CN1618465A - 联合疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

提供了新的联合疫苗组合物，所述组合物包括一种单纯疱疹病毒(HSV)抗原和一种HPV抗原，且可任意选择地另外包括下面抗原的一种或更多种：EBV抗原、甲型肝炎抗原或灭活的减毒病毒、乙型肝炎病毒抗原、VZV抗原、HCMV抗原、鼠弓形体抗原。用一种佐剂配制所述的疫苗组合物，所述佐剂是TH1细胞应答的优先刺激物，例如3D－MPL和QS21。

Description

联合疫苗组合物
本申请为2000年9月7日提交的，申请号为00815424.4的、发明名称与本申请相同的申请的分案申请。
本发明涉及新的疫苗制剂、制备它们的方法及所述疫苗制剂在治疗中的应用。具体地说，本发明涉及适合于给予青少年的联合疫苗。
乳头瘤病毒是高度种特异性的小DNA肿瘤病毒。迄今已描述了超过70种独特的人乳头瘤病毒(HPV)基因型。HPV通常对皮肤(例如HPV-1和HPV-2)或者对粘膜表面(例如HPV-6和HPV-11)是特异性的，且常常引起持续达几个月或几年的良性肿瘤(疣)。对有关的个人，这样的良性肿瘤可能是令人苦恼的，但不会是威胁生命的，不过有些是例外。
某些HPV也与癌症有关。HPV和人类癌症之间的最强的正相关是存在于HPV-16及HPV-18与宫颈癌之间的关系。在发展中国家里，宫颈癌是最常见的恶性肿瘤；世界上每年大约有500,000个新病例出现。现在，在技术上可行的是：用疫苗主动地和原发性HPV-16感染作斗争、以及甚至与确认的包含HPV-16的癌作斗争。有关于防备HPV-16的预防性接种和治疗性接种之前景的综述，参见：Cason J.，Clin.Immunother.1994；1(4)293-306和Hagenesee M.E.，Infections in Medicine 1997 14(7)555-556，559-564。
特别关注的其它的人乳头瘤病毒是血清型31、33和45乳头瘤病毒。
今天，已分离出不同类型的HPV，且借助于细菌中的克隆系统及新近通过PCR的扩增，已鉴定了它们的特征。在与充分表征的牛1型乳头瘤病毒(BPV1)之基因组的分子组构进行比较的基础上，确定了所述HPV基因组的分子组构。
虽然发生较少的变异，但是，所描述的所有HPV基因组至少有7种早期基因即E1至E7，以及至少有两种晚期基因L1和L2。另外，一个上游的调节区包含着似乎控制所述HPV基因组的大多数转录事件的调节序列。
E1和E2基因分别涉及病毒复制和转录控制；且E1和E2基因往往会由于病毒的整合而被破坏。E6和E7涉及病毒转化，近来证据暗示E5也涉及病毒转化。
就与宫颈癌有关的HPV例如HPV-16及HPV-18而言，在病毒DNA整合后，开始致癌过程。所述的整合导致编码衣壳蛋白L1和L2的基因失活，并导致建立起两种早期蛋白E6和E7的连续超量表达，所述的超量表达将导致正常的细胞分化的逐步丧失及癌的形成。
宫颈癌在妇女中是常见的，且通过癌变前的中间阶段发展到常常导致死亡的侵袭性癌。该病的所述中间阶段被称为宫颈上皮内瘤；且根据严重程度的增加，将所述中间阶段分成I至III级。
临床上，女性肛生殖道的HPV感染表现为宫颈扁平湿疣，宫颈扁平湿疣的标志是主要影响宫颈鳞状上皮的表层细胞和中间细胞的中空细胞病。
作为病毒的致细胞病变效应结果的中空细胞表现为具有一个核周透明晕的多核细胞。异常角质化使上皮变厚，造成病变的疣状外观。
如果这类扁平湿疣是HPV 16血清型或HPV 18血清型阳性的，则由于扁平湿疣朝着本身被认为是侵袭性宫颈癌癌前病变的宫颈上皮内瘤(CIN)和原位癌(CIS)发展，因而是高度危险的因素。
WO 96/19496公开了人乳头瘤病毒E6蛋白和E7蛋白的变异体，尤其是在E6蛋白和E7蛋白中都有一个缺失的E6/E7融合蛋白。据说这些缺失的融合蛋白是免疫原性的。
在WO94/00152、WO94/20137、WO93/02184和WO94/05792中公开了基于HPV L1的疫苗。这样的一种疫苗可包含作为单体的所述L1抗原、一种衣壳粒或一种病毒样颗粒。这样的粒子可另外包含L2蛋白。例如在WO93/00436中描述了基于L2的疫苗。其它的HPV疫苗基于早期蛋白，例如E7、或例如L2-E7的融合蛋白。
HSV-2是生殖器疱疹的主要病原体。HSV-2和HSV-1(唇疱疹的病原体)的特征在于其主要在神经元之神经节细胞中既诱发急性疾病、又建立潜伏感染的能力。
仅在美国，估计大约500万人发生生殖器疱疹，每年记录有50万临床病例(原发性感染和复发性感染)。原发性感染一般发生在青春期之后，其特征为局部出现有持续2至3周的疼痛性皮肤病变。在原发性感染之后的接下来的六个月内，50％的患者将经历该病的一次复发。大约25％的患者每年可经历10-15次该病的复发性发作。在免疫妥协的患者中，高频复发的发生率在统计学上高于正常患者群体中的发生率。
HSV-1和HSV-2病毒都有许多位于病毒表面的糖蛋白组分。这些组分称为gB、gC、gD和gE等等。
需要有效的联合疫苗以预防青少年特别易患的疾病。
本发明提供一种疫苗组合物，所述组合物包含与一种佐剂结合的：
(a)一种单纯疱疹病毒(HSV)抗原；及
(b)一种人乳头瘤病毒(HPV)抗原；
该佐剂为TH1细胞应答的优先刺激物。
本发明疫苗组合物给予青少年是非常有益的，青少年可能尤其有HSV和/或HPV感染的危险。
本发明的疫苗组合物可任意选择地另外包括下文描述的许多其它抗原中的一种或更多种。
已发现，根据本发明的疫苗组合物出人意外地没显示出干扰；也就是说，针对本发明组合物中每种抗原的免疫应答，与通过结合作为TH1细胞应答优先刺激物的佐剂单独给予每种抗原而获得的免疫应答基本上一样。
