CN101766815A - 紫杉醇及多西紫杉醇的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了紫杉醇作为疫苗佐剂的应用，还公开了多西紫杉醇作为疫苗佐剂的应用。疫苗为蛋白质疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗或全病毒疫苗。本发明充分运用了紫杉醇和多西紫杉醇能够激活天然免疫系统的原理，以紫杉醇和多西紫杉醇作为疫苗佐剂应用于疫苗的制备，可以大幅度提高疫苗诱导的细胞和体液免疫反应强度，减少注射部位的局部刺激反应，且可以冰冻保存疫苗，延长疫苗贮存期。

Description

紫杉醇及多西紫杉醇的用途
技术领域
本发明涉及紫杉醇及其多西紫杉醇用于制备疫苗的佐剂用途。
背景技术
疫苗是控制人类和动物传染病的重要手段。一个理想的疫苗用于免疫接种后，不仅可以在被免疫的个体中产生足够的免疫反应强度，而且可以产生适宜的免疫反应类型，发挥免疫保护作用。在疫苗生产阶段，通常采用增加抗原用量或在疫苗中加入佐剂的方法来保障疫苗的有效性。增加抗原的用量使疫苗的生产成本提高，以及潜在着增加抗原依赖性毒副作用的缺点。纯化抗原可以减少疫苗的毒副作用，但这又使生产疫苗的成本增加。在疫苗中加入佐剂可以在保障疫苗有效性的同时，减少抗原的用量，减少生产抗原所需的成本，并可在免疫注射时降低抗原依赖性毒副作用的产生，如注射局部红肿、疼痛，头晕等。如果所用的佐剂足够安全，则疫苗中加了佐剂后，在保障疫苗有效性的同时，既可降低疫苗的生产成本，又可提高疫苗的安全性。具有佐剂作用的物质虽然很多，但迄今被美国食品和药物管理局(FDA)准许的人用疫苗中，氢氧化铝是唯一的一种佐剂。铝佐剂在疫苗中吸附抗原而形成复合物，注射后在局部形成抗原贮存库，缓慢释放出抗原发挥佐剂作用。铝佐剂主要促进体液免疫应答，适用于以抗体为保护性免疫的疾病疫苗，如白喉、破伤风、乙肝、麻疹等。铝佐剂虽然在人用或兽用疫苗上广泛应用，仍存在许多缺点，如轻度局部反应，形成肉芽肿，甚至发生局部无菌性脓肿；人的一种肌肉的局部组织损伤可能和铝佐剂有关；此外，铝胶冷冻后胶体状态被破坏，不能发挥佐剂作用，因此不能冷冻保存；不同制备批次的铝胶佐剂，胶体状态不同，难以获得相同佐剂效果。
综上所述，现有的铝胶佐剂存在着以下缺陷：
1)现有的铝胶佐剂主要促进体液免疫反应，而对细胞免疫反应的效果弱；
2)现有的铝胶佐剂引起的注射部位局部刺激反应大；
3)现有的铝胶佐剂疫苗不能冰冻保存，贮存期短。
1963年美国化学家瓦尼(M.C.Wani)和沃尔(Monre E.Wall)首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉(Pacific Yew)树皮和木材中获得紫杉醇的粗提物。在筛选实验中，Wani和Wall发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高的抑制作用，并开始分离这种活性成份。由于该活性成份在植物中含量极低，直到1971年，他们才同杜克(Duke)大学的化学教授姆克法尔(Andre T.McPhail)合作，通过X-射线分析确定了该活性成份的化学结构是一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇(taxol)。纯品紫杉醇呈白色结晶性粉末状，相对分子质量为853.9，熔点为213～216℃，无臭，无味，化学结构式如图1所示。由于其天然含量极低，在当时未引起人们的注意。1977年，Horwitz博士发现其抗癌机理是能够与癌细胞的微管蛋白结合，促进微管蛋白聚合装配成微管二聚体，从而抑制微管的正常生理解聚，使细胞有丝分裂停止在G2期及M期，阻止了癌细胞的快速繁殖。紫杉醇抗癌机理的发现推动了它在临床方面的研究。已有报道，紫杉醇可有效治疗卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、食管癌、精原细胞瘤和何金氏淋巴瘤等。目前，紫杉醇制剂已被美国FDA批准作为抗癌新药在临床应用，在我国临床上也广泛用于癌症治疗。最近的研究发现，紫杉醇有具有脂多糖(LPS)样作用，能够激活天然免疫系统，上调一些细胞因子和相关基因的表达。多西紫杉醇(docetaxel)是在紫杉醇的基础上人工合成的，在C4和C5位置上含有一个带有氧四环的紫杉烷环结构，并在C13位置上含有一个庞大的酯侧链，化学结构式如图2所示。纯品多西紫杉醇为白色粉末，相对分子质量为807.88，熔点为232℃。
