KR101152561B1 - 핵산 코팅된 입자 - Google Patents

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Abstract

입자 매개된 전달 기구로부터의 전달에 적합한 입자를 제공한다. 입자는 핵산 축합제 및 금속 이온 킬레이트화제의 존재하에 불활성 금속 담체 입자 상에 핵산을 침착시킴으로써 수득한다. 또한, 입자의 제조 방법 및 핵산 면역화 및 유전자 치료요법의 방법을 비롯한, 입자를 사용하는 치료 방법을 기재하고 있다.
입자 매개된 전달 기구, 핵산 축합제, 금속 이온 킬레이트화제, 불활성 금속 담체 입자, 유전자 치료요법

Description

핵산 코팅된 입자 {NUCLEIC ACID COATED PARTICLES}
본 발명은 무침 기구에 의한 핵산의 입자 매개된 전달에 적합한 핵산 코팅된 입자에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 포유동물 조직으로 핵산 분자를 생체내 및 생체외 전달하기 위한 상기 입자의 용도에 관한 것이다.
유전자 치료요법 및 핵산 면역화는 후천적 및 선천적 질병 둘 다의 치료 및 예방을 위한 유망한 접근법이다. 이들 기술은 목적하는 핵산을 후속적인 생체내 발현을 위해 대상체에게 전이시키는 것을 제공한다. 전이는 대상체의 세포 또는 조직을 생체외에서 형질감염시키고, 형질전환된 물질을 숙주로 재도입시킴으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 핵산은 생체내에서 수용자에게 직접 투여될 수 있다. 그러나, 생체내 전달 방법은 핵산이 발현될 수 있도록 핵산이 수용자의 세포로 들어 가게끔 해야 한다.
이와 관련하여 유전자 전달을 위한 수많은 방법이 개발되었다. 물론, 핵산의 경피 전달은 경구 또는 비경구 전달 기술에 비해 여러 이점을 제공한다. 특히, 경피 전달은 전통적인 투여 시스템에 비해 안전하고 편리하고 비침윤적이며, 경구 전달과 관련된 주요 문제점 (예를 들어, 가변적인 흡수율, 위에서의 분해 및 대사, 간에서의 초회 통과 효과, 위장 자극 및(또는) 쓰거나 불쾌한 약물 맛) 또는 비경 구 전달과 관련된 주요 문제점 (예를 들어, 주사바늘 통증, 처치된 개체로의 감염 도입의 위험, 주사바늘 사고에 의해 야기되는 의료 종사자의 오염 또는 감염의 위험, 및 사용된 주사의 폐기)을 편리하게 피할 수 있다.
그러나, 핵산의 경피 전달도 수많은 문제점을 내재하고 있다. 무손상 피부를 통한 수동적인 전달은 구조적으로 상이한 수많은 조직을 통한 분자의 수송을 수반한다. 이들 조직으로는 각질층 (주요 장벽), 살아있는 표피, 유두 진피, 또는 혈액 또는 림프계로 진입하기 위한 모세관 벽을 들 수 있다. 따라서, 경피 전달 시스템은 각각의 유형의 조직에 의해 나타나는 다양한 저항을 극복할 수 있어야 한다.
따라서, 수동적인 경피 전달에 대한 수많은 대안법들이 개발되었다. 이들 대안법으로는 피부 투과율을 증가시키기 위해 피부 침투 개선 제제 또는 "투과 개선제"를 이용하는 방법 뿐만 아니라, 이온이동, 전기충격 또는 초음파를 이용하는 것과 같은 비화학적인 방법이 포함된다. 그러나, 이들 대안적인 기술은 대개 피부 자극 또는 민감화와 같은 자체적인 부작용을 일으킨다.
최근, 핵산의 경피 전달에 적합한 입자 매개된 기술이 개발되었다. 관심있는 핵산을 보유한 입자를 입자 가속화 기구를 이용하여 고속으로 가속화시켜 표적 조직으로 발사한다. 생체내에서 상기 입자는 보유된 핵산을 세포에 흡수시킬 필요없이 수용자 세포에게 직접 발사된다.
입자 매개된 전달에 적합한 다양한 입자 가속화 기구가 당업계에 공지되어 있다. 현재 사용되는 기구들은 코팅된 담체 입자를 표적 세포를 향해 추진시키기 위해 폭발성, 전기성 또는 기상의 방출을 이용한다. 예를 들어, 바이오리스틱 (Biolistic(R)) 기구는 DNA-코팅된 초소형의 금 비드를 표피 세포로 직접 전달한다 (문헌 [Yang et al (1990) PNAS USA 87:9568-9572]). 또한, 미국 특허 제5,630,796호 (Bellhouse et al., "the PowderJect(R) needless syringe device")에 기재된 바와 같은 무침 주사기를 이용하여 입자를 전달할 수 있다.
입자 매개된 기구는 핵산을 안전하고 용이하게 전달하도록 의도된다. 그러나, 입자의 물리적 특성은 전형적으로 입자가 매우 고속으로 발사된다는 무침 투여의 요구를 충족하도록 조정되어야 한다. 입자는 주사기의 기체 분사, 또는 피부 또는 점막 조직과의 탄동적 충격과 같은 작용하에 생존할 수 있도록 구조적 일체성을 가져야 한다. 또한, 입자가 조직을 통과하기에 충분한 운동량을 달성할 수 있도록 하는 밀도를 갖는 것이 중요하다. 그러나, 핵산 전달의 경우에는, 입자가 세포를 파괴하지 않고 세포막을 통과할 수 있도록 세포 크기보다 작아야 한다. 핵산 자체는 보관시 분해되기 쉽다. 따라서, 핵산은 입자와 회합될 때 안정한 조건에서 유지되어야 한다. 그러나, 핵산과 입자의 회합은 또한 표적 세포로 핵산이 전달된 후 핵산의 효과적인 발현을 가능하게 해야 한다. 핵산이 항원을 코딩하는 경우, 입자 회합의 수단은 또한 대상체에서 항원의 면역 유발을 가능하게 해야 한다.
한 기술에 따르면, 입자 매개된 전달에 적합한 입자는 핵산 분자를 불활성 금속 담체 입자 상에 코팅함으로써 형성될 수 있다. 담체 입자는 텅스텐 또는 금과 같이 적합한 밀도 및 크기를 갖는 물질로부터 선택된다. DNA 또는 RNA를 금 또 는 텅스텐 입자 상에 코팅 또는 침착시키는 수많은 방법이 공지되어 있다. 일반적으로, 이들 방법에서는 소정량의 금 또는 텅스텐과 플라스미드 DNA, CaCl2 및 스퍼미딘을 조합한다. 생성된 용액을 코팅 절차 동안에 계속해서 와동시켜 반응 혼합물의 균일성을 보장한다. 핵산의 침착 후, 코팅된 입자를 적합한 막으로 전이시킬 수 있고, 사용 전에 건조시키거나, 샘플 모듈 또는 카셋트의 표면 상에 코팅시키거나, 사용을 위한 전달 카셋트, 특히 입자 매개된 전달 장치 상에 로딩할 수 있다.
<발명의 개요>
담체 입자에 부착된 핵산의 안정성을 최적화하여 입자의 수명 및 무손상 표적 세포에 전달되는 핵산의 양을 증진시킬 뿐만 아니라, 표적 세포에 전달시 핵산의 발현 및 생리학적 활성을 최적화시키는 신규한 제제를 개발하였다. 구체적으로, 핵산 축합제 및 금속 이온 킬레이트화제의 존재하에 핵산이 불활성 금속 담체 입자에 안정하게 부착될 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 핵산을 알칼리성이 아니라 중성 pH에서 담체 입자 상에 침착시켜, 핵산의 완전성을 보존하는 것을 도울 수 있다. 또한, 그 후 입자를 핵산의 손실없이 수성 또는 알콜성 용액으로 세척하여, 안정성 개선 제제의 도입을 용이하게 할 수 있다. 킬레이트화제의 화학 작용을 함께 이용하여 핵산을 축합시킴으로써 물리적 손상 및 화학적 손상 둘 다로부터, 예를 들어 자유 라디칼에 의한 산화 또는 엔도뉴클레아제에 의한 소화로부터 핵산을 보호한다. 본 발명의 입자는 효과적인 입자 매개된 전달에 의해 세포에 전달될 수 있다. 핵산 입자 회합의 안정성에도 불 구하고, 표적 세포에서 핵산이 효과적으로 발현된다는 것이 밝혀졌다. 또한, 항원을 코딩하는 핵산의 면역능도 입증되었다.
따라서, 본 발명은 핵산 축합제 및 금속 이온 킬레이트화제의 존재하에 불활성 금속 담체 입자 상에 핵산을 침착시킴으로써 수득되는, 입자 매개된 전달 기구로부터의 전달에 적합한 입자를 제공한다.
입자 제제는 입자 제조물 중에 1종 이상의 당 및(또는) 염을 이용함으로써 및(또는) 에탄올 또는 비타민 A, C 또는 E와 같은 항산화제로 입자를 처리함으로써 더욱 개선될 수 있다.
본 발명은 또한
- (i) 핵산 축합제 및 금속 이온 킬레이트화제의 존재하에 불활성 금속 담체 입자 상에 핵산을 침착시키는 단계; 및
(ii) 생성된 입자를 수집하는 단계를 포함하는, 입자 매개된 전달 기구로부터의 전달에 적합한 입자의 제조 방법;
- (a) 핵산 축합제 및 금속 이온 킬레이트화제의 존재하에 불활성 금속 담체 입자 상에 항원을 코딩하는 핵산을 침착시킴으로써 수득가능한, 입자 매개된 전달 기구로부터의 전달에 적합한 입자를 제공하는 단계; 및
(b) 유효량의 상기 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 핵산 면역화 방법;
- (a) 핵산 축합제 및 금속 이온 킬레이트화제의 존재하에 불활성 금속 담체 입자 상에 치료적 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 침착시킴으로써 수득가능한, 입자 매개된 전달 기구로부터의 전달에 적합한 입자를 제공하는 단계; 및
(b) 유효량의 상기 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 유전자 치료요법; 및
- 핵산; 금속 이온 킬레이트화제; 및 (i) 핵산 축합제, (ii) 1종 이상의 디사카라이드 및(또는) 트리사카라이드 당, 및 (iii) 1종 이상의 염 중 하나 이상을 표면에 갖는 불활성 금속 담체 입자를 포함하는, 입자 매개된 전달 기구로부터의 전달에 적합한 입자를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 입자를 함유하는, 입자 매개된 전달 기구를 위한 투여 용기 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 입자로 로딩된 입자 매개된 전달 기구를 제공한다.
본 발명의 이들 및 다른 목적, 측면, 실시양태 및 이점은 본원에 개시된 관점에서 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 잘 이해될 것이다.
본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 본 발명이 특정하게 예시된 분자 또는 방법 변수로 제한되지 않으며, 물론 이들 변수가 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어들은 단지 본 발명의 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이며 제한적으로 의도된 것이 아님을 이해해야 한다. 또한, 달리 언급하지 않는 한, 본 발명은 당 분야의 기술에 속하는 바이러스학, 미생물학, 분자생물학, 재조합 DNA 기술 및 면역학의 전형적인 방법을 이용하여 실시될 것이다. 이러한 기술들은 문헌을 통해 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)], [DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.)], [Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984)], [A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)] 및 [Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.)]을 참조한다.
본원에서 상기 또는 하기에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태의 표현은 달리 명확하게 설명하지 않는 한 복수 형태를 포함하는 것으로 이해해야 한다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 수많은 방법 및 물질이 본 발명의 실시에 이용될 수 있지만, 본원에서는 바람직한 물질 및 방법을 기재한다.
A. 정의
본 발명을 기재하는 데, 하기 용어들이 이용될 것이고, 이들 용어는 하기 지적한 바와 같이 정의되는 것으로 의도된다.
용어 "핵산 분자" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 호환적으로 사용되고, 임의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오티드 (데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드) 또는 그의 유사체를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 삼차원 구조를 가질 수 있고, 공지되거나 공지되지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예로는 유전자, 유전자 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 단리된 DNA, 임의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를 들 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 전형적으로 특정 서열의 4가지 뉴클레오티드 염기: 아데닌 (A); 시토신 (C); 구아닌 (G); 및 티민 (T) (폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우에는 티민 (T) 대신에 우라실 (U))으로 구성된다. 따라서, 용어 "핵산 서열"은 폴리뉴클레오티드 분자의 알파벳 표현이다. 이 알파벳 표현은 중앙 처리 장치를 가지며 기능적 게놈학 및 상동성 조사와 같은 생물 정보학적 용도에 사용되는 컴퓨터에 데이타베이스로 입력될 수 있다.
