JP2021054854A - 帯状疱疹ワクチン組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】帯状疱疹を予防するためのワクチン組成物を提供する。【解決手段】水痘帯状疱疹ウイルスの糖たんぱく質E、式1のグルコピラノシル脂質アジュバント、および代謝可能油、を含む、水痘または帯状疱疹に対するワクチン組成物。(R1、R3、R5、R6:C10−C12アルキル。R2、R4:C8−C14アルキル。)【選択図】なし
Description
本発明は、帯状疱疹を予防するためのワクチン組成物に関する。
水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)の一次感染は、主に顔や体幹にできる、伝染性の高い発疹を特徴とする水痘を引き起こす。最初の感染後、ウイルスDNAは宿主神経細胞の細胞質内で何年間も休眠した状態となる。本ウイルスは成人において、再活性化され、帯状疱疹(herpes zoster、zosterまたはshingles)を引き起こす可能性がある。
帯状疱疹は、一次感染時に発生したものとは異なる発疹を引き起こす。該発疹は激しい痛みを伴い、帯状疱疹後神経痛(PHN)などのより深刻な症状につながる可能性がある。
水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)は、ヒトヘルペスウイルス3(HHV−3)としても知られており、ヘルペスウイルス科(Herpesviridae family)のアルファヘルペスウイルス亜科(alphaherpesvirus subfamily)のメンバーである。VZVは、約125,000ヌクレオチドの2本鎖DNAゲノムを有する、エンベロープウイルスである。VZVのゲノムは、正二十面体のヌクレオカプシドに封入されている。ウイルス外被(表皮)は、ヌクレオカプシドとウイルスエンベロープとの間の空間に位置し、ウイルスによりコードされるたんぱく質および酵素からなるコンストラクトである。ウイルスエンベロープは、宿主細胞膜に由来し、ウイルスによりコードされる糖たんぱく質を含有する。
VZVゲノムは70以上のオープンリーディングフレーム(ORF)をコードし、そのうち9個は糖タンパク質(gE、gI、gB、gH、gK、gN、gL、gCおよびgM)をコードしており、これらは、ウイルス複製サイクルの異なる段階で機能すると推定される。
糖たんぱく質E(gE)は、ウイルス複製に必須であり(Mallory et al. (1997) J. Virol. 71: 8279-8288および Mo et al. (2002) Virology 304: 176-186)、感染細胞および成熟ビリオンに見られる最も豊富な糖たんぱく質である(Grose, 2002, The predominant varicella-zoster virus gE and gI glycoprotein complex, In Structure-function relationships of human pathogenic viruses, Holzenburg and Bogner (eds.), Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, NY)。
糖たんぱく質I(gI)は、感染細胞においてgEと複合体を形成し、それによって両法の糖たんぱく質のエンドサイトーシスを促進し、これらの糖たんぱく質はその後、最終的なウイルスエンベロープが得られるトランスゴルジに送達される(Olson and Grose (1998) J. Virol. 72: 1542-1551)。
糖たんぱく質B(gB)は、ウイルスの侵入に重要な役割を果たすと考えられおり、ウイルス中和抗体のエピトープを有し、ビリオン表面で2番目に多い糖たんぱく質である(Arvin (1996) Clin. Microbiol. Rev. 9: 361-381)。
糖たんぱく質H(gH)は、ウイルスの細胞間伝播を促進する融合機能を有すると考えられている。
現在、水痘または帯状疱疹を予防するために一般的に使用されている弱毒生ワクチンはいくつかの欠点を有する。第1に、VZV感染に対する免疫が時間とともに低下し、ワクチンの効果が消えるといういくつかの証拠がある(Chaves et al. (2007) N. Engl. J. Med. 356: 1121-1129)。従って、ワクチン接種を受けた対象は、VZVによって引き起こされるより深刻な症状である、帯状疱疹にかかりやすいままである可能性がある。さらに、弱毒生ワクチンは、弱毒化された病原性を有する生ウイルスを用いて製造されているので、ワクチン接種対象はワクチン接種により水痘または帯状疱疹にかかりやすくなる可能性がある。実際、ワクチンに使用されたウイルス株によって引き起こされたと報告されている帯状疱疹のケースがいくつかある(Matsubara et al. (1995) Acta Paediatr Jpn 37: 648-50; および Hammerschlag et al. (1989) J Infect Dis. 160: 535-7)。さらに、該ワクチンには弱毒生ウイルスが存在するため、免疫機能が低下している対象には、ワクチンの使用が制限されることがある。
ウイルスの休眠後に神経細胞に沿って再出現する帯状疱疹を予防する効果を高めるためには、VZV抗原に対する液性免疫の活性化よりも、細胞性免疫(CMI)の活性化を有意に増強することが重要である。そのために、T細胞であるTh1とTh2(ヘルパーT細胞)のうち、Th1の活性化を促進することにより、Th1/Th2比を高めることが重要である。
従って、弱毒生ワクチンの欠点を有することなく、細胞性免疫反応を選択的に高めることができる、新規の帯状疱疹ワクチン組成物の開発が必要とされている。
発明の開示
技術的課題
本発明の目的は、安全性が高く、帯状疱疹予防効果に優れたワクチン組成物であって、弱毒生ワクチンの欠点を有することなく、細胞性免疫反応を選択的に高める、ワクチン組成物を提供することにある。
技術的課題
本発明の目的は、安全性が高く、帯状疱疹予防効果に優れたワクチン組成物であって、弱毒生ワクチンの欠点を有することなく、細胞性免疫反応を選択的に高める、ワクチン組成物を提供することにある。
課題の解決
1.水痘または帯状疱疹に対するワクチン組成物であって:
水痘帯状疱疹ウイルスの糖たんぱく質E;