虽然发现紫杉醇和多西紫杉醇的抗癌作用迄今已有40多年，但将上述2者作为疫苗佐剂的使用尚未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种紫杉醇以及多西紫杉醇的新用途：能作为疫苗佐剂。
为了解决上述技术问题，本发明提供紫杉醇作为疫苗佐剂的应用。
本发明还同时提供了多西紫杉醇作为疫苗佐剂的应用。
上述疫苗为蛋白质疫苗、核酸疫苗、多肽疫苗或全病毒疫苗。
本发明实际应用中，是在制造疫苗的过程中加入紫杉醇或多西紫杉醇；使每毫升疫苗中含紫杉醇或其多西紫杉醇0.1～10毫克。
本发明充分运用了紫杉醇和多西紫杉醇能够激活天然免疫系统的原理，以紫杉醇和多西紫杉醇作为疫苗佐剂应用于疫苗的制备，可以大幅度提高疫苗诱导的细胞和体液免疫反应强度，减少注射部位的局部刺激反应，且可以冰冻保存疫苗，延长疫苗贮存期。紫杉醇及其多西紫杉醇用于疫苗生产，方法简便，无需过多改变现有生产工艺。此外，由于紫杉醇及其多西紫杉醇已经被批准用于人医临床，用紫杉醇及其多西紫杉醇作为佐剂开发新型疫苗避免了针对佐剂进行的繁杂的安全性试验。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是紫杉醇的化学结构式；
图2是多西紫杉醇的化学结构式；
图3是一免后两周和二免后两周各组小鼠血清OVA特异性IgG和IgM抗体效价对比图；
图3中A代表IgG抗体效价，B代表IgM抗体效价；
图4是一免后两周和二免后两周各组小鼠血清OVA特异性IgG亚类水平(血清1∶100稀释)；
图5是二免后两周各组小鼠脾细胞在特异性抗原OVA和有丝分裂源ConA以及LPS刺激后的增殖情况对比图；
图6是二免后两周各组小鼠脾细胞在特异性抗原OVA刺激后细胞因子IL-12，IFN-γ，IL-4和IL-10的mRNA表达情况对比图；
图7是二免后两周各组小鼠脾细胞在特异性抗原OVA刺激后T-bet/GATA3mRNA表达情况对比图；
图8是紫杉醇(Taxol)和多西紫杉醇(Docetaxel)对模式抗原OVA的佐剂作用。
图9是紫杉醇(Taxol)和多西紫杉醇(Docetaxel)对全病毒抗原灭活口蹄疫病毒的佐剂作用。
上述图3～9中，具有a、b不同字母的组表示有统计学差异(P＜0.05)；
图10是一免后两周和二免后两周各组小鼠血清H1N1特异性IgG抗体水平对比图；
图11是冻融实验前后的IgG水平的对比图。
具体实施方式
为验证本发明的紫杉醇及其多西紫杉醇疫苗佐剂作用，用卵清白蛋白(OVA)作为模式抗原进行动物试验。
实例1：不同剂量的紫杉醇对小鼠注射模式抗原卵清白蛋白(OVA)的佐剂作用
一、材料和方法
1.实验动物
雌性ICR小鼠60只，购自上海实验动物中心。
2.抗原
模式抗原卵清白蛋白(OVA)购自Sigma公司。OVA通过内毒素去除柱(Pierce公司)去除两次，除去内毒素，然后用BCA试剂盒法定量(Pierce公司)。
3.紫杉醇(Taxol)
购于上海和氏璧生物技术有限公司(Shanghai Tauto Biotech Co.，Ltd.)。
4.氢氧化铝铝胶
购于浙江万马有限公司。
5.试验疫苗制备
先将紫杉醇溶解在无水乙醇中(40mg/ml)，OVA溶解在生理盐水中(0.25mg/ml)。向一试管内加入吐温-80、无水乙醇、OVA生理盐水溶液、生理盐水、紫杉醇溶液或者氢氧化铝铝胶，每100微升的实验疫苗中所含OVA、Taxel和铝胶的含量如表1所示。
表1、各组实验疫苗所含成分(/100μl)
组别   OVA(μg)   Taxol(μg)   铝胶(μg)   吐温-80(μl)   乙醇(μl)   生理盐水(μl)
  1   0   0   0   0.5   0.5   99