선택된 항원을 "코딩하는" 핵산 서열은 생체내에서 적절한 조절 서열의 제어하에 위치할 때 폴리펩티드로 (DNA의 경우) 전사 및 (mRNA의 경우) 번역되는 핵산 분자이다. 코딩 서열의 경계는 5' (아미노) 말단에서의 개시 코돈 및 3' (카르복시) 말단에서의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 본 발명의 목적을 위해, 이러한 핵산 서열로는 바이러스성 cDNA, 원핵세포성 또는 진핵세포성 mRNA, 바이러스성 또는 원핵세포성 DNA 또는 RNA로부터의 게놈 서열, 및 심지어 합성 DNA 서열을 들 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 번역 종결 서열은 코딩 서열에서 3'에 위치할 수 있다.
"벡터"는 핵산 서열을 표적 세포로 전이시킬 수 있다 (예를 들어, 바이러스성 벡터, 비-바이러스성 벡터, 입자성 담체, 및 리포솜). 전형적으로, "벡터 구조물", "발현 벡터" 및 "유전자 전이 벡터"는 관심있는 유전자의 발현을 지시할 수 있으며 유전자 서열을 표적 세포에 전이시킬 수 있는 임의의 핵산 구조물을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 클로닝 및 발현 비히클을 포함한다. "플라스미드"는 염색체외 유전자 요소 형태의 유전자 벡터이다.
"프로모터"는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시하고 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 프로모터는 유도성 프로모터 (프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 유도되는 경우), 억제성 프로모터 (프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 억제되는 경우), 및 구성 프로모터를 들 수 있다. 용어 "프로모터" 또는 "제어 요소"는 전장 프로모터 영역, 및 이들 영역의 기능적 (예를 들어, 전사 또는 번역의 제어) 세그먼트를 포함한다.
"작동가능하게 연결된"이란 이렇게 기재된 성분들이 그들의 통상적인 기능을 수행하도록 형상화된 요소들의 배열을 의미한다. 따라서, 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 주어진 프로모터는 적당한 효소가 존재하는 경우에 상기 서열의 발현을 초래할 수 있다. 프로모터는 서열의 발현을 지시하도록 기능하는 한, 서열에 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들면, 번역되지 않았으나 전사된 개재 서열은 프로모터 서열과 핵산 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 여겨질 수 있다.
"재조합"은 원래부터 또는 조작에 의해, 천연적으로 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 결합되지 않고(않거나) 천연적으로 연결된 것이 아닌 폴리뉴클레오티드에 연결된 게놈, cDNA, 반합성, 또는 합성 기원의 핵산 분자 (폴리뉴클레오티드)를 서술하기 위해 본원에 사용된다. 단일 재조합 핵산 분자 내에 함유된 2개의 핵산 서열이 보통 천연적으로 서로 결합되지 않은 경우, 이들은 서로에 대해 "이종성"이다.
"폴리펩티드"는 가장 넓은 의미로 2종 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체, 또는 다른 펩티드 모방체의 화합물을 의미하기 위해 사용된다. 상기 서브유닛은 펩티드 결합 또는 다른 결합, 예를 들어 에스테르, 에테르 등의 결합에 의해 연결될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 둘다, 및 아미노산 유사체 및 펩티드 모방체를 비롯한 천연 및(또는) 비천연 또는 합성 아미노산을 의미한다. 3개 이상의 아미노산의 펩티드는 펩티드 쇄가 짧다면 보통 올리고펩티드라고 지칭한다. 펩티드 쇄가 길다면, 펩티드는 전형적으로 폴리펩티드 또는 단백질이라고 지칭한다.
"항원"은 개체에서 면역학적 반응을 이끌어 낼 수 있는 임의의 작용제, 일반적으로는 거대분자를 의미한다. 상기 용어는 개개의 거대분자 또는 항원성 거대분자의 동종 또는 이종 집단을 의미하기 위해 사용할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "항원"은 일반적으로 1개 이상의 에피토프를 함유하는 단백질 분자 또는 그의 부분을 의미하기 위해 사용된다. 본 발명의 목적상, 항원은 적절한 공급원으로부터 얻거나 유래될 수 있다. 또한, 본 발명의 목적상, "항원"은 단백질이 충분한 면역원성을 유지하는 한, 천연 서열에 대해 변형된 단백질, 예를 들어 결실, 첨가 및 치환 (일반적으로는 본래 보존성임)된 단백질을 포함한다. 상기 변형은 예를 들어 부위-지시된 돌연변이유발을 통해 의도적일 수 있거나, 예를 들어 항원을 생산하는 숙주의 돌연변이를 통해 우발적일 수 있다.
관심 항원에 대한 "면역 반응"은 개체에서의 상기 항원에 대한 체액성 및(또는) 세포성 면역 반응의 발생이다. 본 발명의 목적상, "체액성 면역 반응"은 항체 분자에 의해 매개되는 면역 반응을 의미하는 반면, "세포성 면역 반응"은 T-림프구 및(또는) 다른 백혈구에 의해 매개되는 면역 반응이다.
용어 "핵산 면역화"는 항원 또는 항원들의 생체내 발현을 위해 하나 이상의 선택된 항원을 코딩하는 핵산 분자를 숙주 세포로 도입시키는 것을 의미하기 위해 본원에 사용된다. 핵산 분자는 경피적 입자 전달에 의해 수용 대상체로 직접 도입시킬 수 있다. 다르게는, 분자를 대상체로부터 제거해 놓은 세포로 생체외 도입시킬 수 있다. 후자의 경우, 관심 핵산 분자를 함유하는 세포를 대상체로 재도입시켜 핵산 분자에 의해 코딩된 항원에 대항하는 면역 반응을 개시할 수 있다. 이러한 면역화에 사용되는 핵산 분자를 본원에서는 일반적으로 "핵산 백신"이라 언급한다.
용어 "경피" 전달은 피내 (예컨대, 진피 또는 표피로), 경피 (예컨대, "피부경유의") 및 경점막 투여, 즉, 피부 또는 점막 조직으로의 또는 이를 통한 약제 통과에 의한 전달을 의미한다. 예를 들면, 문헌 [Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft and Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989)]; [Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications, Robinson and Lee (eds.), Marcel Dekker Inc., (1987)]; 및 [Transdermal Delivery of Drugs, Vols. 1-3, Kydonieus and Berner (eds.), CRC Press, (1987)]을 참조한다. 따라서, 상기 용어는 미국 특허 제5,630,796호에 기재된 바와 같은 무침 주사기로부터의 전달 뿐만 아니라 미국 특허 제5,865,796호에 기재된 바와 같은 입자 매개된 전달을 포함한다.
"무침 주사기"는 피부를 뚫는 통상적인 바늘을 이용하지 않고 미립자 조성물을 경피로 전달하는 기구를 의미한다. 본 발명에 사용하기 위한 무침 주사기는 본 문서 전반에 걸쳐 논의한다.
용어 "개체" 및 "대상체"는 인간 및 기타 영장류, 예를 들어 침팬지 및 기타 유인원 및 원숭이 종과 같은 비인간 영장류; 농용 동물, 예를 들어 소, 양, 돼지, 염소 및 말; 가정용 포유동물, 예를 들어 개 및 고양이; 실험실용 동물, 예를 들어 마우스, 래트 및 기니 피그와 같은 설치류; 조류, 예를 들어 가정용, 야생용 및 사냥새, 예를 들어 닭, 칠면조 및 기타 가금 조류, 오리, 거위 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 척색동물 아문의 임의의 구성원을 의미하기 위해, 본원에서 호환적으로 사용된다. 상기 용어는 특정한 연령을 나타내지 않는다. 따라서, 성인 및 신생 개체 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 이들 척추동물 모두의 면역계는 유사하게 작동하기 때문에, 본원에 기재된 방법은 상기 척추동물 종 중 임의의 동물에 사용하기 위한 것으로 의도된다.
B. 일반적 방법
본 발명은 핵산의 입자-매개 전달에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 입자 매개된 전달 기구로부터의 전달에 적합한 입자, 및 핵산 축합제 및 금속 이온 킬레이트화제의 존재하에서 불활성 금속 담체 입자 상에 핵산을 침착시키는 단계를 포함하는 방법, 또는 몇몇 실시양태에서 상기 단계로 본질적으로 이루어지는 방법으로 수득가능한 입자를 제공한다.
담체 입자는 입자 매개된 전달 기구로부터 세포내 전달시키기에 적합한 밀도 및 적합한 입자 크기를 갖는 금속으로부터 선택된다. 바람직하게는, 담체 입자 밀도는 약 15 내지 25 g/ml, 예를 들어 약 15 내지 23 g/ml 또는 약 16 내지 20 g/ml이다. 담체 입자의 직경은 약 0.5 내지 10 ㎛, 예를 들어 약 1 내지 5 ㎛일 수 있다. 담체 입자의 직경이 약 0.5 내지 3 ㎛, 예컨대 약 1 내지 3 ㎛ 또는 0.5 내지 2 ㎛인 것이 특히 바람직하다.
금속 담체 입자는 입자를 투여할 생체외 세포 또는 대상체의 신체 내에서 비반응성이라는 점에서 불활성이다. 전형적으로는 금, 텅스텐, 백금 또는 이리듐 담체 입자를 사용한다. 금 또는 텅스텐 입자가 바람직하다. 금 입자는 콜로이드성 금 입자일 수 있다. 금 입자는 크기면에서의 균일성 (입자 크기가 약 1 내지 3 ㎛인 알파 케미칼스(Alpha Chemicals) 제품 또는 0.95 ㎛를 포함하는 입자 크기 범위의, 미국 뉴저지주 사우쓰 플레인필드 소재의 데구사(Degussa) 제품) 및 감소된 독성을 제공한다. 미세결정 금 (예컨대, 미국 뉴저지주 이스트 뉴와크 소재의 엥겔하드 코퍼레이션(Engelhard Corp.) 제조의 금 분말 A1570)은 다양한 입자 크기 분포를 제공하며, 이는 전형적으로 약 0.1 내지 5 ㎛의 범위이다. 그러나, 미세결정 금의 불규칙한 표면적은 핵산으로의 고효율 코팅을 제공한다. 텅스텐 입자는 직경 약 0.5 내지 2 ㎛의 평균 크기로 쉽게 이용가능하다.
전형적으로 핵산 분자는 대상체로의 전달을 위한 치료적으로 관련된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 입자는 핵산 면역화 또는 유전자 치료요법에 사용하기에 적합한 것이 바람직하다. 따라서, 핵산은 대상체로 전달되었을 때 체액성 및(또는) 세포성 면역 반응을 이끌어 내는 면역성, 예를 들어 면역적 서열을 제공할 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 다르게는, 핵산은 원하는 생물학적 또는 치료적 효과 (예컨대, 항바이러스 기능)를 갖는 표적 세포 게놈 또는 비-천연 단백질로부터 결손 또는 분실된 치료적 폴리펩티드, 예컨대 단백질을 코딩하는 1개 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 핵산은 안티센스 또는 리보자임 기능이 있는 분자를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 유전자적 장애를 치료하기 위하여, 특정 장애에서 결함이 있는 것으로 알려진 유전자에 상응하는 기능적 유전자를 대상체로 투여할 수 있다. 상기 핵산은 DNA인 것이 바람직하다.
전달에 적합한 핵산은 염증성 질환, 자가면역, 만성 및 감염성 질환, 예를 들어 AIDS, 암, 신경계 질환, 심혈관계 질환, 고콜레스테롤증; 각종 혈액 장애, 예를 들어 각종 빈혈, 지중해빈혈 및 혈우병; 유전적 결손, 예를 들어 낭성 섬유증, 고쉐(Gaucher)병, 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍, 기종 등과 같은 장애의 치료를 위해 사용되는 핵산을 포함한다. 암 및 바이러스 질환에 대한 안티센스 치료법에 유용한 다수의 안티센스 올리고뉴클레오티드 (예컨대, mRNA의 번역 개시 부위 (AUG 코돈) 주위의 서열에 상보적인 짧은 올리고뉴클레오티드)가 당업계에 기재되어 있다. 예컨대, 문헌 [Han et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 4313]; [Uhlmann et al (1990) Chem. Rev. 90: 543], [Helene et al (1990) Biochim. Biophys. Acta. 1049: 99]; [Agarwal et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079]; 및 [Heikkila et al (1987) Nature 328: 445]을 참조한다. 본원에 사용하기에 적합한 다수의 리보자임이 또한 기재되어 있다. 예컨대, 문헌 [Chec et al (1992) J. Biol. Chem. 267: 17479] 및 골드버그(Goldberg) 등의 미국 특허 제5,225,347호를 참조한다.
