RU2242512C1 - Штамм вируса западного энцефаломиелита лошадей (western encephalomyelitis virus-wee 163-a) гкв № 964 для приготовления диагностических и профилактических препаратов - Google Patents
Штамм вируса западного энцефаломиелита лошадей (western encephalomyelitis virus-wee 163-a) гкв № 964 для приготовления диагностических и профилактических препаратовInfo
- Publication number
- RU2242512C1 RU2242512C1 RU2003116404/13A RU2003116404A RU2242512C1 RU 2242512 C1 RU2242512 C1 RU 2242512C1 RU 2003116404/13 A RU2003116404/13 A RU 2003116404/13A RU 2003116404 A RU2003116404 A RU 2003116404A RU 2242512 C1 RU2242512 C1 RU 2242512C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- encephalomyelitis virus
- western
- virus
- wee
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Штамм вируса западного энцефаломиелита лошадей - western encephalomyelitis virus - WEE 163-A депонирован в Государственной коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН под номером ГКВ №964. Штамм имеет следующую аминокислотную последовательность гликопротеина Е2 оболочки вириона
N-конец- SITDDFTLTSPYLGFCPNCRHSAPCFSPIKIENVWDESDDGSIRIQVSAQF
GYNQAGTADVTKFRYMSYDHDHDIEEDSMEKIAISTSGPCRRLGHKGYFLLAQCPPGDSVT
VSITSGASENSCTVEFKIRRKFVGREEYLFPPVHGKRVKCHVYDHLKERSAGYITMHRPSP
HAYKSYLKEASGEVYIKPPSGKNVTYECKCGDYSTGIVSTPTKMNGCTKAKQCIAYKSDQT
KWVFNSPDLIRHTDHSVQGKLHIPFRLIPTVCPVPLAHTPTVTKWFKGITLHLTATRPTLL
TTRKLGLRADATAEWITGTTSRNFSVGREGLEYVWGNHEPVRVWAQESAPSDPHGWPHEII
IHYYHRHPVYTVIVLCGVALAILVGTASSAACITKARRDCLTPYALAPNATVPTALAVLCC
IRPTNA-С-конец. Штамм обладает высокой репродуктивностью, хорошо размножается в клетках ФЭК и перевиваемых клетках VERO при разных условиях культивирования, накапливаясь в титрах до 5×109-1×1010 БОЕ/мл. Кроличьи антитела к нему реагируют в высоких титрах с другими известными штаммами ВЗЭЛ, циркулирующими в разных регионах мира. Штамм хорошо хранится при -70°С. Штамм может быть использован для создания генно-инженерных препаратов. 2 табл.
Description
Изобретение относится к медицинской вирусологии и предназначено для создания средств диагностики и профилактики заболеваний, вызванных вирусом западного энцефаломиелита лошадей.
Вирус западного энцефаломиелита лошадей (ВЗЭЛ) - возбудитель тяжелых заболеваний нервной системы - поражает человека и домашних животных (лошадей) и относится к группе карантинных инфекций (2-ая группа патогенности). Вирус передается кровососущими членистоногими (комарами) и в основном циркулирует в западном полушарии (Северная и Южная Америка), однако имеются сообщения о выделении ВЗЭЛ-подобного вируса на территории России, в Удмуртии (А.А.Смородинцев и др., 1962). Коммерческие отечественные диагностические тест-системы, базирующиеся на использовании очищенных вирусных антигенов, антител к ним (методы иммуноферментного анализа - ИФА, иммунофлюоресценции - ИФ, латекс-агглютинации - ЛА) или на выявлении генетического материала этого вируса (например, метод обратной транскрипции -полимеразной цепной реакции - ОТ-ПЦР) отсутствуют. Задача создания методов диагностики (в особенности дифференциации от других, близких по антигенной структуре альфавирусов) и профилактики этого заболевания, основанных на использовании хорошо охарактеризованных вирусных штаммов, остается актуальной. Отсутствие коммерческих отечественных диагностических тест-систем не позволяет проводить плановые экологические исследования (для выявления антигенно-родственных штаммов ЗЭЛ в сыворотках людей и животных) в регионах с потенциальным распространением антигенно-родственных альфавирусов.
Известны ослабленные (аттенуированные) штаммы вируса ЗЭЛ, использованные для приготовления диагностических и профилактических препаратов (например, штамм В628) в США. В Государственной коллекции вирусов Российской Федерации такие штаммы отсутствуют. Кроме того, в связи с общепринятыми правовыми нормами их коммерческое применение в других странах, в частности в Российской Федерации, невозможно.
