JPH02291262A - 呼吸器シンシチウム抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ワクチンにおける使用に適し、また呼吸器シ
ンシチウムウィルス（　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎ
ｃｙｔｉａｌ　　ｖｉｒｕｓ）（ｒ｛，ＳＶ）による感
染の診断に適する、前記ウイルスＩ　Ｒ　Ｓ　Ｖ　ｌ特
異性抗原の製造に関する。また、本発明は、ＲＳｖ特異
性抗京の製造に有用である特定の細胞系統およびこれら
の抗原をその細胞表面上に有する特定の，細胞系統シて
関する。

過去において、動物におけるウィルス疾患は一般にウイ
ルスの人工的に減衰した系統または抗原的に関係するウ
ィルスを用いるワクチン接種により抑制ざれてきた。ヒ
トおよび動物一・の投与に適した代わりのワクチンの研
究において、ウィルスで感染した細胞培養物について研
究を実施し、そしてあるウイルスが復製するとき、それ
らはそれらが感染した細胞上に膜すなわち表面の抗原の
生成を誘発できることがわかった。これらの抗原は特定
のウィルスに対して特異性であり、そしてそのウイルス
に対するイムノグ口プリンと反応することが示され、そ
してそれらを用いて製造した抗血清はウィルス全中和す
ることが示された。こうしてこれらのウィルス特異性抗
原は大きい興味がもたれてきているが、これらの抗原は
感染した細胞の比較的わずかの族上に見い出される。

本発明によれば、呼吸器シンノチウムウィルスに対して
特異性の抗原全細胞の表面に有する細胞個体群を製造で
きることが発見された。この細胞個体群において、接種
された細胞の実質的すべては、それらの細胞表面上に、
それらの継代接挿の歴史のある時間において、担持する
。

したがって、本発明は、 （１）　　ヒトまたは動物の粘膜から誘導した細胞をイ
ンビトロｆｉｎ　ｖｉｔｒｏ，生体外）で培養し、 （２）培養した細胞に呼吸器シンンチウムウィルスを接
触し、そしてウィルスを吸収させ、そして （３）　　ウイルスで感染した細胞を培養物から選択す
る、 ことからなる呼吸器シンシチウムウイルスに対して特異
性の抗原の製造法を提供する。

この方法によシ得られた生ずる細胞系統は細胞表面に連
合するＲＳＶ特異性抗原を有し、そしてこのように生成
された細胞系統および細胞表面から単離できる抗原の両
者は、本発明の１つの面全形成する。抗原は、細胞から
単離されたものであるか否かにかかわらず、適当な担体
または希釈剤との組成物の形で提供できる。

本発明の方法において出発物質として使用する，細胞は
、ヒトまたは動物の粘膜から誘導され、好ましくは気道
から誘導される。このような細胞の特定の源は気管、肺
および鼻の粘膜であり、そして望ましくはそれらはウシ
、ことにウシの胎児の鼻の粘膜の細胞から誘導される。

細胞の特定のタイプは、本発明に従い接種すべき細胞と
して役立つことのできる、後述する細胞系統ＮＭ５のも
のである。

本発明によれば、培養した細胞を、工程（３）における
選択の前または後に、それ以上のウィルス、たとえば、
ウシのウィルスの下痢ウィルス（ｂｏｖｉｎｅ　　ｖｉ
ｒｕｓ　ｄｉａｒｒｈｏｅａ　　ｖｉｒｕｓ）（ＢＶＤ
Ｖ）で接種することができる。後述する細胞系統ＮＭ７
の細胞は、超感染させて、このようにして多数ウィルス
のワクチンを製造できる。こうして、２種以上のタイプ
のウィルス抗原を含有する細胞を製造できるが、ウィル
スのいずれも他の抗原の増殖を妨害しないようにするこ
とが重要である。１１，ＳＶ単独の場合において、生ず
る細胞系統を、それが細胞の実質的Ｋ１ｏｏ％がそれら
の膜上に几ＳＶに対して特異注の抗原を有する継代接種
の数ｆｐａｓｓａｇｅ　ｎｕｍｂｅｒ）に到達するまで
、連続的に再接種できることが示された。

ＲＳｖ特異性抗原を有する感染された細胞は、特定のウ
ィルスの疾患に対する接種物として、たとえば、固定後
、あるいはさらに精製後、使用できるＯ ＲＳＶ特異性抗原をそれらの表面上に担持する細胞の固
定は、架橋剤、たとえば、グルタルアルデヒドで処理す
ることにより実施できる０グルタルアルデヒドは、感染
性を破壊するが、抗原構造の免疫原性を保存または増大
することが知られており、そしてある量において、これ
はそれが本発明のＲＳＶ感染粘膜，細胞に対してもつ効
果である。

望ましくは、固定に使用するグルタルアルデヒドの濃度
は０．１５重量％を超えるべきではなく、さらに好まし
くは０．０７５重量％ｔ超えるべきではない。固定期間
は変化するが、通常１〜５分の間であろう。