  2   10   0   0   0.5   0.5   99
  3   10   50   0   0.5   0.5   99
  4   10   100   0   0.5   0.5   99
组别   OVA(μg)   Taxol(μg)   铝胶(μg)   吐温-80(μl)   乙醇(μl)   生理盐水(μl)
  5   10   200   0   0.5   0.5   99
  6   10   0   200   0   0   100
6.免疫方法
60只小鼠随机分成6组，每组10只。每只小鼠每次皮下注射疫苗0.1ml，注射2次，间隔3周。佐剂及抗原剂量见表1。
7.血样采集
一免后和二免后2周分别采血。血样静置于4℃冰箱过夜，600g，离心，吸取血清，分装于0.2ml塑料离心管中，-80℃保存。
8.OVA特异性IgM和IgG的检测
IgM和IgG抗体效价检测步骤如下：
(1)用5μg/ml OVA(溶于碳酸盐缓冲液，pH 9.6)包被96孔聚酯板，置于4℃过夜。
(2)用PBST(含0.05％吐温-20的PBS)洗3次。
(3)用含5％小牛血清的PBS封闭96孔板1小时，PBST清洗3次。
(4)向孔内加入100μl血清(一免后的血清1∶100稀释；二免后血清1∶1000稀释)，然后倍比稀释。
(5)将含上述血清的96孔板孵育1小时，再次用PBST洗三次。
(6)向孔内加入HRP标记的二抗(山羊抗鼠IgG或IgM，1∶5000)100μl，孵育1小时，用PBST洗三次。
(7)加入100μl TMB底物(Exalpha Biologicals，Inc)显色10-20分钟。
(8)最后用50μl的2M H2SO4终止显色反应，用酶标仪上在450nm处读取OD值。
(9)阳性滴度的终点为OD值高于同等稀释度的阴性血清(生理盐水组)平均值的2.1倍。
9.OVA特异性IgG亚类的检测
检测步骤如下：
(1)用5μg/ml OVA(溶于碳酸盐缓冲液，pH 9.6)包被96孔聚酯板，置于4℃过夜。
(2)用PBST(含0.05％吐温-20的PBS)洗3次。
(3)用含5％小牛血清的PBS封闭96孔板1小时，PBST清洗3次。
(4)向孔内加入100μl血清(一免后的血清1∶100稀释；二免后血清1∶1000稀释)。
(5)将含上述血清的96孔板孵育1小时，再次用PBST洗三次。
(6)加入生物素(biotin)标记的二抗IgG1，IgG2a，IgG2b或IgG3(1∶1000)，孵育1小时，用PBST清洗3次。
(7)加入抗生物素标记的辣根过氧化酶(1∶5000)，孵育30分钟，用PBST洗三次。
(8)加入100μl TMB底物(Exalpha Biologicals，Inc)显色10-20分钟。
(9)最后用50μl的2M H2SO4终止显色反应，用酶标仪上在450nm处读取OD值。
(10)阳性滴度的终点为OD值高于同等稀释度的阴性血清(生理盐水组)平均值的2.1倍。
10.淋巴细胞增值试验
淋巴细胞增值试验步骤如下：
(1)二免后两周从小鼠脾脏分离出脾细胞，细胞悬浮在RPMI 1640培养液(含10％小牛血清(HyClone)，100UI/ml青霉素和100μg/ml链霉素)。若有红细胞混杂，用0.01MTris-HCl(含0.83％NH4Cl，pH＝7.2)裂解，用完全Hank’s液清洗细胞，计数，调节细胞浓度至5×106个细胞/ml。
(2)向96孔板上每孔加入5×106个细胞。
(3)向细胞悬液中加入ConA，LPS或者OVA溶液，使其最终浓度分别为5μg/ml，8μg/ml或100μg/ml。
(4)培养板置37℃，5％CO2培养。Con A和LPS培养孵育48小时；OVA培养板孵育4天。
(5)向细胞培养液内加入50μl MTT溶液(2mg/ml)，孵育2～4小时。
(6)离心培养板(1400g，5min)，小心倒去细胞培养液。
(7)每孔加入150μl DMSO(含4％的1M HCl)溶解结晶染料。
(8)用酶标仪上在450nm处读取OD值。刺激指数(SI)的计算公式如下：SI＝(刺激的细胞OD值)/(非刺激细胞OD值)。
