JPH07502897A

JPH07502897A - ネコ白血病ウイルスワクチン

Info

Publication number: JPH07502897A
Application number: JP5512609A
Authority: JP
Inventors: ハファー，キース
Original assignee: ファイザー・インコーポレイテッド
Priority date: 1992-01-06
Filing date: 1993-01-06
Publication date: 1995-03-30
Also published as: CA2127466A1; AU3441693A; EP0621893A1; WO1993014190A1; EP0621893A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ネコ白血病ウィルスワクチン本願は、一般には、獣医学ワクチンに関し、より詳細には、ネコ白血病ウィルスにより引き起こされるネコの持続感染を予防するための組成物および方法に関する。

発明の背景ネコ白血病は、ネコ科動物、特に飼いネコの衰弱性のウィルス性疾患で、しばしば動物の死をもたらす。ネコ白血病の発病機序は以下の段階に分けることができる　初期疾を、回復または寛解、そして末期症状である。一般に、持続的にウィルス血症になるネコ科動物のみが、感染初期に有意な臨床的あるいは血液学的兆候を示す。臨床的兆候は、種々の程度の発熱、倦怠感、体重減少、全身性リンパ節疾唐および血液学的異常を包含する。

ネコ白血病ウィルス（ＦｅＬＶ）に感染したネコ科動物は無症候性であるかもしれずまたはネコ白面病疾、轡の症状を示すかもしれない。自然感染の後、約、４０％のネコ科が、ＦｅＬＶに対する体液性免疫応答を示し、ウィルスを拒絶し、免疫性になる。感染の初期段階に死亡した場合、それは、通常、重症の骨髄抑制および／または二次感染の直接の結果である。キャリヤーであるネコ科動物がその生涯を通して無症候性を保持するかもしれないが、これらの動物の大部分はあるＦｅＬＶ関連疾関連疾病するであろう。

ＦｅＬＶキャリヤーに対するウィルスの効果に直接関連する疾患は、腫瘍性疾患、骨髄抑制生涯、免疫生涯および生殖の問題を包含する。間接的に関連する疾患は、ウィルス性および細菌性二次感染ならびに原生動物性疾患である。

ＦｅＬＶは、通常、感染動物と感染していない動物との物理的接触により伝達される。３種のＦｅＬ〜・′亜型がネコの疾患に関連している。亜型ＡはすべてのＦｅＬＶ感染のうち１００％に存在する。ウィルスをＦｅＬＶに感染したネコ科動物から単離する場合、ＦｅＬＶＡが単独で見い出される場合が５０％、ＦｅＬＶＢとともにＦｅＬＶＡが見い出される場合が４９％、そしてＦｅＬＶ亜型Ａ、ＢおよびＣが一緒になって引き起こしたと見られる感染である場合がわずかに１％である。該ウィルスは外的環境中で非常に不安定で、室温において数時間以上生存することは希で、たいていの消毒薬て失活される。

多くの既知ＦｅＬＶ用ワクチンがある［例えば、ノヤレ・ソト（Ｊａｒｒｅｔｔ）著。

オリジンス・オン・ヒユーマン・キャンサー（Ｏｒｉｇｉｎｓ　ｏｆ　Ｆｌｕｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ）中。

１２１５〜１２２２頁、　「ネコ白血病に対するワクチンの開発Ｊ　（１９７７年）およびピンク−（Ｐｉｎｔｅｒ）ら、ウイロｏシー（Ｖｉｒｏｌ、　）第８３巻・４１７〜４２２頁（１９７７年）参照］。しかしながら、これらの既知ワクチン１ま、免疫性を示す一貫した抗体応答を誘発しない。そのうえ、該ワクチンは持続ウィルス血症を予防するが、感染を予防しない。いくらかのネコ科動物は、感染を解除する前に一時的なウィルス血症となる。このウィルス血症状態は免疫抑制を伴し）、動物は二次感染に対してより感受性になる［ンエイ・エム・スカーレ・ソト（Ｊ、　Ｍ、　５ｃａｒｌｅｔｔ）ら、カーネル・ベタリナリアン（Ｃｏｒｎｅｌｌ　Ｖｅｔ、　）　、第８０巻（第３号）・２３７〜２４２頁（１９９０年）］。

加えて、ある種のＦｅＬＶサブユニットワクチンにより誘導された免疫応答力く、実際にＦｅＬＶの抗体増加感染を媒介しうろことが報告されてＬ）る［ペダーセン（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ　）ら、ベタリナリー・イミュノロノー・アンド・イミュノノく゛ノロノー（Ｖｅｔ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、　）　、第１１巻　１２３頁（１９８６年）］。

当該分野において、ウィルス蛋白質に対する抗体増加を起こさずにＦｅＬＶ感染に対する防御能を有するワクチンおよびワクチン組成物：二つ（嘱ての必要性力く存在する。

発明の要約 −の態様において、本発明は、ＦｅＬＶにより引き起こされる疾、壱に対する防御にて有用である抗原を産生ずるＦｅＬＶ亜型で形質転換されｔこ安定なネコＴ細胞すンパ睡細胞株を提供する。−の具体例において、ＦｅＬ〜ｒ亜型Ａカ１らなる細胞株が提供される。他の具体例では、亜型Ａ、ＢおよびＣのうち１種まｊこ１まそれ以上の種類が使用される。形質転換細胞は、細胞膜」−のＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞抗原の存在により特徴付けられ、培養において、選択されたＦｅＬ’ｖ’亜型ウィルス蛋白質の産生能を有する。

