KR102660479B1

KR102660479B1 - 수두 또는 대상포진 백신 조성물 및 이를 이용하는 방법

Info

Publication number: KR102660479B1
Application number: KR1020210117104A
Authority: KR
Inventors: 이찬규; 조나단 로벨; 윤지선; 김석규; 이병만; 하다희; 이정윤; 이춘근; 이예람; 웨이 치아오 후앙; 한제민
Original assignee: 주식회사 유바이오로직스; 주식회사 팝바이오테크놀로지
Priority date: 2020-09-11
Filing date: 2021-09-02
Publication date: 2024-04-25
Also published as: KR20220034667A; US20240033346A1; EP4212173A1; WO2022055176A1

Abstract

수두-대상포진 바이러스(Varicella Zoster virus: VZV)의 gE (glycoprotein E) 항원 및 모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl lipid A: MLA)를 포함하는 수두 또는 대상포진 백신 조성물 및 이를 이용하는 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 백신 조성물은 최적화된 신호펩티드 서열을 포함하는 gE 항원을 포함함으로써 생산 수율이 현저히 향상될 수 있고, MLA를 포함함으로써 면역원성을 증강시킬 수 있고, QS-21을 더 추가하여, MLA로 증강된 면역원성을 더욱 강화할 수 있으며, CoPoP 리포좀 형태로 제조되어 리포좀 표면에 백신 항원이 제시될 수 있어 항원제시세포에 항원이 더욱 잘 흡수될 수 있으며, 하나의 제형에 백신 항원과 면역증강제를 포함하므로 백신 효능을 극대화할 수 있다. 따라서, 상기 백신 조성물은 수두-대상포진 바이러스 감염 질환에 대한 예방 또는 치료에 기존의 백신을 대체하여 유용하게 사용될 수 있다.

Description

수두 또는 대상포진 백신 조성물 및 이를 이용하는 방법{Vaccine composition for chicken pox or herpes zoster and method using the same}

수두-대상포진 바이러스(Varicella Zoster virus: VZV)의 gE (glycoprotein E) 항원 및 모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl lipid A: MLA)를 포함하는 수두 또는 대상포진 백신 조성물 및 이를 이용하는 방법에 관한 것이다.

백신의 안전성에 대한 요구가 증대되면서 생백신이나 사백신보다 구조와 성분이 명확하고 안전한 서브유닛 항원(Subunit antigens)의 개발이 증가하고 있다. 그러나 서브유닛 항원은 생백신 또는 사백신에 비해 안전성은 높으나 백신 효능이 낮아 이를 보강하기 위해 면역증강제(Adjuvant)를 사용한 백신 개발이 크게 늘어나고 있다. 현재까지 의약품용 면역증강제는 백신의 면역원성을 강화시키기 위해 인체 백신 개발에 주로 이용되어 왔으나, 구체적인 작용기전이 밝혀지고 몸속 면역체계를 조절해 질환을 극복하기 위한 면역치료법이 각광받으면서 항암, 자가면역 치료 등의 분야로 적용범위가 확대되고 있다.

대상포진(herpes zoster)은 수두-대상포진 바이러스(Varicella Zoster virus: VZV)에 감염되어 수두(chicken pox)로 발병한 후, 신경절에 잠복해 있다가 면역력이 약해지면 재활성화 되어 발병한다. 전체 환자의 약 60% 정도가 50대 이상이며, 면역기능이 저하되거나 스트레스를 많이 받은 사람에서 발병하여 발진과 수포를 일으키고, 피부병변이 나은 후에도 매우 심한 통증이 수개월 또는 수년 동안 남아있게 되는 '대상포진 후 신경통(postherpetic neuralgia: PHN)'이라는 조절이 힘든 합병증을 수반한다. 매년, 전 세계에서 1천만 명, 미국에서는 50만 명이 해당 바이러스에 영향을 받으며 이 중, 약 10~20%의 경우 VZV가 재활성화하여 대상포진이 발병한다.

최초 개발된 대상포진 백신인 Merck사의 조스타박스(Zostavax)는 예방효과가 높지 않고 약독화된 수두-대상포진 생바이러스를 주성분으로 사용하므로 면역결핍 상태의 환자, 임부, 혹은 임신 가능성이 있는 사람 등에 대해서는 투약에 제한이 있으며, 생산성이 낮아 수요에 비해 공급이 원활하지 못하고 가격이 비싼 문제가 있다.

이에, 생산성이 높고, 효능은 우수하면서 안전성이 보장될 수 있는 새로운 대상포진 백신의 개발이 필요하다.

대한민국 등록특허 제10-2133927호.

수두-대상포진 바이러스(Varicella Zoster virus: VZV)의 gE (glycoprotein E) 항원 및 모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl lipid A: MLA)를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

백신 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 수두-대상포진 바이러스(Varicella Zoster virus: VZV)의 gE (glycoprotein E) 항원; 및 모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl lipid A: MLA)를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "수두-대상포진 바이러스(Varicella Zoster virus: VZV)"는 바리셀라 조스터 바이러스라고도 하며, 감염 시 수두(chicken pox) 또는 대상포진(herpes zoster)을 유발하는 바이러스를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "gE (glycoprotein E)"는 수두-대상포진 바이러스의 표면에 존재하는 당단백질 E를 의미하며, 인간 허피스바이러스 3형(Human herpesvirus type 3, HHV-3) 전체 게놈에서 gE 유전자에 해당하는 ORF 68 영역에 의해 코딩되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 야생형 gE 단백질은 NCBI Genbank 등록번호 NP_040190.1의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있고, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있으며, 상기 서열번호 5의 아미노산 서열에서 1 내지 30 번째 아미노산 서열은 신호펩티드 서열에 해당하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "항원"은 동물 내로 주사되거나, 흡수되거나, 달리 도입되는 조성물을 포함하는, 동물에서 항체 및/또는 T 세포 반응의 생성을 자극할 수 있는 화합물, 조성물, 또는 물질을 말한다. 상기 항원은 모든 관련된 항원성 에피토프를 포함한다. 용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 말한다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VZV의 gE 항원은 야생형 gE 항원과 달리 C-말단에 앵커(anchor) 영역, 예를 들면, 서열번호 5의 아미노산 서열에서 547 내지 623 번째 아미노산 서열을 포함하지 않는 재조합 단백질일 수 있다. 예를 들면, 상기 gE 항원은 야생형 gE 항원에서 상기 C-말단 영역이 제거되도록 절단된(truncated) 것일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VZV의 gE 항원은 생산성이 개선될 수 있도록 신호펩티드가 최적화된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 gE 항원은 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는 신호펩티드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 gE 항원은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 C-말단에 '아르기닌-아르기닌-트립토판-트레오닌-글리신-글리신-루신-아르기닌(AAWTGGLA)'의 아미노산 서열이 더 포함된 것일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 gE 항원은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 이러한 동일성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 gE 항원과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

상기 gE 항원은 서열번호 3 또는 4의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈 최적화된 것일 수 있고, 예를 들어, CHO 세포에서 발현이 잘 될 수 있도록 코돈 최적화된 것일 수 있다. 상기 gE 항원은 서열번호 3 또는 4의 염기서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로, 서열번호 3 또는 4의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 기능적으로 동등한 성질을 가지는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.

상기 gE 항원은 VZV 및 이로부터 분리된 단백질로부터 유래되거나 또는 재조합된 폴리펩티드일 수 있다. 상기 gE 항원은 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 재조합될 수 있다. 예를 들어, gE 항원을 코딩하는 염기서열을 디자인하여 이를 포함하는 벡터를 제작하고, 이를 숙주세포에 도입하여 gE 항원을 발현하는 미생물을 제작한 후, 상기 숙주세포를 배양하여 배양물로부터 gE 항원을 분리 및 정제하여 재조합된 gE 항원을 수득할 수 있다. 상기 gE 항원을 코딩하는 염기서열은 예를 들어, 서열번호 3 또는 4의 염기서열일 수 있다.

상기 gE 항원은 상기 백신 조성물 총 중량에 대해서 0.0001 내지 10 중량%, 0.0001 내지 5 중량%, 0.0001 내지 1 중량%, 0.0001 내지 0.5 중량%, 0.0001 내지 0.1 중량%, 0.0001 내지 0.05 중량%, 0.001 내지 10 중량%, 0.001 내지 5 중량%, 0.001 내지 1 중량%, 0.001 내지 0.5 중량%, 0.001 내지 0.1 중량% 또는 0.001 내지 0.05 중량%로 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "지질 A"는 2개의 글루코사민(탄수화물 또는 당) 및 이에 결합된 아실 사슬로 이루어져 있고, 일반적으로 각 글루코사민에 하나의 인산기가 결합된 것을 의미한다. 아실 사슬의 개수에 따라 트리, 테트라, 펜타, 헥사 또는 헵타 아실화된 것일 수 있다. 글루코사민에 직접 부착된 4개의 아실 사슬은 길이가 10 내지 16개의 탄소로 이루어진 베타 히드록시 아실 사슬이고, 2개의 추가적인 아실 사슬은 주로 베타 히드록시기에 부착된 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl lipid A: MLA)"는 MPL, MPLA, MPL-A 또는 EcML (Escherichia coli MLA)과 혼용될 수 있고, 지질 A의 2개의 글루코사민 중 하나의 글루코사민에만 1개의 인산기가 결합된 것을 의미할 수 있다. 상기 MLA는 아실 사슬의 개수에 따라 트리, 테트라, 펜타, 헥사 또는 헵타 아실화된 것일 수 있고, 예를 들면, 1-탈인산-지질 A, 1-탈인산-펜타 아실 지질 A, 1-탈인산-테트라 아실 지질 A, 또는 이들의 조합일 수 있다. 용어, "1-탈인산-지질 A"는 지질 A의 구조에서 1번 위치의 인산기가 떨어지고 히드록시기로 변환된 것으로, MLA의 일종이며, 헥사 아실화된 것일 수 있고, "1-탈인산-헥사 아실 지질 A" 또는 "헥사 아실화된 1-탈인산-지질 A"와 혼용될 수 있다.

상기 MLA는 당 모이어티(sugar moiety)를 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 당 모이어티는 2-케토-3-데옥시-D-만노-옥투로소네이트 (2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonate: Kdo)일 수 있다. Kdo는 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)의 구성 성분으로서, 거의 모든 LPS에서 발견되는 보존된 잔기이다.

상기 MLA는 살아있는 세균의 막, 예를 들어 외막에 존재하는 것일 수 있다.

상기 MLA는 화학적으로 합성되거나, 또는 MLA를 생산하는 균주로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 MLA를 생산하는 균주는 예를 들면, 야생형 또는 유전자 조작된 대장균(Escherichia coli)일 수 있고, 대한민국 등록특허 제 10-2019331호에 개시된 대장균 KHSC0055 균주일 수 있다.

