JPS60248179A - 家禽アデノウイルス２型の増殖方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、七面鳥、ニワトリ、キジ等の様々な家禽類の
疾患に関係する家禽アデノ（ＡｖｉａｎＡｄｅｎｏ　；
　ＡＡ）ウィルス■型の予防に関する。さらに、本発明
は、ＡＡウィルス■型〔七面鳥の出血性腸炎ウィルス、
キジのマーブルスジリーン病（Ｍａｒｂｌｅ　５ｐｌｅ
ｅｎ　Ｄｉｓｅａｓｅ）　ウィルス、ニワトリの肺肝ウ
ィルス〕に対するワクテ／、その調製およびその使用に
関する。ＡＡウィルス■型により起きる疾患に対するワ
クチンは本発明の細胞培養システムで調製される。

家禽アデノウィルスは血清学的にみてｌ型または■型の
いずれかに属するものとして分類される（Ｄｏｍｅｒｍ
ｕｔｈ＋　Ｃ＋Ｈ＋　ら、［Ａｖｉａｎ　ａｄｅｎｏｖ
ｉｒｕｓＧｒｏｕｐ　Ｉｌ、　Ｔｈｅ　Ｈｅｍｏｒｒｈ
ａｇｉｃ　Ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ　−Ｍａｒｂｌｅ　５ｐ
１ｅｅｎ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖｉｒｕｓｅｓ　Ｊ家禽類
の疾患に関する第４９回北東部会議、１９７７年、オン
タリオ州、ゲルフ、ゲルフ大学で提出、ＭｃＦｅｒｒａ
ｎ、　Ｊ、Ｂ、によるＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ　ｏｆ
Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ　Ａｎｉｍａ：ｉｓ　’（Ｃｏｍ
ｐａｒａｔｉｖｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆ　Ｖｉｒａ
ｌ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　第■巻、第３章：　Ｅ、Ｋｕｒ
ｓｔａｋとＣ，Ｋｕｒｓｔａｋ　（編）、Ａｃａｄｅｍ
ｊ、ｃ　Ｐｒｅｓｓ、　）ロント、１９８１年、ｐ、、
１０２〜１６５〕。普通の沈降性抗原によるニワトリ胎
児致死性オーファンウィルＸ（ＣＥＬＯ）に関係するア
デノウィルスは家禽アデノウィルスｌ型であり、少なく
とも１２の血清タイプがあると思われる。家禽アデノウ
ィルス■型は、七面鳥の出血性腸炎、キジのマーブルス
ジリーン病およびニワトリの肺肝を伴なう非マレック病
（マーブルスジリーン病）の原因を含む。

それゆえＡＡウィルス■型は家禽類の経済的に重要力疾
患であり、家禽産業における毎年の損失は一億ドルを数
える。寒天ゲル沈降試験に基づけばウィルス１型とＩｌ
型の間には倒らの交差反応も見られないが、しかしなが
らこれはむしろ感受性の低い試験システムであり、それ
ゆえ２つの型におけるウィルス間の血清学的関係の可能
性を全く無視することはできない。

本発明は、ＡＡウィルス■型のインビトロ増殖について
好結果が得られる方法、および疾患に関係するＡＡウィ
ルス■型の予防に′おいて有効なＡＡウィルス１１型ワ
クチンの製造に対しこの方法を適用することに関する。

Ｃ、Ｈ、Ｄｏｍｅ　ｒｍｕｔｈらの報告〔’ｖａｃｃｉ
ｎａｔｉｏｎｆｏｒ　Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　Ｅｎｔ
ｅｒｉｔｉｓ　ｏｆ　Ｔｕｒｋｅｙｓ”Ａｙｉａｎ　Ｄ
ｉｓｅａｓｅｓ＋　２　Ｌ　５５７〜５６５．１９７７
：”Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｊ、ｎｇ−Ｎｅ
ｃｋｅｄ　Ｐｈｅａｓａｎｔｆｏｒ　Ｍａｒｂｌｅ　５
ｐｌｅｅｎ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ”　ＡｖｉａｎＤｉｓｅ
ａｓｅｓ、２３＋　３０〜３８＋　（１９７９）　）　
およびＪ、Ｔｈｏｒｓｅｎ　らの報告（”Ｆｉｅｌｄ　
Ｔｒｉａｌｓ　ｏｆａｎ　工ｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ　
Ｐｒｏｃｅａｕｒｅ　ＡｇａｉｎｓｔＨｅｍｏｒｒｈａ
ｇｉｃ　Ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ　ｏｆ　Ｔｕｒｋｅｙｓ”
　ＡｖｉａｎＤｉｓｅａｓｅｓ、　２　ｆ５＋　４７３
〜４７７　、）　にあるように、七面鳥の田作性１揚炎
およびキジのマーブルスジリーン病はウィルスの無毒性
株でワクチン接種することによシ予防することができる
。

簡便さのために、ワクチンウィルスは通常飲料水中で若
鳥に経口投与されているが、しかしながらたとえば霧状
散布まだは静脈注射もしくは筋肉注射のような他の接種
経路でも良い。最近までＡＡウィルス■型を細胞培養法
または家禽胎児を用いて増殖させることができなかった
。このためワクチンウィルスは、七面鳥のひなに感染さ
せ、数日後これらを殺し、肺臓を取り出し、他の鳥に与
えたとき保護をもたらすに十分なウィルスを含む肺臓組
織の粗ホモジネートを調製することによシ製造されなけ
ればならなかった。

このワクチン製造法には幾つかの不利が伴なう。

第一に、病気にかかっていない多数の鳥を隔離して育て
る必要がある。第二に、外部からの物質たとえば丹毒菌
の菌種または他のウィルスでワクチンを汚染するという
ことも起こりうる。第三に、各パッチにおけるウィルス
の量を測定する簡単な方法がないのでワクチンのイＪ効
性を標準化することが困難である。最後に、ワクチンは
組織酵素が存在するため不安定であり、それゆえ−７′
０℃で貯蔵しなければならない。粗製牌ホモシネ〜トか
らワクチンを精製する手段も報告されているが、これら
の技術は上述した欠点を完全に克服するものではない。

Ｆａｅｉｎａら（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　５ｔｕａｉｅ。ｏ
ｆ　Ｈｅｍｏｒｒ−ｈ４ｇｉｃ　Ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ　
Ｖｉｒｕｓ　ｗｉｔｈ　Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏ　−ｒｅ
ｓｃｅｎｔ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、
　Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅ。

２６．１５０〜１５７（１９８２））は、ＨＥＶによる
ニワトｌ／、七面鳥およびキジの細胞のインビトロ感染
について説明しているが、これらの家禽細胞培養におい
てウィルスを継代する試みはすべて失敗している。ワク
チンウィルスの連続したインビトロ増殖法がなく、感染
した嶌から得た牌ホモジネートをワクチン製造に使用す
ることが免疫を起させるために手に入れうるただ１つの
方法である。最近、Ｎａｚｅｒｉａｎら［：　Ｅｓｔａ
ｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆＢ−Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔ
ｏｉｄ　ｃｅｌｌｌｉｎｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｍａｒｅｋ’
５Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖｉｒｕｓ−ｊ、ｎｄｕｃｅｄ　Ｔ
ｕｍｏｒｓ　ｉｎ　Ｔｕｒｋｅｙｓ”。

■ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｃ
ａｎｃｅｒ　２９　：６３〜６８（１９８２））　、　
Ｌｉｎ　ら　（Ｅｓｔａｂｌｊ、ｓｈｍｅｎｔｏｆ　Ｌ
ｙ、ｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ　ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅｓ
、ｆｒｏｍ　Ｍａｒｅｋ’５Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｐｒｉｍ
ａｒｙ　Ｔｕｍｏｒｓ、　Ｐｏｕｌｔｒｙ　５ｃｉｅｎ
ｃｅ。

６２．１９０２〜１９０５（１９８３））は、マレック
病（ＭＤ）　ウィルス、すなわちヘルイスウイルスに感
染した七面鳥の腫瘍からリンパ芽球様細胞ラインを樹立
した。さらに、米国特許第４，３８８，２９８号（Ｎａ
ｚｅｒｉａｎら）にはＭＤＴＣ−ＲＰ−１９と呼ばれる
七面鳥のリンパ芽球様細胞ラインに出血性腸炎ウィルス
（）ＩＥＶ）　を増殖させる方法について記載されてい
る。しかし女から、これはマレック病ウィルスで潜在的
に感染された形質転換細胞ラインであり、それゆえワク
チン製造Ｖは適さないことがある。

Ｐｅｒｒｉｎら（Ｈｅｍｏｒｒｂａｇｉｃ　Ｅｎｔｅｒ
ｉｔｉｓ　ｏｆＴｕｒｋｅｙｓ；　Ｃｕｌｔｕｗｅ　ｏ
ｆＶｉｒｕｓ　工ｎ　Ｖｉｔｒｏ。

Ｂｕｌｌ、Ａｃａｄ、Ｖｅｔ、ｄ、ｅＦｒａｎｃｅ＋　
５４＋　２３１〜２３５＋（１９８１，）　）は、肺臓
細胞培養７ステムをＨＥＶ／ＭＳＤウィルスのインビト
ロ複製に用いる予備研究について概略を述へている。Ｐ
ｅｒｒｉｎらによるこの実験は、はとんど白血球細胞か
らなる細胞システムにおいてＲＥＶ／ＭＳＤウィルスが
複製することを示唆するが、しかしながらその結果は確
定しているようには見えない。さらに、この研究はイン
１１０における数回植え継ぎの影響を立証するのに失敗
し、ウィルスをワクチンへ入れる試みを行なっていない
。

それゆえ、家禽アデノ　（ＡＡ）　ウィルスを培養する
これ捷での試みは、上述したＮａｚｅｒｉａｎの場合を
除いで不成功に終っている。これについて幾つかの説明
がある。ＡＡウィルス■型で感染されやすい適当な細胞
の種類を選択することが、インビトロでのこれらウィル
スの増殖を最終的に成功させるのに決定的な錠である。

たとえはこれまでの実験ではニワ）　リおよび七面鳥の
線維芽細胞培養物まだはニワトｌ）および七面鳥の腎臓
線維芽細胞培養物が用いられた。これらの培養物はウィ
ルスの増殖を支持しなかった。しかしながら白血球は自
然に感染した鳥における標的（ｔａｒｇｅｔ）細胞であ
る。鳥におけるこの自然の感染しやすさが細胞の種類を
選択する基本であった。

実験の成功に決定的である別の面は、感染した細胞と非
感染細胞を区別する能力である。ＨＥＶおよび他のＡＡ
ウィルス群■型のウィルスと特異的に反応する単クロー
ン性抗体の開発によって、非常に高感度の蛍光抗体試験
が確立された。この試験は非常に低レイルのウィルスの
検出を許す。