예를 들어, 고형 종양의 치료를 위한 방법에서, 독성 펩티드 (즉, 리신, 디프테리아 독소 및 코브라 독액 요소와 같은 화학치료제)를 코딩하는 유전자, p53과 같은 종양 억제 유전자, 형질전환된 종양유전자에 대해 안티센스인 mRNA 서열을 코딩하는 유전자, 항신생물성 펩티드, 예를 들어 종양 괴사 인자 (TNF) 및 기타 사이토킨, 또는 형질전환된 종양유전자의 트랜스도미넌트 음성 돌연변이체를 종양 부위에서 또는 그 근처에서 발현시키기 위해 전달시킬 수 있다.
유사하게, 항바이러스 및(또는) 항박테리아 활성을 나타내거나 숙주의 면역계를 자극한다고 공지된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 투여할 수도 있다. 핵산은 인터류킨, 인터페론 및 콜로니 자극 인자와 같은 다양한 사이토킨 (또는 그의 기능적 단편) 중 하나를 코딩할 수 있다. 핵산은 진균; 바이러스, 예를 들어 인유두종 바이러스 (HPV), HIV, HSV2/HSV1, 인플루엔자 바이러스 (A, B 및 C형), 폴리오 바이러스, RSV 바이러스, 리노바이러스, 로타바이러스, 간염 A 바이러스, 노르웍 바이러스 군, 장내바이러스, 아스트로바이러스, 홍역 바이러스, 파르 인플루엔자 바이러스, 멈프스 바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, 거대세포바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 아데노바이러스, 풍진 바이러스, 인간 T-세포 림프종 I형 바이러스(HTLV-I), 간염 B 바이러스 (HBV), 간염 C 바이러스 (HCV), 간염 D 바이러스, 수두 바이러스, 마버그(Marburg) 및 에볼라(Ebola); 박테리아, 예를 들어 엠. 튜베르쿨로스시스(M. tuberculosis), 클라미디아(Chlamydia), 엔. 고노로에애(N. gonorrhoeae), 쉬겔라(Shigella), 살모넬라(Salmonella), 비브리오 콜레라(Vibrio Cholera), 트레포네마 팔리두아(Treponema pallidua), 슈도모나스(Pseudomonas), 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis), 브루셀라(Brucella), 프란시셀라 툴로렌시스(Franciscella tulorensis), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 렙토스프리아 인터로가우스(Leptospria interrogaus), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pnumophila), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 스트렙토코코스(Streptococcus) (A 및 B형), 뉴모코코스(Pneumococcus), 메닝고코코스(Meningococcus), 헤모필러스 인플루엔자(Hemophilus influenze) (b형), 톡소플라스마 곤디크(Toxoplama gondic), 콤플리박테리오시스(Complybacteriosis), 모락셀라 카타랄리스(Moraxella catarrhalis), 도노바노시스(Donovanosis), 및 악티노마이코시스(Actinomycosis); 진균성 병원체, 예를 들어 칸디다증 및 아스페르길루스증; 기생충 병원체, 예를 들어 촌충, 흡충, 회충, 아메바증, 편모충증, 크립토스포리디움, 주혈흡충, 폐포자충, 트리코모나스증 및 선모충증을 포함하나 이에 제한되지 않는 병원체에 의한 암, 알러지, 독성 및 감염을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 상태의 치료 또는 예방을 위한 항원을 코딩할 수 있다. 또한, 핵산을 사용하여 구제역, 코로나바이러스, 파스튜렐라 뮬토시다(Pasteurella multocida), 헬리코박터(Helicobacter), 스트롱길러스 불가리스(Strongylus vulgaris), 액티노바실러스 플류로뉴모니아(Actinobacillus pleuropneumonia), 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 이. 콜라이(E. coli), 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis), 보르데텔라 파라퍼투시스(Bordetella parapertussis) 및 보르데텔라 브로키셉티카(Bordetella brochiseptica)와 같은 수많은 수의학적 질환에 대항하는 적합한 면역 반응을 제공할 수 있다. 따라서 한 측면에서, 본 발명의 입자는 백신으로서의 용도를 발견할 수 있다.
또한, 본 발명은 안티센스 치료법에서의 용도, 예컨대, 특이적인 상보적 서열로 혼성화함으로써 이들 서열의 전사 및(또는) 번역을 억제할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 전달을 위한 용도를 발견할 것이다. 따라서, 특별한 질환의 진행에 필수적인 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 표적으로 함으로써 질환 과정을 방해할 수 있다. 안티센스 치료법, 및 질환-유발 유전자의 발현을 억제하거나 조절하기 위하여 특정 핵산 표적 서열에 특이적으로 및 예상대로 결합할 수 있는 수많은 올리고뉴클레오티드는 공지되어 있고, 당업자에게 쉽게 이용가능하다. [Uhlmann et al (1990) Chem Rev. 90: 543], [Neckers et al (1992) Int. Rev. Oncogenesis 3, 175]; [Simons et al (1992) Nature 359, 67]; [Bayever et al (1992) Antisense Res. Dev. 2: 109; Whitesell et al (1991) Antisense Res. Dev. 1: 343]; [Cook et al (1991) Anti-cancer Drug Design 6: 585]; [Eguchi et al (1991) Ann. Rev. Biochem. 60: 631]. 따라서, 본원에서는 안티센스 치료법에 사용하기 위해, 숙주 세포에서 표적 서열에 선택적으로 결합할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
전형적으로 핵산은 발현 벡터로서 제공된다. 이러한 발현 벡터는 분자 생물학 업계에서 통상적으로 구축될 수 있고, 예를 들면, 플라스미드 DNA 및 적절한 개시자, 프로모터, 인핸서 및 기타 요소, 예를 들어 삽입된 서열을 발현시키기 위하여 올바른 방향으로 배치되고 필수적일 수 있는 폴리아데닐화 신호의 사용과 연관될 수 있다. 적합한 벡터는 당업자에게 명백할 것이다. 이와 관련하여 추가로 예시하기 위해 문헌 [Sambrook et al. 1989]을 참조한다.
적합한 발현 벡터는 숙주 세포에 의한 폴리뉴클레오티드의 발현을 제공할 수 있는 제어 서열, 전형적으로는 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 발명에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 벡터는 유전자 치료요법 또는 핵산 면역화의 방법에 사용하기에 적합한 것이 바람직하다. 벡터를 생체외 사용하여 예를 들어 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있고, 그 후 이 숙주 세포를 대상체로 재도입시킨다. 다르게는, 벡터는 대상체로의 직접적인 전달을 위해 생체내 사용될 수 있다.
벡터는 전형적으로는 복제 기점을 제공하는 플라스미드, 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 임의로는 프로모터의 조절자이다. 벡터는 하나 이상의 선별가능한 마커 유전자, 예를 들어 암피실린 내성 유전자를 함유할 수 있다.
프로모터 및 기타 발현 조절 신호는 발현이 계획된 숙주 세포와 상용성이도록 선택된다. 유도성, 억제성 또는 다른 제어성 프로모터를 사용할 수 있다. 포유동물 숙주 또는 포유동물 숙주 세포에서의 발현을 위해, 진핵생물 및 파지 제어 요소를 둘다 사용할 수 있다.
적합한 포유동물 프로모터는 카드뮴과 같은 중금속 및 β-액틴 프로모터에 대한 반응에서 유도될 수 있는 메탈로티오네인 프로모터를 포함한다. 조직-특이적 프로모터가 특히 바람직하다. 적합한 바이러스 프로모터로는 예를 들어 몰로니(Moloney) 설치류 백혈병 바이러스 긴 말단 반복 (MMLV LTR), 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터, SV40 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스 (hCMV) 이미디어트 어얼리 (IE) 프로모터, 아데노바이러스, HSV 프로모터 (예를 들어 HSV IE 프로모터), 또는 HPV 프로모터, 특히 HPV 상류 조절 영역 (URR)이 포함된다. 이들 프로모터 모두 당업계에서 쉽게 구입가능하다.
전형적으로, 전사 종결 및 폴리아데닐화 서열은 또한 3'에서 각 번역 정지 코돈으로 위치하여 존재할 것이다. 바람직하게는, 5'에서 각 코딩 서열로 위치하는 번역 개시의 최적화를 위한 서열도 존재한다. 전사 종결/폴리아데닐화 신호의 예로는 문헌 [Sambrook et al.]에 기재된 바와 같은 SV40로부터 유래된 것 뿐만 아니라 소 성장 호르몬 종결 서열이 포함된다. 또한, 인핸서 요소는 발현 수준을 증가시키기 위해 포함될 수 있다. 적합한 인핸서의 예로는 SV40 어얼리 유전자 인핸서 [Dijkema et al (1985) EMBOJ. 4: 761], 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복 (LTR)으로부터 유래된 인핸서/프로모터 [Gorman et al (1982) Proc. Natl. Acad. Sci USA 79: 6777] 및 인간 또는 설치류 CMV로부터 유래된 요소 [Boshart et al (1985) Cell 41: 521], 예를 들어 CMV 인트론 A 서열에 포함되는 요소가 포함된다.
본 발명에 사용하기 위한 핵산 축합제는 더욱 치밀한 구조로 핵산을 축합시키기 위한 방법으로 핵산과 상호작용한다. 축합된 핵산은 전형적으로 비축합 형태보다 더욱 안정하며, 보통은 더욱 정돈된 구조, 예를 들어 환상면체 또는 막대 형태를 갖는다. 축합제는 전형적으로 그의 음전하와 반대작용하는 핵산과 정전적으로 상호작용하는 염기성 분자이다. 예를 들면, 효율적인 축합이 발생하기 위해서는 88 내지 90%의 전하 중성화가 요구된다고 보고되어 있다 [Deng H. and V. A. Bloomfield (1999) Biophys J 77:1556-61]. 보통, 축합제는 비교적 높은 친화성으로 핵산에 결합한다.
양이온성 중합체 및 다가 양이온을 비롯한 임의의 적합한 핵산 축합제를 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 축합제는 양이온성 중합체 또는 그의 생리학적으로 허용되는 염이다. 이러한 제약상 허용되는 염으로는 예를 들어, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트, 술페이트 등과 같은 무기산 염 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등과 같은 유기산 염이 포함된다. 전형적으로 염은 히드로클로라이드 또는 술페이트이다.
양이온성 중합체는 폴리아민인 것이 바람직하다. 사용할 수 있는 폴리아민으로는 프로타민, 푸트레신, 스퍼미딘, 스퍼민, 헥사디메트린 브로마이드 (폴리브렌(Polybrene) (등록상표)), 폴리아르기닌 및 폴리리신, 또는 이들의 생리학적으로 허용되는 염이 포함된다. 양이온성 중합체는 폴리아민을 함유하는 펩티드일 수 있다.
폴리아민은 염기성 아미노산의 양이온성 중합체인 것이 바람직하다. 전형적으로 염기성 아미노산은 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로부터 선택된다. 이러한 폴리아미노산은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 쉽게 구입가능하다.
폴리아미노산은 염기성 아미노산의 동종중합체, 예를 들어 폴리아르기닌, 폴리리신 또는 폴리히스티딘일 수 있다. 대안적으로, 폴리아미노산은 1종 이상의 염기성 아미노산의 중합체, 임의로는 1종 이상의 비-염기성 아미노산을 비롯한 아미노산의 중합체일 수 있다. 따라서, 폴리아미노산은 1종 이상의 염기성 아미노산, 및 임의로는 1종 이상의 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 공중합체는 통상적으로 염기성 아미노산을 과반수 이상 포함한다. 예를 들어, 공중합체의 아미노산 중 50 내지 100％가 염기성일 수 있다. 바람직하게는, 60 내지 90％ 또는 70 내지 80％가 염기성이다. 한 실시양태에서는, 공중합체의 아미노산 중 75％ 이상, 예를 들어 85％ 이상, 95％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상이 염기성이다. 일반적으로, 염기성 아미노산은 리신, 히스티딘 및 아르기닌 중 하나 이상을 포함한다. 공중합체가 1종 이상의 비-염기성 아미노산을 포함하는 경우, 이 비-염기성 아미노산은 산성 아미노산, 예컨대 아스파르트산 또는 글루탐산이 아닌 것이 바람직하다. 1종 이상의 비-염기성 아미노산은 지방족 또는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산, 예를 들어 트레오닌, 프롤린, 트립토판, 세린 또는 페닐알라닌을 포함할 수 있다.