別の態様において、本発明は、前記形質転換細胞を培養し、細胞溶解物または培養基から単離することにより製造される選択ＦｅＬＶ亜型蛋白質（ウィルス蛋白質）を提供する。

さらに別の態様において、本発明は、本発明の細胞株により産生された選択ＦｅＬＶ抗原からなるＦｅＬＶワクチン組成物を提供する。ＦｅＬＶピリオンｇｐ７０新生抗原またはネコ・オンコーナウィルス（Ｏｎｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）細胞付随の膜抗原（ＦＯＣＭＡ）に対する中和抗体が実質的に存在しない状態においても、該ワクチンは、予防接種した動物を１種以上のＦｅＬＶ亜型による感染から防御しうる。

さらに別の態様において、本発明の細胞株を他のネコ白血病ウィルス抗原と組み合わせることにより産生される抗原からなるワクチン組成物が提供される。該ワクチンは、異なる菌株のネコ白血病ウィルスでの感染に対する防御能を有する。

本発明のさらなる態様は、本発明の細胞株由来の失活抗原流体および所望によりアジュバントを適当な担体と合することからなる、ＦｅＬＶ感染に対するワクチンの製造法を包含する。

もう一つの言様において、本発明は、本発明の適当なワクチン組成物を感染していないネコ科動物に接種することによる、ネコ白血病の臨床的症状を予防する方法を提供する。

さらに別の態様において、本発明は、本発明のＦｅＬＶワクチンと選択されたワクチンとを同時あるいは連続的に投与することによる、選択されたネコ・ワクチンに対する免疫応答性を高める方法を提供する。本発明のＦｅＬＶワクチンと共に投与するのに適したワクチンは、例えば、ネコ汎白血球減少症、カリシ（ｃａＨｃｉ）　、鼻気管炎およびクラミジアのワクチンまたは他の抗原に対して、接種された動物において防御が考えられる他の抗原を包含する。

本発明の他の態様および利点は、発明の詳細な説明を参考にすれば明らかとなろう。

図面の簡単な説明図１は、リカード（Ｒｉｃｋａｒｄ）　ＦｅＬＶＡ、　Ｂ　（±、対照群）で攻撃しただ後、１２週間にわたるウィルス血症に対するクローンＥ　ＦｅＬＶＡワクチン（Ｕ、ワクチングループ）の試験結果を示すグラフである。

図２は、０（Ｕ）および１２週（±）におけるクローンＥワクチン投与動物と対照動物に対するＦｅＬＶ感染率を示すグラフである。

発明の詳細な説明本発明によれば、選択した安定なネコＴ細胞リンパ腫細胞株を、慣用的方法により、少なくとも１種のＦｅＬＶ亜型で感染させる。下記に詳細に記載するように、本発明の具体例にて使用された細胞株はＴ細胞リンパ肉腫細胞株３２０１（８１回継代）であり、オハイオ州立大学のリチャード・オルセン（Ｒｉｃｈａｒｄｏｌｓｅｎ）博士から得た。

細胞株３２０１の性質（すなわち多くの回数の継代による安定な核型、および細胞膜上のＴ細胞ＣＤ４とＣＤ８抗原の保持、ならびにネコ・オンコーナウィルス細胞付随の膜抗原（ＦＯＣＭＡ）の欠損）を共有する他のネコＴ細胞リンパ腫細胞株を、同様の方法で感染させて本発明のワクチン組成物を製造してもよい。

他のネコＴ細胞株を、個人的にあるいは公の受託機関から得てもよい。それゆえ、本発明は、特に例示された細胞株の使用に限定されることはない。

本発明によれば、細胞株を、１種またはそれ以上のＦｅＬＶ亜型Ａ、ＢおよびＣで形質転換あるいは感染させてもよい。メリーランド州、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）のジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクンヨン（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　、アイオワ州、エイムス（＾ｍｅｓ）のザ・ナショナル・ベタリナリー・サービス・ラボラトリ−（ｔｈｅ　ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、ザ・ナンｇナル・インスティテユート・オン・ヘルス（ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）　、あるいは私的な研究機関から種々のＦｅＬＶ亜型を得ることができる。好ましくは、細胞株を、ＦｅＬＶ亜型Ａて感染させる。なぜならば、それがずべてのＦｅＬ〜７感染に関連しているからである。ついて、感染細胞株を無血清培地で培養する。細胞培養上清を集めてＦｅＬＶｇｐ７０エンベロープ抗原についてチェックし、細胞を集め、クローン化させる。ｐ２７　（ＦｅＬＶコア蛋白）ＥＬＩＳＡ（後記）において最適な細胞生存度および活性度を有するクローンを選択し、多（の回数継代する。

少なくとも１菌株のＦｅＬＶに対する免疫を生成する能力があり、また細胞膜上にＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞抗原を保持している、ＦｅＬＶ蛋白質またはポリペプチド抗原を産生ずることのできる安定な細胞株を選択できるように、細胞継代回数が当業者により選択されうる。しかしながら、本明細書記載の特定の細胞株に関しては、継代回数は１５ないし３５回である。他のネコ細胞株に関して同様の回数の継代を行ってもよい。

好ましくは、該細胞を培養し、無血清培地にて継代させる。その多くの方法は当該分野において利用可能である。感染細胞は完全なｇｐ７０ウィルスエンベロープ蛋白質を無血清培地中に分泌する。感染細胞を含血清培地にて培養すると、感染性完全ウィルス粒子が該培地中に分泌されるため、感染細胞を含血清培地にて培養することが望ましくない。

本発明の細胞株を用い、以下に示す、サブユニットワクチンまたは完全細胞ワクチンを調製してもよい。

サブユニットワクチンついて、選択された継代からの細胞培養を収穫し、懸濁させる。該培養を無血清培地にて約３〜１０日間貯蔵する。５０％の生存度が観察される時に、培養を収穫する。培養および抗原含有培養流体を、当業者が決定できる、適当な常套手段により清澄化させる。−例として、培養流体を濾過により清澄し、望ましくない細胞残骸または培地成分を除去してもよい。

