CZ302811B6

CZ302811B6 - Vakcinacní prostredek

Info

Publication number: CZ302811B6
Application number: CZ20032326A
Authority: CZ
Inventors: Mohammed Slaoui@Moncef
Original assignee: Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Priority date: 1999-09-07
Filing date: 2000-09-07
Publication date: 2011-11-23
Also published as: WO2001017551A2; ATE321569T1; CN1325117C; DE60024893T2; TW200408405A; DE60024893D1; ES2253636T3; CO5280045A1; HK1048435A1; PL354039A1; CA2443214A1; US20040126394A1; HU0303215D0; BR0014171A; TWI258374B; ATE312624T1; HUP0303215A3; NO20021116L; NO332800B1; CN1618465A

Abstract

Podstatu rešení tvorí vakcinacní prostredek, který obsahuje cástice podobné viru HPV16L1, cástice podobné viru HPV18L1, hydroxid hlinitý a 3D MPL jako stimulátor odezvy bunek TH1. Vakcinacní prostredek je velmi výhodný pro aplikaci adolescentum, pro které je infekce virem HPV zvlášte nebezpecná.

Description

Oblast techniky

Popisují se nové vakcinační prostředky, způsoby jejich přípravy a jejich použití při terapii. Zvláště se popisují kombinační vakcíny pro aplikaci adolescentům.

io Dosavadní stav techniky

Papiloma viry jsou nádorové viry obsahující malou molekulu DNA, které jsou vysoce specifické. Popisuje se přes 70 jednotlivých genotypů lidských papilomavirů (HPV), HPV jsou v obecném případě specifické buď pro kůži (například HPV-1 a 2), nebo pro povrchy sliznic (např. HPV-6 i5 a HPV-11) a obvykle způsobují benigní nádory (bradavice), které přetrvávají několik měsíců nebo let. Takové benigní nádory mohou jedince obtěžovat, ale až na několik výjimek neohrožují jejích život.

Některé viry HPV jsou také spojeny se zhoubným bujením. Nej silnější pozitivní vztah mezi HPV a lidským zhoubným bujením je ten, který existuje mezi HPV-16 a HPV-18 a karcinomem děložního čípku. Karcinom děložního čípku je nejběžnější zhoubné bujení v rozvojových zemích. V každém roce se ve světě objeví přibližně 500 000 nových případů. V současné době je technicky možné aktivně bojovat s primárními infekcemi HPV-16 a dokonce prokázat HPV-16, které jsou obsaženy ve zhoubném bujení, použitím vakcíny. Popis možnosti proťylaktické a terapeutic25 ké vakcinace proti HPV-16 se popisuje v publikaci Cason J., Clin. Immunother. 1994, 1(4) 293 až 306 a Hagenesee Μ. E., Tnfections in Medícíne 1997 14(7) 555 až 556, 559 až 564).

Další HPV, které jsou středem zájmu jsou sérotypy 31, 33 a 45.

Izolovaly se různé typy HPV a charakterizovaly se pomocí klonovacích systémů v bakterii a amplifikací PCR. Molekulová organizace genomů HPV se definovala srovnáním genomu, dobře charakterizovaného bovinního papilomavirů typu 1 (BPV 1).

Ačkoli se objevují minoritní variace, všechny popsané genomy HPV mají alespoň sedm časných genů, El až E7 a dva pozdní geny LI a L2. Navíc sekvence proti směru exprese genu nese regulační sekvence, které řídí transkripci genomu HPV.

Geny El a E2 se podílí na virové replikaci a transkripční kontrole a mají tendenci porušit integraci viru. E6 a E7 a jistý důkaz ukazuje, že také gen E5 se podílí na virové transformaci.

dn

U HPV, kteří se podílejí na karcinomu děložního čípku, jako je HPV 16 a 18, onkogenní proces začíná po integraci virovou DNA, Integrace vede k deaktivaci genů, které kódují kapsidové proteiny LI a L2 a při instalaci pokračuje nadměrná exprese dvou Časných proteinů E5 a E7, které povedou k postupné ztrátě normální buněčné diferenciace a k vývoji karcinomu.

Karcinom děložního čípku je běžný u žen a vyvíjí se přes stadium prekarcinomu až do stadia ínvazivního karcinomu, který často vede k úmrtí. Stadium prekarcinomu je známé jako cervikální intraepiteliální neoplázie a hodnotí se stupněm I až III se vzrůstající vážností.

Klinicky se infekce HPV ženského pohlavního ústrojí jeví jako cervikální plochý kondylom, jehož charakteristickým znakem je koilocytóza ovlivňující převážně superficiální a intermediální buňky cervikálního dlaždicového epitelu.

- 1 CZ 302811 B6

Koilocyty, které jsou důsledkem cytopatického účinku viru se jeví jako buňky s více jádry s perinukleární zřetelnou aureolou. Epitel zesílil abnormální keratinizací, která je odpovědná za bradavicový obraz léze.