11.细胞因子与T-bet/GATA-3转录因子检测
(1)细胞制备：二免后两周从小鼠脾脏分离出脾细胞，细胞悬浮在RPMI 1640培养液(含10％小牛血清(HyClone)，100UI/ml青霉素和100μg/ml链霉素)。若有红细胞混杂，用0.01M Tris-HCl(含0.83％NH4Cl，pH＝7.2)裂解，用完全Hank’s液清洗细胞，计数，调节细胞浓度至5×106个细胞/ml。
(2)抗原刺激：在细胞悬液加入OVA溶液，在5％CO2、37℃条件下，培养15小时。
(3)总RNA提取：将上述细胞培养板离心(500×g，5min)，小心的除去细胞培养液。向每孔加入1ml RNA提取试剂(RNAisoTMPlus，TaKaRa Co.，Ltd)提取细胞总RNA。在提取的总RNA中加入30μl去RNase和DNase的水溶解。保存提取物于液氮中。
(4)cDNA合成：反转录试剂在200μl的PCR管(Axygen，USA)中进行，反应总体系为15μl RNA+4μl 5×iScript reaction mix+1μl iScript reverse transcriptase(Bio-Rad Laboratories，Inc.USA)。反转录在MyCycler(Bio-Rad Laboratories，Inc.USA)设备上进行，程序为25℃保温5分钟，42℃保温30分钟，85℃保温5分钟。反转录获得cDNA保存在-20℃。
(5)实时双重PCR法检测目的基因的表达：采用两重TagMan探针来检测目的基因的表达，其中β-actin作为内参基因，另外的为一条目的基因。内参基因β-actin探针(Probe)的5’端标记荧光信号HEX和3’端标记荧光淬灭集团BHQ-1；所有待定量的目基因探针的5’端标记荧光信号FAM和3’端标记荧光淬灭集团BHQ-1。PCR反应体系为20μl，其中2μl 10×PCR buffer与0.4μlTag酶(5U/μl，TakaRa，Co，LTD.DaLian，China)、2μl dNTPmix(2.5mM)、β-actin上下游引物各2μl(5μM)、目的基因上下游引物各2μl(5μM)、β-actin的探针1μl(5μM)、目的基因的探针1μl(5μM)、cDNA模板2μl、去离子水3.6μl。在ABI7500(PE Applied Biosystems，Warrington，U.K.)设备上检测，PCR程序为2步法：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火与延伸30秒，共45个循环。
(6)PCR扩增效率的计算：通过普通PCR分别扩增内参基因β-actin和目的基因IL-4、IL-10、IFN-γ、IL-12、GATA-3和T-bet扩增，PCR使用的模板为上述反转录的cDNA，引物就是实时双重PCR的引物；PCR反应体系为50μl：其中5μl 10×PCR buffer与0.4μlTag酶(5U/μl，TakaRa，Co，LTD.DaLian，China)、4μl dNTPmix(2.5mM)、β-actin上下游引物各4μl(5μM)或目的基因上下游引物各4μl(5μM)、cDNA模板2μl、去离子水30.6μl。PCR扩增在MyCycler设备上进行，程序为：95℃预变性3分钟，95℃变性15秒，60℃退火与延伸30秒，共35个循环。PCR产物经过电泳分离(3％琼脂糖)目的基因片段，通过胶回收试剂盒(TakaRa Agarose Gel DNA Purification Kit，DaLian，China)纯化出目的DNA并送上海生物工程有限公司测序(Sangon Co，Ltd.Shanghai，China)。将上述纯化出来的内参基因β-actin和目的基因的片段DNA进行多次的10倍稀释作为实时双重PCR反应的模板，每次模板从标准内参基因β-actin和目的基因的片段DNA各取1ul。PCR采用的反应体系、设备及其程序完全与步骤(5)一样。优化PCR，从标准的内参基因β-actin和目的基因中选出8个稀释梯度，使得其PCR的Ct值在15至45个循环内。每次目的基因的检测都要同时做该内参基因β-actin和目的基因的8个不同稀释度双重PCR。通过其Ct值获得该条件下内参基因和目的基因的扩增效率。