以下の式1のグルコピラノシル脂質アジュバント;および
代謝可能油:
を含み、
式中、R1、R3、R5およびR6はそれぞれ独立してC10−C12アルキルであり;R2およびR4はそれぞれ独立してC8−C14アルキルである、ワクチン組成物。
2.グルコピラノシル脂質アジュバントが、R1、R3、R5およびR6がC11アルキルである式1のアジュバントである、上記1に記載のワクチン組成物。
3.グルコピラノシル脂質アジュバントが、R2およびR4がC13アルキルである式1のアジュバントである、上記1に記載のワクチン組成物。
4.グルコピラノシル脂質アジュバントが、R2およびR4がC9アルキルである式1のアジュバントである、上記1に記載のワクチン組成物。
5.代謝可能油がスクアレンである、上記1に記載のワクチン組成物。
6.スクアレンが、ワクチン組成物全体の1%(v/v)〜7%(v/v)の量で含有される、上記5に記載のワクチン組成物。
7.スクアレンが、ワクチン組成物全体の1%(v/v)〜4%(v/v)の量で含有される、上記6に記載のワクチン組成物。
8.糖たんぱく質Eが、ワクチン組成物の1回投与量中に、5μg〜100μgの量で含有される、上記1に記載のワクチン組成物。
9.グルコピラノシル脂質アジュバントが、ワクチン組成物の1回投与量中に、7.5μg〜20μgの量で含有される、上記1に記載のワクチン組成物。
10.グルコピラノシル脂質アジュバントが、ワクチン組成物の1回投与量中に、9μg〜18μgの量で含有される、上記9に記載のワクチン組成物。
11.上記1〜10のいずれかに記載の組成物を、対象に投与することを含む、水痘または帯状疱疹を予防または治療するための方法。
1.水痘または帯状疱疹に対するワクチン組成物であって:
水痘帯状疱疹ウイルスの糖たんぱく質E;
以下の式1のグルコピラノシル脂質アジュバント;および
代謝可能油:
を含み、
式中、R1、R3、R5およびR6はそれぞれ独立してC10−C12アルキルであり;R2およびR4はそれぞれ独立してC8−C14アルキルである、ワクチン組成物。
2.グルコピラノシル脂質アジュバントが、R1、R3、R5およびR6がC11アルキルである式1のアジュバントである、上記1に記載のワクチン組成物。
3.グルコピラノシル脂質アジュバントが、R2およびR4がC13アルキルである式1のアジュバントである、上記1に記載のワクチン組成物。
4.グルコピラノシル脂質アジュバントが、R2およびR4がC9アルキルである式1のアジュバントである、上記1に記載のワクチン組成物。
5.代謝可能油がスクアレンである、上記1に記載のワクチン組成物。
6.スクアレンが、ワクチン組成物全体の1%(v/v)〜7%(v/v)の量で含有される、上記5に記載のワクチン組成物。
7.スクアレンが、ワクチン組成物全体の1%(v/v)〜4%(v/v)の量で含有される、上記6に記載のワクチン組成物。
8.糖たんぱく質Eが、ワクチン組成物の1回投与量中に、5μg〜100μgの量で含有される、上記1に記載のワクチン組成物。
9.グルコピラノシル脂質アジュバントが、ワクチン組成物の1回投与量中に、7.5μg〜20μgの量で含有される、上記1に記載のワクチン組成物。
10.グルコピラノシル脂質アジュバントが、ワクチン組成物の1回投与量中に、9μg〜18μgの量で含有される、上記9に記載のワクチン組成物。
11.上記1〜10のいずれかに記載の組成物を、対象に投与することを含む、水痘または帯状疱疹を予防または治療するための方法。
発明の効果
本発明のワクチン組成物は、帯状疱疹の予防に優れている。
本発明のワクチン組成物は、帯状疱疹の予防に優れている。
本発明のワクチン組成物は、VZV抗原に対する液性免疫反応と比較して、VZV抗原に対する細胞性免疫反応を有意に高める。
本発明のワクチン組成物は、2つ以上のTh1特異的サイトカインを生産するTh1細胞の数を、大幅に増加させる。
本発明のワクチン組成物は、IgG1の生産と比較して、IgG2の生産を大幅に増加させる。
本発明のワクチン組成物は、ワクチン接種により、患者を帯状疱疹に感染させる可能性がない。
本発明のワクチン組成物は、免疫機能が低下している対象にも、投与することができる。
本発明のワクチン組成物は、持続性の予防効果を有する。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、水痘帯状疱疹ウイルスの糖たんぱく質E、グルコピラノシル脂質アジュバント、および代謝油を含み、弱毒生ワクチンの欠点を有することなく、細胞性免疫反応を選択的に高めることにより、高い安全性と、帯状疱疹を予防する優れた効果を有する、帯状疱疹ワクチン組成物に関する。
本発明は、水痘帯状疱疹ウイルスの糖たんぱく質E、グルコピラノシル脂質アジュバント、および代謝油を含み、弱毒生ワクチンの欠点を有することなく、細胞性免疫反応を選択的に高めることにより、高い安全性と、帯状疱疹を予防する優れた効果を有する、帯状疱疹ワクチン組成物に関する。
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明のワクチン組成物は、水痘帯状疱疹ウイルスの糖たんぱく質E(VZV)、以下の式1のグルコピラノシル脂質アジュバント、および代謝可能油を含む:
式中、R1、R3、R5およびR6はそれぞれ独立してC10−C12アルキルであり;R2およびR4はそれぞれ独立してC8−C14アルキルである。
式中、R1、R3、R5およびR6はそれぞれ独立してC10−C12アルキルであり;R2およびR4はそれぞれ独立してC8−C14アルキルである。
本発明のワクチン組成物は、VZVの糖たんぱく質E(gE)を含む。本発明における糖たんぱく質E(gE)は、VZVの糖たんぱく質E、またはその免疫原性誘導体を意味する。本発明における免疫原性誘導体は、糖たんぱく質Eの一部が修飾されたものであってよい。例えば、本発明における免疫原性誘導体は、糖たんぱく質Eの一部が切断されたもの、糖たんぱく質Eの1つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたもの、糖たんぱく質Eの1つ以上のアミノ酸が除去されたもの、糖たんぱく質Eに1つ以上のアミノ酸が付加されたもの、または、糖たんぱく質Eの1つ以上のアミノ酸が化学的に修飾されたものであってよい。例えば、本発明の糖タンパク質Eは、配列番号1の配列で表すことができる。
本発明のワクチン組成物は、以下の式1のグルコピラノシル脂質アジュバントおよび代謝可能油を含む:
式中、R1、R3、R5およびR6はそれぞれ独立してC10−C12アルキルであり;R2およびR4はそれぞれ独立してC8−C14アルキルである。例えば、R2およびR4は、C8アルキル、C9アルキル、C10アルキル、C11アルキル、C12アルキル、C13アルキル、またはC14アルキルであってよい。より具体的な例によれば、R2およびR4は、C9アルキルまたはC13アルキルであってよい。例えば、R2およびR4は、C9アルキルであってよい。
式中、R1、R3、R5およびR6はそれぞれ独立してC10−C12アルキルであり;R2およびR4はそれぞれ独立してC8−C14アルキルである。例えば、R2およびR4は、C8アルキル、C9アルキル、C10アルキル、C11アルキル、C12アルキル、C13アルキル、またはC14アルキルであってよい。より具体的な例によれば、R2およびR4は、C9アルキルまたはC13アルキルであってよい。例えば、R2およびR4は、C9アルキルであってよい。
本明細書で用いられる「代謝可能油」という用語は、その構造が代謝によって修飾される油を意味し、植物油、魚油、動物油、および合成油を含み、これらは生物毒性を有さず、代謝進行時に構造変化を受け得る。
本発明の特定の実施形態によれば、本発明の代謝可能油は、スクアレンである。スクアレンは、30個の炭素を有するトリテルペン骨格の炭化水素である。代謝可能油またはエマルジョンとして使用されることが当業界において一般に知られている、様々なスクアレン、例えばサメ肝油からのスクアレンを使用することができる。スクアレンの例示的な組成物は、Fox CB et al. (2013) Vaccine 31 (49): 5848-55に記載されている。
帯状疱疹の予防効果を高めるためには、VZV抗原に対する液性免疫の活性化を最小限に抑えながら、VZV抗原に対する細胞性免疫(CMI)の活性化を有意に増強することが重要である。
高レベルのTh2特異的サイトカインは、提供された抗原に対する液性免疫反応の誘導に有利であり、一方高レベルのTh1特異的サイトカインは、提供された抗原に対する細胞性免疫反応(CMI)の誘導を優先する傾向がある。したがって、Th2特異的サイトカインよりもTh1特異的サイトカインが多く生成されるほど、細胞性免疫反応の活性化の程度が、液性免疫反応の活性化の程度よりも高くなる。
また、IFN−γ、TNF−α、およびIL−2の中から、同時に2つ以上のサイトカインを生産する細胞の数が多いほど、細胞性免疫反応の活性化の程度は高い。
さらに、細胞性免疫反応の活性化の程度が、液性免疫反応の活性化の程度よりも高くなるにつれて、IgG2c抗体の生産は、IgG1抗体の生産と比較して大幅に増加する。
本発明のワクチン組成物は、対象の体内において、液性免疫反応の活性化の程度よりも、細胞性免疫反応の活性化の程度を、大幅に増加させることができる。
例えば、本発明のワクチン組成物は、対象の体内において、Th2特異的サイトカイン(例えば、インターロイキン−4(IL−4)、インターロイキン−6(IL−6)、インターロイキン−10(IL−10)など)の生産と比較して、Th1特異的サイトカイン(例えば、インターフェロンガンマ(IFN−γ)、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、およびインターロイキン−2(IL−2))の生産を、有意に増加させることができる。
また、例えば、本発明のワクチン組成物は、活性化Th1細胞においては、IFN−γ、TNF−α、およびIL−2の中から、1つのサイトカインのみを生産する細胞の数よりも、上述のサイトカインの中から2つ以上のサイトカインを同時に生産する細胞の数を大幅に増加させることができる。
さらに、例えば、本発明のワクチン組成物は、対象の体内において、gE特異的IgG抗体の生産を大幅に増加させることができ、特に、gE特異的IgG1抗体の生産と比較して、gE特異的IgG2c抗体の生産を大幅に増加させることができる。
本発明のワクチン組成物は、1回投与量中に、5μg〜100μgの糖たんぱく質Eを含有してよい。例えば、本発明のワクチン組成物は、1回投与量中に、5μg〜80μg、具体的には5μg〜70μg、より具体的には5μg〜60μg、および最も具体的には5μg〜50μgの糖たんぱく質Eを含有してよい。
本発明のワクチン組成物は、1回投与量中に、7.5μg〜20μg、具体的には9μg〜18μg、より具体的には9μg〜16μg、および最も具体的には10μg〜15μgのグルコピラノシル脂質アジュバントを含有してよい。本発明の別の実施形態によれば、本発明のワクチン組成物は、1回投与量中に、13μg〜17μgのグルコピラノシル脂質アジュバントを含有してよい。グルコピラノシル脂質アジュバントが上記の範囲に含まれると、細胞性免疫反応を選択的に最大化することができる。
本発明のワクチン組成物は、1回投与量中に、1〜7%(v/v)、より具体的には1〜5%(v/v)、および最も具体的には1〜4%(v/v)の代謝可能油を含有してよい。
本発明のワクチン組成物は、糖たんぱく質E、グルコピラノシル脂質アジュバント、および代謝可能油に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体などを含んでよい。例えば、本発明のワクチン組成物は、生理食塩水またはPBS(リン酸緩衝食塩水)を含んでよい。
本発明のワクチン組成物は、様々な形態で、製剤化および包装することができる。一実施形態によれば、糖たんぱく質Eを含有するがグルコピラノシル脂質アジュバントおよび代謝可能油を含有しない第1のバイアルと、グルコピラノシル脂質アジュバントおよび代謝可能油を含有するが糖たんぱく質Eを含有しない第2のバイアルとを、別々に包装して、使用前に混合してよい(ベッドサイド混合)。別の実施形態によれば、糖たんぱく質、グルコピラノシル脂質アジュバントおよび代謝油の全てを含むワクチン組成物を、1つのバイアル、1つのシリンジ(プレフィルドシリンジ)などに包装してよい。
発明の実施形態
以下に、実験例を参照して、本発明をより詳細に説明する。これらの実験例は、本発明を例示することのみを意図したものであり、本発明の範囲は、これらの実験例で例証されたものに限定されない。
以下に、実験例を参照して、本発明をより詳細に説明する。これらの実験例は、本発明を例示することのみを意図したものであり、本発明の範囲は、これらの実験例で例証されたものに限定されない。