Takové ploché kondylomata, když jsou pozitivní na sérotyp HPV 16 a 18 jsou vysoce nebezpečné faktory pro vývoj cervikální intraepiteliální neoplázie (CÍN) a karcinomu in sítu (CIS), které tvoří pre kurzorové léze invazi vní ho cervikální ho karcinomu.

Dokument WO 96/19 496 popisuje varianty lidských papilomavirových proteinů E6 a E7, zvláště io fúzních proteinů E6/E7 sdeiecí v obou proteinech E6 a E7. Tyto deleční fúzní proteiny jsou imunogenní.

Vakcíny založené na HPV LI se popisují v dokumentech WO 94/00 152, WO 94/20 137, WO 93/02 184 a WO 94/05 792. Taková vakcína může obsahovat antigen LI, jako monomer, kapsomér nebo Částice podobné viru. Takové částice mohou navíc obsahovat proteiny L2. Vakcíny založené na L2 se popisují například v dokumentu WO 93/00 436. Jiné vakcíny HPV jsou založeny na časných proteinech, jako je E7, nebo na fúzních proteinech, jako je L2-E7.

Je nutné vytvořit účinnou kombinaci vakcín, aby se zabránilo vzniku onemocnění, ke kterým jsou io adolescenti zvláště náchylní.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje vakcinační prostředek obsahující:

(a) antigen viru herpes simplex (HSV) a (b) antigen lidského papilomaviru (HPV) jo v kombinaci s adjuvans, kterým je výhodný stimulátor odezvy buňky ΤΗ 1.

Vakcinační prostředek podle vynálezu je pro aplikaci výhodnější pro adolescenty, pro něž je HSV a/nebo HPV infekce zvláště nebezpečná.

Imunitní odezva se dá rozdělit do dvou extrémních kategorií, které vykazují humorální nebo buněčnou imunitní odezvu (tradičně charakterizovanou proti látkovým a buněčným efektorovým mechanizmem ochrany). Tylo kategorie odezvy jsou typ THI (buněčná odezva) a imunitní odezvy typu TH2 (humorální odezva).

Extrémní imunitní odezvy typu THI se mohou charakterizovat vytvořením antigenně specifických, haplotypově omezených cytotoxických lymfocytů T a přirozené odezvy buněk K. U myší se odezvy THI často charakterizují vytvořením protilátek subtypu IgG2a, zatímco u člověka odpovídá protilátkám typu IgGl. Imunitní odezvy typu TH2 se charakterizovaly vytvořením rozmezí imunoglobulinových izotypů, které zahrnují IgGl.

Zvažuje se, že hnací síla vývoje těchto dvou typů imunitních odezvy jsou cytokiny. Velké množství cytokinů typu THI má tendenci vyvolat buněčné imunitní odezvy na daný antigen, zatímco velké množství cytokinů typu TH2 má tendenci vyvolat humorální imunitní odezvy na antigen.

Jednoznačné imunitní odezvy typu TH2 a THI nejsou absolutní. U jedince bude podporovat imunitní odezvu, která se popisuje jako převažující THI nebo TH2. Často však není vhodné zvažovat rodinu cytokinů podle myších CD4+ v klonech buněk T (popisuje se v publikaci Mosmann, T. R. and Coffman, R. L. (1989) ΤΗ 1 and TH2 celíš: diffemet pattems of lymphokine secretion lead to different functionalproperties. Annual Review of Immunology, 7, p. 145 až 173). Tradičně odezvy typu TH1 jsou spojeny s produkcí cytokinů INF-γ pomocí T-lymfocytů. Jiné cytokiny jsou často přímo spojeny s buňkami μι otlukovanými T—buňkami, jako jč ÍL—12. Naopak odezvy typu TH2 jsou spojeny s vylučováním IL-4, 1L-5, IL-6, IL-10 a faktorem nekrózy nádoru β (TNF-β).

Je známo, že jistá vakcinaění adjuvans jsou zvláště vhodná ke stimulaci cytokinové odezvy buď typu TH1, nebo TH2. Tradičně nejlepší indikátory rovnováhy TH1 a TH2 imunitní odezvy po vakcinací nebo po injekci zahrnují přímé měření produkce cytokinů TH1 nebo TH2 T lymfocyty in viiro po restimulaci antigenem a/nebo (alespoň u myší) měření poměru IgGl : IgG2a protilátkové odezvy, která je specifická pro antigen.

Adjuvans typu 1 je to, které stimuluje izolovanou populaci T buněk k produkci vysokého množství cytokinů typu TH1, kdy je opětně stimulován s antigenem in vitro a vyvolává imunoglobulinové odezvy specifické pro antigen spojené s isotypem typu TH1.

Adjuvans, kterájsou schopná výhodně stimulovat odezvu buňky TH1 jsou popsaná v mezinárodní patentové přihlášce WO 94/00 153 a WO 95/17 209.

3-de-O-acylovaný monofosforylový lipid A (3D-MPL) je jedno z takových adjuvans. Popisuje se v dokumentu GB 2 220 211 (Ribi). Chemicky jde o směs 3-de-O-acylovaného monofosforylovaného lipidu A s 4, 5 nebo 6 acylovaných řetězců připravených firmou Ribi Immunochen, Montana. Výhodná forma 3-de-O-acylovaného monofosforylovaného lipidu A se popisuje v evropském patentu EP 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologics SA).