상기 MLA는 상기 백신 조성물 총 중량에 대해서 0.0001 내지 10 중량%, 0.0001 내지 5 중량%, 0.0001 내지 1 중량%, 0.0001 내지 0.5 중량%, 0.0001 내지 0.1 중량%, 0.0001 내지 0.05 중량%, 0.001 내지 10 중량%, 0.001 내지 5 중량%, 0.001 내지 1 중량%, 0.001 내지 0.5 중량%, 0.001 내지 0.1 중량% 또는 0.001 내지 0.05 중량%로 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 백신 조성물 내에 포함되는 gE 항원:MLA의 중량비는 1:0.1 내지 10, 1:0.1 내지 5, 1:0.1 내지 4, 1:0.1 내지 3, 1:0.2 내지 10, 1:0.2 내지 5, 1:0.2 내지 4, 또는 1:0.2 내지 3일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 MLA를 생산하는 균주로부터 MLA를 분리하는 방법은 상기 균주로부터 지질을 수득한 후, 수득한 지질로부터 MLA를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 균주로부터 지질을 수득하는 방법은 공지된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 방법은 물리적 또는 화학적 방법을 포함할 수 있고, 물리적 방법은 예를 들어, 초음파 또는 냉해동 반복을 수행하는 것일 수 있고, 화학적 방법은 유기 용매를 사용하여 추출하는 것일 수 있다. 상기 유기 용매는 예를 들어, 클로로포름, 페놀, 페트롤리움 에테르(petroleum ether), 디클로로메탄(dichloromethane), 메탄올, 헥산, 이소프로필 알콜, 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 에탄올, 부탄올, 또는 이들의 조합일 수 있다. 지질을 추출하는 방법은 예를 들어 블라이와 다이어(Bligh and Dyer) 추출법(Bligh, E.G. and Dyer, W.J., Can. J. Biochem. Physiol., 1959, vol.37, p.911-917)일 수 있다.

상기 수득한 지질로부터 MLA를 수득하는 단계는 수득한 지질로부터 당 모이어티(sugar moiety)를 제거하는 단계를 포함하지 않을 수 있고, 상기 당 모이어티는 Kdo일 수 있다. 상기 MLA를 수득하는 단계는 크로마토그래피로 수행될 수 있다. 상기 크로마토그래피는 이온 교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography), 얇은 막 크로마토그래피(thin layer chromatography: TLC), 액체 크로마토그래피(liquid chromatography: LC), 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 이온 교환 크로마토그래피는 음이온-교환 크로마토그래피 또는 양이온-교환 크로마토그래피일 수 있다. 상기 이온 교환 크로마토그래피의 레진은 예를 들어 셀룰로스, 세파덱스(Sephadex), 또는 세파로스(Sepharose)일 수 있다. 상기 이온 교환 크로마토그래피의 레진은 디에틸아미노에틸(diethylaminoethyl: DEAE)기를 함유할 수 있다. 상기 액체 크로마토그래피는 고성능 액체크로마토그래피(high-performance liquid chromatograph: HPLC)일 수 있다. 상기 크로마토그래피는 역상(Reversed-phase) 크로마토그래피일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 백신 조성물은 리포좀 제형일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 백신 조성물은 사포닌을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 백신 조성물 중 사포닌은 QS-21일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 백신 조성물은 (i) 인지질; 및 (ii) 배위결합에 의해 결합된 코발트-포르피린으로 구성되는 코발트-포르피린-인지질(Cobalt-porphyrin-phospholipid: CoPoP) 결합체를 더 포함하고, 리포좀 제형일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 백신 조성물은 CoPoP 결합체 및 사포닌을 더 포함하고, 리포좀 제형일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 백신 조성물 중 사피닌은 QS-21일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 CoPoP 결합체를 더 포함하고, 리포좀 제형인 백신 조성물에 포함되는 gE 항원은 폴리히스티딘으로 태그된 것일 수 있고, 상기 폴리히스티딘은 5 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리히스티딘은 예를 들어, 3 내지 20개, 3 내지 16개, 3 내지 12개, 3 내지 8개, 5 내지 20개, 5 내지 16개, 5 내지 12개, 5 내지 8개, 6 내지 20개, 6 내지 16개, 6 내지 12개, 6 내지 10개, 또는 6 내지 8개의 히스티딘 잔기를 포함하는 것일 수 있다.

상기 폴리히스티딘의 적어도 일부는 리포좀의 단층 또는 이중층의 소수성 부분에 존재하고, 상기 폴리히스티딘의 1개 이상의 히스티딘 잔기는 상기 코발트-포르피린의 코발트와 배위결합을 형성함으로써 상기 gE 항원의 적어도 일부가 리포좀 외측으로 노출되어 있는 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "백신 조성물"은 용어 "면역원성 조성물"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 백신 조성물은 병원체(예, VZV)에 대한 특이적 면역 반응을 유도할 수 있는 인간 또는 동물 대상에게 투여하기에 적합한(예를 들어, 실험 환경에서) 물질의 조성물을 말한다. 백신 조성물은 하나 이상의 항원(예를 들어, 전체 정제　바이러스　또는 항원성 하위단위, 예를 들어, 이들의 폴리펩티드) 또는 항원성 에피토프를 포함한다.

상기 백신 조성물은 또한 부형제, 담체, 및/또는 애주번트(adjuvant)와 같은, 면역 반응을 유도하거나 향상시킬 수 있는 하나 이상의 추가의 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 백신 조성물은 마그네슘 히드록시드, 알루미늄 히드록시드, 알루미늄 포스페이트 및 수화 알루미늄 포타슘 설페이트(Alum), 사포닌의 일종인 QS-21 등의 면역증강제를 더 포함할 수 있다.

상기 백신 조성물은 병원체에 의해 유도된 증상 또는 병태에 대해 대상을 보호하는 면역 반응을 유도하기 위해 대상 또는 대상의 집단에 투여될 수 있다. 상기 백신 조성물은 병원체에 대한 대상의 노출 후에 병원체의 복제를 억제함으로써 병원체에 의해 야기되는 증상 또는 질환을 예방하거나 치료하기 위해(예를 들어, 감소시키거나 개선함) 투여될 수 있다. 상기 백신 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

상기 백신 조성물은 gE 항원의 적어도 일부가 리포좀 외측으로 노출되어 있어, 항원제시세포(Antigen-presenting Cell: APC)에 항원이 흡수될 확률을 높일 수 있고, 이에 따라 높은 면역원성을 유도할 수 있다.

상기 CoPoP 결합체의 포르피린 부분은 포르피린, 포르피린 유도체, 포르피린 유사체, 또는 이들의 조합일 수 있다. 대표적인 포르피린에는 헤마토포르피린, 프로토포르피린 및 테트라페닐포르피린이 포함될 수 있다. 대표적인 포르피린 유도체에는 피로페오포르바이드류, 박테리오클로로필류, 클로로필 A, 벤조포르피린 유도체, 테트라하이드록시페닐클로린류, 푸르푸린류, 벤조클로린류, 나프토 클로린류, 벨진(verdin) 류, 로진(rhodin) 류, 케토 클로린류, 아자클로린류, 박테리오클로린류, 트리포르피린류 및 벤조박테리오클로린류가 포함될 수 있다. 대표적인 포르피린 유사체에는 확장 포르피린 패밀리 멤버(예를 들면 텍사피린류, 사피린류 및 헤키사피린류) 및 포르피린 이성질체(예를들면, 포르피센류, 반전 포르피린류, 프탈로시아닌류 및 나프탈로시아닌류)가 포함될 수 있다. 상기 코발트-포르피린은 예를 들면, 비타민 B₁₂(코발라민) 또는 그 유도체일 수 있다.

상기 CoPoP 결합체의 인지질은 글리세롤 골격을 거쳐 소수성 지질 꼬리에 연결된 인산기를 가지는 친수성 머리 부분을 가지는 지질을 의미할 수 있다. 상기 인지질은 탄소수 6 내지 22의 아실 곁사슬을 포함하는 것일 수 있다. 상기 인지질은 예를 들어, 1-팔미토일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 CoPoP 결합체에서 상기 포르피린은 탄소수 1 내지 20개의 탄소 사슬 링커에 의해 상기 인지질의 글리세롤기에 결합된 것일 수 있다.

다른 양상은 서열번호 3의 염기서열을 포함하는, 수두-대상포진 바이러스(Varicella Zoster virus: VZV)의 gE (glycoprotein E) 항원 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포를 배양하는 단계; 및

상기 숙주세포를 배양한 배양물로부터 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VZV의 gE 항원을 수득하는 단계를 포함하는 백신 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 백신 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, VZV의 gE 항원; 및 MLA를 포함하는 백신 조성물일 수 있고, 앞서 기술된 바와 같다.

상기 발현 벡터는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 목적 단백질을 발현시키기에 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 형태로 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 발현 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질감염된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

상기 백신 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 상기 방법에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "형질감염(transfection)"은 유전자를 숙주로 도입하여 유전자가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 유전자를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 본 발명의 형질감염 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다.

또한, 상기에서 용어, "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미할 수 있다.

상기 숙주세포는 CHO 세포일 수 있다.

상기 형질감염된 숙주세포를 배양하는 단계에 있어서, 배양액의 종류, 배양 온도, 배양 조건 등은 공지된 것일 수 있다. 배양 배지는 항생제를 포함할 수 있다. 상기 항생제는 예를 들어 카나마이신, 암피실린, 클로람페니콜 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "배양물"은 상기 형질감염된 숙주세포를 공지된 미생물 배양 방법에 따라 배양한 다음 수득한 산물을 의미하며, 상기 배양물은 배양 상등액 또는 세포 파쇄액을 모두 포함하여, 세포가 포함 또는 불포함될 수 있다.

상기 gE 항원을 수득하는 단계에 있어서, gE 항원의 수득은 당업계에 통상적인 단백질 분리 및 정제 방법에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상기 숙주세포를 배양한 배양물에 대한 크로마토그래피를 통하여 gE 항원을 분리 및 정제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, gE 항원을 발현하는 형질감염된 숙주세포의 배양 상등액을 회수하여, Q XL 크로마토그래피, 부틸 크로마토그래피, Ni²⁺ 친화 크로마토그래피 및 UF (ultrafiltration) / DF (diafiltration) 공정을 수행하여 재조합 gE 항원을 분리 및 정제할 수 있다.

상기 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 gE 항원 유전자는 형질전환된 숙주 세포의 배양에 의해 고수율로 발현되고, 그에 의해 gE 항원 및 그를 포함하는 백신 조성물의 생산 수율의 증가에 기여할 수 있다.