実験例1:免疫化
ヒトは水痘感染の病歴があるので、マウスで水痘感染を模倣するために、弱毒生ワクチン(LAV、3000pfu)を、雌C57BL/6マウスに1回皮下注射して、一次免疫を行った(LAVプライミング)。LAVプライミング(0日目)から28日後に、VZVタンパク質免疫原またはアジュバントを、含むかまたは含まない種々のVZVワクチン組成物を筋肉内注射により投与して、二次免疫を行った。
ヒトは水痘感染の病歴があるので、マウスで水痘感染を模倣するために、弱毒生ワクチン(LAV、3000pfu)を、雌C57BL/6マウスに1回皮下注射して、一次免疫を行った(LAVプライミング)。LAVプライミング(0日目)から28日後に、VZVタンパク質免疫原またはアジュバントを、含むかまたは含まない種々のVZVワクチン組成物を筋肉内注射により投与して、二次免疫を行った。
VZVに対する液性免疫反応を測定するために、血液サンプルを、LAVプライミング時点で1回、その28日後および42日後にそれぞれ採取し(0日目、28日目、および42日目)、また、VZVに対するCMI(細胞性免疫反応)を測定するために、LAVプライミングの42日後に(42日目)脾臓サンプルから白血球を回収した。
一次免疫(LAVプライミング)、二次免疫(免疫化)および免疫反応測定を、以下の表1に示したように、要約する。以下の表1では、gEは配列番号1のVZV糖たんぱく質Eを指し、LAVは弱毒生ウイルスを指し、SLAは式1のグルコピラノシル脂質アジュバントを指し(式中、R2およびR4はC9アルキルである)、またSEはスクアレンを指す。SLAおよびスクアレンは、Infectious Disease Research Institute (Seattle, US)およびSigma-Aldrich (St. Louis, MO)から、それぞれ入手した。
水酸化アラム(Alum hydroxide)は、水酸化アルミニウムである;Addavax(登録商標)は、スクアレンベースの水中油型ナノエマルジョンである;Pam3CSK4は、TLR1/2アゴニストであり、CAS番号112208―00―1の合成トリアシル化リポタンパク質である;polyICは、ポリイノシン・ポリシチジン酸である;MPLは、モノホスホリルリピドAである;およびODN1826は、クラスB CpGオリゴヌクレオチド―マウスTLR9リガンドである。さらに、免疫化、血液サンプル回収、および脾臓サンプル回収の日は、LAVプライミングの日である0日目から計算した。
実験例2:実験方法
実験例2−1:VZV抗原特異的IgG力価(VZV特異的IgG力価)を測定するための方法
一次免疫および二次免疫を実施した後、VZV抗原特異的IgG力価を測定するために、ELISA(酵素結合免疫吸着測定法)を行った。組換えgEたんぱく質またはVZV抗原(1μg/mL)を、ELISAプレート上にコーディングして、4℃で一晩インキュベートした。ELISAプレートを3回洗浄し、ブロッキングを、2%BSA(ウシ血清アルブミン)を含有するPBS(リン酸緩衝食塩水)で1時間行った。ELISAプレートを洗浄後、希釈した血清サンプルを添加し、2時間インキュベートした。HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)コンジュゲートヤギ抗マウスIgG、IgG1、またはIgG2c抗体を添加し、1時間インキュベートした。最終インキュベーション後、ELISAプレートを洗浄し、TMB(3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン)基質を添加することによりHRP反応を誘導した。ELISA停止溶液を添加することによってHRP反応を停止させ、分光計を使用して450nmの波長で吸光度(OD)を測定した。
実験例2−1:VZV抗原特異的IgG力価(VZV特異的IgG力価)を測定するための方法
一次免疫および二次免疫を実施した後、VZV抗原特異的IgG力価を測定するために、ELISA(酵素結合免疫吸着測定法)を行った。組換えgEたんぱく質またはVZV抗原(1μg/mL)を、ELISAプレート上にコーディングして、4℃で一晩インキュベートした。ELISAプレートを3回洗浄し、ブロッキングを、2%BSA(ウシ血清アルブミン)を含有するPBS(リン酸緩衝食塩水)で1時間行った。ELISAプレートを洗浄後、希釈した血清サンプルを添加し、2時間インキュベートした。HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)コンジュゲートヤギ抗マウスIgG、IgG1、またはIgG2c抗体を添加し、1時間インキュベートした。最終インキュベーション後、ELISAプレートを洗浄し、TMB(3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン)基質を添加することによりHRP反応を誘導した。ELISA停止溶液を添加することによってHRP反応を停止させ、分光計を使用して450nmの波長で吸光度(OD)を測定した。
実験例2−2:酵素免疫スポットアッセイ(ELISPOTアッセイ)を用いてVZV抗原特異的細胞性免疫反応を測定するための方法
一次免疫および二次免疫を行った後、マウスIFN−γELISPOT(酵素免疫スポット)アッセイを実施し、VZV抗原特異的細胞性免疫反応(CMI)を確認した。IFN−γ捕捉抗体(5μg/mL)をELISPOTプレートにコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。ELISPOTプレートを3回洗浄し、10%FBS(ウシ胎児血清)を含む培地で、1時間ブロッキングを実施した。ELISPOTプレートを洗浄後、免疫化したマウスから回収した白血球と、gEたんぱく質、gE OLP(重複ペプチド)、またはVZVライセートとを添加して、白血球刺激のために24時間インキュベートした。白血球刺激終了時に、ELISPOTプレートを洗浄し、ビオチン化マウスIFN−γ検出抗体(2μg/mL)を添加してインキュベートした。プレート洗浄後に、ストレプトアビジン−HRPを添加して、再度インキュベートした。次に、ELISPOTプレートを洗浄後に、AEC基質混合物を添加して、室温で反応を誘導した。反応を、ELISPOTプレートを水で洗浄することにより停止し、プレートを乾燥させた。得られたスポットの数を、装置でカウントした。