Částice 3D—MPL jsou dostatečně malé, aby se sterilizovaly filtraci přes membránu s póry o velikosti 0,22 mikronů (jak se popisuje v evropském patentu EP 0 689 454). 3D-MPL budou přítomny v dávce v rozmezí 10 až 100 pg, s výhodou 25 až 50 pg, kde antigen je v typickém případě přítomen v dávce v rozmezí 2 až 50 pg.

Nosič je s výhodou také přítomen ve vakcinačním prostředku podle vynálezu. Nosičem je olej ve vodní emulzi nebo hliníková sůl, jako je fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý.

Výhodná emulze olej ve vodě obsahuje metabolizovatelný olej, jako je skvalen, alfa-tokoferol a Tween 80. Navíc emulze olej ve vodě může obsahovat spán 85 a/nebo lecitin a/nebo trikaprvlín.

V určitém preferovaném provedení vynálezu se antigeny ve vakcinačním prostředku mohou kombinovat podle vynálezu s 3D—MPL a alum.

, . , ‘ t ' V t I w I · I 1 Γ . 1 '1 . im . 'ΓΛ * mi 1. ...1... ,.“fx ___í J'.

v ly piUKtiii μι ipau^ iiujm. αμιιη.ώνν a _> l>^—i»n u, uuuvu pí uuiniiji »v vuituiuuuiii uuv iulmezí 1 až 200 pg, jako 10 až 100 pg, s výhodou 10 až 50 pg.

V jednom preferovaném provedení vynálezu antigen HPV ve vakcinačním prostředku podle vynálezu obsahuje hlavní kapsidový protein LI HPV a protein L2, zvláště HPV 16 a/nebo HPV 18. V tomto provedení výhodná forma proteinu L2 je zkrácený protein L2. Protein LI ve fúzi L1-L2 je ve formě částic podobných viru (VLP). Protein LI se může fúzovat sjiným proteinem HPV, zvláště s proteinem E7 za vzniku fúze L1-E7. Zvláště jsou výhodné chimérové VLP obsahující Ll-E nebo L1-L2-E.

Proteiny podle vynálezu se s výhodou exprimují v mikroorganizmu E. coli. Ve výhodném provedení vynálezu se proteiny exprimují s histidinovým koncem, který obsahuje mezi 5 až 9 s výhodou 6 histidinových zbytků. Tento histidinový konec je výhodný při zjednodušení čištění. Popis výroby takových proteinů se zcela popisují v patentové přihlášce UK GB 9 717 953.5.

- j CZ 302811 B6

Antigen HPV ve vakcinačním prostředku se může adsorbovat na Al(OH)₃.

Ve výhodném vakcinačním prostředku podle vynálezu je multivalentní vakcínou například tetravalcntní nebo pentavalentní vakcína.

s

Přípravky podle vynálezu jsou velmi účinné při vyvolání imunity, dokonce s velmi nízkou dávkou antigenu.

Přípravky poskytují skvělou ochranu proti primární infekci a stimulují výhodně humorální imuio nitní odezvu a imunitní odezvu zprostředkovanou efektorovými buňkami (DTH).

Vynález dále popisuje vakcinační prostředek vhodný pro použití v medicínské terapii, zvláště při použití při léčbě nebo profylaxi lidské papilomavirové infekce.

Vakcína podle vynálezu dále obsahuj imunoprotektivní množství antigenů a může se připravit běžným způsobem. Příprava vakcinační ho prostředku se v obecném případě popisuje v publikacích Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, Powwell and Newman, PlenurnPress, 1995, New Trends and Developments in Vaccínes, Voliér et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Tvorba kapsulí v lipozómech se

2o popisuje například v publikaci patent US 4 235 877. Spojení proteinů s makromolekulami se popisuje například v dokumentu Likhite, patent US 4 372 945 a Armor et al., patent US 4 474 757.

Množství proteinu v každé vakcinační dávce se vybralo jako množství, které zahrnuje imuno25 ochrannou odezvu bez podstatných nežádoucích účinků, jako je tomu u typických vakcín. Takové množství bude kolísat v závislosti na volbě specifického imunogenu. V obecném případě se očekává, že každá dávka bude obsahovat 1 až 1000 pg proteinu, s výhodou 2 až 100 pg, více se upřednostňuje 4 až 40 pg. Optimální množství pro určitou vakcínu se může zjistit standardní studií, která zahrnuje pozorování titrů protilátek a jejich odezvy. Po 4 týdnech po počáteční vak30 cinaci subjektu se může dále aplikovat zesilující dávka.

Vedle vakcinace osob náchylných k infekcích HPV nebo HSV farmaceutické prostředky podle vynálezu se mohou použít k léčbě pacientů trpících uvedenou virovou infekcí.

Jestliže je to nutné mohou se přidat další antigeny v libovolném pořadí, aby vznikl multivalentní vakcinační prostředek, popsaný dále v textu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Komparativní imunogennost HPV Ags/HBs/gD monovalentní nebo v kombinační vakcíně vytvořené s AS04.

