KR900007952B1

KR900007952B1 - 신규의 한탄바이러스 rok84/105 균주 및 이를 이용한 한탄바이러스 백신의 제조방법

Info

Publication number: KR900007952B1
Application number: KR1019880015199A
Authority: KR
Inventors: 이호왕; 유선자; 안창남
Original assignee: 주식회사 녹십자; 허영섭
Priority date: 1988-11-18
Filing date: 1988-11-18
Publication date: 1990-10-23
Also published as: HU206050B; JPH02242674A; HU895956D0; US5183658A; YU219189A; HUT55641A; JPH0553475B2; KR900007436A

Abstract

내용 없음.

Description

신규의 한탄바이러스 ROK84/105 균주 및 이를 이용한 한탄바이러스 백신의 제조방법

제1도는 본 발명의 실시예 1중 프로타민설페이트 처리량에 따른 상층 EIA역가.

제2도는 한탄바이러스의 포르마린 처리기간에 따른 마우스의 치사율(LD₅₀).

제3도는 한탄바이러스의 포르마린 처리기간에 따른 마우스의 감염율(ID₅₀)

제4도는 보조제 양에 따른 면역 형광체(IF) 생성곡선.

제5도는 알루미늄히드록사이드 겔로 흡착시킨 ROK84/105(MBV)를 접종한 랫트의 알루미늄히드록사이드 양에 따른 면역 형광 항체생성곡선.

본 발명은 신증후군 출혈열의 병원체인 신규의 한탄바이러스 균주 및 신증후군 출혈열의 예방에 탁월한 효과를 갖는 한탄바이러스 백신의 제조방법에 관한 것이다.

현재 지구상에는 바이러스로 인한 유행성 출헐열은 10여종이나 존재하며, 그 전파경로에 따라 모스퀴토본(mosquitoborne), 티크본(tickborne) 및 주노틱(zoonotic)으로 분류하고 있는데 본 발명의 한탄바이러스균주로부터 기인하는 한국형 유행성 출혈열은 주노틱에 속한다. 이 한국형 출혈열은 병원체가 분리되지 못하였고, 쥐와 유관할 것이라는 것은 알고 있었으나, 어떤 종(種)이 숙주이며, 어디에 어떤 병원체를 갖고있는지 증명되지 못하였었다. 유행성 출혈열의 자연계 숙주에 대하여는 많은 예측들이 있었으나 증명된 것은 없었으며, 일본의 아사누마 등은 등줄쥐에 기생하는 털진드기(Trombicular mite)의 유액을 사람에게 접종하여 질병을 일으킬 수 있다 하여 진드기가 숙주 및 매개체 일것이라고 추정하였다.

본 발명자들에 의하여 한국형 유행성 출헐열의 유행지역인 동두천에서 채집한 등줄쥐(Apodemusagrarius coreae)의 폐 및 신장조직에서 병원체를 분리하는데 성공하였으며, 이 병원체는 바이러스임이 확인되어 한탄바이러스(Hantaan Virus)로 명명하였다. 바이러스에 기인하는 출혈열 환자는 한국 뿐만 아니라, 세계 각처에서 다발되고 있으며, 그 중상 또한 한국형 유행성 출혈열과 유사함이 밝혀졌다.

본 발명자들은 소련의 출혈성 신증성 신염(Hemorrhagic nephrosonephritis), 핀란드의 유행성 신장염(Nephropathia epidemica) 및 일본의 유행성 출혈열(Epidemic hemorrhagic fever) 환자 혈청에 이 바이러스에 대한 형광항체가 있음을 증명하고, 이들 질병이 한탄바이러스 또는 이와 항원적으로 유사한 바이러스에 의하여 발생됨을 증명하였으며, 1982년 세계보건기구(WHO)는 이들 질병의 명칭을 신증후군 출혈열(Hemorrhagic fever with renal syndrome)으로 통일하여 부르기로 결정하였다.

전술한 한탄바이러스에 감염된 환자의 증상은 대부분 38-40℃의 발열과 함께 갑자기 오한, 두통, 신경쇠약 및 근육통으로 시작하여 기침, 인두통 및 콧물 등의 상기도(上氣道) 감염증상이 3 내지 5일 동안 나타나며, 중증으로 진행함에 따라 심한 호흡곤란, 흉부, 동통 및 혈담을 동반하며, 심한경우 특이한 붉은 얼굴출혈반이 피부 또는 결막에 나타나 호흡기 감염바이러스 질병으로서 사망하기도 한다.