В выпускаемой в РФ дивакцине (ВЗЭЛ - вирус восточного энцефаломиелита лошадей) применяется штамм ВЗЭЛ California с неохарактеризованной первичной структурой вирусных генов и его белков, а поэтому фенотип его патогенности невозможно контролировать на современном генетическом уровне.
Целью изобретения является создание высокопродуктивного штамма ВЗЭЛ с ослабленной вирулентностью, репродуцирующегося в доступной клеточной культуре (например, в фибробластах эмбриона кур - ФЭК) с высокими титрами при использовании производственных методов культивирования (роллерное или суспензионное) и обладающего высокой иммуногенной активностью и широкими антигенными связями с другими известными штаммами вируса ЗЭЛ с охарактеризованной первичной структурой белков вириона, который может быть использован для приготовления диагностических и вакцинных препаратов.
Полученный штамм вируса западного энцефаломиелита лошадей - western encephalomyelitis virus - WEE 163-А обладает рядом вирусологических свойств, позволяющих рассматривать его как удобную биотехнологическую модель для получения диагностических и вакцинных препаратов. Штамм может быть использован и для испытания противовирусных препаратов "ин витро" (в культуре ткани) и "ин виво" (на лабораторных животных). Штамм обладает высокой репродуктивностью, хорошо размножается в клетках ФЭК и перевиваемых клетках VERO при разных условиях культивирования, накапливаясь в титрах до 5×109-1×1010 БОЕ/мл. Уровни его репродукции можно легко оценить по выраженному цитопатическому действию в клеточной культуре или титрованием по бляшкам под агаровым покрытием. Кроличьи антитела к нему реагируют в высоких титрах с другими известными штаммами ВЗЭЛ, циркулирующими в разных регионах мира. Штамм хорошо хранится при -70°С. Полученные нами сведения об его первичной структуре позволяют контролировать фенотип на генетическом уровне и могут быть использованы для создания генно-инженерных препаратов. Штамм депонирован в Государственную коллекцию вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (ГКВ №964).
Культуральные свойства
Штамм вируса - WEE 163-A получен путем длительного последовательного культивирования и селекции мозгового варианта - WEE McMillan (McM) в первичных и перевиваемых клеточных линиях с периодическим клонированием среднебляшечного варианта (из бляшки в бляшку) путем предельных разведении. Вирус адаптирован к клеткам ФЭК.
Инфекционный титр вируса определяется титрованием под агаровым покрытием (число бляшкообразующих единиц в 1 мл культуральной жидкости –БОЕ/мл) или по развитию цитопатического эффекта (доз ЦПЭ/мл) в клетках ФЭК, ВНК-21 или VERO при титровании в микропланшетах. Штамм имеет среднебляшечный фенотип. Ниже приводятся показатели "продуктивности" штамма. Инфицирование монослоя двухсуточной культуры ФЭК с множественностью 0,1-1 БОЕ на 1 клетку приводит к развитию острой инфекции (цитопатическое действие вируса) и гибели клеток через 12-16 часов после заражения. При монослойном культивировании в стационарной культуре ФЭК уровень накопления инфекционного вируса достигает к этому времени 8-9×108-1-5×109 БОЕ/мл. Уровень продукции вируса на 1 клетку может превышать 1000 БОЕ (более 1000 инфекционных вирусных частиц).
Показатели инфекционного вируса при роллерном культивировании клеток ФЭК достигают уровней 5×109-1-2×1010 БОЕ/мл. Роллерное и суспензионное культивирование инфицированных клеток ФЭК (1 млн. клеток/мл) позволяет получить большие (по массе) количества вируса.
Одновременно с инфекционной активностью в культуральной жидкости накапливаются гемагглютинины, которые определяются в реакции гемагглютинации с эритроцитами гуся (см. Шубладзе А.К. и С.Я.Гайдамович, 1958, Практическая вирусология) в титрах 1:32-1:64 ГАЕ/мл (гемагглютинирующих единиц). Реакция проходит в диапазоне рН 5,6-6,3 с оптимумом рН 6,0-6,1. Соотношение инфекционных и гемагглютинирующих единиц БОЕ:ГАЕ=106-107. Тест РГА может использоваться как ориентировочный на стадиях очистки и концентрации вируса.