一次免疫および二次免疫を行った後、マウスIFN−γELISPOT(酵素免疫スポット)アッセイを実施し、VZV抗原特異的細胞性免疫反応(CMI)を確認した。IFN−γ捕捉抗体(5μg/mL)をELISPOTプレートにコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。ELISPOTプレートを3回洗浄し、10%FBS(ウシ胎児血清)を含む培地で、1時間ブロッキングを実施した。ELISPOTプレートを洗浄後、免疫化したマウスから回収した白血球と、gEたんぱく質、gE OLP(重複ペプチド)、またはVZVライセートとを添加して、白血球刺激のために24時間インキュベートした。白血球刺激終了時に、ELISPOTプレートを洗浄し、ビオチン化マウスIFN−γ検出抗体(2μg/mL)を添加してインキュベートした。プレート洗浄後に、ストレプトアビジン−HRPを添加して、再度インキュベートした。次に、ELISPOTプレートを洗浄後に、AEC基質混合物を添加して、室温で反応を誘導した。反応を、ELISPOTプレートを水で洗浄することにより停止し、プレートを乾燥させた。得られたスポットの数を、装置でカウントした。
実験例2−3:抗原刺激により分泌されたサイトカインを特定するための方法(CBAアッセイ)
一次免疫および二次免疫を実施した後、抗原刺激によりT細胞によって分泌されるサイトカインの種類を特定するために、CBA(サイトメトリックビーズアレイ)アッセイを行った。マウスから回収した白血球を、gEたんぱく質またはVZVライセートで3日間刺激し、遠心分離して上清を得、その後上清をマウスTh1/Th2/Th17 CBAキットによりサイトカインについてアッセイした。7種類のサイトカイン捕捉ビーズ(IL−2、IL−4、IL−6、IL−10、IFN−γ、TNF、およびIL−17A)、上清サンプル、およびサイトカイン検出ビーズを、2時間一緒に反応させ、ビーズを洗浄し、上清中のサイトカインの量を決定した。
一次免疫および二次免疫を実施した後、抗原刺激によりT細胞によって分泌されるサイトカインの種類を特定するために、CBA(サイトメトリックビーズアレイ)アッセイを行った。マウスから回収した白血球を、gEたんぱく質またはVZVライセートで3日間刺激し、遠心分離して上清を得、その後上清をマウスTh1/Th2/Th17 CBAキットによりサイトカインについてアッセイした。7種類のサイトカイン捕捉ビーズ(IL−2、IL−4、IL−6、IL−10、IFN−γ、TNF、およびIL−17A)、上清サンプル、およびサイトカイン検出ビーズを、2時間一緒に反応させ、ビーズを洗浄し、上清中のサイトカインの量を決定した。
実験例2−4:サイトカイン分泌細胞の分布を決定するための方法(ICSアッセイ)
一次免疫および二次免疫を実施した後、Th1特異的サイトカインの分泌をICS(細胞内サイトカイン染色)アッセイにより測定し、抗原特異的細胞性免疫反応を確認した。マウスから回収した白血球を、gEたんぱく質で一晩刺激し、この時点で、GolgiStop(BFA)/GolgiPlug(モネンシン)も添加し、細胞内のサイトカインが外部に分泌されるのを防いだ。刺激された白血球を洗浄後、白血球の細胞表面を、T細胞を特定する抗体(7−AAD、CD3−FITC、CD4−V500)で標識した。反応終了後、白血球を洗浄、透過処理し、サイトカインに結合することができる抗体(TNF−α−PE、IFN−γ−APC、IL−2−V450)と反応させて、細胞内のサイトカインの存在を確認した。反応後、白血球を洗浄および固定し、抗原刺激によりサイトカインを分泌する細胞の分布を解析した。
一次免疫および二次免疫を実施した後、Th1特異的サイトカインの分泌をICS(細胞内サイトカイン染色)アッセイにより測定し、抗原特異的細胞性免疫反応を確認した。マウスから回収した白血球を、gEたんぱく質で一晩刺激し、この時点で、GolgiStop(BFA)/GolgiPlug(モネンシン)も添加し、細胞内のサイトカインが外部に分泌されるのを防いだ。刺激された白血球を洗浄後、白血球の細胞表面を、T細胞を特定する抗体(7−AAD、CD3−FITC、CD4−V500)で標識した。反応終了後、白血球を洗浄、透過処理し、サイトカインに結合することができる抗体(TNF−α−PE、IFN−γ−APC、IL−2−V450)と反応させて、細胞内のサイトカインの存在を確認した。反応後、白血球を洗浄および固定し、抗原刺激によりサイトカインを分泌する細胞の分布を解析した。
実験例2−5:gE抗原刺激により分泌されたIFN−γサイトカインを決定するための方法(IFN−γELISA)
一次免疫および二次免疫を実施した後、IFN−γELISAアッセイを行い、抗原刺激によりT細胞によって分泌される典型的なエフェクターサイトカインである、IFN−γの分泌量を決定した。マウスから回収した白血球を、gEたんぱく質またはgE重複ペプチドで3日間刺激し、遠心分離して上清を得、その後上清をIFN−γELISAキットにより解析した。IFN−γ捕捉抗体(4μg/mL)をELISAプレート上にコーティングし、室温で一晩インキュベートした。ELISAプレートを3回洗浄し、ブロッキングを、1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するPBSで、1時間行った。ELISAプレートを洗浄後、白血球刺激により得られた上清をELISAプレートに添加し、室温で2時間インキュベートした。ELISAプレートを洗浄後、ビオチン化マウスIFN−γ検出抗体(400ng/mL)を添加し、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジン―HRPを添加し、再度20分間インキュベートした。インキュベーション後、ELISAプレートを洗浄し、室温で20分間基質溶液と反応させた。反応を停止溶液で停止させたのち、装置を用いて450nmで吸光度を測定した。