본 발명자들은 상기의 바이러스 질병을 퇴치하고져 예의 연구를 거듭한 결과, 상기 질병을 유발하는 병원체의 확인 및 이들 병원체로부터의 감염을 저지하거나 제한하기 위한 예방백신을 발명하게 되었다.

본 발명의 목적은 한탄바이러스 균주를 이용한 한탄바이러스 백신의 대량생산에 적절한 경제적이고도 효율적인 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에서 실제적으로 이용되는 신규의 한탄바이러스 균주를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 1984년 이 유행성 출혈열 증세로 입원한 환자(경기도 파주에서 복무하는 군인)의 혈청을 발병 3일째 채취하여 이를 Vero E₆세포에서 4회 계대배양하여 바이러스를 분리하는데 성공하였다. 이 바이러스를 한국종균 협회에 1988년 11월 9일자로 기탁하였으나, 본 발명의 균주가 병원성 균주이므로 기탁이 거부되었다(첨부된 기탁거부서 참조). 본 발명의 균주를 한탄바이러스 ROK84/105라고 명명하고, 이를 한탄바이러스 백신의 시이드(seed)로 사용하였다.

일반적으로 인체에 적용되는 백신은 인체에서 유래된 균주를 사용하는 것이 바람직하며, 또한 인체로부터 채취된 혈액중의 한탄바이러스는 마우스나 랫트의 뇌에서 양호하게 증식 될 뿐만 아니라, 백신제조에 필요한 항원을 다량 보유하기 때문에 마우스나 랫트를 이용하여 상기 목적을 달성하는데 적합하다.

본 발명에 의한 바이러스 균주는 분류법상으로는 번야비리다에(Bunyaviridae) 과(科)의 한타바이러스 속(Hantavirus genus)의 4가지형 즉, 한탄바이러스(Hantaan Vi rus)(원형 76-118), 서울 바이러스(Seoul Virus)(원형 80-39), 프로스펙트 힐 바이러스(Prospect Hill Virus), 푸말라 바이러스(Pumala Virus)중에서 한탄바이러스에 속하며, 신증후군 출혈열 환자의 혈액에서 채취하여 마우스나 랫트의 뇌에서 증식되도록 적응시킨 것이다.

본 발명자들에 의하여 본 바이러스의 성장, 증식 및 분리가 최초로 이루어졌으며, 이들 바이러스의 분리를 위하여 사용된 세포는 베로 E₆(Vero E₆)로서 ATCC(기탁번호 : C1008, CRL 1586)와 미육군 전염병 연구소에서 분양받아 조직배양 배지에서 증식하여 사용하였다.

조직배양 배지는 Eagle 배지 95%, 송아지 태 혈청(FCS, fetal calf Serum) 5%이며, 조직배양 세포에 바이러스로 감염된 환자의 혈액을 가한 후, 36℃의 CO₂인큐베이터에서 배양시킨 후, 바이러스 증식을 간접 형광 항체법으로 확인하였다. 일차 계대에서는 비이러스의 증식은 없었으며, 4차 계대에서 바이러스 항원이 세포의 원형질내에서 형광반점을 나타냄을 확인하였다. 이 바이러스를 젖빨이 마우스와 젖빨이 랫트의 뇌에 접종하고, 바이러스의 증식여부를 검사하였다. 시험결과, 이 바이러스는 젖빨이 마우스와 젖빨이 랫트의 뇌에서만 특이적으로 증식함을 확인하였다.

본 발명자들에 의하여 본 발명의 한탄바이러스 ROK84/105주는 젖빨이 마우스와 젖빨이 랫트의 뇌에서 대량 생산할 수 있으며, 추출, 정제하는 방법이 최초로 확립되었다. 본 발명에 의하여 한탄바이러스

ROK84/105주를 4℃의 온도와 pH 7.2의 조건하에서 안정화시키고, 안정화된 바이러스를 마우스의 뇌에 접종하고 pH 7.2, 20% 인산염 완충액으로 뇌유제(Brain Suspension)를 제조하면 뇌유제 면역효소 분석법(ELISA법)에 의한 항원의 역가는 8,192 이상의 수율을 얻는다.

