CN106474468B - 一种复合佐剂、含该复合佐剂的疫苗及疫苗的制备方法 - Google Patents

一种复合佐剂、含该复合佐剂的疫苗及疫苗的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种复合佐剂、含该复合佐剂的疫苗及疫苗的制备方法，所述复合佐剂包括吲哚胺‑2,3双加氧酶的非竞争性抑制剂和铝盐，所述吲哚胺‑2,3双加氧酶的非竞争性抑制剂是4‑苯基咪唑，所述4‑苯基咪唑的含量为0.5‑1.5mg；所述铝盐是的氢氧化铝，所述氢氧化铝的含量为300μg。本申请还涉及含复合佐剂的疫苗及疫苗的制备方法，本申请复合佐剂原料易得，疫苗制备工艺简单，成本低，性能稳定，毒副作用小，从机体免疫调节的正、负两个方面共同促进免疫应答，在免疫剂量范围内使用是安全可靠的，能够有效的诱导抗原特异性的体液免疫应答，显著增强抗原特异性的体液免疫反应，效果优于无佐剂、单一佐剂和铝佐剂组。

Description

一种复合佐剂、含该复合佐剂的疫苗及疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及一种佐剂，尤其是一种用于疫苗的复合佐剂，还涉及含有复合佐剂的疫苗及疫苗的制备方法，属于免疫学领域。
背景技术
近年来，随着疫苗研究的不断深入，特别是分子生物学技术的迅速发展，研制出的新型基因工程疫苗纯度高、特异性强，但分子小，免疫原性相对较弱，难以产生有效的免疫应答，因此应用佐剂来增强其免疫原性就显得尤为重要。
现有疫苗佐剂存在有价格昂贵、增强免疫应答效果不够显著等缺点，目前，已认证应用于人类的佐剂仍寥寥无几，铝盐佐剂就是其中之一。铝盐佐剂在提高抗体水平和安全方面已获得长期的实践证实，目前的研究认为铝佐剂是利用包裹抗原使抗原缓慢释放后，不断刺激免疫系统，诱导持续高效免疫应答的机制从正面增强机体抵御病原体的能力。但这样的正面促进作用并不完全，因为在免疫应答过程中，机体为避免免疫过激导致的损伤会产生许多免疫负调控分子，抑制免疫细胞的功能，减弱免疫细胞对抗原的清除作用。吲哚胺-2,3双加氧酶(Indolea mine-2,3 dioxygenase,IDO)就是其中一类免疫抑制分子，炎症环境中，IDO大量表达后，直接抑制T细胞的活化和增殖，同时促进调节性T细胞的作用，影响免疫应答。那么对该类分子活性的抑制，将会排除其对免疫细胞的干扰，促进机体对抗原有效的正向应答。
4-苯基咪唑(4-Phenylimidazole,4-PI) ，是一种类白色-淡黄色粉末状固体化合物，价格便宜溶解性好，安全，化学上常用作有机合成中间体，目前主要用于药物研发早期阶段合成筛选小分子酶制剂的中间体片段，是生物化学研究中血红素的配体，吲哚胺-2,3双加氧酶(Indoleamine-2,3 dioxygenase,IDO)的非竞争性抑制剂，能够与IDO活性部位血铁红素结合，抑制IDO的活性，解除其对T细胞活化增殖的抑制，恢复甚至加强机体对病毒的自主免疫。
利用病毒抗原结合IDO抑制剂，辅助疫苗共同作用机体，可能会诱导针对病毒的高效免疫应答，促进疫苗的接种，IDO抑制剂具有佐剂研究的价值，将为病毒性肝炎的控制与治疗提供更广阔的前景，目前，尚未出现将IDO非竞争性抑制剂和铝盐复合用于疫苗佐剂的研究报道。
发明内容
为解决现有疫苗佐剂存在的价格昂贵、促进免疫应答效果不显著等问题，本发明提供一种经济、有效、安全、稳定的复合佐剂、含有该复合佐剂的疫苗以及该疫苗的制备方法，具体方案如下：
一种复合佐剂，所述复合佐剂包括吲哚胺-2,3双加氧酶的非竞争性抑制剂和铝盐，所述吲哚胺-2,3双加氧酶的非竞争性抑制剂是4-苯基咪唑，所述铝盐是的氢氧化铝，所述复合佐剂是0.5-1.5mg的4-苯基咪唑+300μg的氢氧化铝，该含量以每单份疫苗液用量计，4-苯基咪唑分子式为C9H8N2，与现有合成佐剂性质不同，4-苯基咪唑能解除吲哚胺-2,3双加氧酶对免疫功能的抑制作用，抑制免疫的负调控，促进免疫应答。
进一步地，作为一个优选，所述的4-苯基咪唑含量为1mg；
一种包括所述的复合佐剂的疫苗，所述疫苗还包括疫苗液、75%乙醇和PBS，所述75%乙醇的用量为3.8-10.4μL。
所述75%乙醇是指质量浓度为75%的医用乙醇。
本申请还包括一种所述的疫苗的制备方法，包括如下步骤：
（1）准备75%乙醇、疫苗液；
（2）在75%乙醇中加入0.5-1.5mg的4-苯基咪唑，待4-苯基咪唑完全溶解后加入300μg的氢氧化铝，混合均匀，得复合佐剂混合液；
（3）在步骤（2）的混合液中加入每单份疫苗液；
（4）往步骤（3）的含复合佐剂的疫苗中加入1×PBS（磷酸盐缓冲液）至300μL，混合均匀，得到含复合佐剂的疫苗。
进一步地，所述75%乙醇的用量为3.8-10.4μL。
进一步地，所述的PBS的PH=7.4。
本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：（1）本申请的复合佐剂原料易得，疫苗制备工艺简单，成本低，性能稳定，毒副作用小，既能促进机体的免疫正调节又能抑制免疫负调控，有效提高了免疫应答水平，在免疫剂量范围内使用是安全可靠的；（2）4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂也能够有效的诱导抗原特异性的体液免疫应答，显著增强抗原特异性的体液免疫反应，效果优于无佐剂、单一佐剂和铝佐剂组。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件，文中所述的较佳条件实施方法仅作示范之用。