임의의 상기 폴리아미노산에 존재하는 아미노산은 L-아미노산 또는 D-아미노산일 수 있다. 바람직하게는, L-아미노산이 사용된다.
바람직한 실시양태에서, 폴리아민은 아르기닌 (Arg)x 또는 리신 (Lys)x의 동종중합체이다. 폴리-L-아르기닌 또는 폴리-L-리신, 특히 폴리-L-아르기닌이 바람직하다. 통상적으로, 동종중합체의 분자량은 약 500 내지 15000, 예를 들어 500 내지 10000, 500 내지 5000, 또는 500 내지 1000이다. 한 실시양태에서, 상기 식 중 x는 2 내지 100, 예를 들어 2 내지 50, 2 내지 30 또는 2 내지 20의 범위일 수 있다.
작은 펩티드 동종중합체, 예를 들어 분자량이 500 내지 1500, 예컨대 500 내지 1250 또는 700 내지 1000의 범위인 동종중합체가 특히 바람직하다. 통상적으로, 작은 펩티드에서, x 값은 2 내지 10, 예를 들어 4 내지 8이다. x가 4 또는 6인 동종중합체, 예를 들어 (Arg)4 또는 (Arg)6이 본 발명에 특히 유용하다.
축합제는 단백질 프로타민 족의 구성원, 예를 들어 황산프로타민일 수 있다. 프로타민은 염기성 단백질로서, 정자 DNA에 히스티딘 대신 결합한다. 따라서, 정자 핵은 우수한 프로타민 공급원, 예를 들어 연어 정자로부터의 살민, 청어 정자로부터의 클루페인, 송어 정자로부터의 이리딘, 철갑상어 정자로부터의 스투린 및 고등어 정자로부터의 스콤브린을 제공한다. 프로타민, 황산프로타민, 인산프로타민 및 정자 핵은 시그마-알드리치사로부터 용이하게 입수할 수 있다.
다른 적합한 폴리아민, 예컨대 푸트레신(putrescine), 스퍼미딘(spermidine) 및 스퍼민(spermine)도 이들의 생리학상 허용되는 염과 함께, 예를 들어 시그마-알드리치사로부터 용이하게 입수할 수 있다.
또한, 축합제는 다가 양이온 또는 이들의 생리학상 허용되는 염을 포함할 수 있다. 상기 다가 양이온으로는, 예를 들어 헥사민 코발트(III) 클로라이드 (Cohex), 트리스(에틸렌디아민) 코발트(III) 클로라이드 (Coen) 및 코발트(III) 세풀크레이트 클로라이드 (Cosep)가 있다. 적합한 생리학적 염으로는 양이온성 중합체와 관련하여 상기 나열된 염들이 있다.
핵산 축합제를 동정하는 데 사용될 수 있는 다수의 시험이 당업계에 공지되어 있다. 변화가 축합 반응과 관련된 경우, 예를 들어 핵산이 고체로 밀집화되거나, 핵산 분자의 전하가 중성화되거나, 또는 엔도뉴클레아제 및 전사 인자와 같은 제제에 대해 미리 이용가능한 인식 부위가 모호화되거나 차단되는 경우, 상기 시험은 일반적으로 시험 핵산 분자의 특성 변화를 분석한다.
액체 핵산 제제화시 축합을 표지하는 분석으로는 전자 및 원자력 현미경 분석, 입자 크기 분석, 제타 포텐셜(zeta potential) 분석, 형광분광 분석, 에티듐 브로마이드 배제 분석, 겔 이동 분석, 원편광 이색성(circular dichroism) 분석 및 핵자기 공명 분석이 있으나, 이들로 한정되지는 않는다. 유용한 참조 문헌의 예로는 [J. Mol Biol (1978) 121, 311-326], [Biophysical Journal (1996), 70, 2847-2856], [Nucleic Acids Res (1999) 27 (8), 1943-1949], [J. Amer. Chem. Soc., (1998) 120 (35), 8903-8909], [J. Pharm Sci (1998) 87 (6), 678-683] 및 [Int. J. Pharm (2000) 210 (1-2), 97-107]가 있다.
본 발명에 사용하기 위한 킬레이트화제는 용액으로부터 금속 이온을 킬레이트화시킨다. 킬레이트화 반응에서 공통적으로 발생하는 금속 이온으로는 Fe2+, Fe3+, Cr3+, Ca2+ 및 Na+ 이온이 있다. 바람직하게는, 킬레이트화제는 Ca2+ 또는 Na+ 이온을 킬레이트화시킨다. 대안적으로, 킬레이트화제는 Fe2+ 또는 Fe3+ 이온을 킬레이트화시키는 것이 바람직하다. 이 킬레이트화제는 단일 자리 또는 여러 자리일 수 있다. 예를 들어, 적합한 킬레이트화제로는 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민 펜타-아세트산 (DTPA), 니트릴로트리아세트산 (NTA), 이노시톨 헥사포스페이트, 트리폴리포스페이트, 폴리인산, 숙신산나트륨, 숙신산칼륨, 숙신산리튬, 말산나트륨, 말산칼륨, 말산리튬, 데스페랄 및 에틸렌디아민-디(o-히드록시-페닐아세트)산 (EDDHA)이 있으나, 이들로 한정되지는 않는다. 통상적으로, EDTA, DTPA 또는 데스페랄, 특히 EDTA 또는 그의 염, 예를 들어 에데테이트 이나트륨이 사용된다.
또한, 1종 이상의 디사카라이드 및(또는) 트리사카라이드 당의 존재하에 핵산을 불활성 금속 담체 입자 상에 침착시키는 것이 바람직하다. 1종 이상의 당은 핵산/금속 입자의 안정성 증가를 보조한다.
적합한 당으로는 수크로스, 수크로스 모노라우레이트, 트레할로스, 락토스, 라피노스 및 만니톨이 있으나, 이들로 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 당은 트레할로스, 수크로스, 락토스 및 라피노스로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 1종 이상의 디사카라이드 또는 트리사카라이드 당의 블렌드가 사용된다. 예를 들어, 1종 이상의 상기 나열된 당의 블렌드가 사용될 수 있다. 수크로스/라피노스의 블렌드가 특히 바람직하다. 통상적으로, 수크로스/라피노스는 3:1 (중량:중량)의 비율로 블렌딩된다.
또한, 1종 이상의 염의 존재하에 핵산을 불활성 금속 담체 입자 상에 침착시킬 수 있다. 1종 이상의 염은 추가의 안정성을 더 제공한다. 염은 본 발명에 따라 킬레이트화제로서 사용될 수 있는 임의의 염이 아닌 다른 염이다. 따라서, 염은 일반적으로 비-킬레이트화 염으로 언급된다. 예를 들어, 염은 통상적으로 말산염 또는 숙신산염이 아니다. 또한, 염은 본 발명에 따라 핵산 축합제로서 사용될 수 있는 생리학상 허용되는 염이 아닌 다른 염이다.
바람직한 실시양태에서, 1종 이상의 염은 염화물, 아세트산염, 시트르산염, 질산염, 인산염 및 황산염으로부터 선택된다. 적합한 염으로는 아세트산칼륨, 염화칼슘, 염화리튬, 아세트산나트륨, 질산마그네슘, 시트르산나트륨, 인산나트륨, 염화나트륨, 황산나트륨 및 황산칼륨이 있으나, 이들로 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 염은 아세트산칼륨이다.
바람직한 실시양태에서, 입자를 보유하는 핵산을 항산화제, 예컨대 에탄올 또는 비타민 A, 비타민 C 또는 비타민 E와 접촉시킨다. 통상적으로, 입자를 항산화제로 처리하면 안정성이 증가한다. 통상적인 처리 방법은 입자를 항산화제로 세척하는 방법과 연관될 수 있다.
한 실시양태에서, 입자 제제에 사용되는 성분 중 하나 이상을 생성된 입자에 혼입하거나, 또는 생성된 입자와 결합시킨다. 따라서, 표면에 핵산이 존재하는 불활성 금속 담체 입자, 금속 이온 킬레이트화제, 및 (i) 핵산 축합제, (ii) 1종 이상의 디사카라이드 및(또는) 트리사카라이드 당 및 (iii) 1종 이상의 염 중 하나 이상을 포함하거나 때로는 본질적으로 상기 성분들로 이루어져 있으며, 입자-매개된 전달 기구로부터 전달하기 적합한 입자가 제공된다.
각각의 입자 성분은 상기 기재된 바와 같다. 바람직하게는, 입자는 적어도 (i) 및(또는) (ii)를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 입자의 제조 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 핵산 축합제 및 금속 이온 킬레이트화제의 존재하에 입자를 불활성 금속 담체 입자 상에 침착시키는 단계, 및 (ii) 생성된 입자를 수집하는 단계를 포함하거나, 또는 몇몇 실시양태에서는 본질적으로 단계 (i) 및 (ii)로 이루어져 있다.
통상적으로, 단계 (i)은 핵산 축합제 및 금속 이온 킬레이트화제의 존재하에 핵산을 혼합에 의해 불활성 금속 담체 입자와 접촉시키는 것을 포함한다. 접촉 절차 동안 혼합물을 계속 와동시켜 반응 혼합물을 균일하게 만드는 것이 바람직할 수 있다. 축합이 일어나는 시점까지, 예를 들어 담체 입자 및 킬레이트화제도 존재할 때까지 핵산 및 핵산 축합제는 (예를 들어, 개별 용액 중에) 서로 분리되어 있는 것이 바람직하다. 이미 담체 입자 및 핵산을 포함하는 혼합물에 축합제를 첨가하여 핵산이 조기에 침착되는 것을 방지하는 것이 특히 바람직하다. 이어서, 금속 이온 킬레이트화제는 축합제 제제와, 담체 입자 및 핵산의 혼합물 중 어느 하나 또는 둘 모두에 존재할 수 있다. 축합제는 단계식으로 첨가, 예를 들어, 적가될 수 있다.
대안적으로, 축합제와 담체 입자의 혼합물을 핵산 제제와 혼합할 수 있다.
금속 입자, 핵산, 핵산 축합제 및 킬레이트화제는 상기 기재되어 있다.
침착 단계에서의 혼합물은 1종 이상의 디사카라이드 및(또는) 트리사카라이드 당, 예를 들어 수크로스, 수크로스 모노라우레이트, 트레할로스, 락토스, 라피노스 또는 만니톨, 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 당은 트레할로스, 수크로스, 락토스 및 라피노스, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 1종 이상의 디사카라이드 및(또는) 트리사카라이드 당의 블렌드가 사용될 수 있다. 예를 들어, 1종 이상의 상기 당의 블렌드가 사용될 수 있다. 수크로스:라피노스의 블렌드, 특히 3:1 (중량:중량)의 비율로 블렌딩된 블렌드가 특히 유용하다.
침착 혼합물은 또한 1종 이상의 염을 포함할 수 있다. 염은 본 발명에 따라 킬레이트화제로서 사용될 수 있는 임의의 염 이외의 것이다. 따라서, 염은 일반적으로 비-킬레이트화 염으로 언급된다. 예를 들어, 염은 통상적으로 말산염 또는 숙신산염이 아니다. 또한, 염은 본 발명에 따라 핵산 축합제로서 사용될 수 있는 생리학상 허용되는 염이 아닌 다른 염이다.
바람직한 실시양태에서, 1종 이상의 염은 염화물, 아세트산염, 시트르산염, 질산염, 인산염 및 황산염으로부터 선택된다. 적합한 염으로는 아세트산칼륨, 염화칼슘, 염화리튬, 아세트산나트륨, 질산마그네슘, 시트르산나트륨, 인산나트륨, 염화나트륨, 황산나트륨 및 황산칼륨이 있으나, 이들로 한정되지는 않는다. 통상적으로, 염은 인산알루미늄이 아니다. 바람직하게는, 염은 아세트산칼륨이다.
당 및(또는) 염은 혼합될 초기 제제, 예를 들어 축합제 제제, 또는 담체 입자/핵산 제제 중 어느 하나 또는 둘 모두에 존재할 수 있다.
한 실시양태에서, 핵산 축합제, 당 및 금속 이온 킬레이트화제를 미리 결정된 양으로 포함하는 용액을 금속 담체 입자, 핵산, 당 및 금속 이온 킬레이트화제를 미리 결정된 양으로 포함하는 용액에 적가한다. 염은 상기 두 가지 용액 중 어느 하나, 또는 둘 모두에 존재할 수 있다.