用于预防乙型肝炎感染、包含一种或更多种乙型肝炎抗原的疫苗是众所周知的。例如，运用SmithKline Beecham Biologicals的疫苗Engerix-B(商标)预防乙型肝炎。这种疫苗包含乙型肝炎表面抗原(具体为在Harford等，Postgraduate Medical Journal，1987，63(增刊2)，第65-70页中描述的226个氨基酸的S-抗原)；且用氢氧化铝作为佐剂配制这种疫苗。
同样得自SmithKline Beecham Biologicals的疫苗Havrix(商标)是可以用来预防甲型肝炎感染的疫苗的一个实例。用氢氧化铝作为佐剂来配制它。这种疫苗包括一种用甲醛溶液(甲醛)灭活的甲型肝炎病毒HM-175的减毒株；参见Andre等的论文(Prog.med.Virol.，第37卷，第1-24页)。
当用于本文时，术语甲型肝炎病毒(HAV)抗原用来表示来源于甲型肝炎病毒的一种蛋白或HAV的一种减毒株，该减毒株可任意选择地是例如用甲醛灭活的减毒株。如果所述HAV抗原是一种来源于甲型肝炎病毒的蛋白，则它可以任选地为一种重组蛋白。
疫苗Twinrix(商标)是重组的乙型肝炎抗原和前面提到的灭活的减毒甲型肝炎病毒的组合。可以用该疫苗来同时防御甲型肝炎与乙型肝炎。
欧洲专利0 339 667(Chemo Sero)描述了使一种甲型肝炎抗原和一种乙型肝炎抗原混合而制造一种联合疫苗的一般概念。在该说明书中，据说所使用的佐剂不是关键性的：它应当仅能够增强免疫活性至所需程度而不引起任何副作用。认为可以使用铝凝胶，特别是氢氧化铝凝胶和磷酸铝凝胶。
按照本发明的疫苗组合物可包括一种HAV抗原或一种HBV抗原，或者可更优选包括一种HAV抗原和一种HBV抗原两者的组合，还可包含所述的HPV抗原和HSV抗原。
这样的疫苗给予青少年是非常有益的，青少年可能尤其有HSV和/或HPV感染、和/或HAV感染、和/或HBV感染的危险。
免疫应答可以大致分成两个极端类型：体液免疫应答或细胞介导的免疫应答(传统上分别根据保护作用的抗体机制和细胞效应物机制来加以鉴定)。已把这些类型的应答称为TH1型应答(细胞介导的应答)和TH2型免疫应答(体液应答)。
可根据抗原特异性的单倍型限制的细胞毒性T淋巴细胞的产生以及天然杀伤性细胞的应答，来鉴定极端的TH1型免疫应答。就小鼠而论，通常根据IgG2a亚型抗体的产生来鉴定TH1型应答；而就人类而言，这些对应于IgG1型抗体。TH2型免疫应答的特征在于产生一系列免疫球蛋白的同种型，在小鼠中包括IgG1。
可以认为，这两种类型免疫应答发生的推动力是细胞因子。高水平的TH1型细胞因子往往会有助于诱导细胞介导的、对特定抗原的免疫应答；而高水平的TH2型细胞因子往往会有助于诱导针对所述抗原的体液免疫应答。
TH1型免疫应答和TH2型免疫应答的区别不是绝对的。事实上，个体将支持被称作主要是TH1或主要是TH2的免疫应答。无论如何，根据由Mosmann和Coffman(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)TH1和TH2细胞：不同的淋巴因子分泌型式导致不同的功能特性。Annual Review ofImmunology，7，第145-173页)就鼠CD4+ve T细胞克隆描述的内容，考察细胞因子家族通常是方便的。传统上，TH1型应答与由T-淋巴细胞产生细胞因子干扰素-γ有关。通常与诱导TH1型免疫应答直接相关的其它细胞因子不是由T-细胞产生的；所述细胞因子例如IL-12。比较起来，TH2型应答与IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和肿瘤坏死因子-β(TNF-β)的分泌有关。
已知某些疫苗佐剂特别适合于激发TH1型细胞因子应答或TH2型细胞因子应答。传统上，接种或感染之后免疫应答的TH1：TH2平衡的最佳指标包括：在用抗原再刺激后，由T淋巴细胞在体外产生TH1细胞因子或TH2细胞因子的直接测量结果；和/或抗原特异性抗体应答的IgG1∶IgG2a之比率的测量结果(至少就小鼠而论)。
因此，TH1型佐剂是这样一种物质，当在体外用抗原再刺激后，该物质刺激分离的T-淋巴细胞群体产生高水平的TH1型细胞因子，并且诱发与TH1型同种型有关的抗原特异性免疫球蛋白应答。
在国际专利申请第WO 94/00153号和第WO 95/17209号中描述了能够优先刺激TH1细胞应答的佐剂。
3脱-O-酰化单磷酰基脂质A(monophosphoryl lipid A)(3D-MPL)就是一种这样的佐剂。可从GB 2220211(Ribi)了解这种佐剂。在化学上，它是一种具有4、5或6条酰化链的3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的混合物，由Ribi Immunochem Montana制造。在欧洲专利0 689 454 B1(SmithKlineBeecham Biologicals SA)中公开了3脱-O-酰化单磷酰基脂质A的一种优选形式。
3D-MPL的微粒最好是小到足以通过一张0.22微米的膜而被过滤除菌(如在欧洲专利第0 689 454号中所述)。3D-MPL将以每剂10μg-100μg、且优选25μg-50μg的范围存在，其中所述抗原一般将以每剂2-50μg的范围存在。
另一种优选的佐剂包含一种来源于皂树Quillaja Saponaria Molina树皮、经Hplc纯化的无毒级分QS21。可任意选择地将这种QS21与3脱-O-酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL)和任选的一种载体混合。
在美国专利第5,057,540号中公开了QS21的生产方法。