一次免疫および二次免疫を実施した後、IFN−γELISAアッセイを行い、抗原刺激によりT細胞によって分泌される典型的なエフェクターサイトカインである、IFN−γの分泌量を決定した。マウスから回収した白血球を、gEたんぱく質またはgE重複ペプチドで3日間刺激し、遠心分離して上清を得、その後上清をIFN−γELISAキットにより解析した。IFN−γ捕捉抗体(4μg/mL)をELISAプレート上にコーティングし、室温で一晩インキュベートした。ELISAプレートを3回洗浄し、ブロッキングを、1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するPBSで、1時間行った。ELISAプレートを洗浄後、白血球刺激により得られた上清をELISAプレートに添加し、室温で2時間インキュベートした。ELISAプレートを洗浄後、ビオチン化マウスIFN−γ検出抗体(400ng/mL)を添加し、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジン―HRPを添加し、再度20分間インキュベートした。インキュベーション後、ELISAプレートを洗浄し、室温で20分間基質溶液と反応させた。反応を停止溶液で停止させたのち、装置を用いて450nmで吸光度を測定した。
実験例3:gE抗原特異的IgG力価(gE特異的IgG力価)の測定
gE抗原特異的IgG力価を、実験例2−1の方法により測定し、実験結果を図1および図2にまとめている。
gE抗原特異的IgG力価を、実験例2−1の方法により測定し、実験結果を図1および図2にまとめている。
図1に示したように、gE抗原特異的IgGの生産は、gE+SLA−SE群において、大幅に増加した。
図2に示したように、IgG2cの生産は、gE+SLA−SE群において大幅に増加し、特に、IgG2cの生産は、IgG1の生産と比較して、大幅に増加した。図2において、横軸「0」を基準とした右側の棒グラフは、IgG2cの生産を表し、左側の棒グラフは、IgG1の生産を表している。
図1および図2を考慮にいれると、gE、SLAおよびSEを含む組成物の使用は、全IgGの生産およびIgG2cの生産を有意に増加させ、特に、IgG1と比較してIgG2の生産を大幅に増加させることを確認した。これらの結果は、高いIgG2cの生産および高いIgG2c/IgG1比の両方を満たす、gE、SLAおよびSEを含む組成物が、最も高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
実験例4:gEまたはVZV抗原特異的細胞性免疫反応の測定(ELISPOTアッセイ)
gEたんぱく質、gE OLP、またはVZVライセート特異的細胞性免疫反応を、実験例2−2の方法(IFN−γELISPOTアッセイ)に従い測定し、実験結果を図3、図4および図5にまとめている。
gEたんぱく質、gE OLP、またはVZVライセート特異的細胞性免疫反応を、実験例2−2の方法(IFN−γELISPOTアッセイ)に従い測定し、実験結果を図3、図4および図5にまとめている。
図3に示したように、二次免疫後にgEタンパク質と特異的に反応したT細胞の数を、ELISPOTアッセイにより確認したところ、代表的なTh1サイトカインであるIFN−γを分泌するT細胞の数が、gE、SLA、およびSEの組み合わせ(gE+SLA−SE)を使用した場合に増加したことがわかる。
図4に示したように、二次免疫後のgE重複ペプチドに特異的なT細胞の数をELISPOTアッセイにより確認したところ、図3の結果と同様に、gE、SLAおよびSEを含む組成物が、他の組成物と比較して、有意に増加した抗原特異的CMIを示したことがわかる。
図5に示したように、gE抗原による免疫化後の、VZVライセートによる刺激によって誘導された、全VZVに特異的なT細胞の数をELISPOTアッセイにより確認したところ、全VZVおよびgE抗原に特異的なエフェクターサイトカインを分泌するT細胞の数が、gE、SLA、およびSEの組み合わせにより増加したことを確認した。
図3、図4および図5を考慮に入れると、gE、SLAおよびSEを含む組成物(gE+SLA−SE)が、VZV抗原特異的CMIならびにgE特異的CMIを、最大限に増加させることができることを確認した。これは、gE+SLA−SE組成物が、他の組成物よりも、より高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
実験例5:抗原刺激により分泌されたサイトカインの量の確認(CBAアッセイ)
抗原刺激により分泌されたサイトカインの確認(CBAアッセイ)を、実験例2〜3の方法により実施し、実験結果を図6にまとめている。図6において、IFN−gはIFN−γを意味している。
抗原刺激により分泌されたサイトカインの確認(CBAアッセイ)を、実験例2〜3の方法により実施し、実験結果を図6にまとめている。図6において、IFN−gはIFN−γを意味している。
図6に示したように、様々なThサイトカインがgE、SLAおよびSEを含む組成物により分泌され、代表的なTh1サイトカインであるIFN−γ(正面から4番目)は大幅に増加したが、一方、Th2サイトカインであるIL−4(正面から2番目)およびIL−6(正面から3番目)、またはTh17サイトカインであるIL−17A(正面から6番目)の分泌は最小限であった。これは、gE、SLAおよびSEを含む組成物が、他の組成物よりも、より高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
実験例6:サイトカイン分泌細胞の分布の確認
抗原刺激によりサイトカインを分泌する細胞の分布を確認するためのアッセイ(ICSアッセイ)を実験例2〜4の方法により実施し、実験結果を図7にまとめている。
抗原刺激によりサイトカインを分泌する細胞の分布を確認するためのアッセイ(ICSアッセイ)を実験例2〜4の方法により実施し、実験結果を図7にまとめている。
図7に示したように、gE+SLA−SE群の場合、2つ以上のTh1特異的サイトカインを同時に分泌するT細胞の数が有意に増加したが(69%)、これは高品質の抗原特異的T細胞が、gE+SLA−SEによる免疫化によって誘発されたことを示している。これは、gE、SLAおよびSEを含む組成物が、他の組成物よりも、より高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
実験例7:VZV抗原特異的IgG力価(抗VZV糖たんぱく質特異的IgG力価)の測定
gE、gI、IE63、gB、gCおよびgLのいずれか1つを二次免疫の抗原として用いたこと、およびSLA−SEをアジュバントとして用いたこと以外は、実験例2−1と同じ方法で、SLA−SEの使用による、様々なVZV抗原特異的IgG力価を決定し、その結果を図8および図9にまとめている。