实施例1
本例提供的含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的甲肝疫苗是：用3.8μL75%乙醇溶解500μg 4-苯基咪唑后，与300μg氢氧化铝混合得复合佐剂，复合佐剂中按常规加入每单份HAV抗原（即动物实验使用的单次注射剂量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均匀，得含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的甲肝疫苗。另外还设置单一佐剂组（4-苯基咪唑）：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，按常规加入每单份HAV抗原（即动物实验中使用的单次注射剂量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均匀，得含有4-苯基咪唑单一佐剂的甲肝疫苗。
其中，4-苯基咪唑为市购产品，分子式为C9H8N2，分子量约为144.18，购自西格玛奥德里（上海）贸易有限公司；HAV抗原为市购的滴度为256EU/mL 18EU HAV抗原液，购自中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所。
实施例1所得含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的甲肝疫苗的免疫试验和效果如下：
A、免疫
将6-8周龄、18-22g的清洁级ICR小鼠随机分为4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂组、氢氧化铝佐剂组、无佐剂组和空白组，共四组，每组7只；所用氢氧化铝为常用的氢氧化铝胶体佐剂，在人体中的剂量为1.8-2.7mg。
对4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂组：注射实施例1的含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的甲肝疫苗至小鼠体内，注射剂量为每只小鼠300μL，其中300μL疫苗中含有4-苯基咪唑500μg，氢氧化铝复合300μg，甲肝抗原18EU。
对氢氧化铝佐剂组：将氢氧化铝300μg与甲肝抗原18EU混合后1×PBS加至300μL，经皮下多点注射到小鼠体内，注射剂量为每只小鼠300μL。
对无佐剂组：将甲肝抗原18EU与1×PBS混合至300uL，再经皮下多点注射到小鼠体内，注射剂量为每只小鼠300μL。
对空白组：仅注射1×PBS，注射剂量为每只小鼠300uL。
免疫方案：在第0周经皮下多点注射到小鼠体内，免疫次数为一次。
B、ELISA检测血清抗－HAV IgG水平
在免疫后的第4、8、12、16周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗-HAVIgG水平，按KPL公司生产的小鼠IgG ELISA试剂盒说明书进行检测操作。
C、数据分析
对所获得的实验数据以Graphpad prism5统计软件进行t检验，以P<0.05为差异的统计学意义。
通过数据分析可以看出，除空白组外，各实验组小鼠免疫4周后，均检测到抗-HAVIgG，并随着时间的延长呈上升趋势，于第12周后达到峰值，此后逐渐下降。4-苯基咪唑500μg+氢氧化铝组在免疫后4、8、16周，产生的抗体水平都高于无佐剂组(P<0.05)，差异有统计学意义；免疫后8、12、16周检测到的抗体水平都比单一佐剂组高(P<0.05)，差异有统计学意义；且全程中与铝佐剂对照组抗体水平相当；而铝佐剂组在免疫后12、16周抗体水平高于无佐剂组(P<0.05)，差异有统计学意义，见表1。表明4-苯基咪唑+氢氧化铝可增强HAV抗原特异性体液免疫应答，效果优于无佐剂组和单一佐剂组，与铝佐剂相当。
表1为使用实施例1提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAV IgG水平（抗体效价值）。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE002
实施例2
本例提供的含有氢氧化铝+4-苯基咪唑复合佐剂的甲肝疫苗是：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，与300μg氢氧化铝混合得复合佐剂，复合佐剂中按常规加入每单份HAV抗原（即动物实验中使用的单次注射剂量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均匀，得含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的甲肝疫苗。另外还设置单一佐剂组（4-苯基咪唑）：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，按常规加入每单份HAV抗原（即动物实验中使用的单次注射剂量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均匀，得含有4-苯基咪唑单一佐剂的甲肝疫苗。其中，4-苯基咪唑+氢氧化铝、HAV抗原获得方式同实施例1。