先前已描述了包含QS21的非反应原性佐剂制剂(WO 96/33739)。已经证明：当与一种抗原一起配制这样的包含QS21和胆固醇的制剂时，这样的制剂是成功的TH1激发佐剂。因此，构成本发明一部分的疫苗组合物可包括QS21和胆固醇的组合。
作为TH1细胞应答优先刺激物的另外的佐剂包括免疫调节寡核苷酸，例如在WO 96/02555中公开的未甲基化的CpG序列。
当提供一种作为TH1细胞应答之优先刺激物的佐剂的时侯，也考虑了不同的TH1激发佐剂(例如在上文提到的那些佐剂)的组合。例如，QS21可以与3D-MPL一起配制。QS21∶3D-MPL的比率一般将约为1∶10至10∶1，优选1∶5至5∶1，且通常大体上为1∶1。适合于最适协同作用的优选范围是2.5∶1至1∶1的3D-MPL∶QS21。
在根据本发明的疫苗组合物中最好也存在一种载体。所述载体可以是一种水包油乳状液，或是一种诸如磷酸铝或氢氧化铝之类的铝盐。
一种优选的水包油乳状液包含一种可代谢的油，例如角鲨烯、α-生育酚和吐温80。另外，所述水包油乳状液可包含span 85和/或卵磷脂和/或甘油三辛酸酯。
在一个特别优选的方面，将根据本发明的疫苗组合物中的抗原与3D-MPL及明矾混合。
通常，对于给予人类，QS21和3D-MPL将以每剂1μg-200μg的范围存在于疫苗中；例如它们将以每剂10-100μg且优选每剂10-50μg的范围存在于疫苗中。通常，所述的水包油将包含2-10％的角鲨烯、2-10％的α-生育酚和0.3-3％的吐温80。角鲨烯：α-生育酚的优选比率等于1或小于1，因为这提供更稳定的乳状液。span 85也可以以1％的水平存在。在某些情况下，本发明的疫苗还包含一种稳定剂可能是有益的。
无毒的水包油乳状液最好包含在水性载体中的一种例如角鲨烯或角鲨烷的无毒油、一种例如吐温80的乳化剂。该水性载体可以例如是磷酸缓冲盐溶液。
在WO 95/17210中描述了在一种水包油乳状液中包含QS21、3D-MPL和生育酚的一种特别有效的佐剂制剂。
本发明组合物中的所述HPV抗原最好来源于：HPV 16和/或HPV18、或者HPV 6和/或HPV 11、或者HPV 31、HPV 33或HPV 45。
在一个优选的实施方案中，按照本发明的疫苗组合物中的所述HPV抗原包含HPV的主要衣壳蛋白L1，且可任选地包含L2蛋白，特别是来自HPV 16和/或HPV 18的上述蛋白。在这个实施方案中，L1蛋白的优选形式是截短的L1蛋白。该L1(可任选地在L1-L2融合体中)最好是呈病毒样颗粒(VLP)的形式。可以将所述L1蛋白融合到另一种HPV蛋白上，尤其是融合到E7上，从而形成L1-E7融合体。特别优选包括L1-E或L1-L2-E的嵌合病毒样颗粒。
在另一个优选的实施方案中，本发明组合物中的所述HPV抗原来源于E6蛋白或E7蛋白，特别是来源于连接到一种具有T细胞表位的免疫融合配偶体上的E6或E7。
在本发明这个实施方案的一种优选形式中，所述免疫融合配偶体来源于流感嗜血菌B(Heamophilus influenza B)的蛋白D。所述蛋白D的衍生物最好包含该蛋白大约前1/3，尤其是包含N-末端的约前100-110个氨基酸。
在本发明这个实施方案中的优选融合蛋白包括：蛋白D-来自HPV16的E6、蛋白D-来自HPV 16的E7、蛋白D-来自HPV 18的E7和蛋白D-来自HPV 18的E6。所述蛋白D部分最好包含蛋白D的前1/3。
在本发明的再一个实施方案中，所述HPV抗原呈L2-E7融合体的形式，特别是来自HPV 6和/或HPV 11的L2-E7融合体。
优选在大肠杆菌中表达本发明的蛋白。在一个优选的实施方案中，表达具有组氨酸尾的所述蛋白，所述组氨酸尾包含5-9个组氨酸残基，优选包含6个组氨酸残基。这些组氨酸残基在帮助纯化方面是有益的。在同时待审的GB 9717953.5号英国专利申请中，全面描述了这样蛋白的制造说明。
可以使所述疫苗组合物中的HPV抗原吸附到Al(OH)3上。
本发明组合物中的HSV抗原最好来源于HSV-2，通常为糖蛋白D。糖蛋白D位于该病毒的膜上，也可见于受感染细胞的细胞质中(EisenbergR.J.等，J of Virol 1980， 35，428-435)。它由393个氨基酸组成，包括一段信号肽，分子量大约为60kD。在所有的HSV被膜糖蛋白中，这种糖蛋白大概是表征得最为清楚的(Cohen等，J.of Virology  60，157-166)。在体内，已知糖蛋白D在病毒附着到细胞膜方面起重要作用。此外，已表明糖蛋白D能够在体内激发中和抗体(Eing等，J.Med.Virology 127：59-65)。然而，尽管在所述患者的血清中存在高水平的中和抗体，但潜伏的HSV-2病毒仍可被再激活并诱导该病复发。
在本发明的一个优选实施方案中，所述HSV抗原是一种截短的、308个氨基酸的HSV-2糖蛋白D，所述糖蛋白D包括天然存在的糖蛋白的1至306号氨基酸，并且在缺乏其膜锚区的该截短蛋白之C末端添加天冬酰胺及谷氨酰胺。所述蛋白的这种形式包括信号肽；切去该信号肽，则产生一种283个氨基酸的成熟蛋白。在Genentech的欧洲专利EP-B-139417里描述了在中国仓鼠卵巢细胞中产生一种这样的蛋白。
在本发明的疫苗制剂中，优选使用重组的成熟HSV-2糖蛋白D的截短物，且将其称为rgD2t。
在WO 92/16231中描述了与佐剂3D-MPL联合的这种HSV-2抗原的组合。
如果在本发明的组合物中包括一种乙型肝炎病毒(HBV)抗原，则这抗原一般是乙型肝炎表面抗原。
已有大量的文献资料记载了乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的制备。参见：例如，Harford等，Develop.Biol.Standard 54，第125页(1983)；Gregg等，Biotechnology 5，第479页(1987)；EP-A-0 226 846；EP-A-0 299 108以及在其中的参考文献。