Úvod

Studie imunogenností se uskutečnila u myší Balb/C za použití čtyř různých antigenů:

I. částice podobné virovému HPV 16L1 (VLP-16)

2. částice podobné virovému HPV18L1 (VLP-18)

3. antigen gD HSV-2

4. HBsAg

-4 CZ 302811 B6 spojených s Alum/3D-MPL (AS04) za použití předem adsorbovaného antigenů nebo 3D-MPL ___ A Ι/ΓΛΤΤλ A inr\ ita 173 ncuv nu v/4.

Přípravek 3D~MPL/AI(OH)3 se označuje jako AS04D, zatímco přípravek založený na 3DMPL/AIPO4 se označuje jako AS04C.

Posuzovaly se následující vakcíny:

1. VLP16 +VLP18 AS04D,

2. gD AS04D,

3. HBs AS04C a hodnotila se možnost kombinovat tyto vakcíny.

Cíl uvedeného experimentuje porovnat imunogennost dvou různých kombinací AS04 vytvořených buď

1. VLP16 + VLP18 a gD

2. VLP16 + VLP18 a gD a HBs Ag.

Experimentální protokol se zcela popisuje v sekci Materiál a metody.

Skupina deseti myší se intramuskulámě imunizovala dvakrát v tří týdenních intervalech pomocí různých prostředků založených na Ag. Protilátková odezva na VLP, gD a HBs Ag a izotypický profil vyvolaný vakcinaci se monitorovala testem ELISAvden 14 po druhé vakcinaci. Ve stejný časový okamžik se po opětné stimulaci in vitro slezinných buněk analyzovala produkce cytokinů (ÍFNy/IL5) antigeny VLP, gD nebo HBs.

Materiály a metody

Prostředek

Složení prostředku

VLP 16, VLP18, gD a HBs vytvořené s 3D-MPL absorbovaného na soli hliníku.

Použité složky

siozxa	Koncentrace:	putr
HPV 16 VLP	560 gg/ml	Tris 20 mM/NaCl 500 mM
HPV 18 VLP	550 gg/ml	NaCl 500 mM/NaP0₄ 20 mM
AI(OH)₃	10 380 gg/”l	H₂O
gD	443 pg/ml	PBS pH 7,4
3D-MPL	1 170 pg/ir.l	voda vhodná pro přípravu injekce
A1PO₄	5 mg/ml	NaCl 150 mM

- 5 CZ 302811 B6

Ad sorpce

a) adsorpce V LP

Čištěné VLP16 a VLP18 se přidaly k AI(OH)₃, aby se získal poměr 2 pg VLP/10 pg AI(OH)₃. Směs se uchovávala při teplotě mezi 2 až 8 °C až do vzniku konečného prostředku.

b) gD adsorpce to 2 pg gD se smíchaly s 10 pg Al(OH)₃. Směs se uchovávala při teplotě mezi 2 až 8 °C až do vytvoření konečného přípravku.

c) adsorpce HBs

2 pg HBs se smíchaly s 10 pg A1PO₄. Směs se uchovávala při teplotě mezi 2 až 8 °C až do vytvoření konečného prostředku.

d) adsorpce 3D-MPL

5 pg 3D-MPL se smíchalo s 10 pg A1(OH)₃. Směs se uchovávala při teplotě 2 až 8 °C do vytvoření konečného prostředku.

Prostředek

Smíchala se H₂O a NaCI (10 x koncentrovaný) a po 10 minutách míchání při teplotě místnosti se přidaly další složky: adsorbovaný antigen, adsorbovaný 3D-MPL a AI(OH)₃ (uvádí se v tabulce dále v textu). Směs se míchala při teplotě místnosti po dobu 10 minut a uchovávala se při teplotě 4 °C až do aplikace injekcí.

Skupina	Antigen	Imunostimulant	přídavné	činidlo
typ	pg	typ	pg	typ	pg
A	gD	2			Al(OH)3	10
	vlpi6	2			Al(OH)₃	10
	vLPis	2			A1(OH)₃	10
			3D-MPL	5	A1(OH)3	10
					Al(OH)3	10
B	gD	2			A1(OH)₃	10
	vlpi6	2			Al(OH)3	10
	vlpi8	2			A1(OH)₃	10
	HB	2			AIPO4	10
			3D-MPL	5	A1(OH)₃	10
C	gD	2			Al(OH)₃	10
			3D-MPL	5	Al(OH)3	10
					Al(OH)₃	30