他の研究者は、七面鳥で産生きれたＨＥＶ抗血清を使用
しているため感染細胞と非感染細胞とを区別することが
できなかったものと思われる。これによりバックグラウ
ンドまだは非特異的蛍光が増大する結果となり、試験の
感度および特異性をがなり低下させる。さらＫ、他の研
究者とシわけＰｅｒｒｉｎらは、細胞培養物中の感染ウ
ィルスの存在を試験するとき、最初の接種材料からの残
存ウィルスを高レベルに含有子る細胞培養物上清を検査
する傾向にあった。一般にアデノウィルスの９０％以」
−は細胞内に残り、それゆえこの理由のために細胞およ
び細胞抽出物を検査した方が細胞培養物における感染ウ
ィルスの増殖をより正確に示すことになると思われる。

実験の成功を強める他の面は、培養基に増殖促進因子と
、してＡＡウィルス■型に対する抗体を含まない血清を
使用することである。これまで多くの研究者は血清中の
抗体の存在を検出するために寒天ゲル沈降試験を用いて
きた。この試験は特異的ではあるが高感度ではない。血
清中のＨＥＶ抗体を測定刊−るために非常に高感度の酵
素連結イムノ　ンルベントアツセイ（ＥＬＩＳＡ）が開
発されたことにより、血清中の非常に低レイルの抗体を
検出することができるようになった。これにより培養基
へ七面鳥の血清を入れる前にこの血清を非常に正確にス
クリーニングすることができる。はとんどの七面鳥（そ
してたぶんニワトリもＰＪｍに）の血清はＡＡウィルス
■型の抗体を含んでいるため、培養基へ血清を入れる他
の研究者は、寒天ゲル沈降試験でスクリーニングしてい
るとは言え、恐らく同時に抗体をも培養基へ入れること
になるであろう。これらの抗体はウィルスを中和するこ
とができ伝染性を妨げるかまたはその度合を減少させる
。

ＡＡウィルス■型のインビトロ増殖方法は、ＡＡウィル
ス■型で感染されやすい白血球を家禽類の体組織または
体液（以下一般に組織という）から単離し、これを培地
で増殖させる方法により行なわれる。続いて、この細胞
をＡＡウィルス■型で感染させ、細胞丙で複製の期間経
過後、このウィルスを白血球細胞培養物から採取する。

この、方法はＡＡウィルス■型の毒性および非毒は株の
いずれの増殖にも有効である。また、七面鳥の出血性腸
炎（ＨＥ）、キジのマーブルスジリーン病（ＭＳＤ）、
牌臓を伴なうニワトリの非マレック病（ＳＶ）ならびに
与えられた家禽類におけるＡＡウィルス■型で起こされ
る他の関連した病気に有効なワクチンの製造にも効果的
である。

本発明の一面は、次の段階からなる家禽アデノ（ＡＡ）
　ウィルス■型のインビトロ増殖方法を提供するもので
ある： ａ）家禽類の肺臓、血液、骨髄または他の組織から採取
した、前記ＡＡウィルス■型に感染されやすい白血球を
単離し、 ｂ）これら白血球を適当な増殖培地で培養し、Ｃ）白血
球細胞培養物にＡＡウィルス■型の１つを接種し、 ｄ）前記接種された細胞培養物をウィルスの増殖に適す
る条件下で増殖する。

本発明の他の一面は、家禽類の組織から白血球を採取し
該白血球を培地に連続的に継代させることからなるＡＡ
ウィルス■型の増殖を支持する細胞ラインを樹立する方
法を提供するものである。

本発明の別の一面は、白血球培養物中でＡＡウィルス■
型をインビトロ増殖させこれによシ家禽類において免疫
を起こさせるのに用いられるウィルスを製造することか
らなる。　）ＩＥ、　ＭＳＤ、　ＳＶおよび家禽類のＡ
、Ａウィルスで起きる他の疾患に対して有効なワクチン
の調製方法を提供するものである。

本発明は、七面鳥の出血性腸炎、キジのマーブルスジリ
ーン病、ニワトリの牌臓を伴なう非マレック病およびＡ
Ａウィルス■型により起きる家禽類の他の関連する疾患
に対し有効なワクチンの調製方法を提供するものであり
、その除法の段階からなるＡＡウィルス■型のインビト
ロ増殖調製法が利用される： ａ）家禽類の肺臓、血液、骨髄捷たは他の組織から採取
され、ＡＡウィルス■型に感染されやすい白血球を単離
し、 ｂ）これら白血球を適当な増殖培地で培養し、ｃ）ＡＡ
ウィルス■型を白血球細胞培養物に接種し、 ｄ）前記ウィルスの増殖に適する条件下で接種された細
胞培養物を増殖させ、 ｅ）前記ウィルスを回収する。

さらに、本発明の他の一面は、七面鳥の出血性腸炎、キ
ジのマーブルスジリーン病、ニワトリの牌臓を伴なう非
マレック病およびＡＡウィルス■型によって起きる他の
関連する疾患に対し七面鳥および他の家禽類を免疫化す
る際使用されるワクチンであって、生ウィルス、死滅も
しくは不活化ウィルス、ウィルスサブユニットまたはウ
ィルス体構成成分（ｖｉｒａｌ　５ｕｂｃｅｌｌｕｌａ
ｒ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）からなる群から選択され、
かつ前記家禽類の組織から単離した白血球細胞の培養物
中でＡＡウィルス■型をインビトロ増殖したものから回
収したウィルス成分からなるワクチンを提供するもので
ある。

それゆえ本発明の目的は、マレック病ウィルスで潜在的
に感染されていない細胞においてウィルスを増殖するの
に適するＡＡウィルス培養法を提供することである。

また、本発明の目的は、ＡＡウィルス■型で起こされる
疾患に対し七面鳥および他の家禽類を免疫化するため安
全で安定した効果のあるワクチンを提供することである
。

本発明の別の目的はＡＡウィルス■型の増殖を支持する
白血球細胞ラインを樹立することである。

本発明の他の目的および有利な点は、以下の記載から容
易に明らかになるであろう。

本発明は、ＡＡウィルス■型に感受性の白血球の単離方
法および培養方法に関する。白血球は、七面鳥、ニワ）
　’）　（ｆｏｗｌ）　、キジまたは他の鳥類の肺臓、
血液または他の組織から、当業界で公知の通常の細胞分
離技術を用いて採取されるのが好ましい。

本発明によれば、肺臓から白血球を単離する好ましい方
法の１つは次の段階よりなる：ａ）七面鳥ひなを安楽死
させ、その肺臓を無菌的に取出し、肺臓から嚢を剥ぎ取
る。

ｂ）増殖培地で肺臓組織をホモージナイズする（第１表
〜第、４表） Ｃ）肺臓ホモジネートをガーゼに通して濾過し、大きな
細胞塊を除く。

ｄ）たとえばフィコール・パック（Ｆ、ｔｃｏｌｌ−Ｐ
ａｑｕｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ社の商標名工ニューシャーシー、ビスキャッ
トアウェイ）溶液を通して５ｏｏｘｙで２０分間遠心分
離する等のようにして、白血球を濃縮し選択的に単離す
る。

ｅ）白血球をフィコール−パックの表面から採取し、こ
れを増殖培地で２度洗い、増殖培地に再懸濁化する（約
５×１０５〜５×１０７細胞／　ｍｌ　）。

ｆ）　インキュ（−ターの組織培養フラスコまたは皿で
、約２〜７％（例えば５％）ＣＯ２雰囲気中、相対湿度
９０〜９９％（例えば９５％）、３７〜４３℃（例えば
４１℃）にて白血球を培養する。細胞はこれらの条件下
で培養し６ケ月まで継代培養することができる（数字は
適当である範囲を表わす：括弧内の数字は現時点で測定
した限り最適の条件を表わす）。

第１表 成　分　増殖培地における容量％ ２５ｍＭＨｅｐｅｓ緩衝液とゲンタマイシン　３６（５
ｏ■／　ｉ　）含有ＲＰＭＩ　１６４０マツコイ（Ｍｃ
Ｃｏｙ’　ｓ　）　５ａ　１３ライボビツツ（Ｌｅｉｂ
ｏｖｉｔ２／５）Ｌｌ　５　２６七面鳥血清　１０ ウシ胎児血清　１０ トリプトース　ホスフェート　ブイヨン　５００ 第２表　ＲＰＭＩ　１６４０　培地１）成分　ｍ９／１ 無機塩： Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２０１００００ＫＣ１４００，
００ Ｍｇ５Ｏ４（無水物）　４８．８４ ＮａＣｄ　６，０００．００ ＮａＨＣＯａ　２０００．００ Ｎａ２ＨＰＯ４（無水物）　ｓｏｏ、ｏｐ他の成分： Ｄ−クルコ−，ｘ　２，０００．００ グルタチオン（還元型）　１００ フエノールレツド　５００ アミノ酸： Ｌ−アルギニン（遊離塩基）　２００．０ＯＬ−アス・
ξライン　５０．−００ Ｌ−アスパラギン酸　２００゜ Ｌ−シｙ、、ｆン・２ＨＣｅ　６５．１５Ｌ−グルタミ
ン酸　２０．０Ｏ Ｌ−グルタミン　３００．００ グリシン　１０．０Ｏ Ｌ−ヒスチジン（遊離塩基）　１５．０ＯＬ−ヒトゝロ
キシプロリン　２０００ Ｌ−イソロイシン（ａ１１ｏ型含有せず）　５０．０Ｏ
Ｌ−ロイシン（メチオニン含有せｆ）　５０．００Ｌ−
１）ジン・ＨＣｌ２　４０．０Ｏ Ｌ−メチオニン　１５．０Ｏ Ｌ−フェニルアラニン　１５．０Ｏ Ｌ−プロリン（ヒト９０キシＬ−プロリンき有せず）　
２０．００Ｌ−セリン　３０００ Ｌ−ス１／オニン（ａｌｌｏｌｌ性せず）　２０．０Ｏ
Ｌ−トリプトファン　５００ Ｌ−チロシン（τすトリウム塩）　２８．８３Ｌ−バリ
ン　２０００ ビタミン： ビオチン　０２０ Ｄ−パントテン酸カルシウム　０２５ コリンクロライド＋　３．００ 葉酸　１．．０Ｏ １−イノシトール　３５００ ニコチンアミド’　７００ ノξラーアミノ安息香酸　１００ ピリドゝキシン・ＨＧＩ　１．００ リボフラビン　０．２０ チアミン・ＨＧｌ　１．００ １　）　Ｍｏｏｒｅ、Ｇ、Ｅ、、　Ｃｒｅｒｎｅｒ、　
Ｆｌ、Ｅ、およびＦｒａｎｋｌｉｎ、　Ｈ，Ａ’、　１
９６７　”Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｎｏｒｍａ、ＩＨｕ
ｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ”、　Ｊ　、Ａ、Ｍ、Ａ
　、　＋　１９９　：　５１−９〜５２４゜第３表　マ
ツコイ　５ａ　培地（変形）１）・２）・３）成分　ｍ
？／１ 鰭雅： Ｇ　ａ　Ｃ’　ＩＪ　２　（無水物）ｉ’）０．００Ｋ
Ｃｅ４００．００ ＭｐＳｏ４．７Ｈ２０２００，。。