当用于本文时，在本文缩写成‘HBsAg’或‘HBS’的表述‘乙型肝炎表面抗原’，包括任一HBsAg抗原或显示HBV表面抗原之抗原性的其片段。人们会明白：除了226个氨基酸序列的HBsAg S抗原(参见：Tiollais等，Nature，317，489(1985)以及在其中的参考文献)外，如果需要，本文描述的HBsAg可包含在上面参考文献中和在EP-A-0 278 940中描述的完整的或部分的前-S序列。本文描述的HBsAg也可指变异体，例如在WO 91/14703中描述的‘逃逸(escape)突变体’。在另一个方面，所述HBsAg可包含一种在欧洲专利申请第0 414 374号中描述为L*的蛋白，亦即这样一种蛋白，其氨基酸序列由乙型肝炎病毒大(L)蛋白(ad亚型或ay亚型)氨基酸序列的多个部分组成，其特征在于该蛋白的氨基酸序列由以下任一个组成：
(a)所述L蛋白的残基12-52，后接残基133-145，再后接残基175-400；
(b)所述L蛋白的残基12，后接残基14-52，后接残基133-145，再后接残基175-400。
HBsAg也可指在EP 0 198 474或EP 0 304 578中描述的多肽。
所述HBsAg通常呈颗粒状态。它可以只包含S蛋白，或者可作为复合颗粒，例如(L*，S)，其中L*是如同上文释义的且S表示乙型肝炎表面抗原之S-蛋白。
可以如WO 93/24148中描述的，使该HBsAg吸附于磷酸铝。
用于本发明制剂中的乙型肝炎(HBV)抗原最好是用于商品Engerix-B(商标；SmithKline Beecham Biologicals)中的HBsAg S-抗原。
在欧洲专利申请0 633 784中描述了一种包含与3D-MPL结合的乙型肝炎表面抗原的疫苗。
现在描述来自另外病原体的、可被包含在按照本发明之组合物中的抗原的实例。
作为疱疹病毒群中一员的EB病毒(EBV)在人类中引起作为原发性疾病的传染性单核细胞增多症。它主要影响儿童或年轻人。普通成人人口的90％以上被EBV感染，EBV终身存留在外周B-淋巴细胞中。该病毒终身在腮腺中产生，且主要通过来自排出该病毒个体的唾液交换而传播。感染EBV的儿童大部分是无症状的或有很轻微的症状，而被感染的青少年和成人则产生典型的传染性单核细胞增多症，其特征为发热、咽炎以及腺病。已被感染的人在他们生命的剩余时间里保持抗-EBV的抗体，因此对进一步的感染是免疫的。
除了EBV的传染特性外，已证明EBV使淋巴细胞转变成快速分裂的细胞，因此与包括非洲伯基特淋巴瘤(BL)在内的几种不同的淋巴瘤有关。EBV也可参与引起鼻咽癌(NPC)。在世界范围内，估计有80,000鼻咽癌病例发生，且鼻咽癌在人种学的中国人种群中是更普遍的。传染性单核细胞增多症是EBV原发性感染的结果。如果不存在另外的危险因素，则传染性单核细胞增多症不是威胁生命的疾病。
已描述了构成EBV病毒被膜的、所谓膜抗原复合物的四种蛋白。通常将它们称为gp 220/350或gp 250/350或者简称为gp 250或gp 350(参见EP-A-151079)。有令人信服的证据表明，gp 350和gp 250诱导中和抗体的产生，且针对gp 350和gp 250的抗体具有中和能力。因此，这些蛋白是可能的EBV疫苗的候选物。有关gp 250/350在预防和治疗与EBV相关疾病方面之应用的进一步资料，参见EP 0 173 254。
主要的EBV表面糖蛋白gp350/220通过与细胞膜蛋白CD21相互作用而感染人的靶细胞。在人体中，gp350/220是EBV中和抗体的主要靶，且已表明gp350/220的某些形式保护人类抵抗EBV相关疾病。虽然可使用其它的保护性抗原，但按照本发明的疫苗组合物最好包含EBV的gp350。
在一个优选的方面，本发明疫苗组合物另外包括一种水痘带状疱疹病毒抗原(VZV抗原)。适合于在所述疫苗组合物中包含的VZV的抗原包括由Longnecker等描述的gpI-V(Longnecker等，Prog Natl Acad Sci USA84，4303-4307(1987))。
在一个优选的实施方案中，使用gpI(参见Ellis等，美国专利4,769,239)。也参见0 405 867 B1号欧洲专利。
在另一个优选方面，本发明的疫苗组合物另外包括人巨细胞病毒(HCMV)抗原。HCMV是一种属于疱疹病毒科的、人DNA病毒。在世界的大多数地方，HCMV是地方病的病毒。在两种群体之中，HCMV导致严重的医学疾病。HCMV是新生儿中先天缺陷的一个主要原因。有危险的第二个群体是免疫妥协患者，例如受到HIV感染的那些患者和经受移植的那些患者。临床上该病引起各种各样的症状，包括发热、肝炎、肺炎和传染性单核细胞增多症。可供针对HCMV的疫苗用的一种优选抗原是WO 95/31555中描述的gB685**。在WO 94/00150(City of Hope)中描述的一种HCMV基质蛋白pp65也提供可供HCMV疫苗用的免疫原。
在一个优选的方面，本发明的疫苗组合物另外包含一种VZV抗原和一种HCMV抗原两者，特别是上面描述的那些抗原。
在另一个优选的方面，本发明的疫苗组合物另外包含一种鼠弓形体(Toxoplasma gondii)抗原。鼠弓形体是一种在包括人类在内的温血动物中引起弓形体病的专性细胞内原生动物寄生物。虽然它在健康个体中通常是无临床症状的；但在怀孕妇女和免疫妥协患者中，弓形体病可以引起严重的并发症。用于针对鼠弓形体的疫苗的一种优选抗原是在WO96/02654中描述的SAG1(也称为P30)或是在WO92/11366中描述的Tg34。
在一个优选的方面，本发明的疫苗组合物另外包括和一种鼠弓形体抗原联合的一种VZV抗原或一种HCMV抗原，特别是上面描述的那些抗原。