-6CZ 302811 B6

Myší sérologie

Anti-VLP-18 a anti-VLP-18 sérologie

Stanovení množství anti-VLP16 a anti~VLP18 protilátek se provedlo testem ELISA za použití VLP 503/1 (20.12.1999) a VLP18 504/2 (25.10.99F) jako potahových antigenů. Roztok antigenů a protilátek se použil v množství 50 μΐ na jednu prohlubeň. Antigen se ředil tak, aby konečná koncentrace byla 0,5 gg/ml v PBS a adsorboval se pres noc při teplotě 4 °C na mikrotitrační destičky s 96 prohlubněmi (Maxisorb Immunodestičky, Nunc, Dánsko). Destičky se inkubovaly po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C s PBS, které obsahuje 1% bovinní sérový albumin. Dvojnásobné ředění séra (počáteční ředění 1/400) v saturačním pufru se přidalo do prohlubní potažených VLP a inkubovaly se po dobu 1 hodiny a 30 minut při teplotě 37 °C. Destičky se promyly čtyřikrát PBS 0,1% Tween 20 a do každé prohlubně se přidalo anti-myší Ig konjugované s biotinem (Amersham, UK) ředěné 1:1500 v saturačním pufru. Destičky se inkubovaly po dobu 1 hodiny a 30 minut pri teplotě 37 °C. Po promytí se přidal streptavidin-biotinylovaný peroxidázový komplex (Amersham UK) ředěný 1/1000 v saturačním pufru a inkubace pokračovala po dalších 30 minut pri teplotě 37 °C. Destičky se promyly shora v textu popsaným způsobem a inkubovaly se po dobu 20 minut v roztoku o-fenylendiaminu (Sigma) 0,04 %, H₂O₂ 0,03 % v 0,1 % Tween 20, 0,05M citrátovém pufru pH 4,5. Reakce se zastavila 2N kyselinou H₃SO₄a hodnoty se odečítaly pri vlnové délce 490/630 nm. Titry ELISA se vypočítaly SoftmaxPro (za použití rovnice se čtyřmi parametry) a exprimovaly se v ekvivalentních jednotkách na 1 ml.

Anti-gD odezva

Kvantifikace protilátek proti gD se provedla testem ELISA za použití gD (gD 43B318) jako potahového antigenů. Roztoky antigenů a protilátek se použily v množství 50 μί v jedné prohlubni. Antigen se ředil na konečnou koncentraci 1 pg/ml v PBS a adsorboval se přes noc pri teplotě 4 °C do prohlubní destiček, které obsahují 96 prohlubní (Maxisorb Immunodestičky, Nunc, Dánsko). Destičky se inkubovaly po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C s PBS, který obsahuje 1 % bovinní sérový albumin a 0,1% Tween 20 a anti-myší IgG 1, IgG2a a IgG2b nebo Ig konjugované s biotinem (Amersham, UK) ředěné 1/1 500 nebo se do každé prohlubně přidal lgGl, IgG2a, IgG2b (IMTECH, USA) ředěné v koncentraci 1/4000, 1/8000, 1/4000 v saturačním pufru a směs se inkubovala pri teplotě 37 °C 1 hodinu 30 minut. Po promytí, se přidal streptavidinbiotinylovaný peroxydázový komplex (Amersham, UK) ředěný l/l000 v saturačním pufru a vše se inkubovalo po dobu 30 minut při teplotě 37 °C. Destičky se promyly, jak se popisuje shora v textu a vše se inkubovalo po dobu 20 minut v roztoku o-fenylendiamin (Sigma) 0,04 % H₂O₂, 0,3 % v roztoku 0,01% Tween 20, 0,05M citrátový pufr pH4,5. Reakce se zastavila 2N kyselinou sírovou a hodnoty se odečítaly pri vlnové délce 490/630 nm. Titry testu ELISA se vypočítaly z odkazu na r f · v. v 1. \ . ..'..1 . JI„. , , ------.·------1., .. „I,..:.

ΟΟΠίΙΙΛΑΓίυ pUUZJLl 1UVI1IW U Uljd UVZ.11<XI1 ivuny a U/\{Jl liliu vúlj v V1\ « 1 « uiviiimvik jednotkách na 1 ml.

Produkce cytokinů

Dva týdny po druhé imunizaci se myši usmrtily, asepticky se vyňala slezina. Připravila se suspenze buněk v médiu RPMI 1640 (GIBCO), která obsahuje 2mM L-glutamin, antibiotika, 5x10“³ M 2-merkaptoetanol a 5% fetální telecí sérum. Buňky se kultivovaly v konečné koncentraci 5xí O⁶ buněk/ml v množství 1 ml na destičky s 24 prohlubněmi s různou koncentrací (10 až 1 pg/ml) každého Ag (VLP, gD nebo antigeny HBS). Supematanti se sklidili o 96 hodin později, zamrazili se až do okamžiku, kdy se u nich testovala přítomnost IFNy a IL5 testem ELISA.