gE、gI、IE63、gB、gCおよびgLのいずれか1つを二次免疫の抗原として用いたこと、およびSLA−SEをアジュバントとして用いたこと以外は、実験例2−1と同じ方法で、SLA−SEの使用による、様々なVZV抗原特異的IgG力価を決定し、その結果を図8および図9にまとめている。
図8に示したように、VZV抗原特異的IgGの生産は、gE+SLA−SE群において、有意に増加した。
図9に示したように、IgG2cの生産は、gE+SLA−SE群において大幅に増加し、特に、IgG2cの生産は、IgG1の生産と比較して、有意に増加した。図9において、横軸「0」を基準とした右側の棒グラフは、IgG2cの生産を表し、左側の棒グラフは、IgG1の生産を表している。
図8および図9の結果を考慮に入れると、gE、SLAおよびSEを含む組成物の使用が、全IgG生産およびIgG2cの生産を有意に増加させ、特に、IgG1と比較してIgG2cの生産を大幅に増加させたことを確認した。これは、高いIgG2cの生産および高いIgG2c/IgG1比の両方を満たす、gE、SLAおよびSEを含む組成物が、最も高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
実験例8:VZV抗原刺激により分泌されたサイトカインの量の確認
免疫化に続いて、抗原刺激により分泌されたサイトカインを確認するための実験(CBA)アッセイを、gE、gI、IE63、gB、gCおよびgLのいずれか1つを二次免疫の抗原として用いたこと、およびSLA−SEをアジュバントとして用いたこと以外は、実験例2−3と同じ方法で実施し、結果を表10にまとめている。
免疫化に続いて、抗原刺激により分泌されたサイトカインを確認するための実験(CBA)アッセイを、gE、gI、IE63、gB、gCおよびgLのいずれか1つを二次免疫の抗原として用いたこと、およびSLA−SEをアジュバントとして用いたこと以外は、実験例2−3と同じ方法で実施し、結果を表10にまとめている。
図10に示したように、gE+SLA−SE群の場合に、代表的なTh1サイトカインであるIFN−γの分泌量が大幅に増加した。これは、細胞性免疫反応(CMI)が非常に活性化されたこと、および、gE、SLAおよびSEを含む組成物が、他の組成物よりも、より高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
実験例9:VZV抗原特異的サイトカインを分泌する細胞の分布の確認
免疫化に続いて、抗原刺激によりエフェクターサイトカインを分泌するT細胞の分布を確認するための実験(ICSアッセイ)を、gE、gI、IE63、gB、gCおよびgLのいずれか1つを二次免疫の抗原として用いたこと、およびSLA−SEをアジュバントとして用いたこと以外は実験例2−4と同じ方法で実施し、その結果を図11にまとめている。
免疫化に続いて、抗原刺激によりエフェクターサイトカインを分泌するT細胞の分布を確認するための実験(ICSアッセイ)を、gE、gI、IE63、gB、gCおよびgLのいずれか1つを二次免疫の抗原として用いたこと、およびSLA−SEをアジュバントとして用いたこと以外は実験例2−4と同じ方法で実施し、その結果を図11にまとめている。
図11に示したように、gE+SLA−SE群の場合に、Th1サイトカインであるIFN−γ、IL−2、およびTNF−αを分布するCD4+T細胞の割合が有意に増加した。これは、細胞性免疫反応(CMI)が非常に活性化されたこと、および、gE、SLAおよびSEを含む組成物が、他の組成物よりも、より高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
実験例10:抗原の組み合わせによる、VZV特異的免疫原性の特定
二次免疫時に、gE抗原を単独で用いた場合、および、gE抗原を別のVZV抗原と組み合わせて用いた場合に、誘導されるVZV特異的免疫原性を特定するために、VZV抗原特異的IgG力価およびVZV抗原特異的T細胞免疫反応を、実験例2−1および実験例2−2の方法により確認し、実験結果を図12にまとめている。
二次免疫時に、gE抗原を単独で用いた場合、および、gE抗原を別のVZV抗原と組み合わせて用いた場合に、誘導されるVZV特異的免疫原性を特定するために、VZV抗原特異的IgG力価およびVZV抗原特異的T細胞免疫反応を、実験例2−1および実験例2−2の方法により確認し、実験結果を図12にまとめている。
図12に示したように、gE抗原を単独で用いた場合に誘導されるVZV特異的抗体反応およびT細胞反応は、gE抗原をgIまたはIE63抗原と共に用いた場合に誘導されるVZV特異的免疫反応と、有意に異ならなかった。これは、gE、SLAおよびSEを含む組成物が、他の組成物よりも、より高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
実験例11:gE抗原特異的IgG力価(gE特異的IgG力価)の測定
様々なアジュバントの使用によるgE抗原特異的IgG力価を、gEを抗原として用いたこと、およびSLA−SE、水酸化アラム、Addavax、Pam3CSK4、polyIC、MPL、フラジェリン、イミキモド、およびODN1826のいずれか1つを、二次免疫のアジュバントとして用いたこと以外は、実験例2−1と同じ方法で測定し、その結果を図13および図14にまとめている。
様々なアジュバントの使用によるgE抗原特異的IgG力価を、gEを抗原として用いたこと、およびSLA−SE、水酸化アラム、Addavax、Pam3CSK4、polyIC、MPL、フラジェリン、イミキモド、およびODN1826のいずれか1つを、二次免疫のアジュバントとして用いたこと以外は、実験例2−1と同じ方法で測定し、その結果を図13および図14にまとめている。
図13に示したように、gE抗原特異的IgGの生産は、他のアジュバント群と比較して、gE+SLA−SE群において大幅に増加した。
図14に示したように、IgG2cの生産は、他のアジュバント群と比較して、gE+SLA−SE群において大幅に増加し、特に、IgG2cの生産は、IgG1の生産と比較して、有意に増加した。図14において、横軸「0」を基準とした右側の棒グラフは、IgG2cの生産を表し、左側の棒グラフは、IgG1の生産を表している。
図13および図14を考慮にいれると、gE、SLAおよびSEを含む組成物の使用は、全IgGの生産およびIgG2cの生産を有意に増加させることを確認した。これは、gE、SLAおよびSEを含む組成物が、最も高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