在一个优选方面，本发明疫苗组合物是一种多价疫苗，例如一种四价疫苗或一种五价疫苗。
在诱发保护性免疫方面，甚至用很低剂量的抗原(例如低到5μg的rgD2t)，本发明的制剂也是非常有效的。
它们提供针对原发性感染的极好保护，且有利地既刺激特异性的体液(中和抗体)免疫应答、又刺激效应细胞介导的(DTH)免疫应答。
在另一个方面，本发明提供一种本文描述的、供医学治疗之用的疫苗制剂，特别是提供供治疗或预防人乳头瘤病毒感染及单纯疱疹病毒感染之用的疫苗制剂。
本发明的疫苗将包含免疫保护量的所述抗原，且可以用常规技术来制备本发明的疫苗。
在Pharmaceutical Biotechnology，Vol.61，Vaccine Design-the subunitand adjuvant approach，Powell和Newman编辑，Plenurn Press，1995中，以及在New Trends and Developments in Vaccines，Voller等编辑，UniversityPark Press，Baltimore，Maryland，美国，1978中，全面地描述了疫苗的制备。例如，Fullerton的美国专利4,235,877描述了在脂质体内的包封。例如，Likhite的美国专利4,372,945和Armor等的美国专利4,474,757公开了将蛋白结合到大分子上。
每剂疫苗中的蛋白量选择为在典型的疫苗中诱发免疫保护性应答而无显著不良副作用的量。这样的量将根据使用哪一种特定的免疫原而变化。通常，预期每一剂将包含1-1000μg的蛋白，优选2-100μg，最优选包含4-40μg的蛋白。可通过涉及观测抗体效价及受接种者的其它反应的标准研究，来确定特定疫苗的最适量。在初次接种以后，受接种者可过大约4周接受一次加强。
除了为易患HPV感染或HSV感染的人接种外，可用本发明的药用组合物来免疫治疗性地治疗受到所述病毒感染的患者。
在本发明的再一个方面，提供一种本文描述的制造方法，其中该方法包括：将一种人乳头瘤病毒抗原及一种单纯疱疹病毒抗原与例如3D-MPL的一种TH1诱发佐剂混合，且优选与例如明矾的一种载体混合。
如果需要，可以以任何方便的顺序来添加其它的抗原，从而提供本文描述的多价疫苗组合物。
下面的实施例阐明了本发明，但不限制本发明。
实施例1：用AS04配制的单价疫苗或联合疫苗中的HPV抗原/HBs/gD之相当的免疫原性
引言
采用预先吸附于Al(OH)3或AlPO4上的抗原或3D-MPL的整体式材料(monobulks)，将以下四种不同的抗原与明矾/3D-MPL(AS04)一起配制：
1.HPV16 L1病毒样颗粒(VLP-16)，
2.HPV18 L1病毒样颗粒(VLP-18)，
3.HSV-2的gD抗原，
4.HBsAg，
用所配制的抗原在Balb/C小鼠体内进行免疫原性研究。
将3D-MPL/Al(OH)3制剂称为AS04D，而将基于3D-MPL/AlPO4的制剂称为AS04C。
评价下面的疫苗：
1.VLP16+VLP18 AS04D，
2.gD AS04D，
3.HBs AS04C；
并评价组合这些疫苗的潜力。
本实验的目的是比较两种不同AS04组合的免疫原性；所述组合是用
1)VLP16+VLP18与gD、
2)VLP16+VLP18与gD及HBs Ag中的任一种制造的。
在材料与方法一节中全面地描述了所述实验方案。
总之，用基于不同抗原的制剂，以3周的间隔为各组小鼠肌内免疫两次，每组10只小鼠。在第二次免疫后第14天，通过ELISA，来监测通过接种诱导的针对病毒样颗粒、gD和乙型肝炎表面抗原的抗体应答以及同种型的分布型。在同一时间点，在体外用或者VLP抗原、gD抗原或者HBs抗原再刺激脾细胞后，分析所述细胞因子的产生(干扰素γ/IL5)。
材料与方法
制剂
制剂组合物
用在铝盐上的3D-MPL配制的VLP16、VLP18、gD及HBs。
所用的成分
    成分   浓度   缓冲液
    HPV 16 VLP   560μg/ml   Tris 20mM/NaCl 500mM
    HPV 18 VLP   550μg/ml   NaCl 500mM/NaPO4 20mM
    Al(OH)3   10380μg/ml   H2O
    HBs   1219μg/ml   PO4 10mM/NaCl 150mM
    gD   443μg/ml   pH7.4的PBS
    3D-MPL   1170μg/ml   注射用水
    AlPO4   5mg/ml   NaCl 150mM
吸附
a)VLP的吸附
将纯化的VLP 16和VLP18材料(bulk)添加到Al(OH)3中，从而达到2μg VIP/10μg Al(OH)3的比率。把该混合物贮藏在2-8℃之间直到最后的配制为止。
b)gD的吸附
将2μg gD与10μg Al(OH)3混合。将这种混合物贮藏在2-8℃之间直至最后的配制为止。
c)HBs的吸附
将2μg Hbs与10μg AIPO4混合。将这种混合物贮藏在2-8℃之间直至最后的配制为止。
d)3D-MPL的吸附
将5μg 3D-MPL与10μg Al(OH)3混合。将这种混合物贮藏在2-8℃之间直至最后的配制为止。
将5μg3D-MPL与10μg AlPO4混合。将这种混合物贮藏在2-8℃之间直至最后的配制为止。
配制
混合水和NaCl(10x浓缩的)，在室温下搅拌10分钟后，添加不同的成分：吸附的抗原、吸附的3D-MPL和Al(OH)3(参见下表)。在室温下将它们摇动10分钟并贮藏在4℃，直至注射为止。
      抗原       免疫刺激剂          载体
    组别  类型     μg  类型     μg   类型     μg