- 7 CZ 302811 B6

IFNy (Genzyme)

Stanovení množství IFNy se provedlo testem ELIS A za použití činidel od firmy Genzyme. Roztoky vzorků a protilátek se použila v množství 50 μΐ na prohlubeň. Mikrotitrační destičky s 96 prohlubněmi (Maxisorb Immuno-destičky, Nunc, Dánsko) se potáhly přes noc při teplotě 4 °C 50 μΐ křečcích anti-myších IFNy ředěných na koncentraci 1,5 pg/ml v karbonátovém pufru pH 9,5. Destičky se inkubovaly po dobu jedné hodiny pří teplotě 37 °C se 100μ1 PBS, které obsahují 1 % bovinní sérový albumin a 0,1% Tween 20 (saturační pufr). Dvojnásobné ředění supematantu za stimulace in vitro (začínající v polovině) v saturačním pufru se přidalo na destičky potažené anti-IFNy a inkubovalo se po dobu jedné hodiny 30 minut při teplotě 37 °C. Destičky se promyly čtyřikrát PBS Tween 0,1 % (promývací pufr) a do každé prohlubně se přidaly kozí anti-myší IFNy v saturačním pufru v konečné koncentraci 0,5 pg/ml a destičky se inkubovaly po dobu jedné hodiny 30 minut při teplotě 37 °C. Po promytí se přidal konjugát AMDEC (Amersham) ředěný 1/10 000 v saturačním pufru a destičky se inkubovaly při teplotě 37 °C po dobu 30 minut. Destičky se promyly, jak se popisuje shora v textu a inkubovaly se s 50 μΙ TMB (Biorad) po dobu 10 minut. Reakce se zastavila 0,4N kyselinou sírovou a hodnoty se odečítaly pří vlnové délce 450/630 nm. Koncentrace se vypočítaly za použití standardní křivky (použitím standardu myšího IFNy) pomocí SoftmaxPro (rovnice se čtyřmi neznámými) a exprimovaly se v jednotkách pg/ml.

1L5 (Pharmigen)

Kvantifikace ÍL5 se provedla testem ELIS A za použití Činidel od firmy Pharmigen. Roztoky vzorků a protilátek se použily v množství 50 μΐ na jednu prohlubeň. Mikrotitrační destičky s 96 prohlubněmi (Maxisorb Immuno-destičky, Nunc, Dánsko) se potáhly přes noc při teplotě 4 °C 50 μΐ krysími anti-myšími IL5 ředěnými v koncentraci 1 μg/ml v karbonátovém pufru pH 9,5. Destičky se inkubovaly po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C se 100 μΐ PBS, který obsahuje 1% bovinní sérový albumin a 0,1% Tween 20 (saturační pufr). Dvojnásobné ředění supematantu ze stimulace in vitro (začínající v polovině) v saturačním pufru se přidalo na destičky potažené anti-IL5 a inkubovalo se po dobu jedné hodiny 30 minut při teplotě 37 °C. Destičky se promyly čtyřikrát PBS Tween 0,1% (promývací pufr) a do každé prohlubně se přidaly krysí antimyší IL5 konjugované s biotinem v saturačním pufru v konečné koncentraci 1 pg/ml a destičky se inkubovaly po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C, Po promytí se přidal konjugát AMDEX (Amersham) ředěný 1/10 000 v saturačním pufru a destičky se inkubovaly při teplotě 37 °C po dobu 30 minut. Destičky se promyly, jak se popisuje shora v textu a inkubovaly se s 50 μΐ TMB (Biorad) po dobu 15 minut. Reakce se zastavila 0,4N kyselinou sírovou a hodnoty se odečítaly při vlnové délce 450/630 nm. Koncentrace se vypočítaly za použití standardní křivky (použitím rekombinantního myšího IL-5) pomocí SoftmaxPro (rovnice se čtyřmi neznámými) a exprimovaly se v jednotkách pg/ml.

-8CZ 302811 B6

Skupiny

Skupiny myší Balb/C se imunizovaly intramuskulámě s následujícími prostředky:

Tabulka l: Skupiny a prostředky

Skupina	přípravek
A	VLP16 2 pg, VLP18 2 pg, 3D-MPL 5 pg, Al(OH)₃ 50 pg
B	VLP16 2 pg, VLP18 2 pg, HBs 2 pg, gD 2 pg, 3D-MPL 5
1	pg, A1(OH)₃ 40 pg, A1PO₄ 10 pg
c	gD 2 pg, 3D-MPL 5 pg, A1(OH)₃ 50 pg
D	VLP16 2 pg, VLP18 2 pg, 3D-MPL 5 pg, Al(OH)₃ 50 pg
E 1	HBs 2 pg, 3D-MPL 5 pg, AlP0₄ 10 pg, A1(OH)₃ 40 pg

Detailní informace o prostředcích se uvádějí v sekci Materiály a Metody.

Výsledky

1. Sérologie

a) odezva anti—VLP16

Humorální odezvy (Ig) se měřily testem ELISA za použití VLP 16 503-1 (20.12.99) jako potahového antigenu. Provedla se analýza séra získaného v den 14 post II.

Obrázek č. 1 zobrazuje protilátkové odezvy proti VLP16 Ig měřené u jednotlivých sér v den 14 post II.

Titry získané proti VLP16 získané po imunizaci s kombinací VLP, gD a HBs Ag (skupina B) jsou slabě nižší než titr získaný buď kombinací VLP a gD (skupina A), nebo monovalentní prostředky VLP (skupina D) (GMT respektive 27 578 verzus 48 105 ekvivalentních jednotek na 1 ml verzus 44 448 ekvivalentních jednotek na 1 ml). Dříve než se provedla statistická analýza, aplikoval se T—Gerubbův test za účelem exkluze dat. Za účelem analýzy se eliminovaly dvě myši, které nevykazují odezvu ve skupinách A a D.

