使用包含gE、SLA和SE的组合物显著增加了总IgG产生和IgG2c的产生，特别是与IgG1相比，IgG2c的产生大大增加。这表明：包含gE、SLA和SE的组合物(其同时满足IgG2c高产量和IgG2c/IgG1高比率)具有预防带状疱疹的最大效果。

试验实施例8：确认VZV抗原刺激所导致分泌的细胞因子的量

以与试验实施例2-3中相同的方式进行用于确认免疫后由抗原刺激分泌的细胞因子的实验(CBA测定)，不同点在于：gE，gI，IE63，gB，gC和gL在二次免疫中被用作抗原并且将SLA-SE用作佐剂，结果总结在图10中。

如图10所示，在gE+SLA-SE组的情况下，代表性Th1细胞因子IFN-γ的分泌量大大增加。这意味着细胞介导的免疫应答(CMI)被大大激活，并且包含gE、SLA和SE的组合物比其他组合物具有更好的预防带状疱疹的效果。

试验实施例9：确认分泌VZV抗原特异性细胞因子的细胞的分布

按照实施例2-4中相同的方式进行用于确认免疫后，通过抗原刺激导致分泌效应细胞因子的T细胞分布的实验(ICS测定)，不同点在于：在二次免疫中使用gE，gI，IE63，gB，gC和gL中的任何一个作为抗原，并使用SLA-SE作为佐剂，结果总结在图11中。

如图11所示，在gE+SLA-SE组的情况下，分泌Th1细胞因子IFN-γ，IL-2和TNF-α的CD4⁺T细胞的比例显著增加。这表明：细胞介导的免疫应答(CMI)被大大激活，并且包含gE、SLA和SE的组合物比其他组合物具有更好的预防带状疱疹的效果。

试验实施例10：根据抗原组合鉴定VZV特异性免疫原性

为了鉴定单独使用gE抗原时和在二次免疫时将gE抗原与另一种VZV抗原组合使用时诱导的VZV特异性免疫原性，按照试验实施例2-1和2-2的方法来确认VZV抗原特异性IgG效价和VZV抗原特异性T细胞免疫应答，实验结果总结在图12中。

如图12所示，当单独使用gE抗原时所诱导的VZV特异性抗体应答和T细胞应答，与当gE抗原与gI或IE63抗原一起使用时所诱导的VZV特异性免疫应答没有显著差异。这表明：包含gE、SLA和SE的组合物比其他组合物具有更好的预防带状疱疹的效果。

试验实施例11：gE抗原特异性IgG效价的测量(gE特异性IgG效价)

以与试验实验例2-1中相同的方式，测量取决于使用各种不同佐剂的gE抗原特异性IgG效价。除了使用gE作为抗原之外，SLA-SE、氢氧化铝、Addavax、Pam3CSK4、polyIC、MPL、鞭毛蛋白、咪喹莫特和ODN1826中的任一种被用作二次免疫中的佐剂，结果总结于图13和14中。

如图13所示，与其他佐剂组相比，gE+SLA-SE组中gE抗原特异性IgG的产生大大增加。

如图14所示，与其他佐剂组相比，gE+SLA-SE组中IgG2c的产生大大增加，尤其是IgG2c的产生与IgG1相比显著增加。在图14中，基于横轴“0”的右侧条形图表示IgG2c的产生，左侧的条形图表示IgG1的产生。

结合图13和14的结果，证实使用包含gE、SLA和SE的组合物显著增加了总IgG产生和IgG2c的产生。这表明：包含gE、SLA和SE的组合物具有预防带状疱疹的最佳效果。

试验实施例12：测量gE或VZV抗原特异性细胞介导的免疫应答(ELISPOT测定)

按照试验实施例2-2(IFN-γELISPOT测定)的方法，测量gE蛋白、gE OLP或VZV裂解物特异性细胞介导的免疫应答，实验结果总结在图15、16和17中。

如图15所示，通过ELISPOT试验证实了二次免疫后特异性响应于gE蛋白的T细胞数目，可以看出：分泌代表性Th1细胞因子IFN-γ的T细胞数量，与其他佐剂组相比，在gE+SLA-SE组中显著增加。

如图16所示，通过ELISPOT测定证实了二次免疫后对gE重叠肽特异的T细胞数，可以看出：与图15的结果类似，包含gE、SLA和SE的组合物，与其他组合物相比，显示出显著增加的抗原特异性CMI。

如图17所示，通过ELISPOT试验证实了用gE抗原免疫后用VZV裂解物刺激所诱导的完整VZV特异性T细胞数目，已表明：gE+SLA-SE增加了特异性针对完整VZV的分泌IFN-γ的T细胞数目。

结合图15、16和17的结果，已证实：与其他组合物相比，包含gE、SLA和SE的组合物可以最大程度地增加VZV抗原特异性CMI以及gE特异性CMI。这表明：gE+SLA-SE组合物比其他组合物具有更好的预防带状疱疹的效果。