단계 (i)에서 성분의 농도는 생성된 입자 중 핵산의 안정성에 실질적으로 영향을 끼치지 않으면서 달라질 수 있다. 금속 담체 입자는 임의의 적합한 양으로, 예를 들어 0.1 내지 100 mg/ml, 예컨대 0.1 내지 10 mg/ml 또는 1 내지 10 mg/ml의 현탁액으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 핵산 농도는 0.01 내지 10 mg/ml, 예컨대 0.1 내지 1 mg/ml이다. 통상적으로, 축합제의 농도는 0.1 내지 10 mg/ml, 예를 들어 0.1 내지 1 mg/ml이다. 바람직하게는, 금속 이온 킬레이트화제의 농도는 0.1 mM 내지 1 M, 예컨대 1 mM 내지 0.1 M, 예를 들어 10 내지 50 mM이다. 존재하는 경우, 당의 농도는 예를 들어 0.1 mg/ml 내지 1 g/ml, 바람직하게는 1 mg/ml 내지 0.1 g/ml, 예를 들어 10 내지 50 mg/ml일 수 있다. 존재하는 경우, 염의 농도는 통상적으로 0.1 mM 내지 1 M, 예를 들어 1 mM 내지 0.1 M, 예컨대 10 내지 50 mM이다.
본 발명의 방법은 핵산 입자를 항산화제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, 이 처리 방법은 입자를 항산화제의 용액으로 세척하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 에탄올을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 에탄올은 수크로스 포화된 것이다. 다른 적합한 항산화제로는 비타민 A, 비타민 C 및 비타민 E가 있다. 또한, 또는 대안적으로, 핵산 입자를 수용액 또는 알콜성 용액, 예컨대 물 또는 이소프로판올로 1회 이상 세척할 수 있다.
코팅된, 임의로는 세척된 입자는 적합한 막으로 수송되어 사용하기 전에 건조되거나, 샘플 모듈 또는 카세트의 표면 상에 코팅되거나, 또는 특정 입자-매개된 전달 기기에 사용하기 위한 전달 카세트에 로딩될 수 있다. 임의의 적합한 건조 방법이 사용될 수 있다. 질소 스트림하에 건조시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 입자는 단일 단위 투여 또는 다중투여 용기에 포장될 수 있다. 상기 용기는 적합한 양의 입자를 포함하는 밀폐 용기를 포함할 수 있다. 입자는 멸균 제제로 포장될 수 있으며, 이에 따라 밀폐 용기는 대상체로 전달하는 데 사용될 때까지 제제의 멸균 상태를 보존하도록 설계될 수 있다. 용기는 입자-매개된 전달 기구에 직접 사용하도록 개조되는 것이 바람직하다. 통상적으로, 상기 용기는 캡슐, 호일 파우치, 샤세, 카세트 등의 형태를 갖는다. 또한, 입자 전달 기구는 코팅된 입자가 적합한 투여량으로 함유되도록 미리 설정된 상태로 제공될 수 있다. 이어서, 미리 설치된 기구는 밀폐 용기에 미리 포장될 수도 있다.
입자가 포장되어 있는 용기를 추가로 표지하여 조성물을 확인하고 관련 투여 정보를 제공할 수 있다. 또한, 용기는 정부 관청, 예컨대 식약청(Food and Drug Administration)에 의해 규정된 형태의 통지서(용기에 함유된 인간 투여용 핵산 제제의 제조, 용도 또는 판매에 관한 연방법하에 관청으로부터 받은 승인을 표시함)으로 표지할 수 있다.
입자-매개된 전달에 적합한 입자 가속화 기구가 당업계에 공지되어 있다. 최신 유전자 총 기구는 폭발성, 전자성 또는 기체성 방출법을 이용하여 코팅된 담체 입자를 표적 세포를 향해 추진시킨다. 코팅된 담체 입자는 이동가능한 담체 시트에 방출가능하게 부착되거나, 또는 기체 스트림이 통과하는 표면에 제거가능하게 부착되어 표면으로부터 입자를 들어올려 이들을 표적을 향해 가속화시킬 수 있다. 기체성 방출 기구의 예가 미국 특허 제5,204,253호에 기재되어 있다. 폭발성-유형의 기구가 미국 특허 제4,945,050호에 기재되어 있다. 본원에 사용하기 적합한 전자성 방출 장치의 한 예가 미국 특허 제5,120,657호에 기재되어 있다. 다른 전자성 방출 장치가 미국 특허 제5,149,655호에 기재되어 있다. 상기 모든 특허의 개시내용은 그 전문이 본원에 참고문헌으로 인용되어 있다.
본 발명의 코팅된 입자는 또한 벨하우스(Bellhouse) 등의 미국 특허 제5,630,796호에 기재된 기구("파우더젝트(등록상표; PowderJect(R)) 무침 주사 기구") 및 국제 공개번호 WO 94/24263호, WO 96/04947호, WO 96/12513호 및 WO 96/20022호에 기재된 기구와 같은 무침 주사 기구를 이용하여 투여될 수 있다(상기 문헌은 모두 본원에 참고문헌으로 인용되어 있음).
미국 특허 제5,630,796호에 기재된 것과 같은 기구는 상부로부터 하부까지 기체 실린더, 입자 카세트 또는 패키지 및 관련 소음기 매질이 포함된 초음속 노즐이 일렬로 장착된 펜-형태(pen-shape)의 기기로서 제공될 수 있다. 입자는 적합한 용기, 예를 들어 워셔(washer)-형태의 스페이서로 열-밀봉되어 자가-함유 밀봉 단위를 형성하는 2개의 단절가능한 중합체 막에 의해 형성된 카세트에 제공된다. 막 재료는 특정 개방 방법 및 초음속 유동이 개시될 때의 조건을 지시하는 파열압이 달성되도록 선택될 수 있다.
기기 작동시, 기구를 작동시켜 압축 기체를 실린더로부터 기구 안의 확장 챔버로 방출시킨다. 방출된 기체는 입자 카세트와 접촉하고, 충분한 압력이 축적되면 후속 전달을 위한 초음속 노즐로 입자를 회전시키는 카세트 막을 순간적으로 관통한다. 노즐은, 특정 기체 속도 및 유동 패턴을 달성하여 소정의 입자가 미리 지정된 영역의 표적 표면으로 전달되도록 설계된다. 소음기는 초음속 기류에 의해 발생하는 소음을 경감시키기 위해 사용된다.
국제 공개번호 WO 96/20022호에 기재된 전달 시스템은 또한 압축 기체 공급원의 에너지를 이용하여 분말 조성물을 가속화시키고 전달한다. 그러나, 이 시스템은 기류 대신 충격파를 이용하여 입자를 가속시키는 미국 특허 제5,630,796호의 시스템과는 구별된다. 보다 구체적으로, 신축성 돔 뒤에 발생한 충격파에 의해 순간적으로 상승된 압력이 돔의 후면에 충격을 가하여 신축성 돔이 표적 표면 방향으로 갑작스럽게 외번(eversion)된다. 이러한 갑작스러운 외번은 표적 조직, 예를 들어 경구 점막 조직을 관통하는 데 충분한 속도, 즉 운동량으로 분말 조성물(돔의 외부에 위치함)을 사출시킨다. 분말 조성물은 돔이 완전하게 외번된 시점에서 방출된다. 또한, 돔은 고압 기류를 완전하게 함유하여 조직과 접촉하지 않도록 하기 위해 이용된다. 이 시스템은 상기 전달 작동 과정 동안에 기체가 방출되지 않기 때문에 원래 조용하다. 이러한 설계는 예를 들어 입자를 최소한으로 침윤성 수술 부위로 전달하기 위해 다른 폐쇄성 또는 다른 민감성 적용법에 이용될 수 있다.
본 발명의 코팅된 입자는 대상체로 직접 생체내 전달되거나, 또는 대상체로부터 추출한 세포로 생체외 전달될 수 있으며, 이 때, 형질전환된 세포는 나중에 대상체에 다시 주입된다. 생체내 전달의 경우, 입자는 통상적으로 피하, 상피, 피내, 점막내 (예를 들어, 비강, 직장 및(또는) 질부), 복막내, 정맥내, 경구 또는 근육내 경로로 주입된다. 입자는 최종 분화된 세포로 전달되는 것이 바람직하지만, 비-분화된 세포, 또는 부분적으로 분화된 세포, 예컨대 혈액 줄기 세포 및 피부 섬유아세포로 전달될 수도 있다. 입자가 피부 상피 세포로 전달되는 것이 가장 바람직하다.
코팅된 입자는 투여 제제와 상용성인 방법에 의해 예방학상 및(또는) 치료학상 유효한 양으로 대상체에게 투여된다. 본 발명 입자 조성물의 "치료학상 유효량"은 질병 또는 상태 증상을 치료하거나 예방하기에 충분할 것이며, 통상적인 시험에 의해 측정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 포함될 것이다. 일반적으로, 입자는 0.001 내지 1000 ㎍ 핵산/투여량, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10.0 ㎍ 핵산/투여량의 양으로 전달된다. 그러나, 정확한 요구량은 치료될 개체의 연령 및 일반적인 증상, 및 선택된 특정 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라 다른 인자에 따라 달라질 것이다. 적절한 유효량은 임상 시험을 통해 용이하게 결정될 수 있다. 문헌 [Physicians Desk Reference] 및 [Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics]은 요구량을 결정하는 목적에 유용하다.
C. 실험
하기는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 구체적인 실시양태의 실시예이다. 실시예는 단지 예시적 목적을 위해 제공되며, 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니다. 사용된 숫자 (예를 들어, 양, 온도 등)에 대해 정확성을 확보하려는 노력을 하였으나, 일부 실험 에러 및 편차는 당연히 허용해야 할 것이다.
실시예 1
3개의 DNA/금 입자 제제, 즉 "DSEP" (실험 A), "폴리 Arg" (실험 B) 및 "개질된 스퍼미딘" (실험 C) 중에서 각종 당, 킬레이트화제 및 기타 부형제/첨가제의 효과를 평가하기 위해 일련의 실험을 수행하였다.
다양한 입자를 하나 이상의 하기 기준에 따라 평가하였다:
(i) 입자 상의 DNA 수율을 용출 및 A260에서의 분광광도측정법, 또는 형광법으로 측정하였다;
(ii) 입자 상의 DNA의 물리적 안정성을 겔 분석 또는 HPLC에 의해 평가하였다;
(iii) 입자의 응집을 광학 현미경 또는 겔을 통한 이동도에 의해 평가하였다;
(iv) CHO 세포에서 루시페라제 리포터 유전자의 발현을 측정하고, 이어서 상기 유전자가 함유된 입자를 세포에 도입함으로써 의해 입자 상의 DNA 발현 활성을 평가하였다;
(v) 항체가 특이적으로 결합하는 항원을 코딩하는 DNA를 함유하는 입자로 백신 접종시킨 마우스의 혈청에서 항체 역가를 측정함으로써 입자의 면역능을 평가하였다.
각각의 제제에 대해, 입자를 상기 기준에 따라 등급을 매겼다.
실험 A: DSEP 제제
하기 식에 따른 입자를 제조하였다:
금 입자-DNA-당-염-기타
시험한 당은 수크로스 모노라우레이트, 만니톨 트레할로스, 락토스, 라피노스 및 수크로스 모노카프레이트로부터 선택하였다. 시험한 염은 아세트산칼륨, 염화칼슘, 염화리튬, 아세트산나트륨, 질산마그네슘, 시트르산나트륨, 인산나트륨, 인산알루미늄, 염화나트륨, 황산나트륨 및 염화마그네슘으로부터 선택하였다.
하기 열거된 바와 같이 당과 염의 다양한 조합을 사용하였다. 수크로스 포화 에탄올로 세척한 효과도 또한 평가하였다.
결과는, 각각의 기준에 대해 가장 효과적이거나 바람직한 것으로부터 가장 덜 효과적인 것의 순으로 각종 당 또는 염을 하기에 나타냈다. 예를 들어, DNA 수율에 대해 최상위 등급의 당은 상대적으로 높은 DNA 수율을 나타냈다; 응집에 대해 최상위 등급의 당은 상대적으로 낮은 응집의 수준을 나타냈다
(i) 입자 상의 DNA 수율
당: 수크로스-수크로스
모노라우레이트～트레할로스～락토스～라피노스 ＞＞＞ 수크로스 모노카프레이트 (수율 0)
염: 아세트산칼륨～염화칼슘～염화리튬～아세트산나트륨～질산마그네슘 ＞ 시트르산나트륨～인산나트륨 ＞＞＞ 인산알루미늄
기타: 수크로스 포화 에탄올로의 세척은 금 분말로부터 DNA를 제거하지 않는다.