Rozdíly pozorované mezi skupinami nebyly statisticky podstatné v Studentově testu podle Newman Keuls.

b) Odezva proti VLP18

Humorální odezvy (Ig) se měřily testem ELISA za použití VLP 18 504-2 (25.10.99), jako potahového antigenu. Sérum se analyzovalo v den 14 post II.

Na obrázku č. 2 je zobrazena anti-VLP18 Ig protilátková odezva měřená v individuálním séru v den 14 post II.

Titry protilátek proti VLP18 získané po imunizaci s kombinací VLP, gD a HBs Ag (skupina B) měly stejnou hodnotu jako titry získané buď kombinací VLP a gD (skupina A), nebo monova- 9 CZ 302811 B6 lentní prostředek VLP (skupiny D) (GMT respektive 56 078 verzus 88 786 ekvivalentní jednotky na I ml verzus 76 991 ekvivalentní jednotky najeden mililitr).

Před každou statistickou analýzou se u každé populace aplikoval T-Grubbův test, aby došlo 5 k exkluzi dat. V případě analýzy se ve skupině A a D eliminovaly dvě myší, které nevykazují odezvu.

Pozorované rozdíly se prokázaly použitím jednosměrné analýzy testu rozptylu jako statisticky nepodstatné.

Iť)

c) Anti-gD odezva

Humorální odezvy (Ig a isoserotyp) se měřily testem ELIS A za použití gD jako potahovacího antigenu. Provedla se analýza séra získaného v den 14 post II.

Na obrázku č. 3 jsou zobrazeny protilátkové odezvy proti gD v individuálním séru získaném v den 14 post II;

S ohledem na anti-gD odezvu v GMT získaném kombinací VLP/gD/HBS (skupina B) se 20 pozoroval slabý vzestup ve srovnání se samotným gD (skupina C) nebo kombinace VLP/gD (skupina A) (GMT respektive 18 631 verzus 32 675 verzus 27 058 ekvivalentních jednotek na 1 ml).

Dříve než se provedla statistická analýza, u každé populace se provedl T-Grubbův test, aby došlo 25 k exkluzi dat. Z analýzy se eliminovaly dvě myši ve skupině A, které nevykazují odezvu.

Jednosměrná analýza testu rozptylu se provedla s titry proti gD po log transformaci dat post II. Mezi třemi prostředky se nepozorovaly podstatné rozdíly.

jo Isotypický přípravek analyzovaný slitým sérem byl následující;

	isotypická náhrada (*)
	IgGl	IgG2a	IgG2b
skupina A	96	3	2
skupina B	96	3	2
skupina C	97	1	1

V izotypickém profilu se nepozoroval žádný rozdíl vyvolaný třemi prostředky: odezva IgGl (96 až 97 % IgG 1) se hlavně vyvolala ve 3 skupinách, jak se uvádí v tabulce dále v textu,

d) Odezva proti HBs

Humorální odezvy (Ig a izotypy) se měřily testem EL1SA za použití HBsAg (Hep286) jako pota40 hovacího antigenu. Analyzovala se séra získaná v den 14 post II.

Na obrázku č. 4 jsou zobrazeny protilátkové odezvy proti HBs měřené u jednotlivého séra získaného v den 14 post II.

Slabě nižší proti látková odezva proti HBs se pozorovala v kombinační skupině B, která obsahuje antigeny VLP, gD a HBs ve srovnání se samotným antigenem HBs (skupina E) (GMT 28 996 ekvivalentní jednotka najeden mililitr verzus 20 536 ekvivalentních jednotek na 1 ml).

- 10CZ 302811 B6

Jednosměrná analýza rozptylu se provedla s titry protilátek proti HBs pro log transformaci dat pubi li. uiczj bKUpuiuu o ( vur/nDh/gu) a bKupJiivu n (run puuzium □luuculuvu icbiu podle Newmana a Keulse se nezjistily podstatné rozdíly.

Isotypická náhrada analyzovaná spojeným sérem bal následující a nevykazuje žádné rozdíly mezi 2 skupinami s poměrem ígG2 chráněném v kombinační vakcíně.

	Isctypická náhrada (%}
	IgGl	IgG2a	XgG2b
skupina B	54	24	21
skupina E	56	23	21

to 2. Imunitní odezva zprostředkovaná buňkami

Imunitní odezvy zprostředkované buňkami (produkce IFNy/lL5) se hodnotily v den 14 post II po in vitro opětné stimulaci slezinných buněk antigeny VLP, gD nebo HBs. V případě každé skupiny myší se spojilo 5 orgánů. Experimentální postup se zcela popisuje v sekci Materiál a meto15 dy.

3. Produkce cytokinů

a) in vitro opětná stimulace pomocí VLP16 a VLP18

Na obrázku 5 je znázorněna produkce cytokinů sledovaná v slezinných buňkách po 96 hodinách in vitro opětné stimulace pomocí VLP16.