固定した細胞全体ｋ用いることを避けるために、ワクチ
ンに混入する前に細胞表面からウイルス抗原を精製しよ
うとする場合、これは抗原に対する抗血清を有する免疫
吸着カラムに分裂した細胞を通して洗浄することによっ
て実施できる。こうして抗原は細胞表面から完全に単離
できるか、あるいは細胞からの核および細胞負の除去に
より部分的に単離するが、膜構造物に結合したままにし
ておくことができる。後者の手順は抗原に連合する核酸
（核酸は一般にワクチンにおいて望ましくない）の量を
減少するが、抗原性の大部分を保持するＯ 本発明のほかの面は、本発明に従い製造した、呼吸器シ
ンシチウムウイルスに対して特異性のウイルスの１種ま
たは２種以上の免疫原的に有効量、たとえば、１ｘ１ｏ
’〜４　Ｘ　１　０’の固定細胞／投与、全製薬学的に
許容しうる担体または希沢剤と一緒に含有する、ワクチ
ンとしての使用に適した製薬学的組成物にある。抗原は
前述のように、固定された細胞の表面上に存在すること
ができ、あるいは部分的に１たは完全に単離された形で
あることができる。必要に応じて、組成物は本発明のＲ
ＳＶ細胞表面の抗原以外の抗原を、細胞と連合してまた
は分離した実体として、含有し、こうして多ワクチンを
形成することができる。このような抗原の例は、ＢＶＤ
Ｖ，　　バラインフルエンザウイルス３　（　Ｐｉ　−
３　）型、ＭｙｃｏｐｌａｓｍａｄｉｓｐａｒおよびＭ
ｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｂｏｖｉｓ　抗原である。

組成物は適当な固体または液体の形であることができ、
そして非経口的または経口的投与の普通の方法で投与で
きる。こうして、組成物は、たとえば、注射溶液の形あ
るいは錠剤、カプセル剤、溶液、懸濁液または乳濁液の
形であることができる。これらの組成物に使用するのに
適当な担持または希釈剤はフロインド不完全補助液（Ｐ
ＩＡ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕ
ｍｌｃ，　ｐａｒｖｕｍ）およびＱｕｉ凰一Ａであり、
好ましくはＱｕｉｔ　　Ａであり、Ｑｕ　ｉ　Ｉ−Ａは
部分的に精製したサポニンであ９そして注射部位におい
て少ない反応を生成する。ヒトまたは動物に呼吸器シン
シチウムウイルスにより生じた疾患、必要に応じて、他
のウイルス疾患に対して、ヒトまたは動物に前述の組成
物を投与することによシ、ワクチン接種できる。

本発明に従い製造した、ウイルス抗原を有する細胞、あ
るいは完全にまたは部分的に学離したウイルス抗原を使
用する他の方法は、′Ｒ．Ｓｖにより生じた疾患を、ヒ
トまたは動物から採取した生物学的試料、たとえば、血
清中のＲ，ＳＶ抗休を検出することにより、診断する方
法である。免疫学的診断法をこの目的に使用できる。す
なわち、定性的沈殿技術を使用できるが、好ましくは定
量的技術を使用し、たとえば、免疫吸着法を使用する。

この方法において、抗原は、たとえば、血清試料らばク
ラス間の分布を決定する。あるいは、未知量の抗体を含
有する試料による放射線標識抗血清の結合の阻止を含む
ラジオイムノアツセイ（ＲＩＡ）を使用できる。しかし
、好ましくは、免疫螢光技術を使用し、ここでフルオレ
セインまたはローダミンのような螢光マーカーをウイル
ス抗体へ結合させ、そしてマークした抗原への抗体の結
合を検出する。

また、本発明の抗原または細胞系統は、固相へ結合させ
、親和性精製において使用して、ＲＳｖ抗体を生物学的
試料から、前記試料を固相へ接触させ、引き絖いてｒ＜
，ｓｖ抗体金固相から分離することにより、単離できる
。

また、本発明は、本発明に従って製造したウイルス抗原
を有する細胞をその栄養培地中で生体外培養することか
らなる、前記細胞の増殖法全提供する。

このような培地は、必須の塩類、アミノ酸類およびビタ
ミン類を含有し、生理学的ｐＨに緩衝し、成長促進物質
、たとえば、動物血清全補充した、等張培地であること
ができる。一例は表１において後に示す器官培地である
。こうして、本発明の方法によって製造された細胞系、
統は、成長させ、継代接種してウイルス特異性抗原の製
造全最高とすることができる。別法として、それら全液
体窒素中に保存し、これから必要Ｋ応じてそれら全回収
して前記抗原の入手容易な源とすることができる。ジメ
チルスルホキンド゜と床結慄獲削！一Ｌ　イ’Ｚ用する
ことが望ましい。