””　ｆｉ４６０．００ Ｎａ）（Ｃｏ３　Ｚ２００．Ｏ０ ＮａＨ２ＰＯ４゜Ｈ２Ｏ５８ｏｏ。

他の成分’　６００．００ バクトーベプトン　！’Ｊ０．ＯＯ Ｄ　−ｆ′ｂ＝−’−３，０００，００グルタチオ／（
還元型）０．５０ フｘ　７−７ｔ、　ｙラド　１０．００アミノ酸： Ｌ−アラ−１１３，９Ｏ Ｌ−アルギニン　ＨＧｉ　４２．１　ＯＬ−アスパラギ
ン　４５．ＱＯ Ｌ−アスパラギン酸　１９９７ Ｌ−システィン　３１５゜ Ｌ−グルタミン酸　２２１０ Ｌ−グルタミン　２１９．２０ グリシン　７５０ Ｌ−ヒスチシｙ　Ｈｃｇ、Ｈ２Ｏ２０，９６Ｌ−ヒト９
０キシプロリン　１９７０ Ｌ−イソロイシン　３９３６ Ｌ−ロイシン　３９．３６ Ｌ−＋）ジン。ＨＣｌ　３６．５　Ｏ Ｌ−メチオニン　１４つＯ Ｌ−フェニルアラニン　１６５０ Ｌ−プロリン　１７３０ Ｌ−セリン　２６３０ Ｌ−スレオニン　１７９０ Ｌ−）リプトファン　３１０ Ｌ−チロシンにナトリウム塩）　Ｉ　８．１．　ＯＬ−
バリン　１７６０ ビタミン： アスコルビン酸　０．５０ ビオチン　０．２．０ コリンクロライド’　５．００ Ｄ−ノξントテン酸カルシウム　０．２０葉酸　ｉｏ、
ｏ。

１−イノシＩ・−ル　３６００ ニコチンアミド　９５０ ニコチン酸　０．５．０ パラーアζノ安、に１香酸　１．００ ビ’）　Ｉ’キｌ”−ｖｂ　・ＨＣＩ　Ｏ，５０ヒリ）
’キシンー　Ｈ’Ｊ　０．５０ リボフラビ／　０２０ チ’ミン−ＨＣｅ　Ｏ，２０ １）　Ｍｃｃｏｙ、　’Ｊ’、Ａ、　Ｍａｘｗｅｌｌ、
　Ｍ、およびに、ｒ　ｕ、Ｂ　ｅ　＊Ｐ＋Ｆ、、Ｐｒｏ
ｃ、ＳｏＣ，Ｅｘｐｅｒ、Ｂ１ｏ〕、、＆　Ｍｅｄ、。

１００：　１１５〜］１８（１９５９）。

２）　Ｈｕｓ、　Ｔ、Ｇ、およびＫｅｌｌｏｇｇ、　Ｄ
、Ｓ、、　Ｊｒ、。

ｉＪ、Ｎａ、ｔ’１．Ｃｏｎｃｅｒ　Ｉｎｅｔｚ　２５
：　２２１（１９６０）。

３　）　Ｔｗａｋａｔａ、Ｓ、、Ｇｒａｃｓ、Ｊ、Ｔ、
、Ｊｒ、、Ｎ、Ｙ＋Ｊｏｕ、ｒ。

ｏｆ　Ｍｅｃｌ−，６４／Ａ１．８：　２２７９〜２２
８２（Ｓｅｐｔ。

１５．１．９４６）。

第４表　Ｌ−１５（ライボビツツ）培地１）成分　ｍｆ
／／１ 無機塩 ＣａＣ４２（無水物）　１４０．００ Ｋ（Ｊ　４００．００ ＫＨＰＯ６０，００ ４ ＭＮＣ６２−６Ｈ２０２００，００ Ｍ、９Ｓ○４　’　７Ｈ２０２００，０ＯＮａ（Ｊ　８
，０００．００ Ｎａ２ＨＰＯ４−７）（２０３５９，００他の成分 Ｄ＋）ガラクトース　９００．００ フエノールレツド″’　１０．００ ピルビン酸ナトリウム　５５０．００ アミノ酸 ＤＬ−アラニン　４５０．０Ｏ Ｌ−アルギニン（遊離塩基）　５００．０ＯＬ−アスパ
ラギン　２５０．０Ｏ Ｌ−システィン（遊離塩基）　１２０．０ＯＬ−グルタ
ミン　３００００ グリシン　２００．０Ｏ Ｌ−ヒスチジンにｔ／Ｌ離地基）　２５０．００ＤＬ−
イソロイシン　２５０．０Ｏ Ｌ−ロイシン　１２５．０　Ｏ Ｌ−リジン（遊離塩基）　７５．００ ＤＬ−メチオニン　１５０．００ ＤＬ−フェニルアラニン　２５０．０ＯＬ−セリン　２
００．００ ＤＬ−スレオニン　６００．０Ｏ Ｌ−）リプトファン　２０．０Ｏ Ｌ−チロシン　３００．００ ＤＬ−バリン　２００．００ ビタミン ＤＬ−パントテン酸カルシウム　１．００コリンクロラ
イド’　１．００ 葉酸　１．００ １−イノントール　２００ ニコチンアミドゝ　１００ ピリドキシン　ｌ−１ｃ１１．００ リボフラビン−５′−ホスフエーナ、ナトリウム　０．
１０チアミンモノホスフエート　１００ １　）　Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ、Ａｌｂｅｒｔ、Ａｍ、Ｊ
、Ｈ７ｇ、Ｉ　７８　：１７３〜１８０（１９６３）。

血液から白血球を単離する他の好ましい方法は次の段階
からなる： ａ）緩衝化された抗凝血物質〔たとえば０００５ｍＭ　
ＥＤＴＡナトリウムおよびヘノξす７１０単位／ｍｅを
含むリン酸緩衝溶液（ｐＨ７，２））を含有した注入器
へ七面鳥血清等量を吸い込ませる。

ｂ）この混合物をフィコール−パック上に層状に入れ、
８００１９で２０分間遠心分離する。

Ｃ）白血球をフィコール−パックの表面から採取し、２
度洗い、増殖培地にこの細胞を再懸濁させる。

ｄ）前記の（ｆ）のように白血球を培養する。

θ）前記のｆｃ）のように採取後、フィコール−パンク
の表面から取った白血球を、段階的・ξコール（Ｐｅｖ
ｃｏｌｌ）　（３０％、４０％、５０％、６０％、７０
％Ｐｅｒｃｏ１１．　ＲＦ’Ｍ１１６４０中）勾配上で
３０分間３、　ＯＯＯｒ、ｐ、　ｍ、にて遠心分離する
ことにより精製することができる。４０％および５０％
パーコール溶液の表層の細胞を取り出し、増殖培地で２
度洗い、約１０６細胞／ｍ１３の濃度に再懸濁し、上述
の条件下で培養する。

細胞培養物を感染させるのに用いられる出血性腸炎ウィ
ルス（ＲＥＶ）は毒性および非毒性株の両方を含む。こ
れらの株は、１９８０年にＤｒ。

Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｄｏｍｅｒｍｕｔｈ　（Ｖｉｒｇｉｎ
ｉａ　ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＥｘｐｅｒｉｍｅｒ＋
ｔ　５ｔａｔｉｏｎ、　Ｖｉｒｇｉｎｉａ　Ｐｏ１ｙｔ
ｅｃｈｎｉｃＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　ａｎｄ　５ｔａｔｅ
　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、バージニア州、ブラックスプ
ルグ）から入手した。ＲＥＶの好ましい保１株の１つは
ウィルスの非毒性株で、これはメリーラントゝ州ロック
ヴイルのＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託され、寄託番号ＡＴＣＣＶ
Ｒ−８９８が与えられているマーブルスジリーン病（Ｍ
ＳＤ）のウィルス及びそれと同じであるものを含む。そ
の起源および公知の性質はＤｏｍｅｒｍｕｔｈ、　Ｇ、
Ｈ，らによりＪ　、　Ｗ４１ａＤ１θ、１１．：３３８
〜３４２．１９７５にすでに記載されている。本発明に
よるＡＡウィルス■型培養の目的のために、このＲＥＶ
／ＭＳＤウィルスまたは同様の特徴を有する他のＡＡウ
ィルス■型のいずれかを使用することができる。このＲ
ＥＶ／ＭＳＤ培養物は他のＡＡウィルスｌ型と交差反応
しないが他のＡＡウィルス■型と交差反応することが知
られている。

白血球培養物に接種するウィルスの他の発生源は、特に
限定するものではないが、たとえばＡＡウィルス■型で
感染された鳥の体液（たとえば血液）、組織（たとえば
肺臓）または制泄物である。

好ましい実施態様の１つにおいて、リンパ系器官好まし
くは肺臓から粗製ウィルス含有抽出物またはクロロホル
ム抽出および塩化セシウム遠心分離により精製された抽
出液が、以下のようにして毒性廿たは非毒性ＡＡウィル
スＩＩ型で感染した七面鳥から調製される： ａ）ＡＡウィルス■型に感染した化ｍ１鳥を感染後４〜
６日目に殺し、肺臓を取り出し、低張トリス−緩衝液（
０，０１ｍＭ）リスＨＣＩ　、　ｐＨ８，１）９容量へ
加える。

ｂ）肺臓をホモジネートする（たとえばブリンク？　ン
（Ｂｒｉ、ｎｋｍａｎ）ポリトロンを用いて１０〜１５
分間）。

Ｃ）たとえは凍結・解凍を２回行ない、および／または
処理廿たは音波処理（Ｂｒａｕｎｓｏｎｉｃ１５１０を
用いて４００ワツトで１分間を３回ンする等により、ホ
モジネートを処理して牌細胞からウィルスを放出させる
。

ｄ）遠心分離（１０，０００：ｌで１０分間）により細
胞破片を除き、ウィルス含有上澄液を用いて白血球細胞
培養物へ接種する。

上述の粗抽出物をｄ）から始まる次の段階によりさらに
精製することができる。

ｅ）粗抽出物をクロロホルムと１　：　２　（ｖ／ｖ）
の割合で一緒にし、ホモジネーシヨノをくす返シ、次い
で１０．　ＯＯＯｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠心分離する
と抽出物か三層に分離する二上の水層はウィルスを含有
Ｌ、中間層は細胞破片を含有し、下層のクロロホルム層
は脂肪物質を含む。