(7)引物设计与目的基因的相对表达计算方法：所有检测的目的基因与内参基因β-actin的引物与探针都参考软件Primer Express 3.0(PE Applied Biosystems，Warrington，U.K.)设计，并且所有目的基因的引物都跨内含子设计，在该双重PCR反应条件下不能从脾细胞基因组上扩出目的片段。双重PCR所获得的每组样本的内参基因和检测的目的基因Ct值输入软件REST 2005(Eppendorf公司获得)，同时输入用标准模板做的双重PCR的内参基因和检测的目的基因的实际扩增效率。其中设置β-actin为内参基因；生理盐水组为校正组，最后获得每组样本中检测的目的基因相对于生理盐水组的表达倍数值。
二、结果
1.OVA特异性IgG及其亚类
模式抗原OVA中加入佐剂(紫杉醇或氢氧化铝胶)后进行免疫，动物于一免和二免后所产生的IgG效价均高于不加佐剂的对照组。紫杉醇的佐剂作用呈量效关系。紫杉醇的剂量在100微克时，动物于一免和二免后产生的IgG应答均高于其它各组产生的IgG效价，并分别为对照组的4.8倍和14.9倍(P＜0.05)，如图3A所示。
模式抗原OVA中加入佐剂(紫杉醇或氢氧化铝胶)后进行免疫，动物于一免和二免后所产生的IgG亚类IgG1，IgG2a，IgG2b and IgG3均高于不加佐剂的对照组。在含紫杉醇的三组中，IgG亚类的变化依赖紫杉醇的剂量。IgG1的应答水平在紫杉醇200微克剂量组高于50微克剂量组；IgG2a的应答水平在紫杉醇为50微克剂量组高于200微克的剂量组；紫杉醇的剂量为100微克时，IgG各亚类高于其它各组。佐剂显著促进了IgG1的产生(P＜0.05)，但对其它IgG亚类无显著促进作用(P＞0.05)(见图4)。
2.OVA特异性IgM
模式抗原OVA中加入100微克或200微克紫杉醇后免疫动物，一免后动物产生的IgM水平是不加佐剂的对照组的4.7倍(P＜0.05)。二免后动物产生的IgM水平无显著性差异(P＞0.05)(见图3B)。
3.淋巴细胞增殖试验
模式抗原OVA中加入佐剂(紫杉醇或氢氧化铝胶)后免疫动物，加佐剂各组的淋巴细胞刺激指数均高于不加佐剂的对照组。其中以100微克紫杉醇组的淋巴细胞刺激指数为最高(见图5)。
4.细胞因子mRNA的表达
模式抗原OVA中加入佐剂(紫杉醇或氢氧化铝胶)后免疫动物，脾淋巴细胞对细胞因子mRNA的表达产生了显著的变化。这种变化取决于佐剂的种类以及紫杉醇的剂量。紫杉醇在高剂量(200微克)时促进较高的IL4和IL10mRNA表达以及较低的IFN γ和IL12mRNA表达；紫杉醇在低剂量(50微克)时促进较低的IL4和IL10mRNA表达以及较高的IFN γ和IL12mRNA表达。100微克紫杉醇组产生最高的IL4，IL10，IFN γ和IL12mRNA表达。铝胶显著促进IL4和IL10mRNA的表达，但对IFN γ和IL12mRNA无促进作用(见图6)。
5.转录因子T-bet和GATA-3mRNA表达
转录因子T-bet和GATA-3mRNA的表达依赖于佐剂的种类和剂量。高剂量紫杉醇(200微克)比低剂量紫杉醇(50微克)促进更高的DATA-3和更低的T-bet mRNA表达；低剂量紫杉醇(50微克)比高剂量紫杉醇(200微克)促进更高的T-bet和更低的GATA-3mRNA表达。铝胶显著促进GATA-3(P＜0.05)T-bet mRNA表达，但对GATA-3mRNA无促进作用(P＞0.05)(见图7)。
实例2紫杉醇和多西紫杉醇对小鼠注射模式抗原卵清白蛋白(OVA)的佐剂作用
一、材料和方法
1.实验动物
雌性ICR小鼠30只，购自上海实验动物中心。
2.抗原
模式抗原卵清白蛋白(OVA)购自Sigma公司。OVA通过内毒素去除柱(Pierce公司)去除两次，除去内毒素，然后用BCA试剂盒法定量(Pierce公司)。
3.紫杉醇(Taxol)和多西紫杉醇(Docetaxel)
购于上海和氏璧生物技术有限公司(Shanghai Tauto Biotech Co.，Ltd.)