細胞の培養法は器官培養、組織培養または細胞培養によ
ることができるが、器官片付近からの則胞の増殖がウイ
ルス特異性抗原を提供するとき、望ましくは、器官培養
による。たとえば細胞の収量を増加することができ、そ
れゆえウイルス特異註抗原の収量を増加できる、いかな
る既知の方法を使用することもできる。こうして、成長
培地はこの目的に適合することがあり、たとえば、イン
シュリン金、たとえば、５μｙ／ａｔの濃度で加えるこ
とができ、あるいは細胞は回転培養、セファローズビー
ド培養または懸濁培養に適合することがある。ほかの別
法として、細胞、たとえば、リンパ腫、骨髄腫または線
維芳細胞に融合して、それらをよりいっそう急速に増加
し、こうしてウイルス抗原が形成する速度を増加するこ
とができる。

後者の技術は、ウイルス抗原を結合する粘膜細胞膜が接
種すべきヒトまたは動物における抗宿主反応を起こしう
る場合、とぐに有用であろう。これらの反応全減少する
ため、膜全接種すべきものと同じ種の細胞から誘導する
ことができる。あるいは、動物から誘導された細胞の系
統をヒトの線維芽、骨髄腫またはリンパ腫の，ｙ＋ｌＩ
Ｉ胞と融合させて、ヒトのワクチンにおける使用に適し
た融合細胞を生成できる。望まし〈ぱ、上に示したよう
に、このような融合した細胞は核酸のレベルを減少する
ために除去されたその核および細胞Ｍを有ｔｙ　、ヒト
のワクチンにおける望ましくないとしばしば考えられる
。

また、本発明の１つの面を形成する特定の，細胞系統（
ＮＭ５と標示）が製潰され、これは、Ｔ｛，ＳＶを接種
したとき、本発明に従いその細胞表面にウィルス特異性
抗原を生成できる。ＮＭ５は他のウイルスの抗原全含有
し、同時にこれらの抗原全復製することができ、こうし
て多ウイルスワクチンを生成する潜在能力を有する細胞
系統を提供する。

ＮＭＳ中に接種できる他のウィルスの例は、ＢＶＤＶで
ある。細胞系統ＮＭ５に相当するが、培養中実際に凡Ｓ
Ｖで感染された細胞菌株をＮＭ７と標示し、これは本発
明のさらに他の態様を形成する。それは、少なくともい
くつかの継代接種において、細胞個体群の１００％上の
Ｒ，ＳＶに対して特異性の抗原を有することが示された
０２つの細胞系統ＮＭ５およびＮＭ７は、次の方法で製
造した。

鼻の粘膜をウシの胎児（ＳＷ１２９）から切除し、ほぼ
５ｍｍＸ５＋ｏ＋の正形に切り、プラスチック製ベトリ
皿の前もって引っかいた領域に置く。次いで器官培地（
組成は下表１参照）ヲ、有毛上皮がおおわれるまで、加
えた。次いで、皿を３５℃で３日間培養した。

培養物を反射光で検査し、激しい毛の活性をもつものの
み全使用した。呼吸シンシチウムウイルス（ＲＳ■）の
１０００プラク形成単位（　ｐｆｕｌ全８つの培地に滴
下し、そして他の８つの培地は接種しない対照として作
用した。ウイルスを３５℃で２時間吸収させた後、培養
物を培地中で３回洗い、３５℃でさらに培養した。培地
を各週２回変え、試料をウイルス感染度の滴定のため集
めた。

感染後１４日まで、細胞は感染した培養物と対照の培養
物の両方の鼻粘膜組織のまわりのプラスチック上で広く
増殖した０器官培養物片を取り出した後、増殖した細胞
を３７℃でトリプシンーペルセン溶液と一緒に保温する
ことにより除去した。

（トリフシンーベルセン溶液はＥＤＴＡ（ｌＪン［％１
塩緩衝食塩水中の０．０２％）およびＤｉｆｃｏ１　：
　２　５　０　トＩＪプシン（リン酸塩緩衝食塩水中の
０．２５％＋｛ｉ＝４：１の比（体積）で含有した。細
胞全成長培地中に再野濁し、４オンスの医学的平らなび
ん中に接種した。１週間後、１つのびんからの細胞を２
つ中に接種した。感染しない培養物から誘導された紬胞
系統ＱＮＭ５と名付け、そしてＮＭ７の，′＠胞表面上
のウイルス特異性抗原は本発明の池の態様を表わす。

細胞系統ＮＭ７は、呼吸器シンシチウムウイルスとまた
その膜細胞表面上にそのウイルスに対して特異性の抗原
ｋｍ有する細胞系統であり、そして本発明の方法に従っ
て製造した生成物である。

Ｔ｛，　Ｓ　Ｖで感染しない対応する細胞系統ＮＭ５も
、細胞系統ＮＭ７４ＲＳＶによる感染の診断に使用する
とき、本発明において重要である。こうして、それは、
対照として使用することができ、ウイルスおよびウイル
ス抗原をもたない以外すべての面で、それは細胞系統Ｎ
Ｍ７と同一である。あるいは、それ自体を、細胞培養物
として双使用して、Ｒ，ＳＶまたは他のウィルスを接種
し、そしてウィルスを成長させると同時にウィルス抗原
を製造することができる。