ｆ）透明な水層（上層）を採取し、−晩１０．０００ｒ
、ｐ、ｍ、でウィルスをＲレット化し、トリス緩衝液に
再懸濁させ、さらに２〜３回クロロホルムで抽出する。

ｇ）最後に抽出した後、塩化セシウムのクッションを用
いて２０．０００　ｒ、ｐ、ｍ、で１時間ベレット化し
てウィルスを濃縮し、次いで塩化セシウム連続勾配上で
２４時間４０．００　Ｏｒ、ｐ、ｍ、で２度バンドさせ
る。伝染性ウィルスの大部分は密度１３３〜１．３４　
ｇ　／　ｃｍ３のバンドに見られた。

ｈ）得られたウィルスは保存緩衝液に対し透析され、０
４５μのミリポアフィルタ−で濾過し、白血球培養物に
接種するのに用いるか、または−７０℃で貯蔵する。

ＡＡウィルス■型の毒性株または非毒性株のいずれもが
細胞で培養することができる。どれらのウィルス株は鳥
に対する病原性の点で異なる。たとえばＲＥＶの非毒性
株は一過性の肺臓を起こさせるだけであるが、毒註株は
肝臓ならびに多量の出血を起こし、死に至る場合もある
。

細胞培養物は上で概略述べたようにウィルス含有抽出物
により、通常、細胞培養物が完成して１〜３時間以内に
感染される。ウィルス含有抽出物の適当な希釈率は、通
常各ウィルス調製物の感染力に応じて１０−２〜１０−
６の範囲であり、このうちの適当な希釈液を細胞培養物
へ加える。感染′された細胞培養物金増殖培地で保持し
、５％ＣＯ２と９５％ＦＩＨ（相対湿度）の雰囲気中４
１℃でインキュハートする。一般に、接種後１〜３日目
にウィルスを採取する。培養物中の感染細胞のほとんど
は大きくなっており、光学顕微鏡で観察しうる核内封入
体を含有する。ＲＥ　Ｖの毒性株と非毒は株で感染され
た白血球培養物の間には明確な差異は見られない。

感染後白血球にウィルス註抗原が存在することは蛍光抗
体（ＦＡ）試験またはＡＡウィルス■型の特定のプロテ
ィンに対するマウス承クローン性抗体を用いた当業界で
公知の他の試験により検知される。この試願においては
、細胞培養物からの白血球を、当業界の通常の技術によ
りスライドガラスに固定する。この固定した細胞をハイ
ノリド−マ細胞培地中で温室にて３７℃で１時間インキ
ュベートする。この細胞を洗った後、蛍光標識したヤギ
の抗−マウスエ９Ｇを加え、細胞を１時間３７℃でイン
キユイートシ、その後調製物を当業界で公知の技術を用
いてスライド゛ガラスに封入し、蛍光顕微鏡で観察する
。ＡＡウィルス■型で感染された細胞は蛍光を発し、感
染細胞の割合が顕微鏡の幾つかの場所における蛍光細胞
と全細胞とを計測することにより推定される。感染細胞
は通常直径１０〜１２μであり、それより大きいことも
ある。これらはしばしば細胞質に液胞を含み、付着細胞
および非付着細胞の両方ともに核封入体が見られる。

電子顕微鏡下で調べると固定された白血球培養物の超薄
切片には細胞の核にウィルス粒子（７０〜９０　ｎｍ）
　が存在するのがわかる。細胞は非常に太き（（１０−
４０μ）、細胞質にファゴソーム（食胞）とミトコンド
リアを有し、核にはイリヌクレア（Ｐｅｒｉｎｕｃｌｅ
ａｒ）染色質を有する。これらの観察に基づいて、細胞
が未成熟な大型マクロファージまだはｒ）ｉ味であるこ
とがわかる。しかしながらこれは形態学に基づいて簡単
に確認されるものではない。

本発明はさらに、七面鳥のＲＥＶ、キジのＭＳＤおよび
ニワトすの肺肝を伴なう非マレック病ならびにＡＡウィ
ルス■型で起きる他の関連疾患に対する七面鳥または他
の家禽類の免疫化のだめのワクチンの調製に関する。

ＲＥＶに対抗し鳥に接腫するのに用いるワクチンを調製
するに当っては、ウィルスは感染された全細胞培養物か
ら回収され、細胞は全細胞培養物、培養培地または上澄
液から当業者に公知の技術により採取される。たとえば
付着細胞はゴム製ポリスマンで組織培養フラスコから剥
離し、非付着細胞と一緒に遠心分離（２０００ｒ、ｐ、
ｍ、で５分間）してベレット化される。細胞はウィルス
放出を促進するため、低張囲トリス緩衝ｉ（０，０１ｍ
Ｍ　）。

リスＨＣｅ　、　ｐＨ８，１）で懸濁させ、凍結と解凍
を２回行ない、および／または音波処理を、たとえばブ
ラウンソニック（Ｂｒａｕｎｓｏｎｉｃ）　］　５１０
ソニケータを用い１００ワツトで２０秒間を３回くり返
すことにより破壊される。細胞片を遠心分離（１０，０
００ｒ、ｐ、ｍ、で１０分間）により除き、ウィルス含
有上澄液を回収し、保存緩衝液で透析し、０４５μフイ
ルターを用いて濾過し、保存緩衝液と一緒にして保存す
る。

ウィルス回収のだめの１つの好捷しい方法は次のようで
ある：ａ）白血球を音波処理、凍結および解凍または浸
透圧ショックにより破壊し、ｂ）遠心分離により細胞片
からウィルス含有上澄液を選択的に分離する。得られた
上澄液を次いで透析し、好ましい保存緩衝液と一緒にす
る。好捷しい保存緩衝液の配合は、０．０２　Ｍ　トリ
ス−Ｈ（Ｊ　。

０、００１　Ｍ　ＭｇＣｌ２．５％（ｖ／ｖ）グリセロ
ールオよび５％（ｗ／■）ウシ血清アルズミン（ｐＨ８
，０）である。

この緩衝液は、文献に先きに報告されている２つの緩衝
液を組合わせだものである。典拠は次のものである：　
１　）　Ｐｒａｇｅ、　Ｌ、、　Ｐｅｔｔｅｒｓｏｎ、
　Ｕ、。

Ｈｏｇｌｕｎａ、　Ｓ、、およびＬｏｎｂｅｒｇ−Ｈｏ
１ｍ、　Ｋ、ならびにＰｈ１ｌｉｐｓｏｎ、　Ｌ、著”
５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆ　Ａｄｅ
ｎｏｖｉｒｕｓｅｓ”　（Ｉ　ＶＣＳｅｑｕｅｎｔｉＪ
ｌＩＤｅｇｒａ、ｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｄｅ
ｎｏｖｉｒｕｓ　Ｔｙｐｅ　ＩＩＶｉｒｏｎ、Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ　４２＋　３４１〜３５８，１９７０：１１゜
この文献には次の緩衝液が略述されている１０２５Ｍ　
ショ糖、０．０２　Ｍ　）　ｌ）　ス、０．　ＯＯ２Ｍ
　Ｍｆ１０１１２および０５％ブタノール；ｐＨ７４゜
２番目の文献は次のものである：　Ｃｅｐｋｏ、　Ｃ，
Ｌ、、　Ｃｈａｎｇｅｌｉａｎ。

ｐ、ｓ、および５ｈａｒｐ、　Ｐ−Ａ、　（”■ｍｍｕ
ｎｏｐｒｅｃｉｐｉ−ｔａｔｊ、ｏｎ　ｗｊ、ｔｂ　Ｔ
ｗｏ−Ｄｉｍｅｎｔ：１ｏｎａｌ　Ｐｏｏ］、ｓ　ａｓ
　ａ）ｌｙｂｒｉｄｏ＋ｎ＋ＬＳｃ、ｒＯｅｎｉｎｇ　
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ：　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄ　
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｍｏｎｏｃ
ｘｏｎａＩＡｎｔｉｂｏｄｊｅｏ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ａ
ｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ＩＩ　Ｐｒｏｔｅコｎｓ。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１　］　０．３８５〜４０１，１９
８１〕。略記されている緩衝液は０．０２　Ｍ　）　’
）ス、０００１Ｍ　ＭｌｌＣｅ２オ、１：　ヒ５％グリ
セｏ　−／Ｌ、　；　ｐＨ８，０である。

好ましい緩衝液はこれら２つの各々を一部ずつ集め、さ
らに５％ウシ血清アルブミンを含むものである。ウィル
スが増殖した細胞培養物を使用しさらに緩衝液を使用す
ることにより、液状で保存されうる安定な製品が得られ
る。これは最近使用されている粗製牌抽出物ワクチンに
比べ有利で一段の向上である。これ塘でのワクチンは組
織酵素が存在するため不安定で一７０℃で保存しなけれ
ばならなかった。当業者に公知の他の緩衝液も寸だ透析
に、および保存のためにワクチンと組合わせて使用する
ことができる。また、ワクチンは保存のだめに凍結乾燥
することもできる。

さらにワクチンは、フロイント　アジュバント（Ｆｒｅ
ｕｎｄ′ｓ　Ａａｊｕｖａｎｔ）、水酸化アルミニウム
、硫酸アルミニウムカリウム、または当業者に公知の他
の適当なアジュバントから選択されるアジュバントと組
合わせてもよい。

ワクチンはその一定量を飲料水または飼料にまぜて経口
的に投与するか、エーロゾルによりまたは七面鳥のＨＥ
、キジのＭＳＤおよびニワトリのＳＶに対し保護するだ
めの他の通常の方法により投与されると考えている。非
毒１ｑＨＥＶは毒性ＲＥＶに対し鶏（ｆｏｗｌ）を保護
するものと知られている故に、これは勿論ワクチンの製
造に用いられるのに好捷しい株である。しかしながら他
の非毒１ｉＡＡウィルス■型もまだ適する。

七面鳥の効果的投与量を定めるだめの適当な範囲を決定
する規準もまた本発明により提供される。

ａ）現時点で培養採取物中のウィルス粒子の数を定量す
ることは困難であるが、最低１０個のウィルス粒子を含
む培養採取物を選択することは安全で有効な投与量をも
たらすものと信じられる。

ｂ）培養採取物はＥＬＩＳＡで測定したとき血清抗体力
価少なくとも１／２ｏ−を起こすに十分なウィルスを含
む。現時点では抗体力価］／８ｏ　で有効な保護が達成
される。しかしながらこれは烏の年令でいくらか変化す
るので、より健康維持に適する力画か保穫投与量を規定
するのに選択される。