残りの抗原物質、ウィルスＲＮＡおよび細胞ＤＮＡを包含する、清澄化した培養流体中の残りの核酸を常套手段により失活させる。例えば、濾過して単離した抗原をブロモエチレンイミン、ベータプロピオラクトンまたは他の数種の適当な不活性化剤で失活させてもよい。ついで、得られた不活性化抗原培養流体を任意の選択されたアジュバントと混合し、ワクチンとして用いるために処方してもよい。また、培養流体を、当該分野に知られた慣用的蛋白質精製手段により、さらなる精製に付し、抗原蛋白質を単離してもよい。

本発明の−の具体例として、Ｔ細胞リンパ腫細胞株３２０１クローンＥをＦｅＬＶ亜型八で感へさせて数回継代し、ＦｅＬＶＡによる高産生細胞を選択する。

細胞培養上清を収集し、ＦｅＬＶ抗原についてチェックし、細胞を収集してクローン化する。最適細胞生存度およびｐ２７ＥＬＩｓＡ活性を有するクローンを選択し、マスター・セル・ストック（ＭＣ３）を産生ずるために１５回、または（ＭＣ５＋２０）を産生ずるために３５回継代する。ついで、ＭＣＳまたはＭＣ３＋２０を収穫し、懸濁させ、無血清培地に３〜１０日間貯蔵する。

５０％の生存度が観察される時に、培養を収穫する。ＦｅＬＶ抗原を本発明のＦｃ１ＬＶ感染ネコＴ細胞により回りの無血清培地および培養流体中に分泌させ、濾過により清澄化させ、失活させる。培養流体中の得られた失活ＦｅＬＶｇｐ７０抗原蛋白質はＦｅＬＶ亜型Ａに対して特異的能動免疫を提供する能力を有する。

細胞株３２０１クローンＥは、発明者および譲受人であるスミスクライン・ビーチャム・ラボラトリ−・インコーホレイテッド（ペンシルベニア州、キング・オン・プルンア）　（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｉｎｃ、　）により維持されている。

ワクチン組成物の処方において、清澄化された失活抗原培養流体またはより精製された抗原蛋白質を感染していないネコ科動物に投与し、該動物をＦｅＬＶによる感染から保護する。本発明に係る、単離されるかまたは培養流体中に存在するかのいずれかである、培地中に分泌される抗原ウィルス蛋白質は、完全ウィルス蛋白質自身よりもむしろ、ＦｅＬＶウィルスエンベロープ蛋白質ｇｐ７０のエピトープまたはエピトープ部に結合する、循環抗体を接種動物にて生成する能力を有する。これらの抗体が、細胞株を感染させるのに用いた特定のＦｅＬＶのｇｐ７０のエピトープよりも池のエピトープに対して交差反応であることは示されていなかった。本発明の抗原蛋白質または培養流体に照射することにより得られる抗体はいずれもＦＯＣＭＡに結合しない。例えば、クローンＥにより産生される抗原は、抗体がＦｅＬＶＡのｇｐ７０エピトープまたはその一部を標的とするが、亜型Ｂおよび亜型Ｃｇｐ７０またはＦＯＣＭＡに結合しない、接種動物における抗体の形成を誘発する。感染したＴ細胞株により産生されるウィルス蛋白質は、完全な蛋白質の結合よりもむしろエビトビツクであるため、例えば、ＦｅＬＶＡに対する誘発抗体応答は、ＦｅＬＶＢまたはＦｅＬＶＣと交差反応的でない。

同様に、Ｔ細胞を感染させるのに用いる選択されたＦｅＬＶ亜型が亜型Ｂまたは亜型Ｃである場合、同様の交差反応性の欠如が証明されるであろうと考えられる。

本発明に係るクローンＥまたは他の感染Ｔ細胞により産生されるこれらの失活アジュバント抗原を用い、ＦｅＬＶＡまたは１種またはそれ以上の他のＦｅＬＶ亜型による持続感染から免疫処理動物を保護する能力を有するワクチンを生成することができる。有利には、これらの抗原は、前記のｇｐ７０エピトープよりも、他のＦｅＬＶ抗原に対する抗体の増加を生じさせない。

完全細胞ワクチン前記の別法において、本発明の感染細胞株をネコ科動物に投与してもよい。本来、十分に免疫原性であるならば、非感染物質をワクチンとして用いることが好ましい。完全細胞は、当該分野における種々の公知技法により失活させることができる。

本発明のワクチン処方はすべて、好ましくは、活性成分として適量の本発明の失活ウィルス抗原（または培養流体）または完全細胞を含有する、滅菌非経口用溶液または懸濁液、滅菌経口用溶液またはり濁液などの単位用量形にてネコ科動物に投与する。本明細書にて用いる場合、「単位用量形」なる語は、ネコに対する用量であって、アジュバント、必要ならば、所望により医薬上許容される希釈剤、担体またはビヒクルと組み合わせて、所望の治療効果を得るために要求される量（すなわち、有効量）の本発明のウィルス抗原または完全細胞を含有する各単位を言う。非経口投与の場合、流体単位用量形は、ビヒクルに懸濁させるがまたは溶解させた活性成分を用いて製造され、滅菌とすべきである。

本発明の各単位用量のワクチン組成物は、好ましくは、約１１０００ｎ／ｍＬ〜約１０．ＯＯＯｎｇ／ｍＬの全ウィルスｇｐ７０蛋白質を、さらに好ましくは約１５００ｎｇ／ｍＬ　〜約８．０００　ｎ　ｇ／ｍＬの完全ウィルス蛋白質を含有する。