염이 전혀 존재하지 않으면 수율이 매우 낮아졌다.
(ii) 입자 상의 DNA의 물리적 안정성
당: 수크로스 ＞ 트레할로스 ＞ 만니톨～락토스～라피노스 ＞ 수크로스 모노라우레이트 ＞ 수크로스 모노카프레이트
염: 아세트산칼륨～아세트산나트륨～시트르산나트륨～인산나트륨 ＞ 염화나트륨 ＞ 황산나트륨 ＞ 염화리튬
기타: 수크로스 포화 에탄올로의 세척은 안정성에 기여하였다.
인산알루미늄은 침착을 방지하였다.
(iii) 응집
당: 수크로스 모노카프레이트 < 라피노스～락토스～수크로스 모노라우레이트 < 수크로스～트레할로스
염: 아세트산칼륨～염화리튬～인산나트륨～시트르산나트륨～염화나트륨～황산나트륨 < 염화칼슘～염화마그네슘 < 질산마그네슘
(iv) 입자 상의 DNA의 발현 활성
수크로스/아세트산나트륨～아세트산칼륨/라피노스～수크로스/질산마그네슘～아세트산칼륨/수크로스 모노라우레이트
(v) 마우스 면역능
실온에 저장한 실시간 숙성 배합물에 대해:
수크로스/아세트산나트륨～스퍼미딘/CaCl2 핵산 입자 (3개월)
라피노스/아세트산칼륨～수크로스 모노라우레이트/아세트산칼륨～스퍼미딘/CaCl2 핵산 입자 (1개월)
실험 B: 폴리 Arg 제제
하기 식에 따른 입자를 제조하였다:
금 입자-DNA-당-킬레이트화제-폴리아르기닌 펩티드.
시험한 당은 트레할로스, 수크로스 및 라피노스로부터 선택하였다. 시험하는 킬레이트화제는 EDTA, DTPA 및 데스페랄(DFO)로부터 선택하였다. 시험하는 폴리아르기닌 펩티드는 13000 Mw 폴리아르기닌, (Arg)6 및 (Arg)4로부터 선택하였다. 당, 킬레이트화제 및 폴리아르기닌의 다양한 조합을 시험하였다.
결과를, 다시 가장 바람직한 성분에서 가장 덜 바람직하거나 덜 효과적인 등급 순으로 하기에 나타냈다.
(i) 입자 상의 DNA 수율
시험한 당: 트레할로스, 수크로스, 라피노스
킬레이트화제: EDTA, DTPA, 데스페랄 (DFO)
기타: 폴리-Arg 펩티드 (13,000 Mw, (Arg)6, (Arg)4 중 하나)
상기의 모든 조합에 대한 수율은 이론적 수율의 50％를 초과하였다.
(ii) 입자 상의 DNA의 물리적 안정성
당: 수크로스 ＞ 트레할로스 ＞ 라피노스
킬레이트화제: EDTA ＞ DTPA ＞ 데스페랄 (DFO)
기타: 모든 폴리-Arg 펩티드는 유사한 안정성을 나타냈다.
(iii) 응집
이 제제에 대해서 응집이 문제되지 않았다.
(iv) 입자 상의 DNA의 발현 활성
트레할로스/EDTA/(Arg)4 ～ 트레할로스/DTPA/(Arg)4.
DNA, 금 입자 및 스퍼미딘을 사용하여 제조한 입자는 이들 제제와 유사한 수준의 발현 활성을 나타냈다.
(v) 마우스 면역능
수크로스/EDTA/(Arg)4 ＞ 트레할로스/EDTA/(Arg)4～트레할로스/DTPA/ (Arg)4～수크로스/DTPA/(Arg)4
DNA, CaCl2 금 입자 및 스퍼미딘으로 제조한 입자는 트레할로스/EDTA/(Arg)4 입자와 유사한 면역능을 나타냈다.
실험 C: 개질된 스퍼미딘 제제
하기 식에 따른 입자를 제조하였다:
금 입자-DNA-스퍼미딘-당-염-기타.
시험한 당은 수크로스, 트레할로스 및 라피노스로부터 선택하였다. 시험한 염은 염화마그네슘, 질산마그네슘, 염화칼슘, 황산나트륨, 황산칼륨 및 브롬화나트륨으로부터 선택하였다.
스퍼미딘 농도의 효과, 및 특정 물/에탄올 용액으로의 입자 처리 효과도 또한 시험하였다.
결과를 하기에 나타냈다.
(i) 입자 상의 DNA 수율
당: 라피노스 ＞ 트레할로스 ＞ 수크로스
염: MgCl2～MgN03～CaCl2 ＞ 황산나트륨～황산칼륨～브롬화나트륨
기타: 스퍼미딘 농도 및 알콜/물 ％도 또한 수율에 영향을 끼쳤다.
(ii) 입자 상의 DNA의 물리적 안정성
당: 라피노스 ＞ 트레할로스 ＞ 수크로스
염: MgCl2 ＞ MgNO3 ＞ CaCl2 ＞ 황산나트륨～황산칼륨～브롬화나트륨
(iii) 응집
이 제제에 대해서는 응집이 문제되지 않았다.
실시예 2: 각종 DNA-코팅된 입자의 안정성 연구
다양한 비율의 황산프로타민, EDTA, 물, 및 트레할로스, 수크로스 또는 락토스 중 하나를 사용하여 코팅된 입자를 제조하였다. 표 1에 10개의 배합물로 열거된 바와 같이, 10가지 상이한 비율에 따라 입자를 제조하였다. 각각의 비율에 따라 제조한 입자의 안정성을 4 ℃ 및 60 ℃에서, 0일, 7일, 14일의 시점에 시험하였다.
방법
각각의 비율에 대해, 튜브 A 및 B를 표 1에 따라 준비하였다. 튜브 A 및 B의 내용물을 고속에서 10초 동안, 또는 각각의 용액이 잘 혼합될 때가지 와동시켰다. 튜브 A를 중간 속도에서 와동시키면서, 5 ml 피펫맨을 이용하여 튜브 B의 내용물을 적가하였다. 튜브 A를 추가 15초 동안 와동시키고, 이어서 내용물을 5분 동안 정치시켰다. 튜브 A의 상층액을 제거하고, 잔류 펠렛을 1 ml의 100％ 이소프로판올로 1회 세척하였다. 상기 튜브의 내용물을 와동시키고, 펠렛화시켰다. 이소프로판올을 제거하고, 펠렛을 질소 기류로 건조시켜 분말이 되게 하였다.
각각의 입자 제제 3 내지 5 mg을 칭량하여 1.5 ml 마이크로원심분리 튜브에 넣고 4 ℃ 또는 60 ℃에서 인큐베이션하였다. 각각의 입자 제제에서 DNA의 안정성을 0일, 7일, 14일의 시점에 아가로스 겔 전기영동 및 HPLC로 시험하였다.
결과
입자 제제는 시험 전반에 걸쳐 유사한 안정성을 나타냈다. "비율 4" (표1의 배합물 4)에 따라 제조한 입자를 선택하여 다음 작업을 수행하였다.
Figure 112005015857465-pct00001
실시예 3: "비율 4" (식 4)에 따라 제조한 입자에 기초한 추가 안정성 연구
대규모 (350 mg 금 입자)로 제조하고,
(a) 디사카라이드 부재 (대조군); 또는
(b) 트레할로스; 또는
(c) 수크로스; 또는
(d) 락토스
중 어느 하나를 사용하였다는 점을 제외하고는 실시예 2에서와 같이 표 1의 비율 4에 따라 입자를 제조하였다.
상기 입자를 4 ℃ 및 60 ℃에서 인큐베이션하고, 입자 상의 DNA의 안정성을 8주 후에 아가로스 겔 전기영동으로 평가하였다.
실시예 4: 테트라아르기닌 제제의 개발
다양한 길이의 폴리아르기닌이 DNA를 금 미세입자 상에 침착시킬 수 있음을 입증하기 위해 몇가지 배합물을 시험해 본 후, 수율 및 안정성 연구에 의해 어떤 길이의 폴리아르기닌을 사용할지 조사하는 실험을 설계하였다. 또한, 이전의 배합물에서 안정성을 증대시키는 것으로 나타난 당 및 킬레이트화제의 선택에 대해서도 조사하였다.
그 결과, 4개 및 6개 단량체의 폴리아르기닌이, 안정성에 있어서는 13000 분자량의 중합체 (약 80개 단량체)보다 우수한 것으로 나타났다. 연구된 당 및 킬레이트화제를 비교하였다. 트레할로스 및 수크로스 둘다는 우수한 당이었다. EDTA 및 DTPA 둘다는 우수한 킬레이트화제였다. 6량체보다 DNA와의 해리가 더 신속할 뿐만 아니라 분해 산물이 더 적게 형성되기 때문에 아르기닌 4량체를 선택하였다. 추가의 연구를 위해 생성된 배합물을 TA101.1 (DNA, 수크로스, EDTA), TA101.2 (DNA, 수크로스, DTPA), TA101.3 (DNA, 트레할로스, EDTA), TA101.4 (DNA, 트레할로스, DTPA)로 명명하였다.
이들 4가지 배합물을 장기간의 안정성을 위해 위치시키고, 각각의 기타 물질 및 스퍼미딘/CaCl2 대조군 (여기서, 금 미세입자 상에 DNA를 침착시키기 위해 스퍼미딘 및 염화칼슘이 사용됨)에 대하여 4 ℃, 25 ℃ 및 40 ℃에서 연구하였다. 이들의 안정성을 표 2에 나타냈다. 또한, 이들 배합물을 마우스 연구 및 루시페라제 발현 실험 (DNA에 의해 코딩된 루시페라제)에서 생물학적 활성에 대해 시험하였다.
Figure 112005015857465-pct00002
이들 활성 실험은, 101 시리즈가 모두 활성적이고, 발현되며, 스퍼미딘/CaCl2와 거의 동일함을 나타냈다. 배합물 TA101.1 및 TA101.3의 안정성은 TA101.2 및 TA101.4보다 더 우수하였다. 이는 킬레이트화제 EDTA가 DTPA보다 더 안정함을 나타내지만, 이들 분말로 제제화시켰을 때 트레할로스 (3 및 4)와 수크로스 (1 및 2)간의 차이는 거의 없었다. 테트라아르기닌 배합물의 101 시리즈를 이루는 배합물의 조성을 표 3에 나타냈다.
Figure 112005015857465-pct00003
이어서, 포화 수준의 트레할로스 및 EDTA를 제제 환경으로 사용한 2종의 실험을 수행하였다. 이러한 스크린과 함께, 에탄올 수준을 배수로 하였다. 이러한 제제들은 거의 포화된 용액이 더 많은 안정화제를 금 상에 침착시킬 수 있다는 아이디어를 이용하였다. 에탄올 백분율을 변화시킴으로써 상이한 물 수준 및 밀도로 배합물을 제조할 수 있었다. 이러한 환경에서 제조된 배합물은 101 시리즈의 배합물보다 더 안정한 것으로 보였다.
에탄올, EDTA, 트레할로스 및 테트라아르기닌 수준의 최적화를 다루기 위해 고안된 실험을 이어서 개시하였다. 이러한 실험은 4종의 성분 (테트라아르기닌, EtOH, EDTA, 트레할로스)을 특정 범위 내의 5가지 수준에 걸쳐 변화시키는 고안 하에 수행하였다. 10％ 루시퍼라제-코딩 DNA를 포함하는 DNA 혼합물을 사용하였다. 이는 단일 실험에서 안정성과 활성 모두를 연구할 수 있도록 한다. 결과를 고려하고, 뿐만 아니라 전체 범위의 실험에 걸쳐 안정성 및 발현 결과를 예측하는 실험적 2차 방정식으로 데이타를 모델링함으로써 최적의 배합물을 선택하였다. 추가적인 연구를 위해 생성된 배합물을 TA201.2, TA201.5, TA201.11 및 TA201.15로 명명하였다.
이러한 4종의 배합물의 조성을 표 4에 나타내었다. 이러한 조성은 제제 환경의 조성이며, 즉 최종 분말의 조성이 아니다. 표 3은 이러한 배합물들에서 에탄올이 높은 백분율의 용매로 사용됨을 나타낸다. 201.5와 201.11의 주요한 차이는 트레할로스 수준이지만, 테트라아르기닌 수준 또한 201.5에서 3배 더 높다. 201.2와 201.15의 유일한 차이는 201.15에는 EDTA가 존재한다는 것이다.