    A  gDVLP16VLP18     222 3D-MPL 5   Al(OH)3Al(OH)3Al(OH)3Al(OH)3Al(OH)3     1010101010
    B  gDVLP16VLP18HBs     2222 3D-MPL 5   Al(OH)3Al(OH)3Al(OH)3AlPO4Al(OH)3     1010101010
    C  gD     2 3D-MPL 5   Al(OH)3Al(OH)3Al(OH)3     101030
    D  VLP16VLP18     22 3D-MPL 5   Al(OH)3Al(OH)3Al(OH)3Al(OH)3     10101020
    E  HBs     2 3D-MPL 5   AlPO4Al(OH)3Al(OH)3     101030
小鼠血清学
抗VLP-16和抗VLP-18的血清学
用VLP16 503/1(20/12/99)和VIP18 504/2(25/10/99F)作为包被抗原，通过ELISA完成抗VLP16抗体和抗VIP18抗体的定量。以每孔50μl的量使用抗原溶液和抗体溶液。以0.5μg/ml的终浓度，用PBS稀释所述抗原，且在4℃使该抗原过夜吸附到96孔微量滴定板(MaxisorbImmuno-plate，Nunc，丹麦)的各孔中。然后，使所述板与包含1％牛血清白蛋白的PBS在37℃保温1小时。把血清在饱和缓冲液中的2倍稀释液(以1/400的稀释液开始)添加到所述VLP包被板上，并在37℃将其保温1小时30分钟。用PBS 0.1％吐温-20洗涤所述板四次，并往每个孔中添加用饱和缓冲液以1/1500稀释的结合生物素的抗小鼠Ig(Amersham，UK)，且在37℃将其保温1小时30分钟。在一个洗涤步骤之后，加入用饱和缓冲液以1/1000稀释的链霉抗生物素蛋白-生物素标记的过氧化物酶复合物(Amersham，UK)，并在37℃再保温30分钟。如上所述洗涤所述板，并将其与一种溶液保温20分钟，所述溶液为0.04％的邻苯二胺(Sigma)和0.03％H2O2溶于0.1％吐温-20 0.05M柠檬酸盐缓冲液pH4.5中的溶液。用2N的H2SO4终止该反应，并在490/630nm读数。用SoftmaxPro(用一个四参数方程)，根据参比来计算ELISA效价，并以EU/ml表示。
抗gD应答：
运用gD(gD 43B318)作为包被抗原，通过ELISA完成抗gD抗体的定量。以每孔50μl的量使用抗原溶液和抗体溶液。以1μg/ml的终浓度，用PBS稀释该抗原，且在4℃使该抗原过夜吸附到96孔微量滴定板(Maxisorb Immuno-plate，Nunc，丹麦)的各孔中。然后，使所述板与包含1％牛血清白蛋白和0.1％吐温-20的PBS(饱和缓冲液，100μl/孔)在37℃保温1小时。把血清在饱和缓冲液中的2倍稀释液(以1/100的稀释液开始)添加到gD包被板上，并在37℃将其保温1小时30分钟。用PBS 0.1％吐温-20洗涤所述板四次，并往每个孔中添加用饱和缓冲液以1/1000稀释的结合生物素的抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b或Ig(Amersham，UK)；且在37℃将其保温1小时30分钟。在一个洗涤步骤之后，加入用饱和缓冲液以1/1000稀释的链霉抗生物素蛋白-生物素标记的过氧化物酶复合物(Amersham，UK)，并在37℃再保温30分钟。如上所述洗涤所述板，并将其与一种溶液保温20分钟，所述溶液为0.04％的邻苯二胺(Sigma)和0.03％H2O2溶于0.1％吐温-20 0.05M柠檬酸盐缓冲液pH4.5中的溶液。用2N的H2SO4终止该反应，并在490/630nm读数。用SoftmaxPro(用一个四参数方程)，根据参比来计算ELISA效价，并以EU/ml表示。
抗HBs血清学
运用HBs(Hep 286)作为包被抗原，通过ELISA完成抗HBs抗体的定量。以每孔50μl的量使用抗原溶液和抗体溶液。以1μg/ml的终浓度，用PBS稀释该抗原，且在4℃使该抗原过夜吸附到96孔微量滴定板(Maxisorb Immuno-plate，Nunc，丹麦)的各孔中。然后，使所述板与包含1％牛血清白蛋白和0.1％吐温-20的PBS(饱和缓冲液)在37℃保温1小时。把血清在饱和缓冲液中的2倍稀释液(以1/100的稀释开始)添加到HBs包被板上，并在37℃将其保温1小时30分钟。用含有0.1％吐温-20的PBS洗涤所述板四次，并往每个孔中添加用饱和缓冲液以1/1500稀释的结合生物素的抗小鼠Ig(Amersham，UK)，或添加用饱和缓冲液分别以1/4000、1/8000、1/4000稀释的IgG1、IgG2a、IgG2b(IMTECH，美国)；且在37℃将其保温1小时30分钟。在一个洗涤步骤之后，加入用饱和缓冲液以1/1000稀释的链霉抗生物素蛋白-生物素标记的过氧化物酶复合物(Amersham，UK)，并在37℃再保温30分钟。如上所述洗涤所述板，并将其与一种溶液保温20分钟，所述溶液为0.04％的邻苯二胺(Sigma)和0.03％H2O2溶于0.1％吐温-20 0.05M柠檬酸盐缓冲液pH4.5中的溶液。用2N的H2SO4终止该反应，并在490/630nm读数。用SoftmaxPro(用一个四参数方程)，根据参比来计算ELISA效价，并以EU/ml表示。
细胞因子的产生
在第二次免疫后两周，杀死小鼠，无菌地切取脾脏并将其汇集。用包含2mM L-谷氨酰胺、抗生素、5×10-5M的2-巯基乙醇以及5％胎牛血清的RPMI 1640培养基(GIBCO)，来制备细胞悬浮液。在具有不同浓度(10-1μg/ml)的各种抗原(VLP抗原、E7抗原或HBs抗原)的平底24孔板上，在1ml中，以5×106个细胞/ml的终浓度培养细胞。96小时后收获上清液；并使其冷冻，直到通过ELISA检验干扰素γ和IL5的存在。