実験例12:gEまたはVZV抗原特異的細胞性免疫反応の測定(ELISPOTアッセイ)
gEたんぱく質、gE OLP、またはVZVライセート特異的細胞性免疫反を、実験例2−2の方法(IFN−γELISPOTアッセイ)により測定し、実験結果を図15、図16および図17にまとめている。
gEたんぱく質、gE OLP、またはVZVライセート特異的細胞性免疫反を、実験例2−2の方法(IFN−γELISPOTアッセイ)により測定し、実験結果を図15、図16および図17にまとめている。
図15に示したように、二次免疫後のgEたんぱく質に特異的に反応するT細胞の数を、ELISPOTアッセイにより確認したところ、代表的なTh1サイトカインである、IFN−γを分泌するT細胞の数が、他のアジュバント群と比較して、gE+SLA−SE群において有意に増加したことがわかる。
図16に示したように、二次免疫後のgE重複ペプチドに特異的なT細胞の数を、ELISPOTアッセイにより確認したところ、図15の結果と同様に、gE、SLAおよびSEを含む組成物が、他の組成物と比較して、有意に増加した抗原特異的CMIを示したことがわかる。
図17に示したように、gE抗原による免疫化後の、VZVライセートによる刺激によって誘導された全VZVに特異的なT細胞の数を、ELISPOTアッセイにより確認したところ、全VZVに特異的なIFN−γを分泌するT細胞の数が、gE+SLA−SEにより増加したことを確認した。
図15、図16および図17の結果を考慮にいれると、gE、SLAおよびSEを含む組成物が、VZV抗原特異的CMIならびにgE特異的CMIを、他の組成物と比較して、最大限に増加させることができることを確認した。これは、gE+SLA−SE組成物が、他の組成物よりも、より高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
実験例13:gE抗原またはVZV抗原刺激により分泌されたIFN−γサイトカインの確認(IFN−γELISAアッセイ)
gE抗原またはgE OLP抗原刺激により分泌されたIFN−γサイトカインを確認するための実験(IFN−γELISAアッセイ)を、実験例2−5の方法により実施し、その結果を図18および図19にまとめている。
gE抗原またはgE OLP抗原刺激により分泌されたIFN−γサイトカインを確認するための実験(IFN−γELISAアッセイ)を、実験例2−5の方法により実施し、その結果を図18および図19にまとめている。
図18に示したように、二次免疫後にgEたんぱく質刺激により分泌されるIFN−γサイトカインの分泌量を観察したところ、典型的なTh1エフェクターサイトカインであるIFN−γの分泌量が、他のアジュバント群と比較して、gE+SLA−SE群において増加したことを確認した。
図19に示したように、二次免疫後にgE重複ペプチド刺激により分泌されるIFN−γサイトカインの分泌量を観察したところ、IFN−γの分泌量が、他のアジュバント群と比較して、gE、SLA、およびSEの組み合わせにより、増加したことを確認した。
図18および図19の結果を考慮にいれると、gE、SLAおよびSEを含む組成物は、他のアジュバント含有組成物と比較して、代表的なTh1エフェクターサイトカインの分泌量を増加させたが、これは、gE+SLA−SE組成物が、他の組成物よりも、より高い帯状疱疹の予防効果を有することを意味している。
実験例14:VZV特異的免疫原性を誘導するSLA−SEの最適な量の決定
表2は、最も効果的にVZV抗原特異的細胞性免疫反応(CMI)を誘導できるSLA−SEの最適な量を確認するための実験デザインを、まとめている。弱毒生ワクチン(LAV、3,000pfu)を雌C57BL/6マウスに1回皮下注射し、その後28日目に二次免疫(免疫化)を実施した。LAVプライミング後56日目に、白血球を脾臓サンプルから回収し、VZVに特異的な細胞性免疫反応(CMI)を確認した。
表2は、最も効果的にVZV抗原特異的細胞性免疫反応(CMI)を誘導できるSLA−SEの最適な量を確認するための実験デザインを、まとめている。弱毒生ワクチン(LAV、3,000pfu)を雌C57BL/6マウスに1回皮下注射し、その後28日目に二次免疫(免疫化)を実施した。LAVプライミング後56日目に、白血球を脾臓サンプルから回収し、VZVに特異的な細胞性免疫反応(CMI)を確認した。
gE抗原特異的細胞性免疫反応を実験例2−2の方法により測定し(IFN−γELISPOTアッセイ)、実験結果を図20にまとめている。
VZV抗原特異的細胞性免疫反応を実験例2−2に方法により測定し(IFN−γELISPOTアッセイ)、実験結果を図21にまとめている。
図20および図21の結果を考慮に入れると、VZV抗原特異的細胞性免疫反応を誘導するためのSLAの最適な量は、7.5μg〜20μgの範囲内であることがわかる。
Claims (10)
- グルコピラノシル脂質アジュバントが、R1、R3、R5およびR6がC11アルキルである式1のアジュバントである、請求項1に記載のワクチン組成物。
- グルコピラノシル脂質アジュバントが、R2およびR4がC13アルキルである式1のアジュバントである、請求項1に記載のワクチン組成物。
- グルコピラノシル脂質アジュバントが、R2およびR4がC9アルキルである式1のアジュバントである、請求項1に記載のワクチン組成物。
- グルコピラノシル脂質アジュバントが、ワクチン組成物の1回投与量中に、7.5μg〜20μgの量で含有される、請求項1に記載のワクチン組成物。
- グルコピラノシル脂質アジュバントが、ワクチン組成物の1回投与量中に、9μg〜18μgの量で含有される、請求項5に記載のワクチン組成物。
- 代謝可能油がスクアレンである、請求項1に記載のワクチン組成物。
- スクアレンが、ワクチン組成物全体の1%(v/v)〜7%(v/v)の量で含有される、請求項7に記載のワクチン組成物。
- スクアレンが、ワクチン組成物全体の1%(v/v)〜4%(v/v)の量で含有される、請求項8に記載のワクチン組成物。
- 糖たんぱく質Eが、ワクチン組成物の1回投与量中に、5μg〜100μgの量で含有される、請求項1に記載のワクチン組成物。
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