배합물 TA201.5는 발현 및 안정성 기준이 동시에 최적화된 경우 최적화 소프트웨어에 따른 최적의 배합물이다. TA201.11은 안정성만이 최적화된 경우 최적의 배합물이다. 나머지는 비교를 위한 것이다. TA201.2는 발현성이 최대인 배합물이었고, 활성 실험에서 하이 바(high bar)를 설정하기 위한 추가의 연구에 포함된다. TA201.15는 실험의 중심점이고, 여러번 제제화되었다. 따라서, 이러한 배합물은 가장 많이 반복된 안정성 및 활성 데이타를 갖고, 배합물이 추가로 연구된 경우 경향 자체가 반복되는지를 보기 위한 양호한 앵커로 기능하였다.
Figure 112005015857465-pct00004
배합물 TA201.5, TA201.15 및 TA201.11은 매우 안정하였다. 실제로, 6개월의 숙성 후 25℃ 붕괴 속도를 측정할 수 없었다. 이러한 온도는 배합물이 보관되는 동안 겪을 실제 조건에 가장 근접한다. TA201.5의 안정성을 더 높은 온도에서 연구하였다. 더 높은 온도에서의 상대적인 붕괴 속도의 비교는 더 낮은 온도에서의 상대적인 안정성을 가리킨다. 표 5는 다양한 온도에서의 배합물의 안정성을 나타낸다.
Figure 112005015857465-pct00005
배합물 TA201.5 및 TA201.11의 물리적 피부 독성을 평가하였다. 부작용이 관찰되지 않았다. 배합물 내 DNA에 의해 코딩되는 단백질의 활성을 연구하였다. 루시퍼라제-코딩 DNA를 사용한 경우 루시퍼라제 발현을 관찰하였다. 표 6은 B형 간염 코어 항원 (Cag) 및 B형 간염 표면 항원 (Sag)을 코딩하는 DNA를 사용한 동물 연구의 결과를 나타낸다.
Figure 112008067012187-pct00013
* 이들은 신선한 스퍼미딘/CaCl2였다. M110 및 M114에는 숙성된 스퍼미딘/CaCl2도 있었다.
상기 데이타는 1 ㎎의 담체 입자 로드(load)로 2 ㎍ DNA 투여량에서 ND5.5 감염 동물 상에서의 항체 ELISA 및 ELISPOT 반응 분석법의 관점에서 배합물 TA201.5가 스퍼미딘/CaCl2와 경쟁적임을 명백하게 나타낸다. 배합물은 ELISPOT 데이타 (만-휘트니(Mann-Whitney) 기준)에 관해 스퍼미딘/CaCl2 성능보다 일정하게 크거나 이와 같았다.
배합물 TA201.5의 최종 조성을 측정하였다. 표 7은 TA201.5 분말로부터 측정된 전체 조성 범위를 나타낸다.
Figure 112005015857465-pct00007
* EDTA는 이의 4(-) 상태에서 측정하고, 이러한 종의 질량으로 기록된다 (병에 표시된 F.W.에 나타난 바와 같이 나트륨, 물 또는 수소 부재).
표 8은 테트라아르기닌 제제의 제조에 사용된 재료를 나타낸다.
Figure 112008067012187-pct00014
하기 절차를 사용하여 TA201.5를 35 ㎎ 금 분말의 규모로 제제화하였다.
장치
저울
와동기
초음파처리기
원심분리기
2 ㎖ 에펜도르프 튜브
1 ㎖, 200 ㎕ 피펫맨
기류(air stream)
시약 제조
11.3 ㎎/㎖ 테트라아르기닌 (로트 523352): 0.8 내지 1.0 ㎎의 테트라아르기닌을 칭량한다. 칭량된 ㎎ 당 88.5 ㎕의 H2O를 첨가한다. 이는 상이한 내용물의 로트에 대해 변화될 것이다.
트레할로스 용액: 30 ㎎ 이상의 트레할로스 (재료 목록에 나타난 공급원)를 칭량한다. 칭량된 30 ㎎ 당 120 ㎕의 H2O 또는 트레할로스보다 4배량 (1 ㎎/㎕이므로 질량 또는 ㎕ 단위)의 물을 첨가한다.
500 mM Na 2 EDTA: 용액 상태로 시그마(Sigma)에서 주문할 수 있다 (카달로그 번호에 대해서는 재료 목록 참조)
절차
튜브 B: 에탄올 및 DNA를 튜브 A에 첨가하기 전에 튜브 B를 준비한다. 킬레이트화제 용액, 당 용액, EtOH 및 테트라아르기닌 용액을 첨가한다. 고속으로 10 초 동안 와동시킨다.
튜브 A: 금을 칭량하여 튜브에 넣는다. 킬레이트화제 용액 및 당 용액을 첨가한다. 30 초 동안 초음파처리하고, 고속으로 1 분 동안 와동시킨다. 와동시키면서 EtOH를 적가한다. DNA 용액을 첨가한다. DNA를 첨가한 후, 하기 기술되는 바와 같이 튜브 B를 튜브 A에 첨가한다.
제제화 단계: 중간 속도로 튜브 A를 와동시키면서 (금이 용액 전체에 확실히 혼합되도록 함), 튜브 B의 내용물을 적가한다. 튜브 B의 내용물 모두가 튜브 A에 첨가된 후, 최종 테트라아르기닌 제제를 함유하는 튜브 A를 고속으로 1 분 동안 와동시킨다. 제제를 5 분 동안 침강시킨다. 와동시키고, 이어서 10 초 동안 원심분리한다. 상층액을 피펫으로 제거하여, 분석용으로 남겨둔다. 펠렛을 250 ㎕ 에틸 알콜로 세정한다. 30 초 동안 와동시키고, 3 초 동안 초음파처리한다. 펠렛을 10 초 동안 원심분리하여 가라앉히고, 에틸 알콜을 제거한다. 펠렛을 250 ㎕ 에틸 알콜로 다시 세정한다. 30 초 동안 와동시키고, 3 초 동안 초음파처리한다. 펠렛을 10 초 동안 원심분리하여 가라앉히고, 에틸 알콜을 제거한다. 0.5 L/분의 유속으로 기류를 사용하여 2 시간 동안 분말을 건조시킨다.
튜브 A
ㆍ 금 분말, 35 ㎎
ㆍ EDTA, 26.25 ㎕
ㆍ 트레할로스, 70 ㎕
ㆍ 30 초 동안 초음파처리하고, 1 분 동안 와동시킨다
ㆍ EtOH, 183.75 ㎕ (와동시키면서 적가)
ㆍ DNA, 70 ㎕
튜브 B
ㆍ EDTA, 26.25 ㎕
ㆍ 트레할로스, 70 ㎕
ㆍ 테트라아르기닌, 70 ㎕
ㆍ EtOH, 183.75 ㎕
ㆍ 10 초 동안 와동시킨다
튜브 A & 튜브 B
ㆍ 와동시키면서 튜브 B를 튜브 A에 적가한다
ㆍ 1 분 동안 와동시킨다
ㆍ 5 분 동안 침강시킨다
ㆍ 10 초 동안 원심분리하고, 상층액을 제거한다
ㆍ 에틸 알콜 250 ㎕로 세정하고, 30 초 동안 와동시키고, 3 초 동안 초음파처리하고, 10 초 동안 원심분리하고, 제거한다
ㆍ 에틸 알콜 250 ㎕로 세정하고, 30 초 동안 와동시키고, 3 초 동안 초음파처리하고, 10 초 동안 원심분리하고, 제거한다
ㆍ 공기 또는 질소 하에 2 시간 동안 건조시킨다
배합물 TA201.5의 개발 동안, 제제화 절차에서 각 성분의 개별적인 저장 용액을 먼저 제조한 후, 이들을 특정 순서로 제제화 튜브에 첨가하였다. 그러나, 배합물의 클린룸(clean-room) 제조는 멸균 여과 단계를 필요로 할 것이다. "마스터 혼합(master mixing)" 실험을 개시하여, 이러한 필요성을 다루었다 (NB2334-80). 이러한 전략에서 튜브 A (마스터 A) 및 튜브 B (마스터 B) 내의 모든 수성 성분의 마스터 혼합물을 사용하였다. 이어서, 혼합물을 주사기-여과하여 멸균하고, 여과된 재료를 제제화 튜브 내로 옮겼다. 마스터 혼합 실험에서, 마스터 혼합 절차에 의해 제조된 분말 및 표준 절차에 의해 제조된 분말을 안정성 및 전체 조성의 관점에서 서로 비교하였다.
Figure 112005015857465-pct00009
Figure 112005015857465-pct00010
- 표 10에서의 반감기는 2가지 반감기 계산을 평균화하여 계산하였다. 하나는 ng SC 붕괴 속도 (4에 대한 60)로부터 유도된 것이고, 다른 하나는 ％ SC 붕괴 속도 (4에 대한 60)로부터 유도된 것이다.
2가지 절차로 동일한 최종 생성물이 제조되었기 때문에, 마스터 혼합 전략은 문제가 없는 것으로 간주될 수 있었으며, 이어지는 TA201.5 분말의 분말 제제화에 사용할 수 있었다. 어떤 공정 단계가 결정적인지를 결정하기 위해, 추가적인 공정 실험을 수행하였다.
실험: 배합물 1-9를 동일한 저장 용액으로부터 70 ㎎ 규모로 제조하였다. EDTA, 트레할로스 및 DNA 용액을 제제화 비율로 혼합하여 튜브 A용 마스터 혼합물을 제조한 후, 주사기 여과하였다. EDTA, 트레할로스 및 테트라아르기닌 용액을 제제화 비율로 혼합하여 튜브 B용 마스터 혼합물을 제조한 후, 주사기 여과하였다. 이어서 하기 공정에 의해 배합물 1을 제조하였다.
시약 제조 (10개의 70 ㎎ 제제용)
DNA: 플라스미드 및 루시퍼라제-코딩 DNA의 저장물(stock)을 1 ㎎/㎖로 제공하였다. 9:1의 SC18:루시퍼라제 부피 비율로 두 DNA 용액을 혼합하였다.
1500 ㎕의 SC18 + 166.7 ㎕의 루시퍼라제 DNA.
11.3 ㎎/㎖ 테트라아르기닌: 약 20 ㎎의 테트라아르기닌을 칭량한다. 칭량된 ㎎ 당 88.5 ㎕의 H20를 첨가한다.
트레할로스 용액: 700 ㎎ 이상의 트레할로스를 칭량한다. 칭량된 35 ㎎ 당 140 ㎕의 H20 또는 트레할로스보다 4배량 (1 ㎎/㎕이므로 질량 또는 ㎕ 단위)의 물을 첨가한다.
500 mM EDTA: 용액 상태로 시그마에서 주문할 수 있다 (Cat. E-7889)
마스터 A 부피 비율: 1500 ㎕ 트레할로스, 562.5 ㎕ EDTA, 1500 ㎕ DNA (1 ㎎/㎖)
마스터 A를 주사기 여과한다.
마스터 B 부피 비율: 1500 ㎕ 트레할로스, 562.5 ㎕ EDTA, 1500 ㎕ 테트라아르기닌
마스터 B를 주사기 여과한다.
튜브 A
70 ㎎ 금
332.5 ㎕의 마스터 혼합물 A
367.5 ㎕의 EtOH (와동시키면서 적가)
30 초 동안 초음파처리하고, 10 초 동안 와동시킨다
튜브 B
332.5 ㎕의 마스터 혼합물 B
367.5 ㎕의 EtOH
10 초 동안 와동시킨다
튜브 A & 튜브 B
와동시키면서 튜브 B를 튜브 A에 적가한다
모든 B가 첨가된 후, 고속으로 1 분 동안 와동시킨다
5 분 동안 침강시킨다
5 초 동안 와동시키고, 10 초 동안 원심분리하고, 상층액을 *제거한다
EtOH 500 ㎕로 세정하고, 30 초 동안 와동시키고, 3 초 동안 초음파처리하고, 10 초 동안 원심분리하고, *제거한다
마지막 단계를 1회 반복한다.
펠렛을 0.5 L/분으로 1 시간 동안 공기 하에 건조시킨다
이러한 공정은 대조군 제제화이다. 하기 표는 분말 2-9의 공정 변화를 나타낸다.