상기 백신 조성물을 제조하는 방법은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 VZV의 gE 항원을 포함하는 백신 조성물을 제조함으로써, 백신 조성물의 생산 수율을 현저히 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 백신 조성물은 리포좀 제형이고, 상기 방법은 인지질과 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 제조용 조성물에 MLA를 첨가하여 MLA가 포함된 리포좀 제형을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 방법은 상기 gE 항원과 상기 MLA가 포함된 리포좀 제형을 혼합하는 단계, 및 상기 gE 항원과 혼합된 리포좀에 사포닌을 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 혼합되는 사포닌은 QS-21일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 방법은 상기 gE 항원과 상기 MLA가 포함된 리포좀 제형을 혼합하는 단계, 및 상기 gE 항원과 혼합된 리포좀에 QS-21을 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 리포좀 제형을 제조하는 단계는 상기 리포좀 제조용 조성물에 CoPoP를 더 첨가하여, MLA 및 CoPoP가 포함된 리포좀 제형을 제조하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 방법은 상기 gE 항원과 상기 MLA 및 CoPoP가 포함된 리포좀 제형을 혼합하여, 상기 리포좀 제형에 상기 gE 항원을 결합시키는 단계, 및 상기 gE 항원과 결합된 리포좀에 사포닌을 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 방법은 상기 gE 항원과 상기 MLA 및 CoPoP가 포함된 리포좀 제형을 혼합하여, 상기 리포좀 제형에 상기 gE 항원을 결합시키는 단계, 및 상기 gE 항원과 결합된 리포좀에 QS-21을 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 gE 항원과 리포좀 제형은 항원과 리포좀 중 MLA의 1:0.1 내지 10, 1:0.1 내지 5, 1:0.1 내지 4, 1:0.1 내지 3, 1:0.2 내지 10, 1:0.2 내지 5, 1:0.2 내지 4, 또는 1:0.2 내지 3일 수 있으나, 이에 제한되지 않는 중량비로 혼합될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 gE 항원과 리포좀 제형은 항원과 리포좀 중 MLA의 1:1의 중량비로 혼합될 수 있다.

다른 양상은 수두-대상포진 바이러스 감염이 예상되거나 또는 수두-대상포진 바이러스 감염으로 인한 질환이 발병된 개체에게 상기 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 수두-대상포진 바이러스 감염으로 인한 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 백신 조성물은 상기한 바와 같다.

상기 백신 조성물은 당업계에 알려진 방법에 의해 개체에 투여될 수 있다. 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구 등과 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다.

상기 백신 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "약제학적으로 유효한 양"이란 백신 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 치료될 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 백신 조성물의 체외 배설 속도, 치료 지속 기간, 백신 조성물과 조합되거나 또는 동시에 사용되는 약물, 대상체의 연령, 체중, 성별, 식습관, 일반적인 건강 상태, 및 의약 업계 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다. 상기 약제학적으로 유효한 양을 결정하는데 고려되는 다양한 일반적인 사항들은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Gilman et al., eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990] 및 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990]에 기재되어 있다. 상기 백신 조성물은 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.

상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 생쥐, 래트, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 고양이, 또는 유인원일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "예방"이란 본 발명의 백신 조성물의 투여로 수두-대상포진 바이러스 감염에 의한 질환 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "치료"란 본 발명의 백신 조성물의 투여로 인해 수두-대상포진 바이러스 감염에 의해 이미 유발된 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

일 양상에 따른 백신 조성물은 최적화된 신호펩티드 서열을 포함하는 gE 항원을 포함함으로써 생산 수율이 현저히 향상될 수 있고, MLA를 포함함으로써 면역원성을 증강시킬 수 있고, QS-21과 같은 사포닌을 더 추가하여, MLA로 증강된 면역원성을 더욱 강화할 수 있으며, CoPoP 리포좀 형태로 제조되어 리포좀 표면에 백신 항원이 제시될 수 있어 항원제시세포에 항원이 더욱 잘 흡수될 수 있고, 하나의 제형에 백신 항원과 면역증강제를 포함하므로 백신 효능을 극대화할 수 있다. 따라서, 상기 백신 조성물은 수두-대상포진 바이러스 감염 질환에 대한 예방 또는 치료에 기존의 백신을 대체하여 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 대장균 KHSC0055의 본배양 세포성장 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 2는 대장균 KHSC0055 균주의 배양액으로부터 총 지질을 수득하고 TLC 분석한 결과를 나타낸 사진이다(레인 1, 2 및 3: 수득한 지질 1 ㎎/㎖을 각각 5, 10, 및 15 ㎕씩 적재(loading)한 것).
도 3은 총 지질을 이온교환 크로마토그래피로 정제하고 염 농도구배별 용출액을 TLC로 분석한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 지질 중 인산기 함량의 표준곡선이다.
도 5는 대장균 KHSC0055 균주로부터 수득한 정제 전 총 지질(total lipid: TL), DEAE 1차 정제 시료(DEAE), 및 DEAE 정제 시료를 C8 레진으로 2차 정제한 시료 1 mg/mL를 10 ㎕ 또는 20 ㎕ 적재한 경우의 TLC 분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 gE 항원을 생산하는 세포주에서 gE 항원의 발현을 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 사진이다(레인 1: 사이즈 마커; 레인 2: gEt-H6 생산 세포주 5 ㎍; 레인 3: gEt 생산 세포주 5 ㎍; 레인 4: gEs-H6 생산 세포주 5 ㎍; 레인 5: gEt-H6 생산 세포주 10 ㎍; 레인 6: gEt 생산 세포주 10 ㎍; 및 레인 7: gEs-H6 생산 세포주 10 ㎍).
도 7a는 마우스에 항원, ELS, ECLS, ELSQ 또는 ECLSQ 백신 조성물 투여 후 형성된 항체 역가를 측정하여 gEt 항원과 gEt-H6 항원의 효과를 비교한 결과 그래프이고, 도 7b는 상기와 동일한 실험 후 gEt-H6 항원과 gEs-H6 항원의 효과를 비교한 결과 그래프이고, 도 7c는 상기와 동일한 실험 후 전체 시험군의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 항원, ELS, ECLS, ELSQ 또는 ECLSQ 백신 조성물을 투여한 마우스의 비장세포에 gE 펩타이드, gE 단백질 또는 수두-대상포진 바이러스를 처리하여 항원 특이적으로 재자극을 받은 세포로부터 분비된 사이토카인을 정량화한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 모노포스포릴 지질 A의 제조

1.1. 모노포스포릴 지질 A 생산 균주의 배양

1.1.1. 모노포스포릴 지질 A 생산 균주 및 배지의 준비

모노포스포릴 지질 A 생산 균주로는 대한민국 등록특허 제 10-2019331호에 개시된 대장균 KHSC0055 균주를 사용하였다. 상기 균주의 배양은 30L 발효조(Fermenter)에서 수행되었으며, 종균 배양 및 본배양 배지를 각각 따로 만들었다. 종배양 배지로는 16.0 g/L의 펩톤(BD Bioseciences), 10 g/L의 효모 추출물, 및 5 g/L의 NaCl을 멸균하여 사용하였고, 균주 배양 직전에 100 ㎍/㎖의 암피실린을 첨가하였다. 본배양 배지로는 3.5 g/L의 펩톤(BD Bioseciences), 21.0 g/L의 효모 추출물, 6.0 g/L의 KH₂PO₄, 5.0 g/L의 K₂HPO₄, 및 5.0 g/L의 NH₄Cl을 멸균하여 사용하였고, 40.0 g/L의 글루코스 및 10.0 g/L의 MgSO₄·7H₂O을 멸균하여 균주를 배양하는 동안 본배양기에 무균적으로 첨가할 수 있게 하였다.

1.1.2. 종 배양

1차 종 배양을 위해 1L의 엘렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask)에 200 ㎖의 멸균 종배양 배지를 가하였다. KHSC0055의 종균 바이알을 해동하여 플라스크에 첨가하고 약 31℃의 진탕배양기에서 약 18 내지 약 22시간 동안 배양하였다.

2차 종 배양을 위해 2L 엘렌마이어 플라스크 6개에 각각 600 ㎖의 멸균 종균배양 배지를 가하고, 35 ㎖의 1차 종균 배양액을 접종하였다. 약 31℃의 진탕배양기에서 약 7 내지 약 12시간 동안 배양하였다.

1.1.3. 본배양

본배양은 30L 발효기에서 초기 워킹볼륨 18L로 배양하였다. 발효기에 18L의 본배양배지를 채워 멸균하고, 글루코스 용액은 따로 멸균하여 배양하는 동안 무균적으로 발효기에 첨가하였다. 배양액 내의 글루코스의 농도는 1g/L 이하로 조절하였다. 배지의 pH는 NH₄OH를 이용하여 pH 6.7을 유지시켜 주었다. 발효기에 2차 종 배양액을 접종하고 약 31℃에서 공기살포(aeration) 3.0 Lpm, 용존 산소량(dissolved oxygen: DO)은 약 50%로 조절하였고 약 300 내지 약 400 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 600nm에서 흡광도를 측정하여 배양물의 성장단계를 모니터링하였다(도 1).

배양액의 회수는 대장균이 지수성장기를 지나 정지기 이후 사멸기에 도달하였을 때 회수하였다. 배양액은 원심분리 또는 접선 유동 여과(tangential flow filtration) 중 하나의 방법으로 여과하고 PBS로 세정 후 동결하였다.

1.2. 지질의 추출 및 박막크로마토그래피(TLC) 분석

상기 실시예 1.1.에서 회수한 배양액을 상온에서 약 20분 동안 원심분리하여 대장균만을 수득하였고, 수득된 대장균 10 ㎖을 40 ㎖의 PBS로 세척한 후 다시 원심분리하여 대장균만을 수득하였다. 세척 2회 반복후 10 ㎖의 PBS에 재현탁 하였다. 재현탁된 대장균 5 ㎖에 메탄올 12.5 ㎖ 및 클로로포름 6.25 ㎖을 가하고 진탕하면서 1시간동안 상온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션된 혼합물을 상온에서 약 30분간 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 수득된 상층액에 메탄올과 클로로포름을 각각 6.25 ㎖씩 취하여 완전히 혼합한 다음 상온에서 20분간 원심분리하였다. 원심분리된 혼합물에서 유기용매 층을 분리하고 질소건조기에서 건조시켜 지질 A와 모노포스포릴 지질 A를 추출하였다. 수득된 지질은 냉장보관하였다.

수득한 지질을 대상으로 얇은 막 크로마토그래피(thin layer chromatography: TLC)를 수행하였다. 수득한 총 지질을 4:1(v/v) 클로로포름:메탄올에 용해시켜 1 ㎎/㎖으로 희석한 후, 5 ㎕, 10 ㎕ 또는 15 ㎕를 10 x 10 cm HPTLC 플레이트(EMD Chemicals)에 스폿팅(spotting)하고, 40:25:4:2(v/v)의 클로로포름:메탄올:물:암모늄 히드록시드(28%(v/v) 암모니아)의 용매에서 전개하였다. 전개된 플레이트를 건조시키고, 10%(v/v) 황산(에탄올 중)으로 분무하여 시각화하고, 300℃의 핫 플레이트에서 그을려 밴드를 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 추출된 지질은 지질 A와 모노포스포릴 지질 A의 혼합물임을 확인하였다.

1.3. 모노포스포릴 지질 A의 1차 정제

상기 실시예 1.2.에서 수득한 총 지질로부터 모노포스포릴 지질 A를 1차적으로 정제하기 위하여 이온교환 크로마토그래피를 수행하였다.

이온교환 크로마토그래피로는 폴리머 기질의 Macro Prep DEAE(Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 사용하였다. Macro Prep DEAE는 약한 음이온 교환수지로서, -HN⁺(C₂H₅)₂가 작용기로 작용한다.해당 정제방법에서 유기용매를 이용하기 때문에 컬럼의 재질은유리(glass) 또는 스테인레스 스틸을 사용하였다.