本例所得含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的甲肝疫苗的免疫试验同实施例1，结果见表2。
表2为使用实施例2提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAV IgG抗体水平。
表2
Figure DEST_PATH_IMAGE004
通过数据分析可以看出，除空白组外，各实验组小鼠免疫4周后，均检测到抗-HAVIgG，并随着时间的延长呈上升趋势，于第12周后达到峰值，此后逐渐下降。4-苯基咪唑1mg+氢氧化铝组在每个检测阶段的抗体滴度都最高，并都显著高于无佐剂组和单一佐剂组(P<0.05)，差异都有统计学意义；且在第4周产生的抗体水平高于铝佐剂组(P<0.05)，差异有统计学意义，直至16周后抗体水平均仍和铝佐剂对照组相当；单一佐剂组在每个检测阶段抗体水平与无佐剂组相当；而铝佐剂组在免疫后12、16周抗体水平高于单一佐剂组和无佐剂组(P<0.05)，差异有统计学意义。见表2。表明4-苯基咪唑1mg+氢氧化铝组可增强HAV抗原特异性体液免疫应答，具有佐剂效应，其体液免疫增强效果高于无佐剂、单一佐剂和铝佐剂组。
实施例3
本例提供的含有氢氧化铝+4-苯基咪唑复合佐剂的甲肝疫苗是：用10.4μL75%乙醇溶解1.5mg4-苯基咪唑后，与300μg氢氧化铝混合得复合佐剂，复合佐剂中按常规加入每单份HAV抗原（即动物实验中使用的单次注射剂量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均匀，得含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的甲肝疫苗。另外还设置单一佐剂组（4-苯基咪唑）：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，按常规加入每单份HAV抗原（即动物实验中使用的单次注射剂量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均匀，得含有4-苯基咪唑单一佐剂的甲肝疫苗。
其中，4-苯基咪唑+氢氧化铝、HAV抗原获得方式同实施例1。本例所得含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的甲肝疫苗的免疫试验同实施例1，结果见表3。
表3为使用实施例3提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAV IgG
抗体水平。
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE006
通过数据分析可以看出，除空白组外，各实验组小鼠免疫4周后，均检测到抗-HAVIgG，并随着时间的延长呈上升趋势，于第12周后达到峰值，此后逐渐下降。4-苯基咪唑1.5mg+氢氧化铝组在免疫12周后，产生的抗体水平较高，在免疫后16周产生的抗体水平高于无佐剂组(P<0.05)，差异有统计学意义；免疫后8、12、16周检测到的抗体水平都比单一佐剂组高(P<0.05)，差异有统计学意义；除第12周外，其它检测时间段与铝佐剂对照组抗体水平相当；而铝佐剂组在免疫后12、16周抗体水平高于无佐剂组(P<0.05)，差异有统计学意义。见表3。表明4-苯基咪唑+氢氧化铝可增强HAV抗原特异性体液免疫应答，效果优于无佐剂组和单一佐剂组，具有佐剂效应。
实施例4
本例提供的含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的乙肝疫苗是：用3.8μL75%乙醇溶解500μg4-苯基咪唑后，与300μg氢氧化铝混合得复合佐剂，复合佐剂中按常规加入每单份乙肝表面抗原（即动物实验中使用的单次注射剂量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均匀，得含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的乙肝疫苗。另外还设置单一佐剂组（4-苯基咪唑）：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，按常规加入每单份乙肝表面抗原（即动物实验中使用的单次注射剂量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均匀，得含有4-苯基咪唑单一佐剂的乙肝疫苗。
其中，4-苯基咪唑+氢氧化铝获得方式同实施例1，乙肝表面抗原为常规的含乙肝表面抗原1μg的市购产品，购自中国医学科学院医学生物学研究所。