试验实施例13：确认通过gE抗原或VZV抗原刺激(IFN-γELISA测定)所导致分泌的IFN-γ细胞因子

按照试验实施例2-5的方法，进行用于确认由gE抗原或gE OLP抗原刺激所导致分泌的IFN-γ细胞因子的实验(IFN-γELISA测定)，结果总结在图18和19中。

如图18所示，当观察二次免疫后由gE蛋白质刺激所导致分泌的IFN-γ细胞因子的分泌量时，已证实：与其他佐剂组相比，gE+SLA-SE组增加了典型的Th1效应细胞因子IFN-γ的分泌量。

如图19所示，当观察二次免疫后由gE重叠肽刺激所导致分泌的IFN-γ细胞因子的分泌量时，已证实：与其他佐剂组相比，通过gE、SLA和SE的组合，可增加IFN-γ的分泌量。

结合图18和19的结果，与其他含佐剂的组合物相比，包含gE、SLA和SE的组合物增加了代表性Th1效应细胞因子的分泌量，这表明：与其他组合物相比，gE+SLA-SE组合物具有更好的预防带状疱疹的效果。

试验实施例14：确定诱导VZV特异性免疫原性的SLA-SE的最佳量

表2总结了用于确认可最有效诱导VZV抗原特异性细胞介导的免疫应答(CMI)的SLA-SE的最佳量的实验设计。将减毒活疫苗(LAV，3,000pfu)一次皮下注射至雌性C57BL/6小鼠，并在其后第28天进行二次免疫(免疫)。在LAV初免后第56天，从脾样品中收集白细胞，以确认对VZV特异性的细胞介导的免疫应答(CMI)。

[表2]

按照试验实施例2-2的方法，测量gE抗原特异性细胞介导的免疫应答(IFN-γELISPOT测定)，实验结果总结在图20中。

按照试验实施例2-2的方法，测量VZV抗原特异性细胞介导的免疫应答(IFN-γELISPOT测定)，实验结果总结在图21中。

结合图20和21的结果，可以看出：用于诱导VZV抗原特异性细胞介导的免疫应答的SLA的最佳量在7.5μg至20μg的范围内。

序列表

<110> 财团法人牧岩生命科学研究所

传染性疾病研究院

<120> 带状疱疹疫苗组合物

<130> 16P01064

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 537

<212> PRT

<213> 人疱疹病毒3(Human herpesvirus 3)

<400> 1

Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly Val Leu Met Gly Phe Gly

1 5 10 15

Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala Ser Val

20 25 30

Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Thr Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn

35 40 45

Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp

50 55 60

Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro

65 70 75 80

Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His

85 90 95

Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu

100 105 110

Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp

115 120 125

Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His

130 135 140

Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly

145 150 155 160

Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val

165 170 175

Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg Ile Tyr

180 185 190

Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu Thr Cys

195 200 205

Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys His Thr

210 215 220

Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu Asn Thr

225 230 235 240

Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Lys

245 250 255

Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu Phe Asp

260 265 270

Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu Lys Val

275 280 285

Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn Met Arg

290 295 300

Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr Trp Lys

305 310 315 320

Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro Gln Pro

325 330 335

Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val Phe Ser

340 345 350

Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys Ile His

355 360 365

Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro Ile Asp

370 375 380

Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr His Pro

385 390 395 400

Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr Phe Thr

405 410 415

Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln Asn Cys

420 425 430

Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser His Met

435 440 445

Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr Leu Lys

450 455 460

Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Val

465 470 475 480

Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val Ser Thr

485 490 495

Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro Pro Thr

500 505 510

Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr Pro Val

515 520 525

Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Leu Arg

530 535

Claims

1.一种针对水痘或带状疱疹的疫苗组合物，包括以下组分：

水痘-带状疱疹病毒的糖蛋白E；

如下结构式1的吡喃葡萄糖基脂质佐剂；以及

角鲨烯；

[结构式1]

其中，R¹、R³、R⁵和R⁶各自独立地为C₁₀-C₁₂烷基；R²和R⁴各自独立地为C₈、C₉或C₁₀烷基。

2.如权利要求1中所述的疫苗组合物，其中，吡喃葡萄糖基脂质佐剂是结构式1中的一种，其中R¹、R³、R⁵和R⁶是C₁₁烷基。

3.如权利要求1中所述的疫苗组合物，其中，吡喃葡萄糖基脂质佐剂是结构式1中的一种，其中R²和R⁴是C₉烷基。

4.如权利要求1中所述的疫苗组合物，其中，在单剂量的疫苗组合物中，吡喃葡萄糖基脂质佐剂的含量为7.5μg至20μg。

5.如权利要求1中所述的疫苗组合物，其中，在单剂量的疫苗组合物中，吡喃葡萄糖基脂质佐剂的含量为9μg至18μg。

6.如权利要求1中所述的疫苗组合物，其中，角鲨烯的含量为总疫苗组合物的1％(v/v)至7％(v/v)。

7.如权利要求1中所述的疫苗组合物，其中，角鲨烯的含量为总疫苗组合物的1％(v/v)至4％(v/v)。

8.如权利要求1中所述的疫苗组合物，其中，在单剂量的疫苗组合物中，糖蛋白E的含量为5μg至100μg。