Вирусные белки и антигенная активность
В состав вирусной частицы (вириона) ВЗЭЛ входят три белка: белок С (core) нуклеокапсида с мол. массой 33 кдальтон, который связан с геномной РНК вириона, и два гликопротеина оболочки вириона - Е2 (с мол. массой 46 кД) и Е1 (43 кД), Белок Е2 индуцирует в иммунном организме выработку нейтрализующих инфекционность антител, белок El - антигемагглютинирующих антител.
Штамм WEE 163-A обладает высокой антигенной активностью, а гипериммунная сыворотка кролика реагирует в высоких титрах (в реакциях нейтрализации - РН, торможения гемагглютинации - РТГА и иммунофлюоресценции - ИФ) с основными представителями ВЗЭЛ-подобных вирусов и в тех же реакциях более слабо - с относящимися к тому же серокомплексу Синдбис-подобными вирусами.
Инфекция и иммунитет у экспериментальных животных
Штамм WEE 163-A имеет ослабленную патогенность для мышей линии balb/c по сравнению со штаммом МсМ: при внутримозговом введении одинаковых доз вируса новорожденным мышам-сосункам гибель наступает позже на 1 сутки, чем в ответ на штамм МсМ; у взрослых мышей при периферическом заражении (подкожном или внутрибрюшинном) штаммом МсМ гибель мышей наступает на 3-4 сутки, а при заражении штаммом WEE 163-A той же дозой подкожно - выживают до 100% мышей, при внутрибрюшинном заражении штаммом WEE 163-A в той же дозе - выживают 50% мышей, а гибель оставшихся наступает на 7-8 сутки.
Культуральные и мозговые антигены штамма WEE 163-A характеризуются высокой иммуногенной активностью и вызывают развитие протективного иммунитета. Иммунные мыши, выжившие после подкожного заражения штаммом WEE 163-A, защищены от введения летальных доз (до 10) штамма МсМ.
Антигенные свойства
Вирус ЗЭЛ относится к роду Alphavirus (семейство Togaviridae) и входит в состав антигенного серокомплекса вирусов Синдбис - ЗЭЛ. Объединение Синдбис- и ЗЭЛ-подобных вирусов в один серокомплекс основано на антигенном сходстве белков оболочки вириона (белки Е1 и Е2 ВС и ВЗЭЛ имеют высокую гомологию и по первичной структуре), выявляемом в реакциях РН, РТГА, ИФ. Вирусы этой группы относятся к РНК-содержащим вирусам с геномом положительной полярности и имеют липидную оболочку. Обработка альфавирусов липид-экстрагирующими соединениями (нейоными детергентами, этиловым эфиром, хлороформом) в течение 30 минут приводит к инактивации инфекционной активности вируса. Диаметр вириона около 50 нм. В состав вирусных частиц входят три структурных белка, обладающих иммуногенными свойствами. Антитела к этим белкам или же сами белки выявляются в сыворотке иммунного (или больного) организма, а также в инфицированных клетках с помощью иммунологических реакций и вирусологических методов.
Методом иммуноблота было показано, что рекомендуемый штамм содержит три основных структурных белка: гликопротеины Е1 и Е2 оболочки вириона и белок С нуклеокапсида.
Трехкратная иммунизация кроликов или лабораторных мышей препаратами очищенного и сконцентрированного вируса (в т.ч. разрушенного детергентом) приводит к развитию специфического иммунного ответа. Структурные белки вириона можно выявить в зараженных ВЗЭЛ клеточных культурах методами ИФ или иммуноферментного анализа (ИФА коммерческие тест-системы отсутствуют). Использование специфических антител в методе непрямой иммунофлюоресценции позволяет обнаружить вирусспецифические белки в зараженных клетках в виде диффузного или гранулярного свечения в цитоплазме. Установлено, что антисыворотка к цельному или разрушенному вирусу и, главным образом, антитела к белку Е2 способны эффективно нейтрализовать инфекционную активность и других штаммов ВЗЭЛ (см. табл.2). Антисыворотка к цельному или разрушенному вирусу и, главным образом, антитела к белку Е1 приводят к торможению гемагглютинации гусиных эритроцитов, вызываемую разными штаммами ВЗЭЛ (см. табл.2).