지질 A와 모노포스포릴 지질 A의 혼합물로부터 모노포스포릴 지질 A만을 수득하기 위해, 암모늄 아세테이트 농도구배 하에 정제하였다. 클로로포름:메탄올:증류수(2:3:1, v/v)의 용액으로 컬럼 볼륨(Column volume: CV) 10 CV 이상 흘려 레진을 평형화시켰다. 3 mg/㎖의 지질 추출물을 평형화된 레진에 적재하였다. 클로로포름:메탄올:증류수(2:3:1, v/v)의 용액으로 20 CV 이상 레진을 세척하여, 대장균 유래의 불순물들이 충분히 닦여져 용출(elution)되게 하였다.

모노포스포릴 지질 A의 용출을 위해, 클로로포름:메탄올: 5 내지 50 mM 염(암모늄 아세테이트)(2:3:1, v/v)의 농도구배를 이용하여 용출하였다. 이때, 1 CV씩 용출된 각 분획에 대해 TLC 분석을 수행하였다(도 3). TLC 분석결과 모노포스포릴 지질 A만 용출된 분획을 수집하여 분별깔대기(separatory funnel)에 풀링하였다. 버퍼 교환 및 모노포스포릴 지질 A의 안정성을 높이고자, 풀링된 용액 60 ㎖ 당 10 ㎖의 클로로포름을 가한 후, 0.1 N의 HCl 용액을 가하였다. 이때 최종 클로로포름:메탄올:증류수의 비율은 2:2:1.8(v/v)로 하였다. 분별깔대기를 잘 흔들어 모든 용액이 고르게 섞이도록 한 뒤 2개의 층으로 분리될 때까지 방치하였다. 이 때, 모노포스포릴 지질 A가 녹아있는 유기용매층과 수용액층이 혼합된 1개 상(phase)에서, 유기용매와 수용액층이 분리된 2개 상으로 상 변화가 일어나면, 유기용매층만을 분리하여 모노포스포릴 지질 A를 얻었다. 레진에 여전히 결합되어 있는 지질 A의 용출을 위해 고농도(500 mM 내지 1 M)의 염(암모늄 아세테이트)으로 레진을 재생(Regeneration)시켰다.

용출액 별 TLC 분석 결과를 도 3에 나타내었다(레인 1: 정제 전 지질 시료, 레인 2 내지 5: 지질 시료 적재 후 세척, 레인 6 내지 25: 염 농도 구배하여 1 CV 씩 분획(모노포스포릴 지질 A 용출), 레인 26 내지 32: 고농도 염으로 세척(지질 A 용출)).

도 3에 나타난 바와 같이, 이온교환 크로마토그래피에 의해 모노포스포릴 지질 A를 높은 순도로 정제할 수 있음을 확인하였다.

1.4. 지질 A와 모노포스포릴 지질 A의 인산기 함량 측정

지질 A와 모노포스포릴 지질 A는 인산기(phosphate)의 개수 차이로 지질 A의 경우 2분자의 인산기를 가지며, 모노포스포릴 지질 A는 1분자의 인산기를 가진다. 따라서, 지질A 1M은 2M의 인산기를 가지며, 모노포스포릴 지질 A 1M은 1M의 인산기를 가진다.

KHSC0055의 균주로부터 얻은 지질은 지질 A의 골격에 부착된 지방산들의 갯수 및 위치의 다양성으로 인해 이성질체의 혼합물이다. 수득된 모노포스포릴 지질 A의 인산기 함량을 측정하기 위해, 하기 방법을 이용하였다.

표준품 0.65 mM Phosphorus standard solution(Sigma cat. no. P3869)을 사용하여 정량곡선을 작성하였다. 0 μmole의 블랭크, 0.0325 μmole(50 ㎕), 0.065 μmole (100 ㎕), 0.114 μmole (175 ㎕), 0.163 μmole (250 ㎕), 및 0.228 μmoles(350 ㎕)로 표준품을 각각 유리 시험관에 가하였다. 0.45 ㎖의 8.9N H₂SO₄를 각각 시험관에 넣고 200℃ 내지 215℃에서 25분간 인큐베이션하였다. 뜨거워진 유리 시험관을 실온에서 5분간 식힌 후 150 ㎕의 H₂O₂를 넣고 200℃ 내지 215℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 뜨거워진 유리 시험관을 실온에서 식힌 다음 3.9 ㎖의 증류수를 각각의 시험관에 첨가하고 충분히 교반하였다. 각각의 유리 시험관에 0.5 ㎖의 2.5%(w/v) 몰리브덴산 암모늄(Ammonium molybdate)(VI) 4 수화물 용액을 가하고 충분히 교반하였다. 각각의 유리 시험관에 0.5 ㎖의 10%(w/v) 아스코르브산 용액을 가하여 충분히 교반한 다음, 액체가 기화되는 것을 방지하기 위하여 유리 시험관의 뚜껑을 꼭 닫아 100℃에서 7분간 인큐베이션하였다. 시료를 실온에서 식힌 뒤 96웰 플레이트로 옮겼다. ELISA 리더기를 이용하여 820 nm에서 흡광도를 측정하고, 측정한 인산기 함량 표준곡선을 도 4에 나타내었다. 표준 곡선의 R²값은 0.9989로, 신뢰성이 있다.

인산기 함량 표준곡선을 이용하여 정제 전 총 지질, 정제 후 모노포스포릴 지질 A 및 지질 A의 인산기 함량을 산출하였다. 산출된 결과를 표 1에 나타내었다.

시료	총 지질(정제 전)	모노포스포릴 지질 A (정제후)	지질 A (정제후)
인산기 함량(μmol/㎎)	0.91	0.55	1.09

표 1에 나타난 바와 같이, 정제 전 총 지질의 인산기 함량은 0.91 μmol/㎎이었고, 모노포스포릴 지질 A의 인산기 함량은 0.55 μmol/㎎이었고, 지질 A는 그 2배인 1.09 μmol/㎎이었다. 따라서, 정제를 통해 총 지질로부터 모노포스포릴 지질 A만 수득되었다는 것을 확인하였다.

1.5. 역상 크로마토그래피에 의한 모노포스포릴 지질 A의 2차 정제

이온교환 크로마토그래피를 통해 지질 A로부터 모노포스포릴 지질 A의 정제를 수행한 후 남아있는 대장균 유래의 인지질의 분리 정제와 모노포스포릴 지질 A의 동종체 함량 조절을 위하여 역상 크로마토그래피(Reverse phase chromatography)를 실시하였다.

분리정제를 위한 레진으로 SMT bulk C8 레진(Separation Methods Technologies, Inc.)을 사용하였다. 정제 조건은 용매의 극성도 차이에 의해 진행하였고, 암모늄 아세테이트를 사용하여 시료를 이온화시켰다. 이동상 A는 2L 기준으로 클로로포름, 메탄올 및 증류수를 각 297, 1,485 및 198 mL씩 혼합하여 15:75:10 (v/v)의 비율을 맞추고, 암모늄 아세테이트를 3.08 g 첨가하여 20 mM로 포함되도록 제조하였다. 이동상 B는 클로로포름 및 메탄올을 각 297 및 1,683 mL씩 혼합하여 15:85 (v/v)의 비율을 맞추고, 암모늄 아세테이트를 3.08 g 첨가하여 20 mM로 포함되도록 제조하였다.

이동상 A를 컬럼 볼륨(Column volume: CV) 기준으로 10 CV 이상 흘려 레진을 평형화시켰다. 상기 실시예 1.3.에서 이온교환 크로마토그래피를 통해 수득한 모노포스포릴 지질 A와 소량의 인지질의 혼합물 시료를 0.45 ㎛ PTFE 시린지 필터로 여과한 후, 평형화된 레진에 적재하였다. 이때 혼합물의 농도가 3 mg/mL 이하가 되도록 하였다. 그 후, 레진에 결합하지 못한 잔여 물질 및 인지질을 제거하기 위하여, 이동상 A를 20 CV 이상 흘려주어 레진을 세척하였다.

이후, 모노포스포릴 지질 A의 동종체인 테트라 아실, 펜타 아실 및 헥사 아실화된 모노포스포릴 지질 A의 순차적 용출(elution)을 위해 농도구배를 이용하였다. 이동상 B를 레진에 흘려주어, 1 CV 씩 용출되는 시료를 받아 각 분획에 대한 TLC 분석을 실시하여, 인지질, 1-탈인산-테트라 아실 지질 A가 용출되는 분획은 제외하고, 1-탈인산-펜타 아실 지질 A 및 1-탈인산-지질 A가 용출되는 분획만을 취하였다. 상기 과정에서 1-탈인산-지질 A가 산성 pH에 장기간 노출될 경우 1-탈인산-지질 A의 분자 내 아실 사슬이 유리될 수 있으므로 안정성 향상 및 버퍼 교환의 목적으로 중화를 진행하였다.

상기 1-탈인산-펜타 아실 지질 A 및 1-탈인산-지질 A 분획을 유리 매스실린더로 부피를 측정하여 2L 분별깔대기에 옮긴 후, 수용액층과 유기용매층으로 상분리를 하기 위하여, 수용액:메탄올:클로로포름 = 1.8:2:2 (v/v)의 비율이 되도록 상기 분획에 클로로포름 및 증류수를 첨가하였다. 첨가할 클로로포름 및 증류수의 부피는 '1-탈인산-펜타 아실 지질 A 및 1-탈인산-지질 A 분획의 부피 X 0.65'의 식을 이용하여 계산하였다. 또한, 이동상에 포함된 암모늄 아세테이트의 중화를 위하여, 6N HCl을 점적하여 첨가하였으며, 첨가할 6N HCl의 부피는 '1-탈인산-펜타 아실 지질 A 및 1-탈인산-지질 A 분획의 부피 X 0.02'의 식을 이용하여 계산하였다. 분별깔대기를 뚜껑으로 막고 용매들이 잘 혼합되도록 흔들어준 후 뚜껑을 살짝 열어 발생한 가스를 배출시키고, 2개의 층으로 분리될 때까지 방치하였다. 층 분리가 완료되면, 1-탈인산-펜타 아실 지질 A 및 1-탈인산-지질 A를 포함하는 하층인 유기용매층을 회수하여, TLC 분석을 통하여 분리가 잘 이루어졌는지 확인하였다(도 5).

실시예 2. 수두-대상포진 바이러스 표면 당단백질 E (glycoprotein E: gE) 항원 제작

2.1. gE 항원 디자인

수두-대상포진 바이러스의 표면 당단백질인 gE 유전자는, 인간 허피스바이러스 3형(Human herpesvirus type 3, HHV-3) 전체 게놈에서 gE 유전자에 해당하는 ORF 68에서 C-말단의 앵커(Anchor) 도메인을 제거한 형태로 디자인하여 제작하였다. 또한, 기존의 gE 단백질은 CHO 세포에서 발현율이 매우 낮아 이로부터 정제된 단백질을 생산하기 어렵기 때문에, 생산성을 높이기 위하여, gE 단백질의 신호펩티드를 최적화하였다.