細胞系統ＮＭ５およびＮＭ７は、パリのパスツール研究
所のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ
ｅｓに１９８０年６月２５日に保管し、それぞれ受け入
れ番号Ｉ一１２４およびＩ−１２５ｋ付された。それら
は、次のように特徴づけられる： 両方のＮＭ５およびＮＭ７の細胞は、ガラスに結合した
とき、線維芽にかつ紡錘形に見え、長さが１００μｍま
でである。懸濁液中の丸い＋細胞は直径が１０μｍであ
る。ＮＭ７の１チ〜５％は多核の大きい則胞である。Ｎ
Ｍ５の極薄切片の電子顕微鏡検査は、電子密な破片と細
胞表面上に少数の微小絨毛を含有する高度に空腔形成し
た細胞質を明らかにする。ＮＭ７細胞において、空胞ぱ
増加し、微小絨毛は増殖しており、１つの領域において
極性化してみえる。また、多くのＮＭ７細胞は、密な細
胞質内封入を含有する。

ＮＭ７細胞内の抗原の範囲は、クルクルアルデヒド固定
ＮＭ７細胞でワクチン接種したウゾから得た血清を用い
て３５８メチオニン標￥ｅ．ＲＳウイルス感染ウシの腎
細胞の免疫沈殿により、決定した。

すべての既知のウイルス特異性ポリベプチドの’３％い
沈殿が観測され、それに加え、１７．０００グルトンの
従来認識されないタンパクが検出された（下表２参照）
。このことから明らかなように、グルタルアルデヒド固
定ＮＭ７細胞は、完全に免疫原型の１｛，ＳＶ抗原の完
全な補体を含有する。抗原は、後の実施例４において示
されるように、Ｉｇ（｝型、■ｇＧ２型およびＩｇＭ型
の抗体全上昇継代接種２２および２７におけるＮＭ５お
よびＮＭ７の両者からの染色体の調製物はウシの雄の主
として末端動原体の常染色体、長い次中部動原体Ｘの染
色体および中部動原体Ｙの染色体の特性を明らかＫした
。５８ＮＭ５核および６５ＮＭ７核の染色体を計数し、
これは細胞の６０チを超え、５５と６４との間であり、
ウシの二倍体の数６０に近い。細胞の悪性転移を説明し
、かつ細胞をワクチンとしての使用に不適とする、倍数
体または主要な異数体の数の証拠は存在しない。

細胞系統ＮＭ５およびＮＭ７の継代接種の歴史（ｐａｓ
ｓａｇｅｈｉｓｌｏｒｙ）　ｆ検査した。ＮＭ５および
ＮＭ７の両者を毎週１〜２つのびんから継代接種し、５
〜７日で、継代接種約３５まで、合流単一層を形成した
。その後、細胞分割は遅くなり、継代接種５０までに停
止した。

継代接種５〜５０の間で、すべてのＮ　Ｍ　７細胞は、
アセトン固定細胞を螢光抗体で染色することにより示さ
れるように、それらの細胞質中にＲ，８Ｖ抗原を含有し
た。

培地中に流入したウィルスの量（　Ｉ　Ｏｇ１ｏ　ｐｈ
ｙ’ｍｌ　ｌと、種々の継代接種レベルにおける、表面
上に抗原を担持するＮＭ７細胞の百分率（チＳＦＡ）′
！ｉｌ−、第１図に示す。解放されたウィルスの力Ｉｉ
ＩｔｉＦｉ、継代接種３における１　０”　ｐ　ｆ　ｕ
　／ａｔから継代接種６における１　０”’　ｐ　ｆ　
ｕ　／ｄに低下し、そノ後継代接種約３０まで１０２〜
１０３の間を変動し、その時から力価は徐々に低下して
結局ウィルスは継代接種５０″！．でに検出できなくな
った。几ＳＶ抗原を表面上に担持する細胞の比率は継代
接種２１における１００チまで上昇し、そこに継代接種
約３０までとどまり、その後多少の変動が生じた。

ＮＭｓおよびＮＭ７の１細胞を、９つの場合において液
体窒素の貯蔵から回収した。それらは各回本質的に同じ
継代接種の歴史を有した。

継代接種２０〜３０の間のＮＭ５およびＮＭ７ａ＋胞’
ｔ，ウシのシンシチウムウイルスまたはウシのウイルス
の下痢ウイルスに対して特異性の螢光抗体で８回染色し
、絶えず陰性であることが示された。両者の系統からの
，細胞−１、Ｒ，ＳＶ抗体の存在で子ウシの腎細胞と子
ウシの精巣の単層中に２回接種した。細胞培養物を６週
間継代接種したにもかかわらず、細胞変性剤１は検出さ
れなかった。