ＲＥＶ抗体の力価測定のだめの間接ＥＬＩＳＡは次の３
段階で行なわれる：（ｉ）　ＲＥＶ（コーティングに使
用）は゛実験的に感染した七面鳥の肺臓から抽出しＧＢ
Ｇｌ勾配上で精製される。１３４Ｉ／Ｃ密度のウィルス
バントゝを２　Ｍ　Ｃａ　Ｃ１２等容量で処理し、３７
℃で３０分間インギューホートする。その後、９６個の
凹部を有するｌ　ＩＪスチレン製ミクロタイター　プレ
ート〔イムロン（Ｉｍｍｕ１ｏｎ’）２、Ｄｙｎａ、ｔ
ｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　の商標名）に、０
０５Ｍ重炭酸す）　ｌ）ラム緩衝液（ｐＨ９，６）の最
適希釈率の抗原を、３７℃で２時間かけて、凹部１個に
つき０．２　ｍｌ当りでコーティングする。プレートコ
ーテイング後、０．０５％ツイーン２０（商標名）含有
ＰＢＳ　（ＰＢＳ−Ｔ）（ｐＨ７，４）　で３回洗う。

（１１）新生仔牛血清１％（ｖ／ｖ）含有］０×１”！
ＥＩＳ−Ｔ　で２倍に希釈された被駁血晶サンプルと陽
性および陰性対照血清とを、２時間３７℃で凹部１個に
つき０．２　ｒｄ加えてインキュベ−１・する。

（ｉｉｉ）　ｒ’　Ｂ　Ｓ　−Ｔで３回洗った後、ウザ
ギ抗−七面鳥Ｔｇｃ−＜　／ｌ／　オキシダーゼ複合体
（１：１０００に希釈）０２ｍｌで、２時間３７℃にて
プレー１−をインキュ（−卜する。ＰＢＳ−Ｔで３回以
上洗った後、５−アミンサリチル酸（００８％Ｗ／Ｖ）
とＨ２Ｏ２（０００５％ｖ／ｖ）を含む基質溶ｒｆｆｌ
（ｐＨ６，０）を四部１個につき０．２　ｍｇ用いてプ
レートをインキュベ−１・する。３０分後室温にて、微
量−ＥＬＩＳＡ　読取り装置（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ＭＲ
５８０）　を用い、４９２ｎ、ｍで酵素活性を測定する
。すべての試験を２回行ない、各検定には２個の＠註対
照血清（公知力価〕と４個の陰性対照血清とが含まれる
。

Ｃ）培養採取物は、希釈率Ｏから］、Ｆ”ｌ：での範囲
、好捷しくは１０−２から１０−４までの範囲で用いら
れる。

さらに好ましい本発明の実施態様は、ＡＡウィルス■型
の増域を支持する白血球細胞ラインの樹立であり、これ
は家禽類の組織（たとえば肺臓、血液、骨髄であるかこ
れに限定されない）から白血球を採取し、培養物に白血
球を連続継代することからなる。

次の実施例は本発明をさらに詳しく説明するだめのもの
たけてあり、本発明の範囲はこれに限定されない。本発
明の範囲は特許請求の範囲によ）決められるものである
。

実施例１：非毒性出血性腸炎ウィルスを用いた七面鳥白
血球の感染 白血球培養物を、５週令と７週令の七面鳥ひなの肺臓か
ら調製した。白血球は、被膜を剥いだ七面鳥肺臓をホモ
・ジネートし、フィコ−ルーツミック溶液中で２０分間
８００Ｘ、９で遠心分融して単離することにより得られ
る。続−て白血球を採取し、洗浄し、増殖培地に再懸濁
（ＩＸ］−０６細胞７１ｍ１）させ、組織培養フラスコ
に播種して、５％ＣＯ２、相対湿度９５％および４１℃
の雰囲気中にフィンキュベートする。播種後３時間して
から、上述のように調製された非毒性ＨＥＶ含有粗牌臓
肺臓物または精製ウィルスを細胞培養物に接種する。ウ
ィルス接種後、１日、２日および３白目に細胞培養物を
ＦＡＴで検査し感染細胞の割合を測定する（第５表およ
び第６表）。

第５表：５ａ令七面鳥の肺臓から調製された白血球細胞
培養物における非毒性ＲＥＶの増殖 粗製牌抽出物　１０−２１．０　１．４　１．８ＩＯ−
３２，７０，７１，０ 精製ウイルス　１０−２０．４　０．３　０．７１Ｆ３
＜０．１　＜０．１　＜０．１ 第６表：１２週令七面鳥の肺臓がら調製された白面は細
胞培養物における非毒１ｉＨＥＶの増埴 肺臓和抽出物　１０”　２．４　３．２　１．６１０　
’　１．５’　１．２　３．２ 精製ウィルス’１０−３０．８　０．８　１．６１０　
（０，１（旧　（０，１ ウィノ吻有文明側勿　−＜０．１　＜０．１　＜０．１
−」」１猛つ〜−−−−−−−−−−−−−−−〜−一
一一一一一−ａ）感染後経過日数におけるＲＥＶ−Ａで
感染された細胞のパーセン）（ＦＡＴで測定ン実施例２
：非毒注ＨＥ　Ｖ　ｔｃよる七面鳥血液白血球の感染 ９週令の七面鳥の血液から白面は培養物を調製する。七
面鳥血液の等容量を抗凝血剤（）ＩＰＭＩ］、　６４０
培地中１ｍｌにつき０．００５　Ｍナトリウム−ＥＤＴ
Ａおよび−・バリン１０単位）を含む注入器へ吸い込ま
せる。フィコール−バック溶液を通して５ｏｏｘ、ｙに
て２０分間遠心分踊することにより血液細胞を分離する
。白血球フラクションを集め、洗浄し、増殖培地に再懸
濁させ、その後細胞を組織培養フラスコに播種（２Ｘ１
０６細胞／ｒｕｇ）Ｌ、５％ＣＯ２、 相対湿度９５％、４１℃の雰囲気中てインキュヘ−１・
する。培養開始後０日、１日、３日および７白目に、非
毒性ＨＥＶ含有粗製牌抽出液で白血球を感染させる。培
養物を感染後様々な時点で検査し感染細胞の割合を測定
する（第７表）。

第７表ニ調製後様々な時点における非毒１９．　ＨＥ　
Ｖを用いた七面鳥血液白血球培養物の感染０　１．６ａ
）１．９　０．５　ＮＥ０〕（Ｑ、Ｉ　ＮＦ　−−−−
−−−−−０，２ｂ）　１．０　０．６　ＮＥ　２．３
ＮＥ　−−ｍ−−−−−−１＜０．１　０．５　ＮＥ　
１．３　ＮＥＯ，ＯＮＥ　−−−−−−−〈０１　く旧
　ＮＥ＜０．Ｉ　ＮＥＯ，０ＮＥ−−−−−−−３ＮＥ
　Ｏ，４ＮＥ　Ｏ，００ＯＮＥＯ，０ＮＥ−一−−−Ｎ
Ｋ　＋５　ＮＥ　００　＜０ＩＮＥＯＯＮＥ−一−−−
７０，０ＮＥ　Ｏ，００，ＯＮＥ−＝−−＝−一一上記
表中、 ａ）ＦＡＴで測定されたウィルス感染非付着細胞の割合 ｂｌＦＡＴで担１１定されたウィルス感染伺着細胞の割
合 ＣＩＮＦ、’−検査せず 実施例３：２つの異なった手段によシ得られた七面鳥血
液白血球のＨＥＶ増殖支持能力 の比較 ９週令七面鳥ひながら血液３０ｒｒｔｌを入手する。

フィコール−パック法またはフィコール−パックに続い
てパーコール精製段階を行なう法のいずれかにより白血
球を全血液から分離し、細胞培養物の確立に用いる。フ
ィコール−パックでの精製は実施例２に記したように行
なう。パーコール法は、さらに、フィコール−パック精
製で得られた白血球フラクションを、パーコールの不連
続勾配（３０，４０，５０，６０および７０％パーコー
ル／ＲＰＭＩ’　１６４０）に通し３．０００　ｒ、ｐ
、ｍ、にて３０分間遠心分離することにより白血球の分
離を行なう。４０％および５′０％パーコールの上面の
白血球を集め、洗浄し、増殖培地に再懸濁させ、組織培
養フラスコに播種し、５％ＣＯ２、相対湿度９５％およ
び４１℃の雰囲気にて保持する。培養物を非毒性ＲＥＶ
の粗製牌抽出物の１０−３希釈液で感染させ、接種後２
日および４回目の各白血球培養物における感染細胞の割
合を測定する（第８表）、。

第８表＝２つの異なった手段により分離された夷面鳥血
液白血球培養物の非毒性ＲＥＶによる感染 フィコール−パック法　１９　０５ フイコールバツク＋パーコーノ→ｔ　６．０　３．９ｃ
）ＦＡＴで測定された感染非付着細胞の割合ウィルスを
含まない対照物を接種された細胞のパーセントは０．１
％未満である。

実施例４：七面鳥の出血性腸炎に対するワクチンとして
の白血球培養物で増殖したＲＥＶの使用 ２０週令七七面の血液３０　ｍ６を、上述したフィコ−
ルーバツク法による白血球培養物の調製に用いる。白面
は培養物を非毒１ｉＨＥＶ含有粗製牌抽出物１０−３希
釈液で感染さぜる。感染後２日月に、ＦＡＴで測定する
と細胞の４３％が感染された。

この時点で付着および非−付着細胞を遠心分離により採
取する。低張性トリス緩衝ｉ（ｏ、ｏｔＭトリス−ＨＣ
，１％ｐＨ８，１）に細胞ベレットを再懸濁させ、凍結
と解凍を２回行ない、音波処理することによシウイルス
を細胞から放出させる。低速度の遠心分離を行ない細胞
片を除き、ウィルス含有上澄液をＰＢＳと一緒にして全
量３０’ｄとする。

ウィルス−ＰＢＳ溶液の１０倍連続希釈１（未希釈から
１０−４まで）を調製する。各希釈液の１ｄを６週令七
面鳥ひなに経口的にワクチン接種する（１群当り七面鳥
８羽）。ＲＥＶに対する抗体力価測定のために血清サン
プルをワクチン接種後１日、８日、１５日と２０日目上
取り出す。１５日日目毒１１ＨＥＶを経口接種すること
により病理で誘発させる。毒性ウィルスで誘発してから
５日月（２０日目上に、鳥を殺し、肺臓を集め、肥大お
よびＨＥＶ抗原の存在について検査する。感染防御が行
なわれないことを示すＲＥＶ抗原は、誘発後金ての非ワ
クチン接種対照物８羽に存在した。

ワクチン接種した鳥では３９羽中の８羽だけがＲＥＶ抗
原を有していたことから（第９表）、細胞培養物で増殖
させたウィルスの感染から防御されたことを示す。さら
に、烏３９羽中の３１羽は血清学的に転換され、ワクチ
ン接種後感染防御抗体力価が現わわだ。