구체적으로, 야생형 gE 유전자인 서열번호 5의 아미노산 서열에서 기존에 백신 항원으로 사용되던 1-546 번째 서열 중 1-30 번째 아미노산 서열인 신호펩티드 서열을 제외한 31-546 번째 아미노산 서열에, 최적화된 신호펩티드 서열을 포함하도록 디자인하였다(이하, "gEt"라고 함; gEt 단백질의 C-말단에 6분자의 히스티딘 태그가 결합된 단백질은 "gEt-H6"이라고 함). 또한, 서열번호 5의 아미노산 서열에서 수두-대상포진 바이러스의 주요 기능을 나타내는 VSD (virion surface domain) 영역에 해당하는 1-538 번째 아미노산 서열 중 상기 신호펩티드 서열을 제외한 31-538 번째 아미노산 서열에, 최적화된 신호펩티드 서열을 포함하도록 디자인하였다(이하, "gEs"라고 함; gEs 단백질의 C-말단에 6분자의 히스티딘 태그가 결합된 단백질은 "gEs-H6"이라고 함). 상기 최적화된 신호펩티드는 CHO 세포에서 발현이 높은 신호펩티드를 스크리닝하여 SignalP 5.0 서버로 분석한 결과, 신호펩티드 서열로 적합한 서열번호 6의 아미노산 서열을 선별하여 적용하였다.

2.2. gE 항원을 생산하는 세포주 제작

하기 표 2의 주형 및 프라이머를 이용하여 각 유전자를 PCR로 증폭하였다.

유전자명	PCR 번호	주형	정방향 프라이머 서열(5'→3')	역방향 프라이머 서열(5'→3')
SP_wt-gEt(1-546)-His tag	PCR1	gE 항원을 코딩하는 코돈 최적화된 염기서열 + 6분자의 히스티딘을 코딩하는 염기서열(서열번호 7)	GCT AGC GCC GCC ACC ATG GGA ACT GTG AAC A (서열번호 8)	GCG GCC GCT TAT CAG TGG TGG TGG TGG TGG (서열번호 9)
SP_wt-gEt(1-546)	PCR2	gE 항원을 코딩하는 코돈 최적화된 염기서열 + 6분자의 히스티딘을 코딩하는 염기서열(서열번호 7)	GCT AGC GCC GCC ACC ATG GGA ACT GTG AAC A (서열번호 8)	GAA TTC tca tta TGC CAG ACC CCC TGT CCA AGC (서열번호 10)
SP_wt-gEs(1-538)-His tag	PCR3	gE 항원을 코딩하는 코돈 최적화된 염기서열 + 6분자의 히스티딘을 코딩하는 염기서열 (서열번호 7)	GCT AGC GCC GCC ACC ATG GGA ACT GTG AAC A (서열번호 8)	GTA CCG GAT CAG AGG GGA GGT GCC TGG GTT (서열번호 11)
SP_wt-gEs(1-538)-His tag	PCR4	PCR3 산물	GCT AGC GCC GCC ACC ATG GGA ACT GTG AAC (서열번호 12)	GCG GCC GCT CAA TGG TGA TGG TGA TGA TGA TAA CGA ATC AGA GGG GAG G (서열번호 13)
SP_mu-gEt(31-546)-His tag	PCR5	PCR1 산물	AGC GTG CTG CGC TAC GAC GAT (서열번호 14)	GCG GCC GCT TAT CAG TGG TGG TGG TGG TGG (서열번호 9)
SP_mu-gEt(31-546)-His tag	PCR6	PCR5 산물	AAG CTT GCC GCC ACC ATG AAG TGG GTG ACA TTT ATC TCT CTG CTT TTC CTG TTC AGC AGC GCC TAC AGT AGC GTG CTG CGC TAC GAC GAT (서열번호 15)	GCG GCC GCT TAT CAG TGG TGG TGG TGG TGG (서열번호 9)
SP_mu-gEt(31-546)	PCR7	PCR6 산물	AAG CTT GCC GCC ACC ATG AAG TGG GTG ACA (서열번호 16)	GAA TTC tca tta TGC CAG ACC CCC TGT CCA AGC (서열번호 17)
SP_mu-gEs(31-538)-His tag	PCR8	PCR4 산물	AGC GTG CTG CGC TAC GAC GAT (서열번호 14)	GCG GCC GCT CAA TGG TGA TGG TGA TGA TGA TAA CGA ATC AGA GGG GAG G (서열번호 13)
SP_mu-gEs(31-538)-His tag	PCR9	PCR8 산물	AAG CTT GCC GCC ACC ATG AAG TGG GTG ACA TTT ATC TCT CTG CTT TTC CTG TTC AGC AGC GCC TAC AGT AGC GTG CTG CGC TAC GAC GAT (서열번호 15)	GCG GCC GCT CAA TGG TGA TGG TGA TGA TGA TAA CGA ATC AGA GGG GAG G (서열번호 13)
SP_mu-gEs(31-538)	PCR10	PCR9 산물	AAG CTT GCC GCC ACC ATG AAG TGG GTG ACA (서열번호 16)	GAA TTC TCA TTA ATA ACG AAT CAG AGG GGA GGT (서열번호 18)

(SP_wt: 야생형 신호펩티드;

SP_mu: 돌연변이 신호펩티드;

gEt: 절단된(truncated) gE;

gEs: gE 단백질의 VSD (virion surface domain) 영역; 및

His tag: 히스티딘 6분자 태그)

증폭된 각 유전자를 pcDNA3.4 TOPO 벡터와 함께 TOPO 반응시킨 후, E.coli TOP10 균주에 형질전환(transformation)하였다. LB 암피실린 플레이트에서 단일 콜로니를 분리 및 PCR로 증폭한 후, 제한효소로 절단하고, 하기 표 3의 시퀀싱 프라이머들을 이용하여 서열을 확인하였다(gEs 유전자: 서열번호 3, gEt 유전자: 서열번호 4).

프라이머명	서열(5'→3')	서열번호
CMV-F1 (vector)	CGC AAA TGG GCG GTA GGC GTG	19
VZV-F2-403	CAG GCA TCC ACG TGA TCc caa	20
VZV-F3-1053	TAT CAC AGC CAC GTG TTC TCC	21
VZV-R1~600	CCATGTCTCGGTATACCT	22
VZV-R2~1200	TGGGTGATACAGACAGG	23
VZV-R3 plus 150 (vector)	AGAGTGCCAG CCCTGGGA	24

상기 형질전환 균주에서 각 플라스미드 DNA를 분리하여 ExpiCHO-S 세포에 일시적 형질감염(transient transfection)시켜 gE 항원을 생산하는 세포주를 제작하였다. 형질감염은 ExpiCHO 발현 시스템(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여, 제조사의 설명에 따라 수행하였고, 형질감염 14일차에 세포 배양 상등액을 회수하여 전기영동 및 웨스턴 블롯을 수행하여 각 gE 항원의 발현을 확인하였다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 각 gE 항원이 약 70 kDa 위치에서 확인되었다.

2.3. gE 항원의 정제

상기 실시예 2.2.에서 제작한 gE 항원을 생산하는 각 세포주를 배양한 후, 배양 상등액을 회수하여, 1차 Q XL 크로마토그래피, 2차 부틸 FF (fast flow) 크로마토그래피, 3차 Ni²⁺ 친화 크로마토그래피, 및 10k UF (ultrafiltration)/DF (diafiltration) 공정을 거쳐 각 재조합 gE 항원을 정제하였다.

구체적으로, 각 세포의 배양 상등액을 회수하여 pH를 6으로 조정한 후 하기 조건으로 Q XL 크로마토그래피를 수행하였다.

- 컬럼: Q XL Sepharose Hitrap 5 mL (Cytiva)

- 유속: 5 mL/분

- 평형화 버퍼: 20 mM 피페라진 용액, pH 6

- 세척 버퍼: 150 mM NaCl을 포함하는 20 mM 피페라진 용액, pH 6

- 용출 버퍼: 250 mM NaCl을 포함하는 20 mM 피페라진 용액, pH 6

용출된 용액에 (NH₄)₂SO₄를 첨가하여 최종 농도 1 M이 되도록 하고, pH를 7.5로 조정한 후 하기 조건으로 부틸 FF 크로마토그래피를 수행하였다.

- 컬럼: Butyl Sepharose Hitrap 5 mL (Cytiva)

- 유속: 5 mL/분

- 평형화 버퍼: 50 mM KH₂PO₄ 및 1 M (NH₄)₂SO₄ 혼합액, pH 7.5

- 세척 버퍼: 50 mM KH₂PO₄ 및 100 mM (NH₄)₂SO₄ 혼합액, pH 7.5

- 용출 버퍼: 50 mM KH₂PO₄ 및 25 mM (NH₄)₂SO₄ 혼합액, pH 7.5

용출된 용액에 NaCl을 첨가하여 최종 농도 0.5 M이 되도록 하고, pH를 7.5로 조정한 후 하기 조건으로 Ni²⁺ 친화 크로마토그래피를 수행하였다.

- 컬럼: Ni²⁺ affinity Hitrap 5 mL (Cytiva)

- 유속: 5 mL/분

- 평형화 버퍼: 50 mM KH₂PO₄ 및 0.5 M NaCl 혼합액, pH 7.5

- 세척 버퍼: 50 mM KH₂PO₄ 및 0.5 M NaCl 혼합액, pH 5.6

- 용출 버퍼: 50 mM 아세트산 나트륨 및 0.5 M NaCl 혼합액, pH 5

용출된 용액에 pH 9.5의 1 M Tris 버퍼를 첨가하여 중화시킨 후 하기 조건으로 10k UF/DF를 수행하였다.

- Ultrafiltration: 5 CV

- Diafiltration 버퍼: 8.1 mM Na₂HPO₄·2H₂O, 1.47 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, pH 7.2

최종 정제된 각 재조합 gE 항원의 단백질 양을 BCA 단백질 정량법으로 측정하여 수율을 확인하였다.

신호펩티드	gE 항원	수율(mg/L 배지)
야생형(wt)	야생형 gE의 1-546 아미노산	-
야생형(wt)	야생형 gE의 1-546 아미노산 + 6분자 히스티딘 태그	-
돌연변이(mutant)	gEt (31-546)	100 mg/L
	gEt-H6 (31-546)	55 mg/L
	gEs-H6 (31-538)	50 mg/L

그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, 야생형 신호펩티드를 포함하는 gE 항원은 수율이 낮아 정제된 항원을 얻지 못하였으나, 돌연변이 신호펩티드(서열번호 6)를 포함하는 gE 항원은 50 내지 100 mg/L의 수율을 나타내 생산성이 현저히 개선되었음을 확인하였다.

실시예 3. 모노포스포릴 지질 A를 포함하는 리포좀 제형의 제작

모노포스포릴 지질 A를 포함하는 리포좀 또는 이에 CoPoP가 첨가된 리포좀 제형을 제작하였다.