Na obrázku ě. 6 je zobrazena produkce cytokinů sledovaná v slezinných buňkách po 96 hodinách 25 in vitro opětné stimulace antigeny VLP.

Při použití dávky 10 pg a 1 pg Ag při opětné stimulaci antigeny VLP se na produkci cytokinů nepozoroval žádný účinek rozdílných dávek.

Se všemi prostředky se pozoroval jasný profil TH1.

Tabulka č. 2: Poměr ÍFN-y/IL-ó po in vitro opětné stimulaci s V LPI 6 a VLP18.

pomei. 11 n/íl-d	skupina A	skupina ts	i—:-;-z i sxupxna o
VLP16 10 pg/ml	5,2	8,9	11,8
VLP16 1 pg/ml	15,1	14,3	16, 5

poměr IFN/IL-5	skupina A	skupina B	skupina D
VLP18 10 pg/ml	19,6	11,1	16,1
VLP18 1 pg/ml	23,2	14,3	18,2

b) opětná stimulace in vitro pomocí gD

Obrázek č. 7 zobrazuje produkci cytokinů sledovanou ve slezinných buňkách po 96 hodinách 40 in vitro opětné stimulace s antigenem gD.

Jestliže se použije pro opětnou stimulaci dávka 10 pg a 1 pg nepozoroval se žádný účinek rozmezí dávky.

IFN-γ se tvořil v porovnání s IL-5 v daleko vyšší koncentraci (tabulka č. 3), což ukazuje, že ve všech skupinách se objevil jasný profil ΤΗ—1 (monovalenty verzus kombinace).

Tabulka č. 3: Poměr IFN-y/lL-5 po in vitro opětné stimulaci s gD.

poměr IEN/IL-5	skupina Λ	skupina B	skupina D
gD 10 μς/ml	6,2	7,2	3/1
gD 1 pg/'ml	6,2	11,2	2,3

c) opětná stimulace in vitro pomocí HBs

Obrázek č. 7 zobrazuje produkci cytokinů sledovanou ve slezinných buňkách po 96 hodinách in vitro opětné stimulace s antigenem HBs.

Podstatná produkce IFN-γ, ale nikoli IL5, se pozorovala ve skupině B. Jak je zobrazeno v tabulce 2, vyšší produkce IFN—γ ve srovnání se skupinou B se pozorovala ve skupině E. Avšak ve skupině E se pozorovala vyšší hodnota IFN-γ pozadí (HBs monovalentní) v případě kontrolního měření opětné stimulace bez antigenu. Velmi vysoký poměr IFN-y/IL-S se pozoroval s monovalentní vakcínou, což naznačuje, že se vyvolává silná odezva THI. Podobně, poměr IFN—γ/Ι L—5 se měřil s kombinovanou vakcínou, která uděluje schopnost prostředku také vyvolávat odezvu THI.

Tabulka č. 4: Poměr IFN—γ/IL—5 po in vitro opětné stimulaci s HBs.

poměr IFN/IL-5	skupina B	skupina E
HBs 10 pg/ml	15,8	65/ 3
HBs 1 pg/ml	7/6	67/6

Závěr

Účinek prostředku VLP/gD nebo VLP/gD/HBsAg spojených s AS04 na imunogennost se hodnotil u myší Balb/C:

S ohledem na serologickou analýzu nemá vliv na sérologii anti-VLP, anti-gD a anti-HBs Ag kombinace.

Kombinace antigenů VLP a gD nebo VLP, gD a HBs neinterferuje s izotypickým profilem protilátkové odezvy vyjádřené pomocí monovalentních vakcín gD a HBs.

Pří hodnocení cytokinů profil TH-I (poměr IFN-y/lL-5) pozorovaný u každé monovalentní vakcíny se potvrdil kombinací skupin vakcín.

Claims

5 1. Vakcinační prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje HPV 16 LI VLP,

HPV 18 LI VLP, hydroxid hlinitý a 3D monofosforyllipid.
2. Vakcinační prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že VLP jsou vytvořeny při použití předem adsorbovaných velkých podílů antigenů nebo 3D mono fosfory l lipidu na io hydroxid hlinitý.
3. Vakcinační prostředek podle nároku l nebo 2, vyznačující se tím, že čištěné podíly VLP 16 a VLP 18 jsou přidány k hydroxidu hlinitému v poměru 2 g VLP na 10 g hydroxidu hlinitého.
4. Vakcinační prostředek, vyznačující se tím, že je tvořen HPV 16 LI VLP, HPV 18 LI VLP, hydroxidem hlinitým a 3D monofosforyllipidem.
5. HPV 16 LI VLP, zpracované spolu s alum/3D-monofosforyllipidem při použití předem 20 adsorbovaných velkých podílů antigenů nebo 3D-monofosforyllipidu na hydroxid hlinitý nebo

A1PO₄.
6. HPV 18 LI VLP, zpracované spolu s alum/3D-monofosforyllipidem při použití předem adsorbovaných velkých podílů antigenů nebo 3D-monofosforyllipidu na hydroxid hlinitý nebo

25 AIPO4.