본 발명의 한탄바이러스 ROK84/105주의 수율은 다른 한탄바이러스 균주, 예컨대, 한탄바이러스 76-118균주보다 월등히 높았다.

상술한 조건하에서 본 발명자들은 한탄바이러스 증식에 대하여 광범위한 연구를 한 결과, 본 발명의 한탄바이러스 ROK84/105 균주가 한탄바이러스 백신의 제조에 필요한 충분한 양의 항원을 공급할 수 있는 시이드이며, 항체의 형성이 탁월함을 발견하였다.

본 발명에 의한 바이러스 균주는 등줄쥐에서 분리된 한탄바이러스 원형(Prototype) 76-118 보다는 인체로부터 분리되었다는 점에서 인체에 적용되는 백신을 제조하는데 더 적합하다.

본 발명의 한탄바이러스 ROK84/105주는 다음과 같은 물리화학적 성상 즉, 번야비리다에(Bunyaviridae)의 특성을 갖는다.

1. 비리온 입자(Virion Particle)

구형 또는 타원형, 직경 약 95nm, RNA.

2. 외막(Envelope)

지방을 포하하는 단백질의 피포물질로 둘러싸여 있고, 5-10nm 크기의 수많은 줄기가 표면에 표출되어 있음.

3. 구조

·단일 나선(Single Stranded)

·3개의 분절(Three-Segment)

·음성 반응 RNA계놈(Negative-Sense RNA Genomes)

·총분자량 : 4 .5×10⁶

·3개의 바이털 뉴클레오캡시이드(Three viral nucleocapsids)

·2개의 바이러스 특이 당단백(two virus-specified glycoprotein)

4. 바이러스 증식

감염세포의 세포질(Cytoplasm)

5. 특 성

본 발명의 신규 바이러스인 한탄바이러스 ROK84/105주는 공지의 한탄바이러스 76-118주와는 아래와 같은 상이한 특성을 나타낸다.

1) 바이러스의 역가가 Vero E₆세포에서 10^7.2/ml임.

2) 바이러스의 역가가 젖빨이 마우스 뇌에서 10^9.8/ml임.

3) 바이러스의 역가가 젖빨이 랫트 뇌에서 10^9.3/ml임.

* 이상과 같이 이 바이러스는 쥐에서 병원성이 강하여 바이러스 접종 후 7-12일 사이에 쥐가 사망함.

4) 이 바이러스는 ICR 젖빨이 마우스에 접종하면 바이러스의 증식이 다른 바이러스보다 빨리 일어나며, 항체가 바이러스 접종 후 5일부터 나타나 10일 경에는 2,000 이상에 달함.

5) 이 바이러스를 SD랫트에 접종하면 바이러스 접종 후 7일에 항체를 증명할 수 있음.

6) 이 바이러스를 Vero E₆세포에서 배양하면 다른 바이러스에 비하여 큰 사이즈인 0.3cm 내외의 플라그(plaque)를 관찰할 수 있음.

본 발명은 신규 바이러스를 배양, 증식, 분리 및 불활화하여 제조한 한탄바이러스 백신을 제공한다.

즉, 본 발명의 한탄바이러스 백신은 1일령의 젖빨이 마우스 또는 랫트에 인체로부터 분리된 한탄바이러스 ROK84/105주를 시이드로 접종하고, 약 10일간 사육한 다음, 완전히 마비를 일으킨 마우스의 두부를 절개하여 그 뇌를 채취하고, 에틸알코올과 프로타민 설페이트용액으로 처리한 후, 이를 정제, 불활화시키고, 보조제(Adjuvant)를 첨가하여 제조한다.

본 발명의 백신을 제조하기 위하여는 시이드 바이러스의 증식이 필요하다. 이와 같은 목적으로 시이드 바이러스는 1.0% 보바인 알부민(Bovine albumin)을 함유한 BSS(Balanced Salt Solution)용액 (pH 7.6)으로 희석하여 사용하며, 회석된 바이러스액은 4℃에서 보존 사용하며, 장기간 보존시에는 -60℃에서 보존하여 사용하는 것이 바람직하다.

상기의 한탄바이러스 희석액을 젖빨이 마우스 또는 젖빨이 랫트의 뇌에 접종시킨다. 10일간 사육한 마우스의 평균 뇌중량은 0.262g이며, 항원의 염가는 20% 뇌현탁액이 8,192이었다. 10일간 사육된 랫트의 평균뇌중량은 0.718g이었고, 항원의 염가는 20% 뇌현탁액이 8,192이었다.