구체적으로, 클로로포름을 용매로 하여 25 mg/mL의 DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 용액, 10 mg/mL의 콜레스테롤, 1 mg/mL의 CoPoP (미국 등록특허 US 10,272,160 B2), 및 1 mg/mL의 모노포스포릴 지질 A 용액을 제조하였다. 상기 모노포스포릴 지질 A는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득한 정제된 모노포스포릴 지질 A로, 약 30% 이하의 1-탈인산-펜타 아실 지질 A 및 약 70% 이상의 1-탈인산-지질 A를 포함하는 것을 사용하였다. 제조한 DOPC 0.8 mL, 콜레스테롤 0.5 mL 및 모노포스포릴 지질 A(MLA) 1 mL를 혼합하여 ELS 혼합액을 제조하였다. 상기 ELS 혼합액에 제조한 CoPoP 1 mL을 첨가 및 혼합하여 ECLS 혼합액을 제조하였다. 상기 ELS 혼합액 및 상기 ECLS 혼합액을 회전 감압 증발기를 사용하여 용매를 완전히 증발시켜 얇은 지질 필름(thin lipid film) 형태로 만들고, pH 7.2의 PBS를 첨가한 후, 60℃로 설정한 초음파 세척기(sonicator)에서 1~2 시간 동안 재수화(Re-hydration)을 통해 1차 균질화하였다. 2차 균질화를 위해 압출기(extruder) 또는 미세유동화기(microfluidizer)를 이용해 최종 제조되는 리포좀 제형의 크기가 200 nm 이하가 되도록 하였다. 이 때, 리포좀 제형의 크기는 동적광산란법(DLS, Dynamic Light Scattering)을 이용한 장비로 분석하였다. 무균 영역에서 0.2 ㎛ PES 시린지 필터로 무균/제균 여과를 실시하고, 여과한 각 ELS 리포좀 및 ECLS 리포좀은 냉장보관하되, ECLS 리포좀은 차광하여 보관하였다. 액체크로마토그래피-하전에어로졸검출기(HPLC-CAD, High Performance Liquid Chromatography-Charged Aerosol Detector)를 이용하여 제조된 리포좀 제형 내 모노포스포릴 지질 A 함량을 정량하였다.

실시예 4. 리포좀 제형과 gE 항원의 결합

상기 실시예 2에서 제작한 각 gE 항원인 gEt, gEt-H6 및 gEs-H6과 실시예 3에서 제작한 ELS 리포좀 및 ECLS 리포좀을 각각 항원:모노포스포릴 지질 A의 중량비가 1:1이 되도록 준비하여 부드럽게 혼합한 후, ELS 리포좀은 그대로 냉장보관하고, ECLS 리포좀은 상온에서 1 시간 이상 방치하여 리포좀과 항원이 결합되도록 한 뒤, 냉장보관하였다.

실시예 5. 수두-대상포진 바이러스 백신 조성물의 효능 확인

5.1. 시험군 설정 및 약물 투여

각 시험군은 음성 대조군으로 1X PBS 투여군인 시험군 1, 양성 대조군으로 조스타박스 투여군인 시험군 2, 항원 단독 투여군인 시험군 3 내지 5, ELS 투여군인 시험군 6 내지 8, ECLS 투여군인 시험군 9 및 10, ELSQ 투여군인 시험군 11 내지 13, 및 ECLSQ 투여군인 시험군 14 및 15로 구성하였고, 각 군 당 6주령 BALB/cAnNCrljOri(Female) 마우스를 5마리씩 구성하였다. 음성 대조군인 시험군 1은 마우스 당 50 ㎕의 1X PBS를 대퇴부에 근육주사하였고, 양성 대조군인 시험군 2는 조스타박스(Merck, USA)의 사람 투여 용량을 마우스 몸무게 기준으로 계산하여 26 ㎕를 피하주사하였다. ELSQ 및 ECLSQ 투여군에 사용한 백신 조성물은 상기 실시예 4에서 제작한 각 항원과 혼합 또는 결합된 ELS 리포좀 및 ECLS 리포좀에 QS-21을 혼합하여 준비하였다. 구체적으로, 투여 하루 전에 1 mg/mL의 QS-21을 준비하여, 상기 각 리포좀 내 포함된 모노포스포릴 지질 A와 동일한 양의 중량으로 QS-21을 혼합한 후, PBS로 희석하여 백신 조성물을 제조한 뒤, 차광하여 사용 전까지 냉장보관하였다. 시험군 3 내지 15의 각 투여 약물은 하기 표 5에 기재된 바와 같이 1X PBS의 최종 부피가 50 ㎕가 되도록 마우스 대퇴부에 근육주사하였고, 상기 모든 투여는 2주 간격으로 2회로 실시하였다.

시험군	제형	결합 항원	동물수 (마리)	투여액량 (㎕)	투여량 (㎍)			투여경로
시험군	제형	결합 항원	동물수 (마리)	투여액량 (㎕)	Ag	MLA	QS-21	투여경로
1	PBS	-	5	50	-	-	-	근육주사
2	ZostaVax	-	5	26	-	-	-	피하주사
3	Ag	gEt	5	50	2	-	-	근육주사
4		gEt-H6	5	50	2	-	-
5		gEs-H6	5	50	2	-	-
6	ELS	gEt	5	50	2	2	-
7		gEt-H6	5	50	2	2	-
8		gEs-H6	5	50	2	2	-
9	ECLS	gEt-H6	5	50	2	2	-
10	ECLS	gEs-H6	5	50	2	2	-
11	ELSQ	gEt	5	50	2	2	2
12		gEt-H6	5	50	2	2	2
13		gEs-H6	5	50	2	2	2
14	ECLSQ	gEt-H6	5	50	2	2	2
15	ECLSQ	gEs-H6	5	50	2	2	2

5.2. 수두-대상포진 바이러스 항원 특이 혈청 항체 역가 측정

면역 후 혈청 내 수두-대상포진 바이러스 항원의 특이 항체 역가 측정을 위해 ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay) 시험법을 사용하였다. 96-웰 플레이트에 PBS로 희석한 각 항원인 gEt, gEt-H6 및 gEs-H6을 웰 당 1 ㎍/mL 씩 분주한 후, 4℃에서 하루 동안 밀봉하여 코팅하고, 0.05% Tween 20이 포함된 PBS로 3회 세척하였다. 마우스 면역 전, 1차 접종, 2차 접종 후 얻은 마우스 혈청을 1% 스킴밀크와 0.05% Tween 20이 포함된 PBS를 이용하여 단계 희석(2-fold dilution)한 후, 각 항원으로 코팅되어 있는 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주하고 2시간 동안 상온에서 밀봉하여 반응시켰다. 이후, 상기 플레이트를 0.05% Tween 20이 포함된 PBS로 3회 세척하고 항-마우스 IgG-HRP를 1% 스킴밀크와 0.05% Tween 20이 포함된 PBS에 1:5000으로 희석하여, 각 웰에 100 ㎕씩 분주하여 차광 상태로 1시간 동안 상온에서 밀봉하여 반응시켰다. 상기 플레이트를 0.05% Tween 20이 포함된 PBS로 6회 세척 후, HRP 발색을 위해 TBM 기질을 각 웰 당 100 ㎕씩 분주하고 10분 반응 후, 0.5M H₂SO₄을 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하여 반응을 중지하였다. 반응이 종료된 플레이트의 흡광도를 450 nm에서 측정하여 각 군별 최종 항체가를 확인하였다.

상기 실험법을 이용하여 얻어진 면역 전 마우스 혈청 결과를 바탕으로 해당 항체가 유무 검사 결과를 양성(Positive)과 음성(Negative)로 구분할 기준을 설정하기 위해 절사값(Cut-off value)을 계산하였다. 절사값은 하기 계산식 1에 의해 계산하였다.

[계산식 1]

절사값 = 면역 전 마우스 혈청의 흡광도 평균 + 2 x 면역 전 마우스 혈청의 흡광도 표준편차.

1, 2차 접종 후 얻은 마우스 혈청으로 계산한 항체 역가는 각 절사값을 기준으로 측정된 흡광도의 상위값에 해당되는 희석배수를 최종 항체가로 결정하였다. 예를 들면, 절사값이 0.143이고, 2¹⁴배 희석한 흡광도가 0.167이고, 2¹⁵배 희석한 흡광도가 0.124인 경우, 2¹⁴가 IgG 최종 항체가가 된다. 상기 방법을 통해 계산된 결과값을 시험군 당 마우스 5마리에 대한 평균 및 표준편차를 구하여 로그 값으로 변환하여 나타내었다.

그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, gEt-H6 항원만 단독으로 투여한 시험군에 비하여 gEt-H6 항원에 모노포스포릴 지질 A를 리포좀 형태로 결합시킨 백신 조성물을 투여한 ELS 투여군에서 약 1,000배 증가된 항체 역가가 나타남을 확인하여, 모노포스포릴 지질 A의 면역증강제로서의 효과를 확인하였다. 또한, ELS 투여군 및 ELSQ 투여군 내에서 항원을 gEt로 사용한 경우와 gEt-H6으로 사용한 경우에 항체 역가는 유사한 것으로 나타났다. 또한, gEt-H6 항원을 포함하는 리포좀에 있어 ELS 투여군과 ECLS 투여군, 및 ELSQ 투여군과 ECLSQ 투여군을 비교 시, CoPoP를 포함하는 리포좀 형태의 백신 조성물 투여 시 약 1,000배 증가된 항체 역가가 나타나, CoPoP를 첨가하여 항원 제시능을 강화함으로써 백신 효능을 증대시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, ECLSQ 투여군은 ECLS 투여군에 비하여 QS-21을 더 포함하지만, 항체 역가에 있어 뚜렷한 차이를 보이지는 않았다.

도 7b에 나타낸 바와 같이, 항원으로 gEt-H6 항원을 이용한 경우와 gEs-H6 항원을 이용한 경우 모두 항원 단독 투여군에 비하여 ELS, ECLS, ELSQ 및 ECLSQ 시험군에서 현저히 높은 수준의 항체 역가를 나타냈고, 2종 항원 간의 항체 형성 효능에 차이가 없었다.

도 7c에 나타낸 바와 같이, 전체 시험군을 비교해보면, 시판 중인 수두-대상포진 바이러스 백신인 조스타박스에 비하여, ECLS 투여군이 약 100배 이상의 항체 형성 효능을 나타내어, 모노포스포릴 지질 A 및 CoPoP의 첨가가 수두-대상포진 바이러스 항원에 대한 항체 생성에 매우 효과적임을 확인하였다.

5.3. 수두-대상포진 바이러스 특이적 세포매개성 면역능 측정

수두-대상포진 바이러스에 의해 특이적으로 활성화되는 T 세포를 확인하기 위하여 인터페론 감마(IFN-gamma)의 발현량을 확인하였다. 인터페론 감마는 항원에 특이적으로 반응하는 T 세포가 분비하는 사이토카인의 종류로 항 바이러스 활성을 위한 세포 매개성 면역능을 측정할 때 대표적인 지표로 사용된다.

먼저, 5-1에 기재된 바와 같이 백신 조성물을 투여하여, 수두-대상포진 바이러스 백신 2차 접종 후 4주가 지난 마우스들을 각 그룹당 2마리를 희생시켜 비장을 추출한다. 비장을 70 ㎛ mesh 위에 두고 주사기 플런저를 이용하여 으깬 후에 RPMI1640 배지로 세척하였다. 각 그룹의 비장은 500 xg, 5 분, 4℃ 환경으로 원심분리를 진행한 후 RBC 용해 완충액(0.01 M Tris 완충액 중 0.083% 염화암모늄)을 첨가하여 적혈구를 제거하였다. 원심분리 및 최종 세척을 마치고 Complete RPMI1640(10% FBS, 1% Antibiotics)에 재부유시킨 후 세포수를 측정하여 U형 96 웰 플레이트에 1 X 10⁶ 개 세포씩 각 웰에 가하였다.