第９表：白血球細胞培養物で作られたワクチンの様々な
希釈液により非毒性ＨＥ■を用いた誘発試験に対し感染
防御された七面鳥の割合 １０”　０／８　８／８ １０−２　０／８　８／８ １０−３　２／８　６／８ １０−’　６／７　１／７ ワクチン接種を しない対照物　８／８　０／８ ワクチン接種を せす、誘発も行 により肺臓におけるＨＥＶ抗原の存在を測定ｂ）抗体−
ＥＬＩＳＡで測定 実施例５：初代血液白血球培養物における非毒性ＲＥＶ
の継代 非電ＩＨＥＶで感染された七面鳥から得た粗製牌抽出物
（最終希釈率ｉ　ｏ−”）を、フィコール−パック遠心
分離で得られた七面鳥の血液白血球の初代感染に用いる
（継代１）。３日後、培地における細胞を集め、上述の
ように２度凍結と解凍を行ない超音波処理することによ
り細胞からウィルスを放出させる。継代１で得られたＨ
ＥＶは七面鳥血液白血球の新たな培養物を感染するのに
用いられる（継代２）。これらの細胞を上述のように処
理してウィルスを放出し、次いでこれを用いて新しい白
血球に感染させる（継代３）。この方法を繰シ返して七
面鳥血液白血球におけるＨＥＶを７代植え継ぐ。各段階
で前の細胞抽出物１０％を用いて前の培地におけるのと
同数の白血球を感染させる（第１０表）。培養について
の条件は前述したのと同じである。

第１０表：初代血液白血球培養物における非毒性ＨＥＶ
の継代 感蜂の　継代番号 Ｉ　ＮＥｂ）　ＮＥ（０，Ｉ　ＮＦ（０，１ＮＥ　ＨＥ
２　４．３　＋、８　０６　０．３　０４　ＮＥ　Ｏ，
４ａ）ＦＡＴで測定 ｂ）ＮＥ・・・検査せず 実施例６：植え継がれた（継代培養）七面鳥血液白面味
のＨＥＶ増埴増殖能力 すでに記載したようにフィコール−パック勾配物で血（
’ｌ　ｓ　ｏ　ｒｒｔｅを遠心分離して七面鳥血液白血
球を得、上述と同じ条件下で培養皿に保持する。培養皿
の１つの細胞は継代培養せず、他の３つの培養皿の細胞
はそれぞれ２回、３回、４回継代培養し、これにより白
血球細胞ラインを作る。初代白血球培養と白血球細胞ラ
インの両方を、非毒性ＲＥＶで感染された七面鳥の粗製
牌抽出物（１’Ｏ−’に希釈された最終抽出物）で感染
させる。この実験のデータを第１１表に示す。

第１１表：初代白血球細胞培養と白血球細胞ラインおけ
る非毒性ＲＥＶの増殖 七面鳥白血球の感染割合ａ） 初代培養　０　＜０．１０．４２．０２．０１．０１．
５　ＮＥｂ）０．９　ＮＥ（初代）細胞ライン　２　（
ｏｌｔｓ　２．６２２３．５２．９　ＮＥ　ＮＥ＜０．
１（初代）細胞ライン　３　＜０．１１．７２．６３．
５２．２　ＮＥ　（ｏ、ｔ　ＮＥ　ＮＥ（初代）細胞ラ
イン　４　０．３　ｕ　１．５０．４　ＮＥ　ＮＥ　Ｎ
Ｅ　ＮＥ　ＮＥａ）ＦＡＴで測定された感染細胞の割合
ｂ）ＮＥ・・・検査せず 実施例７：細胞培養物中で連続継代したＲＥＶの七面鳥
ＨＥに対するワクチンとしての 効力 実施例５（第１０表）で概略を述べたように白血球培養
物に７回連続継代させ感染後３日目に採取した非電１ｑ
）（ＥＶを使用した。ウィルス含有懸濁液をＰＢＳと一
緒にして全量１５ｍｇと、し、その後七面鳥におけるＨ
Ｅに対するワクチンとしての効力を、実施例４で記載し
た用量応答誘発試験で試験スル。希釈８ｉ　１０−”、
１０−２、ｉｏ−”テワクチン接種された鳥全部と希釈
率１０−４でワクチン接種された鳥８羽中３羽に、誘発
したとき次の規準による感染防御が見られた：　１１　
ＥＬＩＳＡによシ感染防御抗体力価ン８０を有する；２
）肺臓にＲＥＶ抗原を有しない（抗原ＥＬＩＳＡによる
力価＜Ｉ’ＯＯ）；３）腸の出血が見られない。

希釈率１０−４でワクチン接種された残りの鳥５羽とワ
クチン接ｆｊｌｉ　Ｌない対照物８羽には誘発後の感染
防御が見られなかった。

この実験により細胞培養物にＨｈ、Ｖ非電註株を７回連
続継代した後にも得られたウィルスは効果的ワクチンと
して用いることができることが明らかである。

第１２表：白血球細胞培養物において７回連続継代した
非電１ｑＨＥＶを用いたワクチン試験 ａ）　ｂ） 家禽類のワクチン影響　を受けた七感染防御　抗体力価
を１０−１　０７８　８／８ １０−２　０／８　８／８ １０−３　０／８　８／８ １Ｆ”　５／８　３／８ ワクチン接種をしな　ｓ／ｓ　Ｏ／８ い対照物 ａ）毒１ｉＨＥＶで誘発後５日月に抗原−ＥＬＩＳＡに
より肺臓のＨＥＶ抗原の存在を測定 ｂ）非毒性ＲＥＶで誘発後５日月に抗体−ＥＬＩＳＡに
より測定 実施例８：家禽アデノウィルスｎＷＫよるニワトリと七
面鳥白血球の感染 七面鳥血液とニヮトｌ）血液をフィコール−バック勾配
物で精製して白血球を得、これを」二連した条件下で保
持する。ａ）肺肝（ＳＶ）を伴なう非マレック病を起こ
すウィルスで感染されたテワトリ、またはｂ）出血性腸
炎ウィルスの非電姓株（ＨＥＶ−Ａ）で感染された七面
鳥、からの粗製牌抽出物を用いて白面はを感染させる。

結果を第１３表と第１４表に示す。ニワトＩＪ白血球培
養物８つのうち４つがＳＶで感染され、８つのうち８つ
がＲＥＶ−Ａ　で感染された（第１３表）。七面鳥白面
帽培プ′１物６つのうち２つがＳＶで感染され６つがＨ
ＥＶ−Ａで感染された（第１４表）。

第１３表：出血性腸炎ウィルス（ＨＥＶ−Ａ）および肺
肝ウィルス（ＳＶＩによるニワト リ白血球の感染 １５２　＋　ａ）　十　＋　＋ １５６　＋　十　＋　− １５８＋　−＋　− １，５９十　−−− １６３〜ｂ）　−十　＋ １６４　＋　＋　− １６９＋　−−− ａ）士はＦＡ試験で感染細胞が検出されたことを示す ｂ）　−は細胞培養物中に感染細胞が検出されなかった
ことを表わす 第１４表：出血ＨＥ腸炎ウィルス（ＨＥＶ−Ａ）および
肺肝ウィルス（ＳＶ）による七面鳥 白血球の感染 １、（）　１　＋ａ）　−’ｂ）　＋　−１０２＋　＋
　＋　＋ １０３　＋　−＋　− １０４＋　−十　− １０７＋　−＋　− ａ）＋ｉｌ′ｉＦＡ試験で感染細胞が検出されたことを
示す ｂ）−は細胞培養物中に感染細胞が検出されなかったこ
とを表わす 実施例９：接抽梢料として非毒性または毒性ＲＥＶを用
いる感染白血球の割合の比較 １８週令七面鳥から集めた血液から白血球培養物を調製
し、ノイコールーバックで精製し、その後、上述の条件
下で保持する。この白血球培養物を、非毒性ＨＥＶまた
は毒性ＲＥＶのいずれかで感染させた七面鳥からの粗製
牌抽出物の希釈液で感染させる。感染細胞の割合をＦＡ
試験で測定する（第１５表）。

第１５表：接種材料として非毒性ＨＥ　Ｖ　（ＨＥＶ−
Ａ）または毒性ＨＥＶ（ＨＥＶ−Ｖ）を用いて感染細胞
の割合を比較 Ｈ’ＥＶ−Ａｂ）　２．１　５．７　１．９　旧　〈０
１ａ）ＦＡＴにより測定された感染細胞の割合ｂ）ＲＥ
Ｖ−Ａで感染した七面鳥の粗製牌抽出物ｃ）ＲＥＶ−Ｖ
で感染した七面鳥の粗製牌抽出物（外５名） 手続補正書（方式） ％式％ 家禽アテノウィルスｎ型の増殖方法 ６補正をする者 事件との関係　出　願　人 住所 氏名　セン・ファウ・ヤー・エム・ヴアン・テン・フル
ク４、代理人 ５補正命令の日刊　昭オＩ］６０年５月２８日（発送日
）６補正の対象 （別紙） （１）明細書第１１頁第５行〜７行の「［Ｄｏｍｅｒｍ
ｕｔｈ・・・・・・Ｖｉｒｕｓｅｓ　」を 「〔ドメルムス（Ｄｏｒｎｅｒｍｕｔｈ　）　、　Ｃ、
Ｈ，、ら［アビア７・アテノウイルス・グループ　ｌＩ
ｏザ・ヘモラジツク・エンテライテイスーマーブル・ス
プリーン・ディシーズ・ウィルシス（Ａｖｉａｎ　ａｄ
ｅｎｏｖｉｒｕｓ　Ｇｒｏｕｐ、　ｎ　。

Ｔｈｅ　Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　Ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ
−Ｍａｒｂｌｃ　５ｐｌｅｅｎＤｉｓｅａｓｅ　Ｖｉｒ
ｕｓｅｓ　）　ｊと補正する〇（２）同第１１頁第１０
行〜１６行のｒ　ＭｃＦｅｒｒａｎ　−−Ｐｒｅｓｓ　
、　Ｊを 「Ｍ、ｃＦｅｒｒａｎ　（マクフエラン）、　Ｊ、Ｂ、
によろアテノウイルシス・オブ・バーチプレイド・アニ
マルズ（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ　ｏｆ　ｖｅｒｔｅ
ｂｒａｔｅ　Ａｎｉｍａｌｓ　）　（コンパラテイブ・
ダイアグノーシス・オブ・バイクル“ディジージス（Ｃ
ｏｍｐａｒａｔｉｖｅＤｉａｇｎｏｓｉＳｏｆ　Ｖｉｒ
ａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　）第１ＩＩ巻、第６章−Ｅ、
クルスターク（Ｋｕｒｓｔａｋ　）とＣ，クルスターク
（編）、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ
ｒｅｓｓ、）ｊと補正する。

（ろ）同第１２頁第１５行〜第１６頁第４行の「Ｃ８Ｈ
，−−Ｄｉ　５ｃａｓｅｓ　ｌを ［Ｃ，Ｉ−１，ドノルムス（Ｄｏｍｅｒｍｕｔｈ　）ら
の報告〔°゛ワクチネーシヨンフォア・ヘモラジツク・
エンテライテイス・オブうターキース（Ｖａｃｃｉｎａ
ｔｉｏｎｆｏｒ　Ｉ−Ｉｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　Ｅｎｔ
ｅｒｉｔｉｓ　ｏｆ　Ｔｕｒｋｅｙｓ　）”アビアン・
ティジージス（Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　）。