干扰素γ(Genzyme)
用来自Genzyme的试剂，通过ELISA进行干扰素γ的定量测定。以每孔50μl的量使用样品溶液和抗体溶液。在4℃，用50μl在pH9.5碳酸盐缓冲液中以1.5μg/ml稀释的仓鼠抗小鼠干扰素γ包被96孔微量滴定板(Maxisorb Immuno-plate，Nunc，丹麦)过夜。然后，使所述板与100μl包含1％牛血清白蛋白和0.1％吐温-20的PBS(饱和缓冲液)在37℃保温1小时。把得自体外刺激的上清液在饱和缓冲液中的2倍稀释液(以1/2开始)添加到抗-干扰素γ包被板上，并在37℃将其保温1小时30分钟。用包含0.1％吐温的PBS(洗涤缓冲液)洗涤所述板四次，并往每个孔中添加用饱和缓冲液以0.5μg/ml之终浓度稀释的结合生物素的山羊抗小鼠干扰素γ，且在37℃将其保温1小时。在一个洗涤步骤之后，在37℃，加入用饱和缓冲液以1/10000稀释的AMDEX缀合物(Amersham)达30分钟。如上所述洗涤所述板，并将其与50μl TMB(Bioard)保温10分钟。用0.4N的H2SO4终止该反应，并在450/630nm读数。用SoftmaxPro(四参数方程)，利用标准曲线(小鼠干扰素γ标准)来计算浓度，并以pg/ml表示。
IL5(Pharmingen)
用来自Pharmingen的试剂，通过ELISA进行IL5的定量测定。以每孔50μl的量使用样品溶液和抗体溶液。在4℃，用50μl在pH9.5碳酸盐缓冲液中以1μg/ml稀释的大鼠抗小鼠IL5包被96孔微量滴定板(Maxisorb Immuno-plate，Nunc，丹麦)过夜。然后，使所述板与100μl包含1％牛血清白蛋白和0.1％吐温-20的PBS(饱和缓冲液)在37℃保温1小时。把得自体外在饱和缓冲液中刺激的上清液的2倍稀释液(以1/2开始)添加到抗-IL5包被板上，并在37℃将其保温1小时30分钟。用包含0.1％吐温的PBS(洗涤缓冲液)洗涤所述板四次，并往每个孔中添加用饱和缓冲液以1μg/ml之终浓度稀释的结合生物素的大鼠抗小鼠IL5；且在37℃将其保温1小时。在一个洗涤步骤之后，在37℃，加入用饱和缓冲液以1/10000稀释的AMDEX缀合物(Amersham)达30分钟。如上所述洗涤所述板，并将其与50μl TMB(Bioard)保温15分钟。用0.4N的H2SO4终止该反应，并在450/630nm读数。用SoftmaxPro(四参数方程)，利用标准曲线(重组的小鼠IL-5)来计算浓度，并以pg/ml表示。
组别
用下面制剂对10只一组的各组Balb/C小鼠进行肌内免疫。
                          表1：组别与制剂
组别                                 制剂
A  VLP16 2μg/VLP18 2μg/gD 2μg/3D-MPL 5μg/Al(OH)350μg
B  VLP16 2μg/VLP18 2μg/HBs 2μg/gD 2μg/3D-MPL 5μg/Al(OH)3 40μg/AlPO4 10μg
C  gD 2μg/3D-MPL 5μg/Al(OH)3 50μg
D  VL16 2μg/VL18 2μg/3D-MPL 5μg/Al(OH)3 50μg
E  HBs 2μg/3D-MPL 5μg/AlPO4 10μg/Al(OH)3 40μg
在上述“材料与方法”中，描述了制剂的详情。
结果
1.血清学
a)抗VLP16应答：
用VLP16 503-1(20/12/99)作为包被抗原，通过ELISA测定体液应答(Ig)。分析第二次免疫后第14天的血清。
图1显示了在第二次免疫后第14天对个体血清测定的抗VLP16 Ig抗体应答。
用VLP、gD和HBs Ag的组合(组B)进行免疫后所获得的抗VLP16之效价，比用或者VLP和gD的组合(组A)或者单价VLP制剂(组D)而得到的抗VLP16之效价略低(GMT分别为27578对48105EU/ml对44448EU/ml)。在统计学分析之前，对各群体使用T-Grubbs检验以进行数据排除。为了分析，排除在组A和组D中的两只无反应小鼠。
运用Student Newman Keuls检验，表明在所述各组之间观测到的差异在统计学上是不显著的。
b)抗VLP18应答：
用VLP18 504-2(25/10/99)作为包被抗原，通过ELISA测定体液应答(Ig)。分析第二次免疫后第14天的血清。
图2显示了在第二次免疫后第14天对个体血清测定的抗VLP18 Ig抗体应答。
用VLP、gD和HBs Ag的组合(组B)进行免疫后所获得的抗VLP18之效价，与用VLP和gD的组合(组A)或单价VLP制剂(组D)而得到的效价在同一数量级上(GMT分别为56078对88786 EU/ml对76991EU/ml)。
在统计学分析之前，对各群体使用T-Grubbs检验以进行数据排除。为了分析，排除在组A和组D中的不响应的两只无反应小鼠。
采用单因素方差分析检验，表明所观测到的差异在统计学上无显著性。
c)抗gD应答：
使用gD作为包被抗原，通过ELISA测定体液应答(Ig和同种型)。分析第二次免疫后第14天的血清。
图3显示了在第二次免疫后第14天对个体血清测定的抗gD的抗体应答。
关于抗gD应答，与仅用gD(组C)或用VLP/gD组合(组A)相比较，观测到用VLP/gD/HBs组合(组B)获得的GMT稍微减少(分别与32675EU/ml、27058EU/ml相比较，GMT为18631EU/ml)。
在统计学分析之前，对数据排斥的各群体使用T-Grubbs试验。为了分析，排除在组A中无反应的两只小鼠。
在将第二次免疫后的数据进行对数变换后，对所述抗gD的效价进行单因素方差分析检验。在所述三种制剂之间，没观测到统计学显著性差异。