Анализ аминокислотной последовательности белка Е2. Штамм имеет следующую аминокислотную последовательность белка Е2:
N-конец-SITDDFTLTSPYLGF
CPNCRHSAPCFSPIKIENVWDESDDGSIRIQVSAQFGYNQAGTADVTKFRYMSYDHDH
DIEEDSMEKIAISTSGPCRRLGHKGYFLLAQCPPGDSVTVSITSGASENSCTVEFKIR
RKFVGREEYLFPPVHGKRVKCHVYDHLKERSAGYITMHRPSPHAYKSYLKEASGEVYI
KPPSGKNVTYECKCGDYSTGIVSTPTKMNGCTKAKQCIAYKSDQTKWVFNSPDLIRHT
DHSVQGKLHIPFRLIPTVCPVPLAHTPTVTKWFKGITLHLTATRPTLLTTRKLGLRAD
ATAEWITGTTSRNFSVGREGLEYVWGNHEPVRVWAQESAPSDPHGWPHEIIIHYYHRH
PVYTVIVLCGVALAILVGTASSAACITKARRDCLTPYALAPNATVPTALAVLCCIRPTNA-С-конец
Знание первичной структуры основного иммуногенного белка позволяет отслеживать изменения вирусного фенотипа на молекулярном уровне в процессе длительного культивирования вируса, а также использовать их для получения генно-инженерных конструкций, экспрессирующих белок Е2 или его фрагменты, для получения вирусных антигенов и антител к ним и последующего использования таких компонентов в иммунологических реакциях и тест-системах.
Пример 1. Получение препаративных количеств вирусных белков на основе штамма WEE 163-A.
Сравнительные показатели уровней накопления штамма WEE 163-A и прототипного штамма ВЗЭЛ МсМ приведены в табл.1. Использование штамма WEE 163-A для получения больших количеств вируса при производстве диагностических и профилактических препаратов будет более рентабельным (в пять-десять раз).
Пример 2. Демонстрация способности штамма WEE 163-A вызывать образование специфических антител, способных нейтрализовать разные штаммы вируса ЗЭЛ.
Трехкратную иммунизацию кроликов препаратами очищенных по стандартной методике вирусных частиц (разрушенных детергентом) проводили подкожно (паравертебральные точки) и в подколенные лимфатические узлы. Первую иммунизацию проводили с использованием полного адъюванта Фрейнда, последующие - без адъюванта с интервалом 4 недели. Титры антител определяли в стандартных реакциях (РН, РТГА, ИФ) с гомологичным (WEE 163-A) и прототипными гетерологичными (штаммы МсМ, FM, HJ, Y-62) вирусами, выделенными на территории Сев. Америки и России. Полученные результаты показывают (см. табл.2), что препарат антигена на основе предлагаемого штамма (WEE 163-А) обладает высокой иммуногенной активностью (высокие титры в РН, РТГА, ИФ), а индуцируемые им антитела вызывают перекрестную нейтрализацию основных прототипных штаммов ВЗЭЛ.
Биотехнологическая характеристика
Предлагаемый оригинальный штамм вируса ЗЭЛ (WEE 163-A-адаптированный, аттенуированный) обладает высокой репродуктивностью. Приготовленные на его основе препараты могут найти применение в вирусологической практике при разработке профилактических средств (вакцин -инактивированной, субъединичной, моновалентной и т.д.) против западного энцефаломиелита и диагностических тест-систем для выявления маркеров (антигенов и антител) этой инфекции. Штамм (как ослабленный по патогенности) может быть использован и для испытания противовирусных препаратов, т.к. титруется (точное количественное измерение) в стандартных, широко распространенных клеточных культурах. Приведенные сведения об аминокислотной последовательности основного иммунодоминантного белка вириона являются "паспортом" данного высокопродуктивного штамма, позволяющим изучать изменения фенотипа вируса на молекулярном уровне, и могут быть использованы для создания генно-инженерных препаратов.