4.试验疫苗制备
先将紫杉醇或多西紫杉醇溶解在无水乙醇中(40mg/ml)，OVA溶解在生理盐水中(0.25mg/ml)。向一试管内加入吐温-80、无水乙醇、OVA生理盐水溶液、生理盐水、紫杉醇溶液或多西紫杉醇，使每100微升的实验疫苗中所含物质如表2所示。
表2、各组实验疫苗所含成分(/100μl)
组别   OVA(μg)   Taxol(μg)  Docetaxel(μg)   吐温-80(μl)   乙醇(μl)   生理盐水(μl)
  1   10   0  0   0.5   0.5   99
  2   10   100  0   0.5   0.5   99
  3   10   0  100   0.5   0.5   99
5.免疫方法
30只小鼠随机分成3组，每组10只。每只小鼠每次皮下注射疫苗0.1ml一次。佐剂及抗原剂量见表2。
6.血样采集
一免后2周采血。血样静置于4℃冰箱过夜，600g，离心，吸取血清，分装于0.2ml塑料离心管中，-80℃保存。
7.OVA特异性IgG的检测
IgG抗体效价检测步骤如下：
(1)用5μg/ml OVA(溶于碳酸盐缓冲液，pH 9.6)包被96孔聚酯板，置于4℃过夜。
(2)用PBST(含0.05％吐温-20的PBS)洗3次。
(3)用含5％小牛血清的PBS封闭96孔板1小时，PBST清洗3次。
(4)向孔内加入100μl血清(1∶50稀释)。
(5)将含上述血清的96孔板孵育1小时，再次用PBST洗三次。
(6)向孔内加入HRP标记的二抗(山羊抗鼠IgG，1∶5000)100μl，孵育1小时，用PBST洗三次。
(7)加入100μl TMB底物(Exalpha Biologicals，Inc)显色10-20分钟。
(8)最后用50μl的2M H2SO4终止显色反应，用酶标仪上在450nm处读取OD值。
二、结果
紫杉醇组和多西紫杉醇组的IgG水平均显著高于对照组，说明紫杉醇和多西紫杉醇有佐剂作用(见图8)。
实例3紫杉醇和多西紫杉醇对小鼠注射全病毒抗原灭活口蹄疫病毒(FMDV)的佐剂作用
一材料和方法
1.实验动物
雌性ICR小鼠24只，购自上海实验动物中心。
2.抗原和佐剂
抗原为灭活O型口蹄疫病毒(FMDV)，由内蒙古金宇生物制品有限公司提供。紫杉醇(Taxol)和多西紫杉醇(Docetaxel)购于上海和氏璧生物技术有限公司(Shanghai TautoBiotech Co.，Ltd.)。
3.实验疫苗的制备：
先将紫杉醇或多西紫杉醇溶解在无水乙醇中(40mg/ml)；FMDV用生理盐水1∶4(体积比)稀释，向一试管内加入吐温-80、无水乙醇、FMDV生理盐水溶液、生理盐水、紫杉醇或多西紫杉醇溶液，使每200微升的实验疫苗中所含物质如表3所示。
表3各组实验疫苗所含成分(/200μl)
组别   FMDV生理盐水溶液(μl) Taxol(μg) Docetaxel(μg) 吐温-80(μl) 乙醇(μl) 生理盐水(μl)
  1   100   0   0   0.5   0.5   99
  2   100   100   0   0.5   0.5   99
  3   100   0   100   0.5   0.5   99
4.免疫方法
24只小鼠随机分成3组，每组8只。每只小鼠每次肌肉注射疫苗0.2ml，注射2次，间隔3周。
5.血样采集：二免后2周采血。血样静置于4℃冰箱过夜，600g，离心，吸取血清，分装于0.2ml塑料离心管中，-20℃保存。
6.特异性IgG检测