２１．５５７〜５６５．１９７７　：　”ワクチネーシ
ョン・オブ・リングーネソクト・フェザノド・フォア・
−７−ソ／Ｌ／　−スプリーン・ティジージス（Ｖａｃ
ｃｉｎａｔｉｏｎｏｆ　］％ｉｒ＋ｇ−Ｎｅｃｋｅｄ　
Ｐｈｅａｓａｎｔ　ｆｏｒ　Ｍａｒｂｌｅ　５ｐｌｅｅ
ｎＤｉ　５ｅａｓｃｓ　）　”　アビアン・ディジージ
ス、２ろ、ろＤ〜ろ８．（１９７９））およびＪ　トル
セン（Ｔｈｏｒｓｃｎ　）らの報告〔゛フィールド・ト
ライアルズ・オブ・アン・イムナイゼーション・プロジ
−ジャー・アゲンスト・ヘモラジソク・エンテライテイ
ス・オブ・ターキーズ（Ｉｉ”１ｅｌｄ　Ｔｒｉａｌｓ
　ｏｆ　ａｎ　ＩｍｒｎｕｎｉｚａｔｉｏｎＰｒｏｃＣ
ｄｕｒｅＡｇａｉｎｓｔ　Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　Ｅ
ｎｔｅｒｊｔｉｓ　ｏｆＴｕｒｌ＜ｅｙｓど　アビアノ
・ディジージス」と補正する。

（４）同第１４頁第１２行〜１４行の「Ｆａｓｉｎａ　
・”　−−Ｄｉｓｅａｓｅ　＋　Ｊを 「ファシナ（Ｆａｓｉｎａ　）ら〔イン・ビトロ・スタ
ディーズ・オブ・ヘモラジツク・エンテライテイス・ウ
ィルス・クイズ・イムノフルオレツセント・アンティボ
ディー・テクニック（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　５ｔｕｄｉｅ
ｓ　ｏｆ　ＨｅｍｏｒｒｈａｇｉｃＥｎｔｅｒｉｔｉｓ
　Ｖｉｒｕｓ　Ｗｉｔｈ　Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｔ　Ａｎｔｉｂｏｄ３’Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　）
　＋アビアン・ディシーズ、」と補正する。

（５）同第１５頁第３行〜第９行のｒ　Ｎａｚｅｒｉａ
ｎ　・・・・・・−８ｃｉｅｎｃｅ　、Ｊを「ナゼリア
ン（Ｎａｚｅｒｉａｎ　）ら〔エスタブリシュメント・
オプ・Ｂ−リンフォプラストイド・セル・ライング・フ
ロム・マレックス・ディシーズ・ウィルス−インデユー
スト・チューマーズ・イン・ターキーズ（Ｅｓｔａｂｌ
ｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂ−Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏ
ｉｄｃｅｌｌ　ｌｉｍｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｍａｒｅｋ’ｓ
　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄＴｕｍ
′ｏｒｓ　ｉｎ　Ｔｕｒｋｅｙｓ　）　＋インターナシ
ョナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＣａｎｃｅｒ　
）　２９　：　６３〜６Ｂ　（１９８２）　］、リン（
Ｌｉｎ　）ら〔エスダブリシュメント・オプ・リンフォ
プラストイド・セル・ライング・フロム・マレックス・
ディシーズ・プライマリ−・チューマーズ（Ｅｓｔａｂ
ｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆ　Ｌ）’ｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉ
ｄ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｍａｒｅｋ’５
Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｐｒｉｍａｆｆ　Ｔｕｍｏｒｓ　）、
ボールトリー〇サイエンス（Ｐｏｕｌｔｒｙ　５ｃｉｅ
ｎｃｅ　）、　ｊと補正する。

（６）同第１５頁第１４行のｒ　ＮａｚｅｒｉａｎＪを
「ナゼリアン」と補正する。

（７）同第１６頁第１行〜６行の［Ｐｅｒｒｉｎ・・・
・・・−ｄｅＦｒａｎｃｅ　＋　Ｊを 「ベリン（Ｐｅｒｒｉｎ　）う［ヘモラジック・エンテ
ライティス・オブ・ターキーズ；カルチャー・オプ・ウ
ィルス・イン１ビトロ（Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　Ｅｎ
ｔｅｒｉｔｉｓ　ｏｆ　Ｔｕｒｋｅｙｓ　；Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ　ｏｆ　Ｖｉｒｕｓ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　）、プル
ーアカド°ベト。

ドフランス（Ｂｕｌｌ、　Ａｃａｄ、　Ｖｅｔ、　ｄｅ
Ｆｒａｎｃｅ　）、　ｊ　と補正する。

（８）同第１６頁第６行の［Ｐｑｒｒｉｎｊを「ベリン
」と補正する。

（９）同第１６頁第１５行のｒＮａｚｅｒｉａｎ　Ｊを
「ナゼリアン」と補正する。

（１０同第２７真下６行〜下１行のｒＭｏｏｒｅ−５２
４Ｊを「ムーア（Ｍｏｏｒｅ　）　、　Ｇ、Ｅ　、、ゲ
ルナー（Ｇｅｒｎｅｒ　）　＋Ｒ，Ｅ、およびフランク
リン（Ｆｒａｎｌｃｌｉｎ　）　＋　Ｈ，Ａ。

１９６７”／Ｊルチャー・オブ・ノーマル・ヒユーマン
・リューコサイン（Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｎｏｒｍａ
ｌ　ＨｕｍａｎＬｅｕｋｏｃｙｔｅｓ　）＋　”　ジエ
イ・エイ・エム７エイ・（Ｊ。

Ａ、Ｍ、Ａ、）、１９９：５１９〜５２４」と補正する
。

０１）同第６０頁第１２行〜第２０行の「１）・・・・
・・・・・１９４６）。」を 「１）マツコイ（’Ｍｃｃｏｙ　）、　Ｔ、Ａ、　マッ
クスウェル（Ｍａｘｗｅｌｌ　）、　Ｍ、およびクルー
ズ（Ｋｒｕｓｅ　）＋Ｐ、Ｆ、、フロス・ンス・エクス
プ・バイオロ、＆メト、　（Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｅ
ｘｐｅｒ、　Ｂｉｏｌ・＋　＆　Ｍｅｄ、　）。

１００：１１５〜１１８（’１９５９）。

２）ハス（Ｈｕｓ　）、　Ｔ、Ｃ，およυ・ケロッグ（
Ｋｅｌｌｏｇ　）。

Ｄ、Ｓ、、ジュニア　（Ｊｒ、）、ジエイ・ナトル・キ
ャノサー・インスト・（Ｊ、Ｎａｔ’１．　Ｃａｎｃｅ
ｒ　Ｉｎ５ｔ、　）＋　２５　：２２１（１９６０）。

３）イワカタ（Ｉｗａｋａｔａ　）　、　Ｓ　、＋ブレ
イス（Ｇｒａｃｅ）。

Ｊ、Ｔ、、ジュニア（Ｊｒ、）、エヌ・ワイ・ジャー・
オブ・メト、（Ｎ、Ｙ、　Ｊｏｕｒ、　ｏｆ　Ｍｅｄ、
）、　６４　／Ｎｏ、　１８　：２２７９〜２２８２（
９ｇ、１５．１９４６）。」と補正する。

０２同第６６頁第２行の［１）・・・・・Ｈｙｇ、Ｊを
「１）ライボビツツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）　＋アルバ
ート（Ａｌｂｅｒｔ　）　。

エム・ジエイ・ハイジ、　（Ａｍ、Ｊ、Ｈｙｇ、）　ｊ
　と補正する。

（１３）同第６４頁第７行〜第１０行のｒ’Ｄｒ、・・
・・・・・・・−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｊを 「チャールズ・ドメルマス（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｄｏｍｅ
ｒｍｕｔｈ　）博士（バージニア・アグリカルチュラル
・エクス啄リメント・ステーション、バージニア・ポリ
テクニク・インステイチュート・アンド・ステイト・ユ
ニバージティー（Ｖｉｒｇｉｎｉａ　Ａｇｒｉｃｕ］ｔ
ｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ＋Ｖ
ｉｒｇｉｎｉａ　Ｐｏ１ｙｔｅｃｈｎｉｃ　Ｉｎ５ｔｉ
ｔｕｔｅ　ａｎｄ　５ｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
）ｊと補正する。

測量第６４頁第１３行〜第１４行のｒ　Ａｍｅｒｃａｎ
・・・・・・Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　Ｊを「アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ　ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　
）　ｊと補正する。

（ト）同第６４貞第１８行〜第１９行のｒ　Ｄｏｍｅｒ
ｍｕｔｈ＝−−Ｄｉｓ、Ｊを「トメ／ｌ／７ス（Ｄｏｍ
ｅｒｍｕｔｈ　）　、　Ｃ，Ｈ，らによりジエイ・ワイ
ルド・タイプ、　（Ｊ、Ｗｉｌｄ　Ｄｉｓ、）ｊと補正
する。

（１６同第４１頁下１行〜第４２頁第５行の「Ｐｒａｇ
ｅ−−−−Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　Ｊを「プレージ（Ｐｒａ
ｇｅ　）＋　Ｌ、ｌ　Ｒダーリン（Ｐｅｔｔｅｒｓｏｎ
　）　＋　Ｕ−＋ホグルンド（Ｈｏｇｌｕｎｄ　）＋　
８−＋およびロンベルクーホルム（Ｌｏｎｂｅｒｇ−Ｈ
ｏ１ｍ）＋　Ｋ　。

ならびにフイリプソン（Ｐｈ１ｌｉｐｓｏｎ　）　、　
Ｌ　、著”ストラクチュラル・プロテインズ・オブ・ア
デノウィルシス（５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ　ｏｆ　Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ　）”〔■ＶＣ
シクエンシャル・テクラデーション・オブ・ザ・アデノ
ウィルス・タイプ　■　ピロン（Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ
Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｄｅｎｏｖ
ｉｒｕｓ　Ｔ’ｉｐｅ　ＩＩ　Ｖｉｒｏｎ　）。

パイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）ｊ　と補正する。

０７）同第４２頁第９行〜第１５行のｒ　Ｃｅｐｋｏ・
・・・・・＝−Ｖｉｒｏｌｏｇ）’Ｊを「セプコ（Ｃｅ
ｐｋｏ　）、　Ｃ，Ｌ、　、シャングリアン（Ｃｈａｎ
ｇｅｌｉａｎ　）　＋　Ｐ、Ｓ、およびシャープ（５ｈ
ａｒｐ）、　Ｐ、Ａ、　Ｃ’“イムノプレシビテーショ
ン・クイズ・ツーージメンショナル・プールズ゛アズ・
ア・ハイブリドーマ・スクリーニング・テクニック：ブ
ロダク刀ン・アンド・キャラクタライゼーション・オプ
・モノクローナル・アンテイボディーズ・アデノスト・
アデノウィルス　■　プロテインズ（Ｉｍｍｕｎｏｐｒ
ｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｗｉｔｈ　Ｔｗｏ−Ｄｉｍｅｎ
ｔｉｏｎａｌ　Ｐｏｏｌｓ　ａｓ　ａ　Ｈｙｂｒｉｄｏ
ｍａＳｃｒｅｅｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　：　Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅ−ｒｉ
ｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ　ＡｇａｉｎｓｔＡｄｅｎｏｖｉｒｕＳ［
Ｉ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　）、”　ノ：イロロジー（Ｖｉ
ｒｏ−１ｏｇｙ）　ｊと補正する。

以　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）次の段階： 家禽類の牌臓、血液、骨髄１だは他の組織から家禽アデ
   ノ　（ＡＡ）　ウィルス■型に感染されやすい白血球を
   採取して単離し、 前記白血球を適当な増殖培地で培養し、前記白血球細胞
   培養物にＡＡウィルス■型に属するウィルスを接種し、
   そして 前記ウィルスの増殖に適する条件下で前記接種された細
   胞培養物を増殖する、 ことからなるＡＡウィルス■型のインビトロ増殖方法。 （２１ＡＡウイルス■型が出血性腸炎ウィルス（ＲＥＶ
   ）である特許請求の範囲第り項記載の方法。 （３）ＡＡウィルス■型がキジのマーブルスジリーン病
   （Ｍａｒｂｌｅ　５ｐｌｅｅｎ　Ｄｉｓｅａｓｅ）　ウ
   ィルスまたはニワトリの牌腫を伴なう非マレック病（ｎ
   ・ｎ−Ｍａｒｅｋ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ）原因ウィルス
   である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ウィルスが毒性法である特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ウィルスが非毒性株である特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ＲＥＶがＡＴＣＣＶＦ！−８９８の番号で表わされる、
   キジのマーブルスジリーン病ウィルス株である唱許請求
   の範囲第２項記載の方法。 白血球細胞培養物が初代白面株細胞培養物である特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 白血球細胞培養物か白血球細胞ライン培養物である特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 家禽類の組織から白血球を採取し、該白血球立方法。 Ａ　Ａウィルス■型かＨＥＶである特許請求の範囲第９
   項記載の方法。 ＨＥＶかＡＴＣＣＶＲ−８９８の番号で表わされる、キ
   ジのマーブルスジリーン病ウィルス株である特許請求の
   範囲第１０虫記載の方法。 α２　組織が肺臓、血液および骨髄から選択される特許
   請求の範囲第９項記載の方法。 αＪ　ウィルスが毒性株である特許請求の範囲第９項記
   載の方法。 α滲　ウィルスが非毒性株である特許請求の範囲第９項
   記載の方法。 （１５）ＡＡウィルス■型を白血球細胞培養物中でイン
   ビトロ増殖させ、これにより家禽類を免疫化するのに用
   いられうるウィルスを産生ずることからなる七面鳥の出
   血性腸炎、キジのマーブルスジリーン病、ニワトリの牌
   腫を伴なう非マレック病および上記家禽類においてＡＡ
   ウィルスｎ型により起きる他の関連疾患に対し有効なワ
   クチンの調製方法。 （１６ｊＡＡウイルス■型がＲＥＶである特許請求の範
   囲第１５項記載の方法。 ａ７）ＨＥＶ７％ＡＴＣＣＶＲ−８９８（Ｄ番号１衣弔
   される、キジのマーブルスジリーン病ウィルス株である
   特許請求の範囲第１６項記載の方法。 αＱ　白血球細胞培養物が初代白血球細胞培養物である
   特許請求の範囲第１５項記載の方法。 ｕ９　白血球細胞培養物が白血球細胞ラインである特許
   請求の範囲第１５項記載の方法。 四　白血球細胞培養物か家禽類の組織から選択される特
   許請求の範囲第１５項記載の方法。 圓　組織が肺臓、血液または骨髄から選択される特許請
   求の範囲第１５項記載の方法。 （２２）　組織か七面鳥、ニワトリまたはキジから得ら
   れる特許請求の範囲第２０項記載の方法。 （２３）　ウィルスか毒性株である特許請求の範囲第１
   ５項記載の方法。 （２（イ）　ウィルスが非毒性株である特許請求の範囲
   第１５項または第１６項記載の方法。 （２５）　ウィルスがＡＡウィルス■型で感染された家
   禽類の体液、組織または排泄物から得られる特許請求の
   範囲第１５項記載の方法。 （２０感染した家禽類が起きている、寝ているまたは小
   屋に入っている環境からウィルスを得る特許請求の範囲
   第１５項記載の方法。 （２７）　生ウィルス、死滅もしくは不活化ウィルス、
   ウィルスサブユニットまたはウィルス体構成成分からな
   る群から選択されるウィルス成分よシなり、該成分は家
   禽類の組織から単離された白血球細胞の培養物中におけ
   るＡＡウィルス■型のインビトロ増殖によシ得られるも
   のであることを特徴とする七面鳥の出血性腸炎、キジの
   マーブルスジリーン病、ニワトリの牌腫を伴なう非マレ
   ック病およびＡＡウィルス■型で起こる他の関連疾患に
   対する七面鳥および他の家禽類の免疫化に用いられるワ
   クチン。 （２８）組織が肺臓、血液または骨髄から選択される特
   許請求の範囲第２７虫記載のワクチン。 ＋２９）ＡＡウィルス■型がＲＥＶである特許請求の範
   囲第２７項記載のワクチン。 （３０）ＨＥＶがＡＴＣＣＶＲ−８９８（７）ｉ号ｆ表
   もされる、キジのマーブルスジリーン病ウィルス株であ
   る特許請求の範囲第２９項記載のワクチン。 ０１）白血球細胞の培養物が白血球細胞の初代培養物で
   ある特許請求の範囲第２７項記載のワクチン Ｃ３つ　白血球細胞培養物が白血球細胞ラインである特
   許請求の範囲第２７項記載のワクチン。 （３３）　ウィルスが毒性株である特許請求の範囲第２
   ７項記載のワクチン。 ０■　ウィルス成分が次のもの： 全細胞培養物； 全細胞培養物から取シ出した細胞； 培養培地；もしくは 上澄液； またはウィルス含有の他の適当なフラクションから回収
   される特許請求の範囲第２７項記載のワクチン。 ０６）緩衝液と一緒にした特許請求の範囲第２７項記載
   のワクチン。 （Ｓｎ　ｌｌｍｆＵ）；０．０２Ｍ　トリＸ−Ｈ（Ｊ％
   ０．００１Ｍ　Ｍｉｌ１２．５％（Ｖ／Ｖ）グリセロー
   ルおよび５％（Ｗ／Ｖ）　ウシ血清アルブミンからなる
   特許請求の範囲第３６項記載のワクチン。 （晒　緩衝液が０．０２Ｍ’）リス−Ｅ（Ｃｄ、Ｏ，Ｏ
   ＯＩＭｂ／ｄ／Ｃ１２，５％（Ｖ／Ｖ）グリセロールお
   よび５％（Ｗ／Ｖ）　ウシ血清アルブミンからなシ、ｐ
   Ｈ８である特許請求の範囲第３６項記載のワクチン。 （譲　凍結乾燥された特許請求の範囲第２７項記載のワ
   クチン。 （４Ｑ　ａ、　）家禽類の肺臓、血液、骨髄または他の
   組織から取り出される白血球であってＡＡウィルス■型
   に感染されやすいものを単離し； ｂ）前記白血球を適当な増殖培地で培養し；ｃ）ＡＡウ
   ィルス■型を前記白血球細胞培養物に接種し； ｄ）前記ウィルスの増殖に適する条件下で前記接種され
   た細胞培養物を増殖し； ｅ）前記ウィルスを回収する； ことによりＡＡウィルス■型のインビトロ増殖調製物を
   得、該調製物を使用することからなる、七面鳥の出抑性
   腸炎、キジのマーブルスジリーン病、ニワトリの牌腫を
   伴なう非マレック病およびＡＡウィルス■型で起こされ
   る家禽類の他の関連疾患に対して活性なワクチンの調製
   法。 （４１１ウィルスの回収が、 ａ）白血球細胞を、音波処理、凍結および解凍または浸
   透圧ショック法により破壊し、ｂ）遠心分隨によりウィ
   ルス含有上澄液を細胞破片から選択的、に分離する、 ことよりなる特許請求の範囲第４０項記載の方法。 （４り　得られた上澄液を保存緩衝液に対し透析し、次
   いで前記保存緩衝液と一緒にする特許請求の範囲第４１
   項記載の方法。 （４３保存緩衝液が０．０２　Ｍ　ｈ　ｌＪス−ＨＯ２
   ，０，ＯＯＩＭ　Ｍ　ｇ　Ｃ１２２，５％（Ｖ／Ｖ）　
   グリセロールおよび５％（Ｗ／Ｖ）　ウシ血清アルブミ
   ンからなる特許請求の範囲第４２項記載の方法。 （４４１保存緩衝液が０．０２Ｍ）リス−ＨＣｄ、００
   ０１Ｍ　Ｍｉｃｅ□、５％（Ｖ／Ｖ）グリセロールおよ
   び５％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンからなり、ｐＨ８
   である特許請求の範囲第４２項記載の方法。 （４ＳＡＡウイルス■型がＲＥＶである特許請求の範囲
   第４０項記載の方法。 （伺　ウィルスが毒性株である特許請求の範囲第４０項
   記載の方法。 （４η　ウィルスが非毒性株である特許請求の範囲第４
   ０項記載の方法。 （４印　有効投与量とするために、ウィルス成分が酵素
   速結イムノソルベント法（ＥＬＩＳＡ）で測定したとき
   少なくとも１／２ｏの血清抗体力価を生ずるのに十分量
   存在する特許請求の範囲第２７項記載のワクチン。 （４９）ワクチンが１単位につき最低１０個のウィルス
   粒子を含むような単位投与形態である特許請求の範囲第
   ２７項記載のワクチン。 （５０）ＨＥＶがＡＴＣＣＶＲ−８９８の番号で表わさ
   れる、キジのマーブルスジリーン病ウィルス株である特
   許請求の範囲第４５項記載の方法。 ６υ　０ないし１０−９の希釈率で有効な投与量とされ
   ている特許請求の範囲第２７項記載のワクチされている
   特許請求の範囲第２７項記載のワクチン。 （５３＋１０−２ないし１０−４の希釈率で有効な投与
   量とされている特許請求の範囲第２７項記載のワクチン
   。 （５４）１０−３ないし１０−４の希釈率で有効な投与
   量とされている特許請求の範囲第２７項記載のワクチン
   。