かくして、本発明は、ネコ白血病の臨床的兆候を記載する。前に感染していないネコ科動物を前記の本発明のワクチンで予防接種する。個々の動物の予防接種に関して、投与量は、ウィルス感染の本体、動物の年齢、健康状態および体重、付随治療の種類、治療頻度および治療割合に依存する。例えば、本発明のＦｅＬ■ ワクチンを他のＦｅＬＶ抗原と組み合わせて投与した場合、ＦｅＬＶ病からの防御を得るのに要求される本発明に従って産生される失活ＦｅＬＶの量は、本発明の失活ＦｅＬＶ抗原を他の抗原の不存在下で投与した場合と同量であるかまたはより少量であると考えられる。

適当な医薬上許容されるビヒクルは当該分野における当業者に周知である。例えば、ビヒクルとしては、水、液体アルコール、液体グリコール、液体ポリアルキレングリコール、液体エステル、液体アミド、液体蛋白質加水分解物および液体ラノリンが挙げられる。

好ましくは、本発明のワクチンは、前記の抗原および１種またはそれ以上の慣用的アジュバントと一緒に処方される。好ましい処方において、タイル（Ｑｕｉｌ）Ａを１０および５０２ｇ／ｍＬの間、最も好ましくは約２５ａ＝ｇ／ｍＬの最終濃度にて最終生成物に加え、水酸化アルミニウムを約１〜約１０％容量の間、最も好ましくは約５％容量の最終濃度にて加える。

しかし、他の適当なアジュバントをキールＡまたは水酸化アルミニウムの代わりに用いてもよい。このような他の適当なアジュバントは、サポニン、油基剤アジュバント、ポリマー、リポソーム、細菌性抗原および他の細胞壁誘導体、コロイド、植物油、接合ミトゲン、植物抽出物およびトキソイド、炭化水素、コレステロールおよびその誘導体、ならびにプラスチックポリマーを包含する。

所望により、本発明のワクチン処方はまた、他の慣用的ワクチン組成成分を含有していてもよい。クエン酸、水酸化ナトリウムのような安定化化合物を適当な慣用的配合量にて用いてもよい。Ｈｅｐｅｓ緩衝剤のような、他の成分および緩衝剤を用いてｐＨを調整してもよい。ワクチン処方は局所麻酔剤を包含する。さらに、ワクチン処方は、メルチオレート、ゲンタミンンおよびパラベンのような保存剤を含有してもよい。好ましい処方においては、メルチオレートを約１：１０．０００〜１：５０．０００の間、最も好ましくは約１：２０．ＯＯＯにて希釈液に加える。加えて、界面活性剤または湿潤剤を組成物中に配合し、活性成分の均一な分配を容易にしてもよい。

本発明の他の具体例において、本発明の失活ウィルス抗原または完全細胞を他のネコ白血病ウィルス抗原と組み合わせて用い、種々のネコ白血病菌株による感染に対して防御能を有するワクチン組成物を生成できる。そのような他のウィルス抗原は、細胞株を他の望ましいＦｅＬＶ型または菌株、例えばＦｅＬ〜７ＢまたはＦｅＬＶＣで感染させることによって、本発明の抗原について記載されているのと同様の方法にて産生できる。また、本発明のワクチンにて用いるための他の抗原は、当該分野における当業者に知られた方法、例えば、出展明示により本明細書の一部とする、オルセン（Ｏｌｓｅｎ）の米国特許第４．３３２，７９３号に記載の方法により製造してもよい。また、所望の細胞株、例、クローンＥを付加ウィルスで共同感染させることが望ましい。−例として、クローンＥを別のＦｅＬＶ亜型、例えば、ＦｅＬＶＢおよび／′またはＦｅＬＶＣと共同感染させ、１種以上のＦｅＬＶ亜型のｇｐ７０ウィルス蛋白質を得てもよい。別例として、本発明のＦ　ｅ　Ｌ　Ｖ感染細胞株を、本明細書中に示されているような別のネコ・ウィルスと共同感染させてもよい。

本発明はまた、本発明のワクチンを選択された非ＦｅＬＶワクチンと同時または連続的に投与することにより、選択された非ＦｅＬＶネコ・ワクチンに対する免疫応答を強化する方法を提供する。このような状況において、適当量にて、すなわち、単位用量形にて投与した場合、本発明のＦｅＬＶワクチンはＦｅＬＶによる感染が原因である疾患に対して保護を与えるように作用するだけでなく、選択された非ＦｅＬＶワクチンに対する動物免疫応答の強化能を有する一般的免疫刺激剤としても作用する。例えば、細胞膜由来の抗原、すなわち、ＣＤ４＋およびＣＤＳ＋抗原を本発明のワクチン処方中に配合してもよい。

本発明のＦｅＬＶワクチンと共に、共同投与（同時または連続的）する場合の適当なワクチンは、他のネコ病原菌、例えば、ネコ汎白血球減少症、カリチ、鼻気管炎、狂犬病、ネコ免疫不全のウィルス、およびクラミジアのワクチンまたは他の抗原に対して予防接種された動物において防御が要求されている他の抗原に対するワクチンを包含する。これらの病原菌に対する既知の慣用ワクチンは当該分野の当業者に利用可能である。

また、本発明のＦｅＬＶワクチンは、選択された非ＦｅＬＶワクチン用の希釈剤として用いてもよい。このような場合、ＦｅＬＶワクチンは、ＦｅＬＶにより引き起こされる疾患に対して保護を与えるための適当な量にて、すなわち、単位用量の形態にて投与されない。どちらかと言えば、希釈剤として用いる場合、本発明のＦｅＬＶワクチンは、単に、選択された非ＦｅＬＶワクチンに対する予防接種された動物の免疫応答についての刺激剤として作用するであろう。