본 발명에 있어서, 시이드 바이러스의 증식은 마우스 뿐만 아니라, 랫트에서도 양호하며, 랫트에서 증식시키는 것이 더 바람직하다. 바이러스가 증식된 마우스는 8일째부터 마비를 일으켜 10일 경에는 사망하게 되는데, 백신 제조용으로는 사망 직전의 뇌를 채취하여 중량을 잰 후, 아래 조성의 희석액(PBS pH 7.2)으로 20%(W/V) 용액을 만든 후, 세포 분쇄기에서 충분히 분쇄하고, 4℃, 3000rpm에서 20분간 원침하여 상층액을 회수한다.

염화나트륨 …… 8.5g

인산나트륨(1염기).2H₂O …… 0.4g

인산나트륨(2염기).12H₂O …… 2.54g

증류수 …… 1리터

pH=7.2

회수된 상층액에 30 내지 40% 냉에탄올을 동량 첨가하고, 4℃에서 16 내지 20시간 방치하여 단백질을 침전시킨다. 이 40% 냉에탄올의 조성은 PBS : 에탄올이 6 : 4인 것이다.

위 용액을 3,000rpm으로 30분간 원심분리하여 침전물을 회수하고, 이 침전물에 상기에서 처음 사용된 양과 동량의 희석액[PBS(pH 7.2)]을 가하여 희석한 후, 믹서에서 혼합하여 바이러스를 추출한 다음, 5,000rpm에서 30분간 원심분리시켜 상층액을 회수하고, 상층액에 0.1 내지 0.5mg/ml이 되도록 프로타민설페이트 수용액을 가하여 1-2시간 동안 교반시키고, 5,000rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 중간원료(Bulk)로 회수한다.

상기의 중간원료(Bulk)를 통상의 방법으로 예를 들면, 포름알데히드로 처리하거나 또는 열처리 하여 불활화시키고, 알루미늄 히드록사이드 겔을 500mg/ml이 되도록 첨가하여 원하는 백신을 얻는다.

상기 불활화 공정에 있어서, 포름알데히드를 사용하는 경우에는 0.01∼0.05% 현탁액의 농도로 15일간 처리하는 것이 바람직하며, 열처리 하는 경우에는 60℃에서 30분간 처리하는 것이 바람직하다. 상기의 공정에서의 온도는 4℃ 이하로 유지시키는 것이 바람직하다.

본 발명을 다음의 실시예로서 상세히 설명하며, 본 실시예로서 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1

한탄바이러스 백신

(1) 한탄바이러스의 제조

1일령의 젖빨이 마우스에 한탄바이러스 ROK84/105주를 접종하고 약 10일간 사육하여 완전히 마비를 일으킨 마우스의 두부를 절개하고, 그 뇌를 채취하여 여기에 뇌중량 4배량의 인산염 완충액(pH 7.2)을 첨가하여 유화시키고, 3,000rpm으로 20분간 원심분리하여 수득되는 상층액을 바이러스액으로 하였다. 이 바이러스액의 감염성(Infectivity)을 보기 위하여 치사율을 측정하였다. 이 바이러스의 치사율(LD₅₀)은 10^-9.68/ml로서 다음과 같이 측정하였다.

ⅰ) 1일령의 젖빨이 마우스를 선택하였다.

ⅱ) 바이러스액을 완충 희석액으로 10^-2내지 10^-9로 계단 희석한다.

ⅲ) 각 단계의 바이러스 희석액을 각각 0.02ml씩 젖빨이 마우스의 뇌내에 적당수 접종한다.

ⅳ) 접종 후, 20일간 관찰하며, 증상이 나타나서 폐사하는 마우스의 수를 기록한다.

v) 폐사한 마우스의 수가 접종한 마우스의 1/2이 되는 희석액 농도를 구한다.

ⅵ) 희석액의 농도를 구하여 리드 앤드 뮌히 법(Read and Muench Method)에 의하여 LD₅₀을 구한다.

그 결과는 다음 표 1 및 표 2에 나타내었다.

날짜별 마우스의 폐사수

[표 1]

(접종 후 수일내의 폐사는 접종사로 취급하여 산출비율에서 제외한다.)