本例所得含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的乙肝疫苗的免疫试验同实施例1，效果见表4。
表4为使用实施例4提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-乙肝表面抗原IgG抗体水平。
表4
Figure DEST_PATH_IMAGE008
通过数据分析可以看出，除空白组外，各实验组小鼠免疫4周后，均检测到抗-HAVIgG，并随着时间的延长呈上升趋势，于第12周后达到峰值，此后逐渐下降。在免疫后的4、8、16周，4-苯基咪唑500μg+氢氧化铝组产生的抗体水平都明显高于无佐剂组(P<0.05)，差异有统计学意义；免疫后8、16周检测到抗体水平都比单一佐剂组高(P<0.05)，差异有统计学意义；除12周外，4-苯基咪唑500μg+氢氧化铝组产生的抗体水平都略高于铝佐剂组；铝佐剂组产生的抗体水平只在12周、16周高于无佐剂组(P<0.05)，差异有统计学意义。见表4。表明氢氧化铝+4-苯基咪唑复合佐剂可增强乙肝表面抗原特异性体液免疫应答，效果优于无佐剂组和单一佐剂组，具有佐剂效应。
实施例5
本例提供的含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的乙肝疫苗是：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，与300μg氢氧化铝混合得复合佐剂，复合佐剂中按常规加入每单份乙肝表面抗原（即动物实验中使用的单次注射剂量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均匀，得含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的乙肝疫苗。另外还设置单一佐剂组（4-苯基咪唑）：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，按常规加入每单份乙肝表面抗原（即动物实验中使用的单次注射剂量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均匀，得含有4-苯基咪唑单一佐剂的乙肝疫苗。
其中，4-苯基咪唑+氢氧化获得方式同实施例1，乙肝表面抗原为常规的含乙肝表面抗原1μg的市购产品，购自中国医学科学院医学生物学研究所。
本例所得含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的乙肝疫苗的免疫试验同实施例1，效果见表5。
表5为使用实施例5提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-乙肝表面抗原IgG抗体水平。
表5
Figure DEST_PATH_IMAGE010
实施例6
本例提供的含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的乙肝疫苗是：用10.4μL
75%乙醇溶解1.5mg4-苯基咪唑后，与300μg氢氧化铝混合得复合佐剂，复合佐剂中按常规加入每单份乙肝表面抗原（即动物实验中使用的单次注射剂量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均匀，得含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的乙肝疫苗。另外还设置单一佐剂组（4-苯基咪唑）：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，按常规加入每单份乙肝表面抗原（即动物实验中使用的单次注射剂量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均匀，得含有4-苯基咪唑单一佐剂的乙肝疫苗。
其中，4-苯基咪唑+氢氧化铝获得方式同实施例1，乙肝表面抗原为常规的含乙肝表面抗原1μg的市购产品，购自中国医学科学院医学生物学研究所。
本例所得含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的乙肝疫苗的免疫试验同实施例1，效果见表6。
表6为使用实施例6提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-乙肝表面抗原IgG抗体水平。
表6
Figure DEST_PATH_IMAGE012
通过数据分析可以看出，除空白组外，各实验组小鼠免疫4周后，均检测到抗-HAVIgG，并随着时间的延长呈上升趋势，于第12周后达到峰值，此后逐渐下降。在免疫后8、16周，4-苯基咪唑1.5mg+氢氧化铝组产生的抗体水平高于无佐剂组和单一佐剂组(P<0.05)，差异有统计学意义；除12周外，4-苯基咪唑1.5mg+氢氧化铝组产生的抗体水平都与铝佐剂对照组相当；铝佐剂组产生的抗体水平只在12、16周高于无佐剂(P<0.05)，差异有统计学意义。见表6。表明氢氧化铝+4-苯基咪唑复合佐剂可增强乙肝表面抗原特异性体液免疫应答，效果优于无佐剂组和单一佐剂组，具有佐剂效应。
实施例7