これらの実施例は、本発明のウィルス流体およびワクチン処方の好ましい製法を説明する。これらの実施例は単なる例示であって、本発明の範囲を制限するものではない。

実施例１−クローンＥ細胞株の調製継代８１のＴ細胞リンパ肉腫細胞株（３２０１）［ドクター・リチャード・オルセン（Ｄｒ、　Ｒｉｃｈａｒｄ　０１ｓｅｎ）、オハイオ・ステイト・ユニバーシティ（ＯｈＪＯ３ｔａｔｅ　ｔＪｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）］を、５℃で１０分間、１０００　Ｘ　９で遠心する。上澄み液を廃棄した後、該細胞を、ウソ胎児血 ′／ｆ４１５％、Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）２％、ピルビン酸ナトリウム（１００ｉＭ）１％、ペニシリン／ストレプトマイシン１％からなり、残部が５０％ＲＰＭＴ　１６４０１５０％リーボウィッツ（Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ）−１５である増殖培地に再懸濁させる。トランスファー比は、細胞１部、増殖培地８部であり、トランスファーは、４〜５日ごとに生じる。次いて、８個の７５ｃｍフラスコの各々の中に細胞懸濁液４０１１をアリコント化する。

次いで、培養フラスコにゆるく蓋をし、３７℃のＣｏｔインキュベーター中に置く。

前記のように増殖させた１〜２日齢の３２０１細胞を含有するフラスコの内容物を１５００ｒｐｍで１０分間遠心した。上澄み液を廃棄し、細胞を３２０１−ＤＥＡＥ培地５　ｍｌ／フラスコで再懸濁した。この培地は、前記増殖培地５０ｍ／および蒸留水１ｍｌ当たり１０真９と混合したジエチルアミノエチルデキストラン０．１５ｍ１から調製され、滅菌化のためにオートクレーブに付される。次いで、再懸濁した細胞ペレットを、３７φＣで、５％ＣＯ２中で３０分間インキュベートした。

インキュベーション後、細胞を再度遠心しく１５００ｒｐｍ、１０分）、次いで、３２０１−ＤＥＡＥ培地を吸い出した。次いで、細胞ベレットを、必要な量（約４胃ｌ）の３２０１増殖培地に再懸濁させて、３×１０６細胞／ｗｓｌを得た。次いで、感染させる準備ができるまで、これらの細胞を、５％ＣＯｍ中、３７ ℃でインキュベートした。

細胞株を継代１２３に増殖させる間に、ＥＬＩ　ＳＡによって、ＦｅＬＶ　ｐ２７（該グループ特異的抗原またはＦｅＬＶの核蛋白質）およびウィルス力価について細胞を慣用的に検査した。ｐ２７の検出は、ＦｅＬＶ感染の主な診断指標である。

ＣＬ８１細胞［ＡＴＣＣ］におけるウィルス単離は、ピー・フィッンンジャ−（Ｐ　、　Ｆ　ｉｓｈｉｎｇｅｒ）ら、ジャーナル・オン・バイｏｏノー（Ｊ　、　Ｖｉｒｏｌ、　）、１４（１）・１７７−１７９　（１９７４）に開示されているとおりに行った。細胞は、不変的にＦｅＬＶ陰性であった。次いで、公知の方法に従って、細胞をＭｎ２＋およびＭｇ２十−逆転写酵素（ＲＴ）活性について試験し、ＦｅＬＶ　（Ｍｎ２十−依存性）およびネコ免疫不全ウィルス（Ｍｇ２＋−依存性）検出について試験した。

細胞は、ケイ・バッファ　（Ｋ、　Ｈａｆｆｅｒ）、バクンーン（Ｖａｃｃｉｎｅ）、５　：　１３３−１３５　（１９８７）に開示されている方法による間接蛍光性抗体法によって測定されるように、Ｍｎ２＋およびＭｇ２＋−ＲＴ活性ならびにＦＯＣＭＡの両方に対して陰性であった。Ｔ細胞マーカー分析によって、細胞がＣＤ４およびＣＤ８陽性であることが判明した。

継代１２３で、遠心しｆ＝　（１００Ｘ　９で１０分間）ＣＴ６００細胞［ドクター・ニールズ・ベダーソン（Ｄｒ、　Ｎ１ｅｌｓ　Ｐｅｄｅｒｓｏｎ）、ユニバーシティ・オン・カリフォルニア・アラ・ディヴイス（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　ａｔ　Ｄａｖｉｓ）］から得た０、　４５ａ！冨濾過上澄み液２４麿ｌ（ポリブレン２田ｑ／ｍｌ）に３２０１細胞を再懸濁させることによって、該３２０１細胞をＦｅＬＶサブタイプＡ　（ＦｅＬＶＡ）に感染させた。これらのＣＴ６００細胞は、培養上澄み液中にＦｅＬＶＡを分泌した。ＦｅＬＶ感染３２０１細胞の５継代後、上澄み液１ｗＩ当たり３×１０４ＦＦＵ（フォーカス形成単位（Ｆｏｃｕｓ　Ｆｏｒｍｉｎｇ　Ｕｎｉｔｓ））のｐ２７ＥＬＩＳＡ活性およびウィルス力価が得られた。さらに２継代後、ＲＰＭＩ　１６４０＋１０％ウソ血清での限界希釈によって、９６ウエルプレート中で細胞をクローン化させた。