변화 단계 배합물 변화 대조군
A에의 B 첨가
 2 B 모두를 1회 분사로 A에 첨가 B를 A에 적가/
연속
3 B를 A에 적가/액적마다 5초 간격
B를 A에
첨가한 후의
와동		 4 고속으로 3 분 와동 고속으로
1 분 와동
5 와동시키지 않고,
모든 B가 A에 첨가된 후 침강되도록 함
침강 시간
 6 10 분 침강 5 분 침강
7 침강시키지 않음,
1 분 와동 후 원심분리
세정 횟수
 8 4회 세정 2회 세정
9 세정하지 않음,
상층액 제거 후 건조시킴
나머지 제제는 상기 제제에 대한 1 마스터 혼합물의 가능성을 평가하기 위해 첨가 순서를 변화시킨 배합물이었다. 이 공정은 대조군과 유사하였다.
마스터 혼합물 부피 비율: 400 ㎕ 트레할로스, 150 ㎕ EDTA, 및 200 ㎕ 테트라아르기닌
마스터 혼합물을 주사기 여과하였다.
배합물 10
70 ㎎ 금
525 ㎕의 마스터 혼합물
735 ㎕의 EtOH (와동시키면서 적가)
30 초 동안 초음파처리하고 10 초 동안 와동시킨다
140 ㎕의 DNA (와동시키면서 천천히 적가 (액적마다 5 초 간격))
모든 B가 첨가된 후, 1 분 동안 고속으로 와동시킨다
5 분 동안 침강시킨다
5 초 동안 와동시킨 후, 10 초 동안 원심분리하고, 상층액을 *제거한다
EtOH 500 ㎕로 세정하고, 30 초 동안 와동시키고, 3 초 동안 초음파처리하고, 10 초 동안 원심분리하고, *제거한다
마지막 단계를 1회 반복한다
펠렛을 0.5 L/분으로 1 시간 동안 공기 하에 건조시킨다
* 원심분리 후 펠렛으로부터 액체를 제거하는 것은 1000 ㎕ 피펫으로 대부분의 액체를 제거한 후, 200 ㎕ 피펫으로 나머지 액체를 제거하여 수행한다. 가능한 한 적은 액체가 분말 상에 잔존할 것이다.
모든 분말을 전체 조성, 안정성, CHO 세포에서의 루시퍼라제 발현, 및 겔 샷(gel shot)에 대해 분석하였다.
Figure 112005015857465-pct00011
Figure 112005015857465-pct00012
- 상기 숫자는 제제화한 날에서 13일 및 20일로의 수퍼-코일형 DNA의 나노그램에서의 변화에 의해 계산하였다.
속도 및 반감기는 서로 매우 밀접하였다. 이는 제제화 공정이 안정성의 관점에서 로버스트성인 것을 가리킨다. 배합물 5 및 7은 다른 것들에 비해 안정성이 약간 더 양호했지만, 배합물 9 및 10은 안정성이 명확하게 유리하였다 (3배). 배합물 9는 세정하지 않았고 (그리고 공정에 적합하지 않음), 배합물 10은 첨가 순서의 변화에 의해 수득하였다.
발현 데이타는 배합물들이 매우 유사함을 가리켰다 (300-400K 카운트/초). 신선한 스퍼미딘/CaCl2 배합물은 더욱 발현적이었지만 (또는 세포가 분석된 시점에 발현 물질이 더 많음), 또한 방출 질량에서도 높게 측정되었다. 배합물 10 및 7은 다른 테트라아르기닌 배합물에 비해 루시퍼라제 발현이 약간 유리하였다 (450-600K 카운트/초). 전반적으로, 공정이 매우 로버스트성인 것으로 실험에서 입증되었다.
로버스트성의 또다른 양상은 첨가 순서 및 배합물을 제조하기 위해 사용된 공정을 변화시키는 것의 효과이다. 한 이같은 실험 (NB2251-124)에서, 동일한 재료 (양 및 농도)로 배합물의 상이한 제조 방식들을 조사하였다. 이 실험에서는 성분들이 상이한 순서로 침착되도록 고안된 배합물들의 안정성만을 고찰하였다. 안정화제 전에, 안정화제와 동시에 또는 안정화제 후에 DNA가 금에 직접 침착될 수 있기 때문에 이는 아마도 효과가 클 것이다.
제제화 공정:
1. 튜브 A 및 튜브 B 접근법. 튜브 A와 튜브 B는 A에는 DNA가 있고 B에는 테트라아르기닌이 있다는 것을 제외하고는 조성이 동일하다. 모두 잘 혼합한 후, B를 A에 적가하였다.
2. 또다른 튜브 A 및 튜브 B 접근법. 이번에는, 튜브 A (금 포함)에, DNA 첨가 전에 과량의 당으로 금을 예비코팅하기 위해 DNA 용액 전에 에탄올을 첨가하였다. 이어서, 튜브 A에 DNA를 첨가한 후, 튜브 B를 튜브 A에 즉시 첨가하였다.
3. 이 접근법은 DNA와 안정화제를 동시에 침착시키도록 고안되었다. DNA 및 에탄올을 제외한 모든 성분들을 한 튜브에 첨가하였다. 이어서, DNA 및 에탄올을 함께 혼합하고 첨가하였다.
4. 이 접근법에서는 DNA를 에탄올 첨가 전에 침착시켰다. DNA, 테트라아르기닌 및 에탄올을 제외한 모든 성분들을 한 튜브에 첨가하였다. 이러한 최종 성분들의 첨가 순서는 각각 DNA, 테트라아르기닌 및 에탄올이었다.
5. 이 접근법은 테트라아르기닌을 DNA 전에 첨가하는 것을 제외하고는 4와 동일하였다. 에탄올은 여전히 마지막이었다.
이러한 제제들을 4℃ 및 60℃ 인큐베이터에 놓고, 제제화 2주 후에 분석하였다. 아가로스 겔 전기영동에서 이러한 분말들 사이에 큰 차이는 없었지만, 분말 4 및 5 (에탄올을 마지막에 첨가, 에탄올 전에 DNA:ARG4 복합체화)가 약간 더 안정하였다.
따라서, 입자 매개된 전달 기구로부터의 전달에 적절한, 핵산 코팅된 신규 입자, 상기 입자의 제조 방법, 및 상기 입자를 사용하는 유전자 치료 및 핵산 면역화 방법이 기술된다. 본 발명의 바람직한 실시양태가 일부 자세하게 기술되었지만, 첨부된 청구항에 정의된 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 명백한 변화가 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.

Claims (67)

  1. (a) 핵산 축합제 및 금속 이온 킬레이트화제의 존재하에 직경이 1 내지 3 ㎛인 불활성 금속 담체 입자 상에 핵산을 침착시키고, (b) 상기 입자를 분말로 건조시킴으로써 수득가능한, 입자 매개된 전달 기구(particle-mediated delivery device)로부터 전달될 수 있는 입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 불활성 금속 담체 입자가 금, 텅스텐, 백금 및 이리듐 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 입자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 불활성 금속 담체 입자가 금 입자인 입자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 항원을 코딩하는 것인 입자.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항원이 바이러스성 항원, 박테리아성 항원 및 진균성 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 입자.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 치료적 폴리펩티드를 코딩하는 것인 입자.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 DNA인 입자.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 축합제가 양이온성 중합체인 입자.
  9. 제8항에 있어서, 상기 핵산 축합제가 폴리아민인 입자.
  10. 제9항에 있어서, 상기 폴리아민이 프로타민, 스퍼미딘, 스퍼민, 푸트레신, 및 그의 생리학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 입자.
  11. 제9항에 있어서, 상기 폴리아민이 폴리아르기닌 또는 폴리리신인 입자.
  12. 제11항에 있어서, 상기 폴리아르기닌이 (Arg)4 또는 (Arg)6인 입자.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속 이온 킬레이트화제가 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 (DTPA), 니트릴로트리아세트산 (NTA), 이노시톨 헥사포스페이트, 트리폴리포스페이트, 폴리인산, 숙신산나트륨, 숙신산칼륨, 숙신산리튬, 말산나트륨, 말산칼륨, 말산리튬, 데스페랄 및 에틸렌디아민-디(o-히드록시-페닐아세트산) (EDDHA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 입자.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 침착이 디사카라이드 당 및 트리사카라이드 당으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 당의 존재하에 수행되는 것인 입자.
  15. 제14항에 있어서, 상기 1종 이상의 당이 트레할로스, 수크로스, 락토스 및 라피노스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 입자.
  16. 제15항에 있어서, 상기 1종 이상의 당이 수크로스 및 라피노스의 블렌드인 입자.
  17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 침착이 1종 이상의 염의 존재하에 수행되는 것인 입자.
  18. 제17항에 있어서, 상기 1종 이상의 염이 아세트산칼륨, 염화칼슘, 염화리튬, 아세트산나트륨, 질산마그네슘, 시트르산나트륨, 인산나트륨 및 염화마그네슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 입자.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 입자가 항산화제와 접촉되는 것인 입자.
  20. 제19항에 있어서, 상기 항산화제가 에탄올, 비타민 A, 비타민 C 및 비타민 E로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 입자.
  21. 제1항에 있어서, 폴리아르기닌, EDTA 및 수크로스의 존재하에 금 담체 입자 상에 DNA를 침착시킴으로써 수득되는 입자.
  22. 제1항에 따른 입자를 함유하는, 입자 매개된 전달 기구를 위한 투여 용기(dosage receptacle).
  23. 제1항에 따른 입자로 로딩된 입자 매개된 전달 기구.
  24. 제23항에 있어서, 무침 주사기인 입자 매개된 전달 기구.
  25. (i) 핵산 축합제 및 금속 이온 킬레이트화제의 존재하에 직경이 1 내지 3 ㎛인 불활성 금속 담체 입자 상에 핵산을 침착시키는 단계;
    (ii) 생성된 입자를 수집하는 단계; 및
    (iii) 상기 입자를 분말로 건조시키는 단계
    를 포함하는, 입자 매개된 전달 기구(particle-mediated delivery device)로부터 전달될 수 있는 입자의 제조 방법.
  26. 제25항에 있어서, 단계 (i)에서 핵산 축합제를 불활성 금속 담체 입자 및 핵산을 포함하는 혼합물에 첨가하는 것인 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 불활성 금속 담체 입자가 금, 텅스텐, 백금 및 이리듐 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 불활성 금속 담체 입자가 금 입자인 방법.
  29. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 핵산이 항원을 코딩하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 항원이 바이러스성 항원, 박테리아성 항원 및 진균성 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  31. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 핵산이 치료적 폴리펩티드를 코딩하는 것인 방법.
  32. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 핵산이 DNA인 방법.
  33. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 핵산 축합제가 양이온성 중합체인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 핵산 축합제가 폴리아민인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 폴리아민이 프로타민, 스퍼미딘, 스퍼민, 푸트레신, 및 그의 생리학적으로 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 폴리아민이 폴리아르기닌 또는 폴리신인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 폴리아르기닌이 (Arg)4 또는 (Arg)6인 방법.
  38. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 금속 이온 킬레이트화제가 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 (DTPA), 니트릴로트리아세트산 (NTA), 이노시톨 헥사포스페이트, 트리폴리포스페이트, 폴리인산, 숙신산나트륨, 숙신산칼륨, 숙신산리튬, 말산나트륨, 말산칼륨, 말산리튬, 데스페랄 및 에틸렌디아민-디(o-히드록시-페닐아세트산) (EDDHA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  39. 제25항 또는 제26항에 있어서, 단계 (i)을 디사카라이드 당 및 트리사카라이드 당으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 당의 존재하에 추가로 수행하는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 1종 이상의 당이 트레할로스, 수크로스, 락토스 및 라피노스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 1종 이상의 당이 수크로스 및 라피노스의 블렌드인 방법.
  42. 제25항 또는 제26항에 있어서, 단계 (i)을 1종 이상의 염의 존재하에 추가로 수행하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 1종 이상의 염이 아세트산칼륨, 염화칼슘, 염화리튬, 아세트산나트륨, 질산마그네슘, 시트르산나트륨, 인산나트륨 및 염화마그네슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  44. 제25항 또는 제26항에 있어서, 단계 (i)로부터 생성된 입자를 항산화제와 접촉시키는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 항산화제가 에탄올, 비타민 A, 비타민 C 및 비타민 E로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  46. 제25항에 있어서,
    (i) 폴리아르기닌, EDTA 및 수크로스의 존재하에 직경이 1 내지 3 ㎛인 불활성 금 입자 상에 DNA를 침착시키는 단계;
    (ii) 생성된 입자를 수집하는 단계; 및
    (iii) 상기 입자를 분말로 건조시키는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
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