마우스의 치사율(LD₅₀)

[표 2]

상기 표 2로부터 LD₅₀=10^-9.68/ml이다.

상기 바이러스의 항원의 역가는 8,192로서 다음과 같이 측정하였다.

측정방법은 EIA방법을 사용하였으며, 플레이트(plate)는 폴리비닐 bottom 96 well을, 완충 희석액(buffer)은 Sigmadiagnostics사 제품으로 코팅 완충액(PBS), 세척 완충액(PBS+0.1% tween 20), 희석완충액(PBS+0.1% tween 20+2.5% Bovine Serum+0.1% thimerosal)를 각각 사용하였다.

ⅰ) 플레이트의 코팅은 면양 유래 항 인체 면역글로불린 M(Goat Antihuman IgM)을 희석완충액으로 500배 희석하여 플레이트 웰당 100μl씩 가하고, 4℃에서 16 내지 20시간 반응시킨다. 면양 유래 항 인체면역글로불린 M(Goat Antihuman IgM)항체는 Tago사제품으로 총 단백량은 1.15mg/ml이었다.

ⅱ) 상기의 플레이트를 세척완충액으로 3회 세척하고, 인체에서 분리된 양성혈청을 최종 EIA 역가가 16이 되도록 희석하여 플레이트 웰당 100μl씩 가한 후, 37℃의 인큐베이터에서 1시간 반응시킨다.

ⅲ) 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 바이러스액을 2배 계단 희석하여 플레이트 웰 당 100μl씩 가한 후, 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 반응시킨다.

ⅳ) 이 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하고, 래비트의 앤티-한탄 바이러스 항체를 희석 완충액으로 3,000 배 희석하여 플레이트 웰 당 100μl씩 가한 후, 37℃ 인큐베이터에서 1시간 반응시킨다. 이때의 래비트 앤티-한탄 바이러스 항체의 EIA 역가는 4이었다.

ⅴ) 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하고, 효소콘쥬게이트 앤티-래비트를 희석 완충액으로 1,000배 희석하여 플레이트 웰 당 100μl씩 가한 후, 37℃ 인큐베이터에서 1시간 반응시킨다. 이 효소 콘쥬게이트는 KPL사 제품으로 단백함량이 0.1mg이며, 휴먼 IgM에 대해 과산화 효소로 표지된 친화성을 갖는 정제항체(peroxidase labeled affinity purified Anti-body to human IgM) 고우트를 사용하였다.

ⅵ) 상기 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하고, 기질(Substrate)을 플레이트 웰 당 100μl씩 가한후, 37℃ 인큐베이터에서 30분간 반응시킨다. 사용된 기질은 ABTS로서, 과산화 효소 기질용액 A(2.2'-azino-dl-[3-ethyl-benzthiazoline sulfonate)와 과산화효소 기질용액 B(hydrogen peroxide)를 1 : 1로 혼합하여 사용하였다.

ⅶ) 상기 플레이트를 육안 또는 ELISA 판독기를 사용하여 405 내지 415nm에서 판독한다.

ⅷ) 문턱값(threshold value)은 기지의 대조음성 혈청(reference negative serum)값의 산술평균치에 표준편차의 3배 값을 합산한 것이다.

그 결과 바이러스의 역가는 8,192이었다.

(2) 에탄올 처리

상기의 바이러스액을 여러가지 에탄올의 농도로 처리하여 최적농도를 선택하였다. 에탄올의 농도를 각각 15%, 20%, 30% 40%의 농도로 처리하고, 4℃에서 16 내지 20시간 방치한 후, 12,000rpm에서 30분간 원심분리하여 상충액과 침전물의 EIA 역가를 산출하여 그 결과를 표 3에 나타내었다.

각각의 에탄올 농도에서의 EIA 역가

[표 3]

에탄올을 처리한 후, 60℃에서 30분간 불활화시켜 랫트에 접종, 항원성을 비교검사하여 표 4에 나타내었다.

ROK 84/105를 랫트에 접종한 후, 항원성의 비교

[표 4]

에탄올 처리 후, 60℃에서 30분간 열처리 불활화 후, 랫트에 접종시의 면역형광 항체가

[표 5]

상기 표 3., 4., 5.로부터 30% 에탄올의 농도가 항원의 회수율과 항체형성율이 가장 우수하였다. 따라서, 바이러스액은 30%의 에탄올 농도로 처리하는 것이 바람직하다.