最適細胞生育能および最大ｐ２７　ＥＬＩＳＡ活性を有するクローン（クローンＥ）を選択し、１５回継代して基本細胞原液（Ｍａｓｔｅｒ　Ｃｅ１ｌ　５ｔａｃｋ　（ＭＣ３））を製造した。継代１５を収穫し、血清捕捉培地に懸濁させ、無血清環境中に置いた。適切な血清捕捉培地は、例えば、ＲＰＭｌ　１６４０．１０％ウシ成体血清（ＡＢＳ）および１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。培地中のＭＣ８の濃度は、約ｌＸ１０８細胞／ｍｌ〜約５Ｘ１０８細胞／ｗｓｌであるべきである。

細胞株の安定性を測定するために、クローンＥ細胞株の染色体分析は、ＭＣ８およびＭＣ３＋２０被検物（基本細胞原液＋２０継代、継代３５）に対して行った。各々についてのモダール（ｍｏｄａｌ）数は、３８てあり、飼いネコの二倍体数（２ｎ＝３８）と同じである。各被検物は、雄性核型を産生した。高継代被検物（ＭＣ３＋２０）の２．３個の分裂中期においてマーカー染色体が見られたが、破損または損傷染色体は見られなかった。分布分析によって、細胞株の形質転換も有意な分解も示唆されなかった。

実施例２−クローンＥ細胞株の染色体分析ＭＣ５（継代１５）の培養艷濁液、および、さらに２０継代後のＭＣ３＋２０（すなわち、継代３５）をコルセミド（Ｃｏｌｃｅｍｉｄ）で処理し、ＫＣＩ低張溶液に曝露させ、メタノール酢酸混合物（３・１）中で固定化させ、顕微鏡スライドガラス上で風乾させた。該スライドガラスをライト染色法で染色して、Ｇバンド化調製物を得た。

Ａ、基本細胞原液調製物飼いネコ（フエリス・カドウス（ｆｅｌｉｓ　ｃａｔｕｓ））の二倍体およびモダール染色体数は、３８である。全部で“７５個のＭＣ３調製物の分裂中期を分析した。３８個の分裂中期（５０６％）は、２ｎ＝３８のモダール染色体数を有した。１１個の分裂中期（１４，６％）は、３７の染色体数を有し、８個の分裂中期（１０゜６％）は、３６染色体を有した。細胞の２２％は、１８〜３５の範囲の数を有した。１個のハイパーモダール分裂中期が観察された。マーカー染色体は、検出されなかった。

Ｂ　基本細胞原液＋２０調製物全部で７５個のＭ　ＣＳ　＋２０の分裂中期を分析した。２６個の分裂中期（３４゜６％）は、正常な核型（２ｎ＝３８）を有し：４０個の分裂中期（１８６％）は、３７の染色体数を有し、１０この分裂中期（１３，３％）は、３にの染色体を有した。分析した分裂中期の２７％は、低二倍体であり、５個の分裂中期（６６％）は、ハイバーモダールであった。マーカー染色体を有する４個の分裂中期が見られた。

ＣまとめＭＣ３およびＭＣ８＋２０の両方についてのモダール数は、３８てあり、飼いネコの二倍体数（２ｎ＝３８）と同じてあった。各被検物は、雄性核型を産生じた。高継代被検物（ＭＣ５＋２０）の２．３個の分裂中期においてマーカー染色体が見られたが、破損または損傷した染色体は、見られなかった。分布分析によって、細胞株の形質転換も有意な分解も示唆されなかった。

実施例３−不活化クローンＥ抗原を含有するワクチンの調製物Ａ　インキュベーフヨシおよび収穫玲蔵庫からのクローンＥ細胞（実施例１において前記したとおり調製した、１× １０６細胞／ｗｌてのＭＣ３）を、回転ビン中でインキュベートし、５０／発酵槽にスケールアンプする。各細胞培養液収穫物を維持培地（ｐＨ６，９５−７，３）と−緒に遠心することによって洗浄して、細胞からつ／血清を除去する。細胞を維持培地中で約１〜５Ｘ１０６細胞７ｍｌの細胞密度に懸濁させる。細胞生育能が５０％未満に低下したと同時に、無血清維持液中で３６〜３７℃で１〜１２日インキュベーション後、培養液を収穫する。細胞溶解および分裂は、光学顕微鏡によって観察可能である。例えば、トリバンブルー除去試験は、細胞死滅を判断するのに有用な一技術である。

後日の浄化のために収穫した培養液を一４０℃以下で冷凍させるか、または、浄化させて、溶液フラクションから残存する無傷の細胞を分離する。収穫物質の最低許容収量は、ｇｐ７ｏ抗原１４１当たり１１００ｎである。この必要な最低収量よりも少ない収穫した物質は、以下の方法によって濃縮されて最小収量を達成するか、または、プールが最小収量を満たすように他の収穫した物質と一緒にプールする。

Ｂ、不活化クローンＥ流体は、以下のとおり失活させる。クローンＥ細胞からの培養流体の体積を測定した後、３５″＋２℃で、培！ｌａ液に不活化剤である二元エチルイミン（ｂｉｎａｒｙ　ｅｔｈｙｌｉｍｉｎｅ）　（Ｂ　Ｅ　Ｉ　）を最終ＢＥ　Ｉａ度１ｍＭ（１，０％）にまで添加する。ＢＥＩ溶液は、蒸留水中２００１Ｍ２−ブロモエチルアミンおよび蒸留水中０．４ＭＮａＯＨの無菌溶液から調製される。各々同体積を混合し、３７℃の水浴中で１時間インキュベートする。４℃ で貯蔵する場合、最終溶液は、調製の２時間以内に使用する。培養濾液を、少な（とも２日間、失活させる間じゆう一定に撹拌しつつ、約３７℃で維持する。