本发明提供的含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的疫苗是：用3.8μL75%乙醇溶解500μg4-苯基咪唑后，与300μg氢氧化铝混合得复合佐剂，复合佐剂中按常规加入每单份狂犬病毒抗原（即动物实验中使用的单次注射剂量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均匀，得含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的狂犬疫苗。另外还设置单一佐剂组（4-苯基咪唑）：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，按常规加入每单份狂犬病毒抗原（即动物实验中使用的单次注射剂量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均匀，得含有4-苯基咪唑单一佐剂的狂犬疫苗。
其中，4-苯基咪唑+氢氧化铝获得方式同实施例1；狂犬病毒抗原为常规的含狂犬病毒抗原0.125IU的市购产品，购自大连汉信生物制药有限公司。
本例所得含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的狂犬疫苗的免疫试验同实施例1，效果见表7。
表7为使用实施例7提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗狂犬病毒IgG抗体水平。
表7
Figure DEST_PATH_IMAGE014
数据分析可以看出，除空白组外，各实验组小鼠免疫4周后，均产生抗-HAV IgG，并随着时间的延长呈上升趋势，于第12周后达到峰值，此后逐渐下降。4-苯基咪唑500μg+氢氧化铝在免疫4、8、16周产生的抗体水平都高于无佐剂组和单一佐剂组(P<0.05)，差异有统计学意义；免疫12周后，产生的抗体水平最高，仅次于铝佐剂对照组，其它检测时间段抗体水平略高于铝佐剂对照组；铝佐剂组产生的抗体水平只在16周高于无佐剂组(P<0.05)，差异有统计学意义。见表7。表明4-苯基咪唑500μg+氢氧化铝可增强狂犬病毒抗原特异性体液免疫应答，效果优于无佐剂组和单一佐剂组，具有佐剂效应。
实施例8
本发明提供的含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的疫苗是：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，与300μg氢氧化铝混合得复合佐剂，复合佐剂中按常规加入每单份狂犬病毒抗原（即动物实验中使用的单次注射剂量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均匀，得含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的狂犬疫苗。另外还设置单一佐剂组（4-苯基咪唑）：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，按常规加入每单份狂犬病毒抗原（即动物实验中使用的单次注射剂量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均匀，得含有4-苯基咪唑单一佐剂的狂犬疫苗。
其中，4-苯基咪唑+氢氧化铝获得方式同实施例1；狂犬病毒抗原为常规的含狂犬病毒抗原0.125IU的市购产品，购自大连汉信生物制药有限公司。
本例所得含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的狂犬疫苗的免疫试验同实施例1，效果见表8。
表8为使用实施例8提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗狂犬病毒IgG抗体水平。
表8
Figure DEST_PATH_IMAGE016
数据分析可以看出，除空白组外，各实验组小鼠免疫4周后，均检测到抗-HAV IgG，并随着时间的延长呈上升趋势，于第12周后达到峰值，此后逐渐下降。4-苯基咪唑1mg+氢氧化铝组在每个检测阶段的抗体滴度都最高，并都显著高于无佐剂组和单一佐剂组(P<0.05)，差异都有统计学意义；且在第四周与铝佐剂组相比，P<0.05，差异有统计学意义。其它检测时间段4-苯基咪唑1mg+氢氧化铝组的抗体水平比同期铝佐剂对照组略高；单一佐剂组在每个检测阶段抗体水平与无佐剂组相当；铝佐剂组产生的抗体水平只在16周高于单一佐剂组和无佐剂组(P<0.05)，差异有统计学意义。见表8。表明氢氧化铝+4-苯基咪唑复合佐剂可增强狂犬病毒抗原特异性体液免疫应答，效果优于无佐剂、单一佐剂和铝佐剂组，且这种效果可持续一定时间。
实施例9