細胞系統をさらに特性ずけるため、５種のウシのウイル
スの復製を支持するＮＭｓおよびＮ〜１７の細胞の能力
を検査した。この検査において、単層培養物を、継代接
種１６〜３０の間において、バラインフルエンザウイル
ス３（Ｐｉ−３）型、ウシウイルスの下痢ウイルス（Ｂ
ＶＤＶ）、ウシのラインウイルス１（ＲＶ−１）型のＳ
Ｄ　−系統、ウシのラインウイルス２（ＲＶ−２）型の
ＥＣ−１１系統および呼吸器シンシチウムウイルスで接
種した。ウイルスヲ細胞に３７℃において２時間吸収さ
せ、次いで培養物を３回洗い、洗浄直後と、３、７、１
０および１４日後に試料を採取した。結果を下表３に示
す。Ｐ　ｉ　−　３およびＢＶＤＶは、ＮＭ５およびＮ
Ｍ７細胞において高い収量を生成した。２つのラインウ
イルスはＮＭ５細胞におけるよりもＮ　Ｍ　７　ｉ｛Ｉ
Ｉ胞において高い力価全生４成したが、この効果ｆｉＮ
Ｍ５においてまったく復製しなかったＫＶ−２の場合最
も著しかった。Ｒ，８ＶはＮＭ５細胞中で増加したが、
ＮＭ７細胞中では増加しなかった。このような自己重複
感染（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　　ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎ
ｃｅ）ｌｏ６／ａｔ）ｋｍ々の時間４℃において０．　
０　７　５％のグルタルアルデヒドで処理した。１分後
、感染性は吸壊された。しがし、螢光抗体にエリ染色さ
れた細胞の涸体数は１５分後変化しな刀瓢っだが、螢光
の強度は５分後低下した。このデータが示すように、５
分『Ｂ］同定された細厠に抗原性であったが感染性では
なく、それゆえワクチンへの混入に適当であった。別法
として、抗原に、こＱＪようなワクチンに混入すク前に
、ＮＭ’ｌ細＠刀）ら郡分的に筐７ｃは児全に単朧でき
クＯ ＮＪ冒７細＠めクいほそれらＣ／Ｊ郡分的にまたは完全
に単点されたウイルス抗原は、前述の診断およびＭＰ−
離の技術に２いても肩用であク。ＮＭ７細胞ヶ用いて診
断試＠を実施丁０とき、ＮＭ５細胞ケ対照として使用し
て試験ｒ反榎すクことが望ましい。

果ＩＭ列　ｌ １２匹の子ウシＱ、Ｍａｒｋｏｌ−Ａｒｌａｃｅｌ　Ａ
油アジュパント中に乳化した４κ１０’のグルグルアル
デヒド固ｉＮＭＴ細胞（ＧＦＣ）で皮下的にワクチン接
種した。３週間後、２回の投与を３週間の間隔で行ない
、これらの子ウシｆ１０”ｐｆｕの住きていクＲＳＶで
鼻内に攻撃した。すべての子ウシは血ｍ字的にワクチン
に対して単一の放射浴血試験にエリ応答し、そして７匹
は中和試験に工り応答した（下表４参照）。攻撃後、た
だし１匹のワクテンｆ＆ねした子ウシは感染し、ただ１
日だけウイルス？流出したが、こｎに比べて９匹のワク
チン接植しない子ウシはすべて感染し、５〜１１日間ウ
イルスケ流出した。

？施Ｅ２り　　２ ６匹の子ウシ刀）ら成ｏグループに、グルタルアルデヒ
ド固定ＮＭ７細胞ケ７ロイント不完全アジュパントと一
緒に２　Ｘ　１　０’　〜ｌκ１０５涸の細ｊＱの量で
、投与した。２回の投与ケ皮下的に行い、そして子ウ／
？第２回の投与後６週間で採血した。

抗体の応答？単一放射浴血（ＳＲＲ）、中オロおＬびラ
ジオイムノアツセイ（ＲＩＡ）にエリ《地足した。結果
ケＦ表５に記■依すク。この茨５７Ｉ）ら明らからよう
に、１更用した抗原の希釈範囲において生成てれた抗体
に２け■有慧差は存在しなかった。

果施例　３　　多ワクチン グルタルアルデヒド固定細胞ＮＭＴ細胞（ＧＦＣ）ｉ２
κ１　０’／投与で、ノくラインンルエンザウイルス３
型、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　　ｄｉｓｐａｒ　　抗原２
工びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ　　ｂｏｖｉｓ　［Ｉｆｉと
一躍にして多ワクチンを生成し、ＮＭ７細胞単独のワク
テンと比奴した。両刀のワクチンに７ロイント不完全ア
ジュバントｔ含有し、３遍闇の間隔で３回反下注射した
。ワクチンにエリ誘発ざれたＲＳウイルス抗体？単一放
射浴血にエリ測定し、粘果葡下衣６にａｅ賊″Ｔ心。