不活化後、プールから代表的な試料を採取し、９　ＣＦＲ１１３，１２０（ａ）に従って、不活化の完了について試験する。初生ＮＬ−ＦＫ−１（ネコの腎臓）細胞［スミスクライン・ビーチャム・アニマル・ヘルス（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ、Ａｎｉｍａｌ　ｈｅａｌｔｈ）］の７５ＣＩ２培養物をＤＥＡＥ−デキストランで処理し、不活化ウィルス流体のロット当たり１．Ｑｍｆを接種し、次いで、少なくとも５つの継代培養を含み、３６℃＋１℃で２１日間、維持する。別法としては、ＮＬ−ＦＫ−１細胞の代わりに、クランデル（Ｃｒａｎｄｅｌ）・ネコ腎臓細胞［アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクンＨン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）］を使用してもよい。

維持期間後、ＦｅＬＶｐ２７抗原の存在について細胞単層を試験する。これは、フルオレセインイソチオンアネート（Ｆ　Ｉ　ＴＣ）フンシュゲート免疫グロブリンまたは市販のモノクローナルをベースとした認可された診断試験キット［例えば、ケンブリッジ・バイオ・サイエンス・カンパニー（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｂｉｏ　５ｃｉｅｎｃｅＣｏ、）］を使用して行うことができる。検出可能なｐ２７抗原の不在は、充分な不活化試験を構成する。

最Ｐａ度約０．２５％（Ｗ／Ｖ）に添加した蒸留水中１Ｍ無菌チオ硫酸ナトリウム溶液でＢＥＩ−不活化流体を中和する。不活化培養流体を限外濾過装置によって濃縮してもよい。これは、高い抗原収量が得られる場合、または、スペースが珍重される組合せ生成物中で不活化培養流体を使用すべきである場合に望ましい。

濃縮する場合、流体は、初期不活化培ｉＩ濾液体積の少なくとも５倍の濃度を有すべきである。不活化流体は、濃縮されていてもいなくても、アジュバントされるまで、約４℃で貯蔵する。

Ｃ抗原の１度の標準化所望により、補助剤の添加前に、希釈剤を添加して、より高い力価の流体を標準化してもよい。最終温度約２５　ａ＝ｇ／ｘｉで該生成物に補助剤としてタイル（Ｑｕｉｌ）　Ａ　［スーパーホス（Ｓ　ｕｐｅｒｆｏｓ）、スウェーデンコを添加する。最終濃度５容量％で生成物に補助剤として水酸化アルミニウムゲル（アルヒドロゲル（Ａ　ｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）、２％Ａ　１２０　ｓ　）を添加する。保存剤として供するために、メルチオレート（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）を最終濃度１：１０，０００までに添加する。

前記成分の添加後、モノクローナル抗体カブチャー試験によって、ｇｐ７０抗原の濃度（＋１９／＋＋ｆｆ）を測定する。ｇｐ７０についてのモノクローナルカブチャーアッセイ（ＭＡｂ−ＥＬＩ　ＳＡ）は、モノクローナル抗体ＩＣ−２［スミスクライン・ビーチャム（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｅ）コの１６．０００希釈（１０ａ＝ｌ）で被覆した９６−ウェルボトムプレート（イムノロン（Ｉ　ｎ＋＋ａｕｎｏｌｏｎ）　２　）中で行われる。

ＩＣ−２を０．０１Ｍホウ酸塩バッファー（ｐＨ９，０）中で希釈する。被覆プレートを４℃で一晩インキユベートする。インキュベーション後、コーティング溶液を廃棄し、プレートを、３７℃で３０分間、ホウ酸塩バッファー中２％Ｂ５Ａ１００　ｐｅＩ／ウェルで後被覆する。該プレートをＰＢＳ−トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄する。ｇｐ７ｏ標準を、ＰＢＳ−０，２５％ＢＳＡ−０，２５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　１００　［シグマ（Ｓ　ｉｇｍａ）］中で約１６４０ｎｇ／ａＩに希釈する。

次いで、同一希釈剤中で４つの該標準の連続２倍希釈を調製する（８２−１０３ｎｇ／ｙｓｌ）。試料を、直接、ＰＢＳ−０，２８６％ＢＳＡ−０．２８６％トリトン中、１：８または必要な別の割合に希釈する。全て５つの標準および試料希釈物をウェル当たり１００ａ＝ｒで、トリブリケートで、洗浄したプレート上に付す。該プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ−）ウィーンで５回洗浄する。ＰＢＳ−トゥイーン中３％ＢＳＡ中で１　：３２００に希釈されたヤギ抗ｇｐ７０（吸収されたウシ血清）を各ウェルに添加する（　１．　ＯＯ；ｚ１７ウエル）。

プレートを再度３７℃で１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ−トウィーンで３回洗浄し、ＰＢＳ−トウイーン中０．５％ＢＳＡ中のウサギ抗ヤギＩｇＧ１００ａｅ／／ウェルを添加する。

使用したコンジュゲート希釈物は、約２０分以内で４０５ｎｉ／　４９０ｎｌｌｌで１゜０〜１．３の最低参照希釈反復試験区についての光学密度を提供する。

プレートを３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ−トウィーンで３回洗浄する。ＡＢＴＳ基質（クロマケン（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ））　１００　ａ＝１／ウェルを添加し、プレートを、室温で、第１標準（１６４０ｎ９／ｍＡ’）が４０５ｎ＋ｉ／　４９０ｎｅ参照でＯＤ値１．３に達するまで、インキュベートする。

プレートを測定した後、標準および試料に対するＯＤ値を、バックグラウンド吸光度について修正する。次いで、参照標準の対数１度から標準曲線を作成し、この曲線から各試験試料希釈物の値を決定する。各試験試料のｇｐ７０含量を、標準曲線の■界内になる試料の希釈物について得られた値の平均として計算する。