(1)在ELISA板上每孔加入50μl经碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释的牛抗O型口蹄疫病毒抗体(1∶1000)(内蒙古金宇生物制品有限公司)，封板，4℃过夜。
(2)用洗涤液洗涤5次，每次300μl，拍干。每孔加入300μl磷酸盐缓冲液(含5％脱脂奶+0.05％吐温-20)封闭，37℃孵育2小时。
(3)用磷酸盐缓冲液洗涤5次，每次300μl，拍干。每孔加入50μl经1∶3稀释的O型口蹄疫病毒抗原，振荡混匀，4℃孵育2小时。
(4)用磷酸盐缓冲液洗涤5次，每次300μl，拍干。每孔加入50μl经磷酸盐缓冲液(含0.05％吐温-20)1∶50稀释的待检血清，37℃孵育1小时。
(5)用磷酸盐缓冲液洗涤5次，每次300μl，拍干。每孔加入经1∶1000稀释的山羊抗小鼠IgG(h+1)抗体(美国Betheyl Laboratory公司)。37℃孵育1小时。
(6)用磷酸盐缓冲液洗涤5次，每次300μl，拍干。每孔加入经1∶10000兔抗山羊IgGFC-HRP，37℃孵育1小时。用洗涤液洗涤5次，每次300μl，拍干。
(7)每孔加入100μl TMB底物溶液。室温孵育15分钟，每孔加入50μl 2M H2SO4终止反应，并轻轻振荡混匀。在15分钟内，用酶标仪测定在450nm波长的OD值。
二结果
紫杉醇或多西紫杉醇和口蹄疫病毒混合注射比口蹄疫病毒单独注射可以诱导出更高的抗FMDV抗体(见图9)(P＜0.05)。
实例4多西紫杉醇对小鼠注射灭活H1N1流感裂解病毒抗原的佐剂作用
一材料和方法
1.实验动物
雌性ICR小鼠64只，购自上海实验动物中心。
2.抗原和佐剂
抗原为灭活H1N1流感裂解病毒，由浙江省疾病控制中心提供。多西紫杉醇(Docetaxel)购于上海和氏璧生物技术有限公司(Shanghai Tauto Biotech Co.，Ltd.)。
3.实验疫苗的制备：
先将多西紫杉醇溶解在无水乙醇中(40mg/ml)，灭活H1N1流感裂解病毒溶解在生理盐水中(0.25mg/ml)。向一试管内加入吐温-80(5％体积比)、无水乙醇(5％体积比)、H1N1流感抗原生理盐水溶液、生理盐水、多西紫杉醇溶液，使每100微升的实验疫苗中所含物质如表4所示。
表4各组实验疫苗所含成分
  组别   H1N1(ng/100μl)   Docetaxel(μg/100μl)
  1   1   0
  2   5   0
  3   10   0
  4   100   0
  5   1   100
  6   5   100
  7   10   100
  8   100   100
4.免疫方法
64只小鼠随机分成8组，每组8只。每只小鼠每次肌肉注射疫苗0.2ml，注射2次，间隔3周。
5.血样采集
首免和二免后2周采血。血样静置于4℃冰箱过夜，600g，离心，吸取血清，分装于0.2ml塑料离心管中，-20℃保存。
6.间接ELISA法检测抗流感病毒IgG
(1)在96孔酶标板中每孔加入100μl包被液(含流感病毒1μg/ml的0.05mol/L碳酸盐缓冲液)，4℃过夜；
(2)用含0.05％(v/v)Tween-20的PBS洗涤液(简称PBST)洗涤3次，每孔300μl，每次3min。每孔加入300μl含3％(w/v)脱脂乳的PBS封闭液，37℃孵育1h；
(3)洗板，加入待检血清和阴性血清，每孔100μl。血清经1∶500稀释后加入，37℃孵育30min；
(4)洗板，加入1∶10000辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG抗体，100μl/孔，37℃孵育30min；