(3) 프로타민 설페이트(Protamine Sulfate) 처리

상기의 에탄올 처리된 바이러스액을 여러가지 프로타민설페이트 농도로 처리하여 최적농도를 선택하였다. 에탄올 처리가 끝난 바이러스액을 바이러스액 당 프로타민 설페이트를 0.1mg/ml, 0.2mg/ml, 0.3mg/ml, 0.4mg/ml, 0.7mg/ml, 1.0mg/ml로 처리한 후, 4℃에서 2시간 동안 방치하고, 18,000rpm으로 30분간 원심분리하고, 상충액의 EIA 역가를 검사하였다. 그 결과를 제1도에 나타냈다.

(4) 불활화 공정

상기 바이러스액을 0.05% 포르마린용액으로 처리하여 처리기간에 따른 치사율 (LD₅₀) 변화와 감염율(ID₅₀)을 관찰하였다.

1일령의 젖빨이 마우스를 사용하여 포르마린 처리직후와 4일째, 7일째, 9일째, 10일째 바이러스액을 10배계단 희석하여 마우스에 접종한다. 이에 따른 마우스 치사율은 다음 표 6의 농도 희석배수를 사용시 그 결과, 마우스의 치사율을 제2도에 나타내었고, 감염율은 제3도에 나타내었다.

처리시간에 따른 마우스의 치사율(LD₅₀)과 감염율(ID₅₀)

[표 6]

제2도 및 제3도로부터 본 발명의 한탄바이러스를 0.05% 포르마린에서 10일 이상 불활화 시켰을때 감염현상이 없었다. 또한 본 발명의 한탄 바이러스를 0.05% 포르마린에서 14일간 불활화시켜 랫트에 접종하여 항원성을 비교 검사하였으며, 그 결과는 표 7에 나타내었다.

ROK 84/105(MBV)주를 랫트에 접종한 후의 항원성

[표 7]

상기 표 6 및 표 7로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 한탄 바이러스 ROK 84/105를 포르마린에서 10일 이상 불활화시켜 마우스의 뇌에 접종하였을때 폐사되는 마우스는 1마리도 없었으며, 30일 후, 그 마우스의 뇌를 두부 절개하여 간접형광항체법(IFA)으로 뇌조직의 바이러스 감염여부를 확인한 결과, 바이러스의 감염은 확인되지 않았다. 따라서, 본 발명의 한탄 바이러스 ROK 84/105는 완전히 불활화된것을 확인하였다.

(5)보조제 처리 공정

본 발명의 한탄바이러스 ROK 84/105를 포르마린으로 불활화시킨 후, 보조제로서 알루미늄히드록사이드겔을 첨가하고, 4℃에서 15일간 정치하였다. 이를 랫트에 0. 5ml/마리를 근육접종하여 EIA 역가를 측정하였다.

그 결과는 다음 표 8, 표 9, 및 제4도 및 제5도에 나타내었다.

보조제 처리후 EIA 역가

[표 8]

알루미늄 겔로 흡착시킨 ROK 84/105(MBV)의 접종후의 항원성

[표 9]

상기 표 8, 9 표 제3, 4도로부터 본 발명의 한탄바이러스 ROK 84/105는 보조제로서 알루미늄 겔 500mg/ml로 처리하는 것이 항체생성율이 가장 양호함을 알 수 있다.

실험예 1

한탄 바이러스 백신의 동물실험

(1) 랫트에 있어서의 투여량 결정실험

상기 실시예 1에서 제조된 한탄바이러스 백신을 여러가지의 역가(EIA Antigen titer)로 랫트(Rat)에 접종하여 최적용량을 결정하였다.

본 발명의 한탄바이러스 백신을 면역시킨 후, 일정기간별항체생성 정도를 간접면역 형광항체법으로 확인하였다. 한탄바이러스 백신을 SD 랫트에 근육주사 후, 항체 반응 결과를 하기 표 10에 나타냈다.

한탄바이러스 백신을 근육주사하여 랫트에 있어서 투여량결정

[표 10]

상기 표 10으로부터 본 발명의 백신은 EIA타이터로서 512 유니트 이상을 접종하였을 경우에 항체가 생성됨을 확인하였다.