本发明提供的含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的疫苗是：用10.4μL75%乙醇溶解1.5mg4-苯基咪唑后，与300μg氢氧化铝混合得复合佐剂，复合佐剂中按常规加入每单份狂犬病毒抗原（即动物实验中使用的单次注射剂量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均匀，得含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的狂犬疫苗。另外还设置单一佐剂组（4-苯基咪唑）：用7μL75%乙醇溶解1mg4-苯基咪唑后，按常规加入每单份狂犬病毒抗原（即动物实验中使用的单次注射剂量），最后加入1×PBS(PH=7.4)至300μL，混合均匀，得含有4-苯基咪唑单一佐剂的狂犬疫苗。
其中，4-苯基咪唑+氢氧化铝获得方式同实施例1；狂犬病毒抗原为常规的含狂犬病毒抗原0.125IU的市购产品，购自大连汉信生物制药有限公司。
本例所得含有4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂的狂犬疫苗的免疫试验同实施例1，效果见表9。
表9为使用实施例9提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗狂犬病毒IgG抗体水平。
表9
Figure DEST_PATH_IMAGE018
数据分析可以看出，除空白组外，各实验组小鼠免疫4周后，均产生抗-HAV IgG，并随着时间的延长呈上升趋势，于第12周后达到峰值，此后逐渐下降。4-苯基咪唑1.5mg+氢氧化铝组在免疫8、16周后产生的抗体水平高于无佐剂组和单一佐剂组(P<0.05)，差异有统计学意义；除12周外，其它检测时间段的抗体水平与铝佐剂对照组相当；铝佐剂组产生的抗体水平只在16周高于无佐剂组(P<0.05)，差异有统计学意义。见表9。表明4-苯基咪唑1.5mg+氢氧化铝可增强狂犬病毒抗原特异性体液免疫应答，效果优于无佐剂组和单一佐剂组，且佐剂效应与铝佐剂相当。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种复合佐剂，其特征在于：所述复合佐剂由吲哚胺-2,3双加氧酶的非竞争性抑制剂和铝盐组成，所述吲哚胺-2,3双加氧酶的非竞争性抑制剂是4-苯基咪唑，所述铝盐是氢氧化铝，所述4-苯基咪唑的含量为1mg；所述氢氧化铝的含量为300μg；该佐剂既能促进机体的免疫正调节又能抑制免疫负调控，显著增强抗原特异性的体液免疫反应。
2.一种包括权利要求1所述复合佐剂的疫苗，其特征在于：所述疫苗还包括疫苗液、75%乙醇和PBS，所述75%乙醇的用量为3.8-10.4μL。
3.一种如权利要求2所述的疫苗的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）准备75%的乙醇、疫苗液；
（2）75%乙醇中加入1mg的4-苯基咪唑，待4-苯基咪唑完全溶解后，加入300μg的氢氧化铝，混合均匀，得复合佐剂混合液；
（3）往步骤（2）的混合液中加入每单份疫苗液；
（4）往步骤（3）含复合佐剂的疫苗中加入1×PBS至300μL，混合均匀，得到含复合佐剂的疫苗。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述75%乙醇的用量为3.8-10.4μL。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述PBS的PH=7.4。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012142237A8 (en) * 2011-04-15 2012-11-22 Newlink Genetics Corporation Fused imidazole derivatives useful as ido inhibitors

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012142237A8 (en) * 2011-04-15 2012-11-22 Newlink Genetics Corporation Fused imidazole derivatives useful as ido inhibitors

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
4-苯基咪唑+氢氧化铝复合佐剂对甲型肝炎减毒活疫苗诱导小鼠体液免疫应答的影响;马静等;《实验动物与比较医学》;20170430;第37卷(第2期);102-107 *
indoleamine 2,3-dioxygenase,an emerging target for anti-cancer therapy;liu x et al.;《curr cancer drug targets》;20091231;第9卷(第8期);938-952 *
structure based development of phenylimidazole-derived inhibitors of indoleamine 2,3-dioxygenase;sanjeev kumar et al.;《J.Med.Chem》;20081231;摘要、table2、第4971页左栏最后一段 *

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