항원 특이적으로 T세포를 활성화시키기 위해, 추출한 비장세포에 표 6에 기재된 바와 같이 gE 항원에 대한 펩타이드(Peptide), gE 항원(Protein), 수두-대상포진 바이러스(Virus)로 각각 재자극하여 72 시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건하에 배양하였다.

항목	조건
일차 세포(Primary cell)	그룹당 2마리의 마우스로부터 분리된 비장세포
재자극 인자	배지(대조군)	펩타이드 2 ㎍/웰	단백질 5 ㎍/mL	바이러스 500 pfu/mL
배양 시간	72 시간

배양이 완료되면 500 xg, 5 분, 4℃ 조건으로 원심분리를 진행하여 상층액만 취하여 사이토카인 분비량을 측정하였다. 분석은 Cytokine ELISA(R&D systems)를 제조사의 설명에 따라 수행하여 각 그룹의 인터페론 감마의 분비량을 확인하였다. 그 결과, 도 8에 도시된 바와 같이, PBS군과 항원 단독 투여군에 비하여 모노포스포릴 지질 A를 리포좀 형태로 결합시킨 면역증강제가 첨가된 그룹에서 수두-대상포진 항원 관련 물질(펩티드, 단백질, 및 바이러스)로 재자극시켰을 때, 대조군(media control: NT) 대비 인터페론 감마의 분비량이 수백배 내지 수천배 더 많은 것을 확인했다. 또한, 항체가와 마찬가지로 세포매개성 면역능에서도 gEt와 gEs 항원 간에 차이는 보이지 않았다. 이를 통하여 VZV의 gE 항원 중 VSD 영역만을 포함하는 gEs 항원이, 상기 gE 항원의 C-말단에 트랜스멤브레인에 존재하는 아미노산 서열을 더 포함하는 gEt 항원과 동등한 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 항원에 CoPoP을 첨가하였을 경우, 항원에 대한 특이적인 항체가가 상당히 높은 것을 확인할 수 있었던 것과 다르게 첨가 전과 거의 비슷한 세포매개 면역력을 보이고 있는 것을 보아 CoPoP의 우수한 항원제시능이 B세포의 분화를 주로 촉진시키는 것으로 예상된다. 모노포스포릴 지질 A와 함께 QS-21을 첨가한 그룹(ELSQ, ECLSQ)에서는 세포매개성 면역에서 대조약으로 사용한 약독화 바이러스 백신 조스타박스를 10배 가량 상회하는 세포성 매개 면역능을 보인다. 결과적으로, 수두-대상포진 바이러스 항원과 모노포스포릴 지질 A 또는 CoPoP 또는 QS-21을 함께 사용하거나, 또는 이들을 조합하여 사용함으로써 항원에 대한 체액성 및 세포성 면역 모두 우수함을 확인하였다.

<110> EUBIOLOGICS CO.,LTD. <120> Vaccine composition for chicken pox or herpes zoster and method using the same <130> PN140650KR <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 526 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gEs <400> 1 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Ser Val Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Thr Asp Glu Asp Lys 20 25 30 Leu Asp Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala 35 40 45 Glu Ser Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp 50 55 60 His Asn Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu 65 70 75 80 Glu Asn Ala His Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile 85 90 95 Asp Ser Gly Glu Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu 100 105 110 Asp Leu Gly Asp Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly 115 120 125 Asp Asp Arg His Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp 130 135 140 Val Phe Lys Gly Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile 145 150 155 160 Glu Val Ser Val Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile 165 170 175 Gln Arg Ile Tyr Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro 180 185 190 Ser Leu Thr Cys Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys 195 200 205 Leu Lys His Thr Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys 210 215 220 Ala Glu Asn Thr Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe 225 230 235 240 Gln Gly Lys Lys Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser 245 250 255 Thr Leu Phe Asp Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly 260 265 270 Val Leu Lys Val Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile 275 280 285 Trp Asn Met Arg Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu 290 295 300 Val Thr Trp Lys Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val 305 310 315 320 Thr Pro Gln Pro Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser 325 330 335 His Val Phe Ser Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln 340 345 350 Tyr Lys Ile His Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr 355 360 365 Val Pro Ile Asp Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys 370 375 380 Leu Tyr His Pro Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly 385 390 395 400 Cys Thr Phe Thr Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val 405 410 415 Tyr Gln Asn Cys Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly 420 425 430 Ile Ser His Met Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly 435 440 445 Thr Thr Leu Lys Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr 450 455 460 Val Phe Val Val Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr 465 470 475 480 Val Val Ser Thr Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly 485 490 495 Phe Pro Pro Thr Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu 500 505 510 Ile Thr Pro Val Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Ile Arg Tyr 515 520 525 <210> 2 <211> 534 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gEt <400> 2 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Ser Val Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Thr Asp Glu Asp Lys 20 25 30 Leu Asp Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala 35 40 45 Glu Ser Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp 50 55 60 His Asn Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu 65 70 75 80 Glu Asn Ala His Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile 85 90 95 Asp Ser Gly Glu Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu 100 105 110 Asp Leu Gly Asp Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly 115 120 125 Asp Asp Arg His Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp 130 135 140 Val Phe Lys Gly Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile 145 150 155 160 Glu Val Ser Val Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile 165 170 175 Gln Arg Ile Tyr Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro 180 185 190 Ser Leu Thr Cys Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys 195 200 205 Leu Lys His Thr Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys 210 215 220 Ala Glu Asn Thr Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe 225 230 235 240 Gln Gly Lys Lys Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser 245 250 255 Thr Leu Phe Asp Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly 260 265 270 Val Leu Lys Val Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile 275 280 285 Trp Asn Met Arg Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu 290 295 300 Val Thr Trp Lys Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val 305 310 315 320 Thr Pro Gln Pro Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser 325 330 335 His Val Phe Ser Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln 340 345 350 Tyr Lys Ile His Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr 355 360 365 Val Pro Ile Asp Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys 370 375 380 Leu Tyr His Pro Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly 385 390 395 400 Cys Thr Phe Thr Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val 405 410 415 Tyr Gln Asn Cys Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly 420 425 430 Ile Ser His Met Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly 435 440 445 Thr Thr Leu Lys Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr 450 455 460 Val Phe Val Val Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr 465 470 475 480 Val Val Ser Thr Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly 485 490 495 Phe Pro Pro Thr Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu 500 505 510 Ile Thr Pro Val Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Ile Arg Tyr Ala Ala 515 520 525 Trp Thr Gly Gly Leu Ala 530 <210> 3 <211> 1581 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gEs <400> 3 atgaagtggg tgacatttat ctctctgctt ttcctgttca gcagcgccta cagtagcgtg 60 ctgcgctacg acgatttcca catcgacgag gataagctgg acaccaatag cgtgtatgag 120 ccttactatc actctgatca tgccgagtcc agctgggtga acaggggcga gtcttcccgg 180 aaggcttacg accacaactc tccctatatc tggcccagga atgactacga tggctttctg 240 gagaacgccc atgagcacca tggcgtgtat aatcagggcc ggggcatcga ctctggcgag 300 agactgatgc agcctacaca gatgtccgct caggaggatc tgggcgacga tacaggcatc 360 cacgtgatcc caaccctgaa tggcgacgat cgccataaga tcgtgaacgt ggatcagagg 420 cagtacggcg acgtgttcaa gggcgatctg aatccaaagc cccagggcca gcggctgatc 480 gaggtgtccg tggaggagaa ccatccattc accctgagag cccccatcca gcgcatctac 540 ggcgtgaggt ataccgagac atggtccttt ctgcctagcc tgacctgcac aggcgacgct 600 gctccagcta tccagcacat ctgcctgaag cataccacat gttttcagga cgtggtggtg 660 gacgtggatt gtgccgagaa tacaaaggag gatcagctgg ctgagatcag ctacagattc 720 cagggcaaga aggaggccga tcagccatgg atcgtggtga acacctctac actgtttgac 780 gagctggagc tggacccccc cgagatcgag ccaggcgtgc tgaaggtgct gcgcaccgag 840 aagcagtacc tgggcgtgta tatctggaac atgaggggct ctgacggcac ctccacatac 900 gctaccttcc tggtgacatg gaagggcgat gagaagaccc ggaatccaac accagctgtg 960 acccctcagc caagaggcgc tgagtttcac atgtggaact atcacagcca cgtgttctcc 1020 gtgggcgaca ccttttccct ggccatgcac ctgcagtaca agatccatga ggctccattc 1080 gacctgctgc tggagtggct gtatgtgccc atcgatccta catgccagcc catgcggctg 1140 tacagcacct gtctgtatca cccaaatgcc ccccagtgcc tgtcccatat gaacagcggc 1200 tgtaccttta catccccaca cctggcccag agagtggcct ccacagtgta ccagaactgc 1260 gagcatgccg acaattacac cgcttattgt ctgggcatct ctcacatgga gccctccttc 1320 ggcctgatcc tgcatgacgg cggcaccaca ctgaagtttg tggatacacc tgagagcctg 1380 tctggcctgt acgtgttcgt ggtgtacttc aacggccacg tggaggccgt ggcttataca 1440 gtggtgtcta ccgtggatca tttcgtgaac gctatcgagg agaggggatt tccaccaacc 1500 gctggacagc ctccagctac cacaaagccc aaggagatca cacctgtgaa cccaggcacc 1560 tcccctctga ttcgttattg a 1581 <210> 4 <211> 1605 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gEt <400> 4 atgaagtggg tgacatttat ctctctgctt ttcctgttca gcagcgccta cagtagcgtg 60 ctgcgctacg acgatttcca catcgacgag gataagctgg acaccaatag cgtgtatgag 120 ccttactatc actctgatca tgccgagtcc agctgggtga acaggggcga gtcttcccgg 180 aaggcttacg accacaactc tccctatatc tggcccagga atgactacga tggctttctg 240 gagaacgccc atgagcacca tggcgtgtat aatcagggcc ggggcatcga ctctggcgag 300 agactgatgc agcctacaca gatgtccgct caggaggatc tgggcgacga tacaggcatc 360 cacgtgatcc caaccctgaa tggcgacgat cgccataaga tcgtgaacgt ggatcagagg 420 cagtacggcg acgtgttcaa gggcgatctg aatccaaagc cccagggcca gcggctgatc 480 gaggtgtccg tggaggagaa ccatccattc accctgagag cccccatcca gcgcatctac 540 ggcgtgaggt ataccgagac atggtccttt ctgcctagcc tgacctgcac aggcgacgct 600 gctccagcta tccagcacat ctgcctgaag cataccacat gttttcagga cgtggtggtg 660 gacgtggatt gtgccgagaa tacaaaggag gatcagctgg ctgagatcag ctacagattc 720 cagggcaaga aggaggccga tcagccatgg atcgtggtga acacctctac actgtttgac 780 gagctggagc tggacccccc cgagatcgag ccaggcgtgc tgaaggtgct gcgcaccgag 840 aagcagtacc tgggcgtgta tatctggaac atgaggggct ctgacggcac ctccacatac 900 gctaccttcc tggtgacatg gaagggcgat gagaagaccc ggaatccaac accagctgtg 960 acccctcagc caagaggcgc tgagtttcac atgtggaact atcacagcca cgtgttctcc 1020 gtgggcgaca ccttttccct ggccatgcac ctgcagtaca agatccatga ggctccattc 1080 gacctgctgc tggagtggct gtatgtgccc atcgatccta catgccagcc catgcggctg 1140 tacagcacct gtctgtatca cccaaatgcc ccccagtgcc tgtcccatat gaacagcggc 1200 tgtaccttta catccccaca cctggcccag agagtggcct ccacagtgta ccagaactgc 1260 gagcatgccg acaattacac cgcttattgt ctgggcatct ctcacatgga gccctccttc 1320 ggcctgatcc tgcatgacgg cggcaccaca ctgaagtttg tggatacacc tgagagcctg 1380 tctggcctgt acgtgttcgt ggtgtacttc aacggccacg tggaggccgt ggcttataca 1440 gtggtgtcta ccgtggatca tttcgtgaac gctatcgagg agaggggatt tccaccaacc 1500 gctggacagc ctccagctac cacaaagccc aaggagatca cacctgtgaa cccaggcacc 1560 tcccctctga ttcgttatgc tgcttggaca gggggtctgg catga 1605 <210> 5 <211> 623 <212> PRT <213> Human herpesvirus 3 <400> 5 Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly Val Leu Met Gly Phe Gly 1 5 10 15 Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala Ser Val 20 25 30 Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Thr Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn 35 40 45 Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp 50 55 60 Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro 65 70 75 80 Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His 85 90 95 Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu 100 105 110 Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp 115 120 125 Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His 130 135 140 Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly 145 150 155 160 Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val 165 170 175 Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg Ile Tyr 180 185 190 Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu Thr Cys 195 200 205 Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys His Thr 210 215 220 Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu Asn Thr 225 230 235 240 Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Lys 245 250 255 Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu Phe Asp 260 265 270 Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu Lys Val 275 280 285 Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn Met Arg 290 295 300 Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr Trp Lys 305 310 315 320 Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro Gln Pro 325 330 335 Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val Phe Ser 340 345 350 Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys Ile His 355 360 365 Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro Ile Asp 370 375 380 Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr His Pro 385 390 395 400 Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr Phe Thr 405 410 415 Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln Asn Cys 420 425 430 Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser His Met 435 440 445 Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr Leu Lys 450 455 460 Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Val 465 470 475 480 Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val Ser Thr 485 490 495 Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro Pro Thr 500 505 510 Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr Pro Val 515 520 525 Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Ile Arg Tyr Ala Ala Trp Thr Gly Gly 530 535 540 Leu Ala Ala Val Val Leu Leu Cys Leu Val Ile Phe Leu Ile Cys Thr 545 550 555 560 Ala Lys Arg Met Arg Val Lys Ala Tyr Arg Val Asp Lys Ser Pro Tyr 565 570 575 Asn Gln Ser Met Tyr Tyr Ala Gly Leu Pro Val Asp Asp Phe Glu Asp 580 585 590 Ser Glu Ser Thr Asp Thr Glu Glu Glu Phe Gly Asn Ala Ile Gly Gly 595 600 605 Ser His Gly Gly Ser Ser Tyr Thr Val Tyr Ile Asp Lys Thr Arg 610 615 620 <210> 6 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant signal peptide <400> 6 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser <210> 7 <211> 1659 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized nucleic acid sequence encoding 1-546 amino acids of gE antigen with 6 histidine <400> 7 atgggaactg tgaacaagcc cgtcgtgggg gtcctgatgg gtttcggtat tattactgga 60 actctgcgta ttacaaatcc tgtccgtgcc agcgtgctgc gctacgacga tttccacatc 120 gacgaggata agctggacac caatagcgtg tatgagcctt actatcactc tgatcatgcc 180 gagtccagct gggtgaacag gggcgagtct tcccggaagg cttacgacca caactctccc 240 tatatctggc ccaggaatga ctacgatggc tttctggaga acgcccatga gcaccatggc 300 gtgtataatc agggccgggg catcgactct ggcgagagac tgatgcagcc tacacagatg 360 tccgctcagg aggatctggg cgacgataca ggcatccacg tgatcccaac cctgaatggc 420 gacgatcgcc ataagatcgt gaacgtggat cagaggcagt acggcgacgt gttcaagggc 480 gatctgaatc caaagcccca gggccagcgg ctgatcgagg tgtccgtgga ggagaaccat 540 ccattcaccc tgagagcccc catccagcgc atctacggcg tgaggtatac cgagacatgg 600 tcctttctgc ctagcctgac ctgcacaggc gacgctgctc cagctatcca gcacatctgc 660 ctgaagcata ccacatgttt tcaggacgtg gtggtggacg tggattgtgc cgagaataca 720 aaggaggatc agctggctga gatcagctac agattccagg gcaagaagga ggccgatcag 780 ccatggatcg tggtgaacac ctctacactg tttgacgagc tggagctgga cccccccgag 840 atcgagccag gcgtgctgaa ggtgctgcgc accgagaagc agtacctggg cgtgtatatc 900 tggaacatga ggggctctga cggcacctcc acatacgcta ccttcctggt gacatggaag 960 ggcgatgaga agacccggaa tccaacacca gctgtgaccc ctcagccaag aggcgctgag 1020 tttcacatgt ggaactatca cagccacgtg ttctccgtgg gcgacacctt ttccctggcc 1080 atgcacctgc agtacaagat ccatgaggct ccattcgacc tgctgctgga gtggctgtat 1140 gtgcccatcg atcctacatg ccagcccatg cggctgtaca gcacctgtct gtatcaccca 1200 aatgcccccc agtgcctgtc ccatatgaac agcggctgta cctttacatc cccacacctg 1260 gcccagagag tggcctccac agtgtaccag aactgcgagc atgccgacaa ttacaccgct 1320 tattgtctgg gcatctctca catggagccc tccttcggcc tgatcctgca tgacggcggc 1380 accacactga agtttgtgga tacacctgag agcctgtctg gcctgtacgt gttcgtggtg 1440 tacttcaacg gccacgtgga ggccgtggct tatacagtgg tgtctaccgt ggatcatttc 1500 gtgaacgcta tcgaggagag gggatttcca ccaaccgctg gacagcctcc agctaccaca 1560 aagcccaagg agatcacacc tgtgaaccca ggcacctccc ctctgattcg ttatgctgct 1620 tggacagggg gtctggcaca ccaccaccac caccactga 1659 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 1 <400> 8 gctagcgccg ccaccatggg aactgtgaac a 31 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 1 <400> 9 gcggccgctt atcagtggtg gtggtggtgg 30 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 2 <400> 10 gaattctcat tatgccagac cccctgtcca agc 33 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 3 <400> 11 gtaccggatc agaggggagg tgcctgggtt 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 1 <400> 12 gctagcgccg ccaccatggg aactgtgaac 30 <210> 13 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 4 <400> 13 gcggccgctc aatggtgatg gtgatgatga taacgaatca gaggggagg 49 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 3 <400> 14 agcgtgctgc gctacgacga t 21 <210> 15 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 4 <400> 15 aagcttgccg ccaccatgaa gtgggtgaca tttatctctc tgcttttcct gttcagcagc 60 gcctacagta gcgtgctgcg ctacgacgat 90 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer 5 <400> 16 aagcttgccg ccaccatgaa gtgggtgaca 30 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 5 <400> 17 gaattctcat tatgccagac cccctgtcca agc 33 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer 6 <400> 18 gaattctcat taataacgaa tcagagggga ggt 33 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV-F1 (vector) primer <400> 19 cgcaaatggg cggtaggcgt g 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VZV-F2-403 primer <400> 20 caggcatcca cgtgatccca a 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VZV-F3-1053 primer <400> 21 tatcacagcc acgtgttctc c 21 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VZV-R1~600 primer <400> 22 ccatgtctcg gtatacct 18 <210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VZV-R2~1200 primer <400> 23 tgggtgatac agacagg 17 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VZV-R3 plus 150 (vector) primer <400> 24 agagtgccag ccctggga 18