Claims (1)
- Высокопродуктивный штамм вируса западного энцефаломиелита лошадей - western encephalomyelitis virus - WEE 163-A рода Alphavirus (семейство Togaviridae) ГКВ №964 для приготовления диагностических и профилактических препаратов, имеющий следующую аминокислотную последовательность (первичную структуру) гликопротеина Е2 оболочки вириона:N-конец- SITDDFTLTSPYLGFCPNCRHSAPCFSPIKIENVWDESDDGSIRIQVSAQF GYNQAGТADVTKFRYMSYDHDHDIEEDSMEKIAISTSGPCRRLGHKGYFLLAQCPPGDSVT VSITSGASENSCTVEFKIRRKFVGREEYLFPPVHGKRVKCHVYDHLKERSAGYITMHRPSP HAYKSYLKEASGEVYIKPPSGKNVTYECKCGDYSTGIVSTPTKMNGCTKAKQCIAYKSDQT KWVFNSPDLIRHTDHSVQGKLHIPFRLIPTVCPVPLAHTPTVTKWFKGITLHLTATRPTLL TTRKLGLRADATAEWITGTTSRNFSVGREGLEYVWGNHEPVRVWAQESAPSDPHGWPHEII IHYYHRHPVYTVIVLCGVALAILVGTASSAACITKARRDCLTPYALAPNATVPTALAVLCC IRPTNA-С-конец.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2003116404/13A RU2242512C1 (ru) | 2003-06-04 | 2003-06-04 | Штамм вируса западного энцефаломиелита лошадей (western encephalomyelitis virus-wee 163-a) гкв № 964 для приготовления диагностических и профилактических препаратов |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2003116404/13A RU2242512C1 (ru) | 2003-06-04 | 2003-06-04 | Штамм вируса западного энцефаломиелита лошадей (western encephalomyelitis virus-wee 163-a) гкв № 964 для приготовления диагностических и профилактических препаратов |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2003116404A RU2003116404A (ru) | 2004-12-10 |
RU2242512C1 true RU2242512C1 (ru) | 2004-12-20 |
Family
ID=34388170
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2003116404/13A RU2242512C1 (ru) | 2003-06-04 | 2003-06-04 | Штамм вируса западного энцефаломиелита лошадей (western encephalomyelitis virus-wee 163-a) гкв № 964 для приготовления диагностических и профилактических препаратов |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2242512C1 (ru) |
-
2003
- 2003-06-04 RU RU2003116404/13A patent/RU2242512C1/ru not_active IP Right Cessation
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Collisson et al. | Cytotoxic T lymphocytes are critical in the control of infectious bronchitis virus in poultry | |
Virelizier | Host defenses against influenza virus: the role of anti-hemagglutinin antibody | |
Krüger et al. | Hantavirus infections and their prevention | |
Tiwari et al. | Assessment of immunogenic potential of Vero adapted formalin inactivated vaccine derived from novel ECSA genotype of Chikungunya virus | |
Rott et al. | Attenuation of pathogenicity of fowl plague virus by recombination with other influenza A viruses nonpathogenic for fowl: nonexculsive dependence of pathogenicity on hemagglutinin and neuraminidase of the virus | |
Li et al. | Oral administration of hepatitis E virus-like particles induces a systemic and mucosal immune response in mice | |
Pereira et al. | An inactivated yellow fever 17DD vaccine cultivated in Vero cell cultures | |
Lin et al. | Absence of M protein in a cell-associated subacute sclerosing panencephalitis virus | |
Lukashevich et al. | Lassa virus diversity and feasibility for universal prophylactic vaccine | |
US4009258A (en) | Influenza vaccine containing a recombinant, antigenically hybridized virus and method of using the same | |
US4517304A (en) | Production of viral antigens | |
Kováčová et al. | Q fever–still a query and underestimated infectious disease | |
Kojima et al. | Stable high-producer cell clone expressing virus-like particles of the Japanese encephalitis virus e protein for a second-generation subunit vaccine | |
Roh et al. | Efficacy of HVT-IBD vector vaccine compared to attenuated live vaccine using in-ovo vaccination against a Korean very virulent IBDV in commercial broiler chickens | |
Tobita et al. | Genetic recombination for antigenic markers of antigenically different strains of influenza B virus | |
RU2603003C1 (ru) | Вакцина инактивированная сорбированная против ящура типов а, о, азия-1 | |
JPH05501401A (ja) | 組換え微生物との転移増殖によるワクチン又はトキソイド製剤及び免疫の方法 | |
RU2699671C1 (ru) | Вакцина для ранней защиты против ящура типа О инактивированная эмульсионная | |
Butchko et al. | Specificity studies on the proliferative response of thymus-derived lymphocytes to influenza viruses | |
Naik et al. | Immunogenic and protective properties of haemagglutinin protein (H) of rinderpest virus expressed by a recombinant baculovirus | |
KR20120131725A (ko) | 고병원성 조류인플루엔자 a h5n1 바이러스 유사입자 및 이를 이용한 가금용 백신 | |
Yang et al. | Safety and immunogenicity of recombinant rabies virus (ERAGS) in mice and raccoon dogs | |
RU2242512C1 (ru) | Штамм вируса западного энцефаломиелита лошадей (western encephalomyelitis virus-wee 163-a) гкв № 964 для приготовления диагностических и профилактических препаратов | |
WO2014167582A2 (en) | Vaccine composition for prophylaxis in ruminants | |
KR101578423B1 (ko) | 세포 배양에 적응된 구제역 o 혈청형-동남아 지역형의 바이러스 백신주 및 이를 포함하는 구제역 바이러스 백신 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170605 |