多ワクチン冫投与したｌＯ匹の子ウソの平均のゾーン面
積はＮｔｖｌ７細胞単独ケ投与した９匹の子ウシＣｔＶ
それエリも１　９．　２　ｚ＋＊’小さかったが、差は
現計的に有意でな〃＼つだ。各グループの３匹の子ウシ
お工びＭ’．ｂｏｖｉｓ　ｆ投与した３匹の子ウシケ、
ワクチンの最後の投与後３刀）月において、午きている
ウイルスで攻翠した。ＲＳウイルスは、Ｍ．ｂｏｖｉｓ
　ｆ投与した３匹の子ウシ、多ワクチンケ投与した３匹
の子ウシの１四２工０：　ｔｌ　Ｓ　＋７　クテンケ投
与した３匹の子ウシのＯ匹から、それぞれ回収された。

人施レ１」４ グルタルアルデヒド固足＃ｌ施（ＧＦＣ　）　（２　×
１０’涸のｍｌｊ胞／投与）ケ３種の異なクアジュバノ
ト、丁なわち、７ロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ
）；　Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ
（Ｃ．ｐａｒｖｕｍ）９１びＱｕｉｌ−Ａと一砧にした
。子ウシのうちで、６匹ににＧＦＣお工びｌＩ′ＩＡ２
与え、３匹にＧ　Ｆ　Ｃ　オｘびＣ．　ｐａｒｖｕｍ（
５〜／投６）を与え、３匹にＧＦＣｓ．−ｘびＱｕｉｌ
−Ａ（ｉｘ９／投与）を与え、そ（，Ｃ３匹ＶＣＧＦＣ
のみケ与えた。９匹の子ウシをワクチン不投与対照とし
た。各ワクチンヶ３週間の間隔で２回皮下投与した。

ワクチンに対す◇抗体の応答は、第１回のワクチン投与
前と弟２回のワクチン投与俊３過間において巣めた血ｍ
について、中和試験お工び単一放肘浴血（　Ｓ　Ｒ　ｌ
ｉ　）試吸にＬｔ）、評洒した。紹果紫、それぞれ次７
お工び衣８にｇｒ：．ｇｆ　Ｏ。

これらの結果が示″ｒＬうに、ワクチン孕接種しない励
吻およびアジュバントを含まないＧＦＣｆ投与した′ｉ
ｉＪＪ物において応答はまったくな刀１つだ。

ＷＨのＳＲＨ応答は、ＧＦＣおよびＣ　．　ｐａｒｖｕ
ｍ冫投与した３匹の子ウシのうちの２匹に見られ７’ｉ
ｌ：ｏし刀ユし、ＧＦＣお工びＦＩＡとＧＦＣおよびＱ
ｕｉｌ−Ａ’６それぞれ投与した子ウシの応答は、Ｇ　
Ｆ　Ｃ　オｘびＣ　．　Ｐａｒｖｕｍ　１，ｚ＋投与ｔ
，７Ｃ子ウシの応答エリも、両方の血清学的試験にエク
と、太き刀１つだ。

各試験において生成したＲＥＶに対す０抗体のクラスケ
、ラジオイムノアツセイ（ＲＩＡ）により決定した。結
果ケ下表９に記載すク。

抗体はワクチン不接独子ウシにおいて検出されず、ソし
てわず刀１に低いレベノレのｚｇａ，お工びＩｇＭがＧ
ＦＣのみヶ投与した子ウシにおいて検出されｗ。ＧＦＣ
ｓ，−ｘびＣ．ｐａｒｖｕｍ’ｚ投与した子ウシにおい
て、Ｉｔ）Ｇ，，ＩｇＧ２お工びＩｇＭの平均のカイ曲
はそれぞれ１０’　　　１０”’および１０’゜１でめ
った。ＧＦＣおよびＦＩＡとＧＦＣお工びＱｕｉｌ−Ａ
ｋ投与した子ウシにおいて、Ｉ　（７　Ｇ　＋　の力１
曲はそｎぞれ１００倍および１０００倍大きかった。し
かし、Ｉｇａ２の力価ほＦ　Ｉ　Ａ．　ｆ投与した子ウ
シエリもほｌ”ｌ　１　０　０倍太き７ｌ）つたが、そ
れらはＱｕｉｌ−Ａ’ｌｚ投与した子ウシに２いて、Ｃ
．ｐαｒｖｕｍ　’ｚ投与した子ウシと比べたとき、わ
ずかに２倍大きかった。

ワクチン誘発抗体の抗原特異性冫、次の手順により決定
した。弟２回のワクチン接種後３週間で渠めｔ血ｍ紫、
憚準の放ｑ寸線標識ＲＳＶ誘兄抗原と混合し、抗原抗体
コンプレックス２Ｓｔａｐｈ．（ＬｕｒｅｕＳで沈殿さ
せ、そして沈殿したウイルス抗原ケポリアクリルアミド
ゲルの電気泳動にＬｆ）分析した。結果ケ下表１０に記
Ｉｌｌ！！す〕。