用所汇集的血清分析出的同种型再划分如下：
    同种型再划分(％)
    IgG1     IgG2a     IgG2b
    组A     96     3     2
    组B     96     3     2
    组C     97     1     1
在由所述三种制剂诱导的同种型分布型方面，没观测到差异，如下面表中的报道，在所述3个组中主要诱导IgG1反应(96-97％的IgG1)。
d)HBs应答
用HBsAg(Hep286)作为包被抗原，通过ELISA测定体液应答(Ig和同种型)。在第二次免疫后的第14天分析血清。
图4显示了在第二次免疫后的第14天对个体血清测定的抗HBs抗体应答。
与只有HBs(组E)相比，在包含VLP、gD及HBs抗原的组合组B中，观测到微弱的抗HBs抗体应答(GMT为20536 EU/ml对28996EU/ml)。
在将第二次免疫后的数据进行对数变换后，对所述抗HBs的效价进行单因素方差分析检验。使用Student Newman Keuls检验，在组B(VLP/gD/HBs)与组E(HBs AS04)之间，没观测到统计学显著性差异。
用所汇集的血清分析出的同种型再划分如下，且显示出在2个组之间，没有差异，在所述联合疫苗组中保持一定比例的IgG2a。
    同种型再划分(％)
    IgG1     IgG2a     IgG2b
    组B     54     24     21
    组E     56     23     21
2.细胞介导的免疫应答
在体外或用VLP抗原、gD抗原或用HBs抗原再刺激脾细胞后，在第二次免疫后的第14天，评价细胞介导的免疫应答(干扰素γ/IL5的产生)。对于小鼠的每个组，建立5个器官的汇集物。
在上面的“材料与方法”中，全面地描述了这个实验的步骤。
3.细胞因子的产生
a)体外用VLP16和VLP18再刺激
图5显示了在体外用VLP16再刺激96小时后于脾细胞中监测到的细胞因子的产生。
图6显示了在体外用VLP18再刺激96小时后于脾细胞中监测到的细胞因子的产生。
对于用任一种VLP抗原的再刺激，采用10μg的剂量和1μg剂量，没有观测到对两者的细胞因子产生的明确的剂量范围效应。
用所有制剂都观测到明确的TH1分布型。
表2：在体外用VLP16和VLP18再刺激后的干扰素-γ/IL-5之比率
干扰素/IL-5之比率     组A    组B    组D
VLP16 10μg/mlVLP16 1μg/ml     5.2    8.9    11.815.1   14.3   16.5
干扰素/IL-5之比率     组A     组B     组D
VLP18 10μg/mlVLP18 1μg/ml     19.6    11.1    16.123.2    14.3    18.2
b)体外用gD再刺激
图7显示了在体外用gD抗原再刺激96小时后于脾细胞中监测到的细胞因子的产生。
当比较用于再刺激的10μg剂量和1μg剂量时，没观测到明确的剂量范围效应。
在所有评价的组(单价对联合)中，与指示明确的TH1免疫应答分布型的IL-5(表3)相比，以高得多的浓度产生干扰素-γ。
   表3：在体外用gD再刺激后的干扰素-γ/IL-5之比率
干扰素/IL-5之比率     组A     组B     组C
gD 10μg/mlgD 1μg/ml     6.26.2     7.211.2     3.12.3
c)体外用HBs再刺激
图8显示了在体外用HBs再刺激96小时后于脾细胞中监测到的细胞因子的产生。
对于组B，观测到显著水平的干扰素-γ而非IL5的产生。正如在表2中所显示的，与组B相比，在组E中观测到较高水平的干扰素-γ的产生。然而，在未用抗原再刺激、用于对照的组E(HBs的单价的)中，观测到干扰素-γ的高本底值。用单价疫苗，则观测到非常高的干扰素-γ/IL5的比率；表明诱发了强TH1应答。类似地，用联合疫苗，测定出高的干扰素-γ/IL5之比率；证实了这种制剂同样诱导TH1应答的能力。
表4：体外用HBs再刺激后的干扰素-γ/IL-5的比率
  干扰素/IL-5比率     组B     组E
  HBs 10μg/mlHBs 1μg/ml     15.87.6     65.367.6
结论
评价了用AS04配制的VLP/gD抗原组合或VLP/gD/HBs抗原组合在Balb/C小鼠体内对免疫原性的影响。
关于血清学分析，在抗VLP、抗gD和抗HBs的血清学中，没观测到所述抗原组合的干扰。
VLP与gD抗原组合或VLP、gD与HBs的抗原组合，不影响由所述gD与HBs单价疫苗显示的抗体应答的同种型分布型。
在细胞因子评价方面，用各个联合疫苗组，则确证了用各种单价疫苗观测到的TH1分布型(干扰素-γ/IL-5的比率)。

Claims (6)

1.一种疫苗，所述疫苗包含HPV 16 L1 VLP，HPV 18 L1 VLP，氢氧化铝和3D-MPL。
2.权利要求1的疫苗，其中VLP采用预先吸附在氢氧化铝上的抗原或3D-MPL整体式材料配制。
3.权利要求1或2的疫苗，其中，VLP16和VLP18纯化材料被加到氢氧化铝上，以获得2克VLP/10克氢氧化铝的比例。
4.一种疫苗，由HPV 16 L1 VLP，HPV 18 L1 VPL，氢氧化铝和3D-MPL组成。
5.一种HPV 16 L1 VLP，采用预先吸附在氢氧化铝或AlPO4上的抗原或3D-MPL的整体式材料与矾/3D-MPL配制。
6.一种HPV 18 L1 VLP，采用预先吸附在氢氧化铝或AlPO4上的抗原或3D-MPL的整体式材料与矾/3D-MPL配制。
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