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 수두-대상포진 바이러스(Varicella Zoster virus: VZV)의 gE (glycoprotein E) 항원; 및
모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl lipid A: MLA)를 포함하는 백신 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 gE 항원은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 백신 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 MLA는 1-탈인산-지질 A, 1-탈인산-펜타 아실 지질 A, 1-탈인산-테트라 아실 지질 A, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 백신 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 gE 항원은 서열번호 3 또는 4의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것인 백신 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 gE 항원은 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는 신호펩티드 서열을 포함하는 것인 백신 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 백신 조성물은 리포좀 제형인 것인 백신 조성물.
청구항 6에 있어서, 상기 백신 조성물은 사포닌을 더 포함하는 것인 백신 조성물.
청구항 6에 있어서, 상기 백신 조성물은 (i) 인지질; 및 (ii) 배위결합에 의해 결합된 코발트-포르피린으로 구성되는 코발트-포르피린-인지질(Cobalt-porphyrin-phospholipid: CoPoP) 결합체, 또는 CoPoP 결합체 및 사포닌을 더 포함하는 것인 백신 조성물.
청구항 8에 있어서, 상기 gE 항원은 폴리히스티딘으로 태그된 것인 백신 조성물.
청구항 9에 있어서, 상기 폴리히스티딘은 5 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 것인 백신 조성물.
청구항 10에 있어서, 상기 폴리히스티딘의 적어도 일부는 리포좀의 단층 또는 이중층의 소수성 부분에 존재하고, 상기 폴리히스티딘의 1개 이상의 히스티딘 잔기는 상기 코발트-포르피린의 코발트와 배위결합을 형성하고, 및 상기 gE 항원의 적어도 일부가 리포좀 외측으로 노출되어 있는 것인 백신 조성물.
서열번호 3의 염기서열을 포함하는, 수두-대상포진 바이러스(Varicella Zoster virus: VZV)의 gE (glycoprotein E) 항원 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포를 배양하는 단계; 및
상기 숙주세포를 배양한 배양물로부터 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 VZV의 gE 항원을 수득하는 단계를 포함하는 백신 조성물을 제조하는 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 발현 벡터는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것인 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 gE 항원은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 숙주 세포는 CHO 세포인 것인 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 백신 조성물은 리포좀 제형이고, 상기 방법은 인지질과 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 제조용 조성물에 MLA를 첨가하여 MLA가 포함된 리포좀 제형을 제조하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 16에 있어서, 상기 방법은 상기 gE 항원과 상기 리포좀 제형을 혼합한 후, 사포닌을 혼합하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 16에 있어서, 상기 MLA는 1-탈인산-지질 A, 1-탈인산-펜타 아실 지질 A, 1-탈인산-테트라 아실 지질 A, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
청구항 16에 있어서, 상기 리포좀 제형을 제조하는 단계는 상기 리포좀 제조용 조성물에 CoPoP를 더 첨가하여, MLA 및 CoPoP가 포함된 리포좀 제형을 제조하는 것인 방법.
청구항 19에 있어서, 상기 방법은 상기 gE 항원과 상기 리포좀 제형을 혼합하여, 상기 리포좀 제형에 상기 gE 항원을 결합시키는 단계, 및 상기 gE 항원과 결합된 리포좀에 사포닌을 혼합하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.