／ ／ こｎらの結果刀・ら明ら刀１な工うに、ウイルス脣弄任
ボリベプチドにＧＦＣのみケ投与した子ウシ刀）らの皿
ｍにエリｒ７Ｌ．殿しな刀▲つた。ＧＦＣお工びＣ．ｐ
αｒυｕｍ　　ｆ投与された子ウシからの血ｍに王安ナ
糖タンパク、ヌクレオプロテインと推定のマトリックス
のクンパク盆沈叙した。ＧＦＣお工ヒＦＩＡ筐たはＧＦ
Ｃお工ひＱｕｉｔ−Ａｆ投与した子ウシ刀）らの血清は
大量のすべての９つのウイルスｄ発ポリペプテド葡沈殿
したが、Ｑｕｉｌ−Ａでワクチン接種した子ウシは３　
５，　０　０　０よｔ）有意に大きい分子童のタンパク
と，１７，０００ダルトンの匠米認識さ扛ないタンパク
？沈Ｉ設した。

これら＋７−１実験の粕果が示丁工うに、Ｑｕｉｌ　−
ＡｔＱＧＦＣのフロイント不児全アジュバントと少なく
とも回８度に効果がりクエうに思われ、さらに、注射都
位におけク反応ＧＪ訝発が少ないという利点盆Ｍすり。

生体外リンパ球転換（Ｌｌ　）活性にエリ決定さ扛クエ
うな、ｔｌｓＶ特異性細胞が甲介丁り免疫會、この芙験
のためにワクチン接種した子ウシに３いて検萱した。Ｌ
Ｔ応答において言１れ０リンノ《球涸体数ｗ、フイコー
ルーイソノくク（ｆｉｃｏｔｌＩｓｏｐαｑｕｅ）こう
自己で、直接の抗イムノグロフリン赤血球ロゼット形成
後、分敵したりンノく球を用いて決定した。ＲＳＶに対
丁．ＬＴ′ｈ！５性ケ、Ｔリンパ球のみと関遅づけた。

ＬＴ応谷の太ささと血清抗体のレベルとの胃には、ウイ
ルス中和壕たは単一放射浴血試験にエリ恢出さｎＯ工う
に、１α接の相関関ｇｆ．ぱ、存在すクエうには見えな
刀・つた。

ワクチン不接機子ウシとＧＦＣのみケ与えた子ウシは、
肩怠のＬＴ−ｚ示さなかった。ＧＦＣｓ，−工びＣ．ｐ
ａｒｖｕｍ　ｆ投与された子ウシ（Ｑ　ＩＪンノ《球會
用いて、低いレベルの刺激が見えた。これと対照的に、
高いレベルのＬＴ活性はＧＦＣおよびＦＩＡとＧＦＣお
工びＱｕｉｔ　−Ａ’ｚ投与した子ウシにおいて見られ
た。第２のワクチン投与便２週曲において、平閂の刺直
指数は、ＧＦＣｓｒ工びＱｕｉｌ　　−Ａ’ｚ投与した
子ウシにおいて、ＧＦＣｓｙ工びＦＩＡ２投与した子ウ
シにおけクエリも、５倍大き刀・つた。これらの姑果ほ
、添付図面に示されてい０。