(2) 항체의 증폭(Booster) 실험

본 발명의 백신은 랫트(Rat)에 1차 접종 후, 1개월 정도까지 항체의 생성이 증가되고, 그 후, 항체의 생성은 감소한다. 약 45∼60일 사이에 2차 접종하면 항체의 생성이 현저하게 증가한다. 그 결과를 제5도에 나타내었다.

(3) 한탄바이러스 백신의 안전성 실험

본 발명의 백신의 안전성을 검사하기 위하여 젖빨이 마우스의 뇌에 본 발명의 백신을 0.02ml씩 접종하고, 30일간 관찰하여 마우스의 건강상태를 조사하였다. 접종 30일 후에 마우스의 두부를 절개하여 뇌를 채취하고, 이를 -30℃ 크리오스태트(Cryostat)에서 0.4μm으로 절단하여 조직절편을 만든다. 아세톤으로 고정한 후, 16Units/drop의 출혈열 환자혈청을 1차 반응시킨 후, 2차로 FITC-결합 앤티-휴먼 감마글로블린 8Units/drop을 가하여 형광 현미경으로 관찰하였다. 이 결과 뇌내에서의 바이러스 증식은 확인되지 않았다. 이 마우스 뇌를 다시 유화시켜 20% 용액으로 만든 후, 젖빨이 마우스의 뇌에 접종하고, 위와 동일한 방법으로 검사하였다. 이 결과 바이러스의 증식은 확인되지 않았으며, 마우스 마비도 일으키지 않았다. 따라서, 본 발명의 한탄바이러스 백신은 완전히 불활화 되었음을 확인하였고, 무독함이 증명되었다.

Claims

다음의 특성을 갖는 한탄바이러스 ROK 84/105 균주.

I. 비리온 입자(Virion Particle)

구형 또는 타원형, 직경 약 95nm, RNA

II. 외막(Envelope)

지방을 포함하는 단백질의 피포물질로 둘러싸여 있고, 5-10nm 크기의 수 많은 줄기가 표면에 표출되어 있음.

Ⅲ. 구조

·단일나선

·3개의 분절

·음성반응 RNA 게놈

·총 분자량 : 4.5×10⁶

·3개의 바이럴 뉴클레오캡시이드

·2개의 바이러스 특이 당단백

Ⅳ. 바이러스증식

감염세포의 세포질

V. 특성

본 발명의 신규 바이러스인 한탄 바이러스 ROK 84/105 주는 공지의 한탄 바이러스 76-118주와는 아래와 같은 상이한 특성을 나타낸다.

1) 바이러스의 역가가 Vero E₆세포에서 10^7.2/ml임.

2) 바이러스의 역가가 젖빨이 마우스 뇌에서 10^9.8/ml임.

3) 바이러스의 역가가 젖빨이 랫트 뇌에서 10^9.3/ml임.

* 이상과 같이 이 바이러스는 쥐에서 병원성이 강하여 바이러스 접종후 7-12일 사이에 쥐가 사망함.

4) 이 바이러스는 ICR 젖빨이 마우스에 접종하면 바이러스의 증식이 다른 바이러스보다 빨리 일어나며, 항체가 바이러스 접종 후 5일부터 나타나 10일 경에는 2,000 이상에 달함.

5) 이 바이러스는 SD 랫트에 접종하면 바이러스 접종 후 7일에 항체를 증명할 수 있음.

6) 이 바이러스를 Vere E₆세포에서 배양하면 다른 바이러스에 비하여 큰 사이즈인 0.3cm내외의 플라그를 관찰할 수 있음.
한탄 바이러스 ROK 84/105주를 마우스나 랫트에 접종하여 증식한 후, 채취하여 에틸알코올과 프로타민 설페이트용액으로 처리하여 정제, 불활화시키고 보조제를 첨가하여 제조된 한탄 바이러스 백신.
제2항에 있어서, 에틸알코올의 농도가 30-40%로 처리된 한탄 바이러스 백신.
제2항에 있어서, 프로타민 설페이트용액의 농도가 0.1-0.5mg/ml로 처리된 백신.
제2항에 있어서, 불활화 방법이 포르말린을 0.01∼0.05% 되게 첨가하여 4℃에서 10일 이상 불활화한 백신.
제2항에 있어서, 불활화를 60℃에서 30분간 열처리하여 제조된 백신.
제2항에 있어서, 마우스나 랫트가 1일령인 젖빨이 마우스 또는 젖빨이 랫트를 사용하여 제조된 백신.