(5)洗板，加入TMB底物溶液显色，100μl/孔，37℃孵育15min；
(6)每孔加50μl 2N H2SO4终止反应；
(7)酶标仪测定OD450值。
二结果
多西紫杉醇和H1N1流感裂解病毒抗原混合注射比流感病毒抗原单独注射可以诱导出更高的抗流感病毒抗体(见图10)(P＜0.05)。
实例5冻融对紫杉醇、多西紫杉醇和氢氧化铝铝胶佐剂作用的影响
一、材料和方法
1.实验动物
雌性ICR小鼠32只，购自上海实验动物中心。
2.抗原
模式抗原卵清白蛋白(OVA)购自Sigma公司。OVA通过内毒素去除柱(Pierce公司)去除两次，除去内毒素，然后用BCA试剂盒法定量(Pierce公司)。
3.紫杉醇(Taxol)和多西紫杉醇(Docetaxel)
购于上海和氏璧生物技术有限公司(Shanghai Tauto Biotech Co.，Ltd.)
4.氢氧化铝铝胶
购于浙江万马有限公司.
5.试验疫苗制备
先将紫杉醇或多西紫杉醇溶解在无水乙醇中(40mg/ml)，OVA溶解在生理盐水中(0.25mg/ml)。向一试管内加入吐温-80(5％)、无水乙醇(5％)、OVA生理盐水溶液、生理盐水、紫杉醇或多西紫杉醇溶液或者氢氧化铝铝胶，使每100微升的实验疫苗中所含物质如表5所示。
表5各组实验疫苗所含成分(μg/100μl)
  组别   OVA   Taxol   Docetaxel   铝胶
  1   10   0   0   0
  2   10   100   0   0
  3   10   0   100   0
  4   10   0   0   200
6.实验疫苗的冻融
步骤5制备的实验疫苗在室温至-20℃反复冻融3次，备用。
7.免疫方法
32只小鼠随机分成4组，每组8只。每只小鼠每次皮下注射疫苗0.1ml，注射2次，间隔3周。佐剂及抗原剂量见表5。
8.血样采集
二免后2周采血。血样静置于4℃冰箱过夜，600g，离心，吸取血清，分装于0.2ml塑料离心管中，-80℃保存。
9.OVA特异性IgG的检测
IgM和IgG抗体效价检测步骤如下：
(1)用5μg/ml OVA(溶于碳酸盐缓冲液，pH 9.6)包被96孔聚酯板，置于4℃过夜。
(2)用PBST(含0.05％吐温-20的PBS)洗3次。
(3)用含5％小牛血清的PBS封闭96孔板1小时，PBST清洗3次。
(4)向孔内加入100μl血清(1∶100稀释)。
(5)将含上述血清的96孔板孵育1小时，再次用PBST洗三次。
(6)向孔内加入HRP标记的二抗(山羊抗鼠IgG或IgM，1∶5000)100μl，孵育1小时，用PBST洗三次。
(7)加入100μl TMB底物(Exalpha Biologicals，Inc)显色10-20分钟。
(8)最后用50μl的2M H2SO4终止显色反应，用酶标仪上在450nm处读取OD值。
(9)阳性滴度的终点为OD值高于同等稀释度的阴性血清(生理盐水组)平均值的2.1倍。
二、结果
以铝胶为佐剂的实验疫苗经三次冻融后免疫动物，IgG水平比未冻融铝胶组显著下降(P＜0.05)；而以紫杉醇或多西紫杉醇为佐剂的实验疫苗经三次冻融后免疫动物，IgG水平和未经作用未冻融紫杉醇或多西紫杉醇组比较，没有显著降低(P＞0.05)(见图10)。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.紫杉醇作为疫苗佐剂的应用。
2.多西紫杉醇作为疫苗佐剂的应用。
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