【図面の簡単な説明】

弟１図は、培地中に流入したウイルスの量（　’　ｏｑ
　＋ｏ　　ｐｆｕ　／　”　）と種々ｆＺｊｄ代接椙レ
ベルにおけ０衣而に抗原担付す．ＮＭ’ｌ削胞の自分率
（％ＳＦＡ　）ｉ示す。 第２図は、ワクテン業車投与した子ウシと、ワクチン？
投与しない子ウシにおけク、平均の刺激指数ヶ示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、呼吸器シンシチウムウイルスの抗原を表面に有する
   細胞からなる細胞系統ＮＭ７。 ２、呼吸器シンシチウムウイルスの抗原を表面に有し且
   つ該抗原が架橋剤での処理により固定されていることを
   特徴とする細胞からなる細胞系統ＮＭ７。 ３、表面の抗原がグルタルアルデヒドでの処理により固
   定されている特許請求の範囲第２項記載の細胞系統ＮＭ
   ７。 ４、呼吸器シンシチウムウイルスの抗原を表面に有する
   細胞からなる細胞系統ＮＭ７および呼吸器シンシチウム
   ウイルスの抗原を表面に有し且つ該抗原が架橋剤での処
   理により固定されている細胞からなる細胞系統ＮＭ７の
   いずれかの細胞系統の細胞の表面から部分的にまたは完
   全に単離されることによって特徴づけられる呼吸器シン
   シチウムウイルス抗原。 ５、呼吸器シンシチウムウイルスの抗原を表面に有する
   細胞からなる細胞系統ＮＭ７および呼吸器シンシチウム
   ウイルスの抗原を表面に有し且つ該抗原が架橋剤での処
   理により固定されている細胞からなる細胞系統ＮＭ７の
   いずれかの細胞系統の細胞、または上記細胞系統の細胞
   の表面から部分的にまたは完全に単離された呼吸器シン
   シチウムウイルス抗原と担体または希釈剤とからなる組
   成物。 ６、呼吸器シンシチウムウイルスの抗原を表面に有する
   細胞からなる細胞系統ＮＭ７および呼吸器シンシチウム
   ウイルスの抗原を表面に有し且つ該抗原が架橋剤での処
   理により固定されている細胞からなる細胞系統ＮＭ７の
   いずれかの細胞系統の細胞に結合された抗原、または上
   記細胞系統の細胞の表面から部分的にまたは完全に単離
   された呼吸器シンシチウムウイルス抗原を免疫原的に有
   効量で含有することを特徴とする、抗原と製薬学的に許
   容しうる担体または希釈剤からなる製薬学的組成物。 ７、呼吸器シンシチウムウイルスの抗原を表面に有する
   細胞からなる細胞系統ＮＭ７および呼吸器シンシチウム
   ウイルスの抗原を表面に有し且つ該抗原が架橋剤での処
   理により固定されている細胞からなる細胞系統ＮＭ７の
   いずれかの細胞系統の細胞、または上記細胞系統の細胞
   の表面から部分的にまたは完全に単離された呼吸器シン
   シチウムウイルス抗原を、免疫診断法に使用することを
   特徴とする、ヒトまたは動物から採取した生物学的試料
   中の呼吸器シンシチウムウイルスに対する抗体を検出す
   ることにより前記ウィルスの感染を診断する方法。 ８、診断法が免疫吸着法、ラジオイムノアツセイまたは
   免疫蛍光法を包含し、そしてヒトまたは動物から採取し
   た血清試料について実施することを特徴とする特許請求
   の範囲第７項記載の方法。 ９、呼吸器シンシチウムウイルスの抗原を表面に有する
   細胞からなる細胞系統ＮＭ７および呼吸器シンシチウム
   ウイルスの抗原を表面に有し且つ該抗原が架橋剤での処
   理により固定されている細胞からなる細胞系統ＮＭ７の
   いずれかの細胞系統の細胞、または上記細胞系統の細胞
   の表面から部分的にまたは完全に単離された呼吸器シン
   シチウムウイルス抗原と、生物学的試料を、固相におい
   て接触させ、引き続いてウィルスの抗体を固相から分離
   することを特徴とする、生物学的試料から呼吸器シンシ
   チウムウイルス抗体を単離する方法。 １０、呼吸器シンシチウムウイルスの抗原を表面に有す
   る細胞からなる細胞系統ＮＭ７を、その栄養培地中で培
   養することを特徴とする細胞系統の増殖方法。 １１、呼吸器シンシチウムウイルスの連続的な伝染性を
   ふくまずに再現しうるセルラインを単離する方法であっ
   て、第１の培養において、ヒト又は動物の気道に由来す
   る粘膜を合成培養媒体中固体基質上で培養し、得られる
   器官培養物から毛様活性を示す培養物を選択し、さらに
   第２の培養において選択された器官培養物を新しい合成
   培養媒体中固体基質上で培養し、器官培養物からおよび
   固体基質から器官培養物の周囲に増殖した細胞を分離し
   、そして分離した細胞を成長媒体中に懸濁させて所望の
   セルラインを与えることを特徴とする方法。 １２、第１の培養を約３５℃で約３日間実施する特許請
   求の範囲第１１項に記載の方法。 １３、第２の培養を約３５℃で約１４日間実施する特許
   請求の範囲第１１又は１２項に記載の方法。 １４、培養媒体が第１表に定義したとおりのものである
   特許請求の範囲第１１〜１２項のいずれかに記載の方法
   。 １５、第２の培養において、培養媒体が１週に２回交換
   される特許請求の範囲第１１〜１４項のいずれかに記載
   の方法。 １６、固体基質がプラスチックの表面である特許請求の
   範囲第１１〜１５項のいずれかに記載の方法。 １７、細胞が付着している基質を、３７℃で、トリプシ
   ン／ベルセネ溶液を用いて培養することによって、該基
   質から細胞を移動させる特許請求の範囲第１１〜１６項
   のいずれかに記載の方法。 １８、粘膜がウシ粘膜である特許請求の範囲第１１〜１
   ７項のいずれかに記載の方法。 １９、粘膜がウシ胎児鼻粘膜である特許請求の範囲第１
   ８項に記載の方法。 ２０、基質から分離された細胞がＳＷ１２９ＮＭ５（Ｃ
   ＮＣＭ　Ｎｏ． I −１２４）として同定された細胞で
   ある特許請求の範囲第１９項に記載の方法。 ２１、合成培養媒体中に懸濁したＳＷ１２９ＮＭ５（Ｃ
   ＮＣＭ　Ｎｏ． I −１２４）。 ２２、固体基質上のＳＷ１２９ＮＭ５（ＣＮＣＭ　Ｎｏ
   ． I −１２４）。 ２３、呼吸器シンシチウムウイルスに対し特異性の抗原
   を、その細胞の表面へ担持するのを誘発できる細胞系統
   ＮＭ５。