ｇｐ７０についてＭＡｂ−ＥＬＩＳＡによって試験された値は、前記方法を使用して、約２９５ｎｇ／ｍｌであった。

Ｄ　ワクチンの構築保存剤および補助剤の不活化クローンＥ流体への添加後、該製剤を４℃で少なくとも２時間混合し、１ＱＮＮａＯＨの添加によって、ｐＨを７．１＋０．１に調節する。このノリアルの試験後、他の構築された多量のノリアルと混合することによって成分を調節する。ワクチンの各投与量は、放出時に合計ｇｌ）７０１ｍｆ当たり少なくとも１７６８ｎｇを含有する。

実施例４一本発明のワクチン製剤による接種の臨床的効果抗原投与後１２週間を通じて、−４性および持続性ＦｅＬＶウィルス血症を予防する際のＦｅＬ〜′Ａワクチンの有効性を測定するために、以下の臨床研究を行った。

前記実施例３の記載に従って、ＦｅＬＶＡ不活化流体を調製した。この研究で使用されるサブユニットワクチンを調製するために、これらの流体０．４４５＊１を、ＡｒＯＨｏ、ｏ５１ｚおよびＲＰＭＩ　１６４０培地Ｑ、５＋＋ｒと混合した。

１０〜１４週齢のＦｅＬＶ−陰性、ＳＰＦ不：＋　［リバティ・ラブダ（Ｌ　１ｂｅｒｔｙＬａｂｓ）、ニューシャーシー州すハティ］を使用した。ネコ１０匹をワクチングループおよび対照グループに当てた。Ｏ日月および２１日間に皮下経路によってワクチン注射した。各ワクチン注射の−１，０および＋１日後に各ネコの体温を測定した。抗原投与（＆１２週間を通じて、０．２１．３５日目および２週間に１度、全血分析を行った。ｇｐ７０に対する抗体力価は、ＥＬＩ　ＳＡによって、ＦＯＣＭＡ力価は、ケイ＋バッファ　−（Ｋ、　Ｈａｆｆｅｒ）ら、バクシーン（Ｖ　ａｃｃｉｎｅ）、８：１２−１６　（１９９０）に開示されている間接ＥＬＩ　ＳＡによるＩＦＡおよび■Ｎ応答によって測定された（ワクチン注射後５週開目および抗原投与後１２週間目のみ）。

抗原投与の一１日月およびＯ日月に、全てのネコをメチルプレドニソロン（ｍｅｔｈｙｌ　ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）で免疫抑制した。連続２日間、ネコにＦｅＬＶ−リカード（Ｒｉｃｋａｒｄ）　Ａ、Ｂ　［ＵＳＤＡ、ナショナル・ベタリナリー・サービシズ・ラボラトリ−（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、アイオワ州アメス］６．６５Ｘ１０５　ＦＦＵ／ｉｌ／日を経鼻経路によって抗原投与した。抗原投与前、および抗原投与後１２週間を通じて２週間に１度、クローン８１細胞アツセイ［ピー・フィッシンンヤー（Ｐ　、　Ｆ　ｉｓｈｉｎｇｅｒ）ら、ジャーナル・オン・パイロロジー（Ｊ　、　Ｖｉｒｏｌ、　）、１４（１）＋１７７−１７９　（１９７４）］によってウィルス血症を測定した。

Ａ、血清学的分析ワクチングループのネコは、ｇｐ７０　ＥＬ　Ｉ　ＳＡ　（このアッセイについての抗原は、生として、ＦｅＬＶサブタイプＢおよびＣである）予備抗原投与において低い〜検出不可能な応答を有した。抗原投与後１２週間では、ワクチン注射は、ｇｐ７０およびＦＯＣＭＡ抗原に対する強い抗体応答を増大させた。抗原投与時および抗原投与の１２週間後のＶＮ力価は、白血球２ワクチン注射について通常観察される応答と同様であった。すなわち、ｇｐ’ｙｏに対する高いＥＬＩ　ＳＡ力価および適度のＦＯＣＭＡ力価が観察された。

Ｂ、ウィルス血症測定一過性ウィルス血症（累積感染発生率）は、対照における１００％と比較して、予防接種において有意に低下した（６０％）（ｐ＜０．０１、フイツシャーズ・イグザクト・テスト（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ　Ｅｘａｃｔ　Ｔｅ５ｔ）　）　［第１図を参照］。同様に、持続性ウィルス血症は、予防接種において３０％に有意に低下し、一方、対照の８０％は、持続性ウィルス血症であった（ｐ＜０．０１）［第２図を参照〕。

これは、不活化クローンＥ流体を含有するワクチンが、予防接種しない対照と比較して、初期および持続性感染の両方に対して予防接種に対する統計学的に有意な保護を提供することを示す。

本発明の種々の変形および変種は、前記定義の明細書中に含まれ、当業者に明白であると思われる。本発明の組成物および製造方法に対するかかる変形および別法は、添付の請求の範囲の範囲に包含されると思われる。

フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号（Ｃ１２Ｐ　２１１００Ｃ１２Ｒ１：９１）Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．少なくとも１種のＦｅＬＶ亜型で感染させた安定な細胞株であって、ネコ・オンコーナウイルス細胞付随の膜抗原のないことにより特徴付けられるネコＴ細胞リンパ腫細胞株。
２．さらに、細胞膜上にＴ細胞ＣＤ４およびＣＤ８抗原を保持することを特徴とする請求項１記載の細胞株。
３．ＦｅＬＶ亜型が、ＦｅＬＶ亜型Ａ、ＦｅＬＶ亜型ＢおよびＦｅＬＶ亜型Ｃからなる群より選択される請求項１記載の細胞株。
４．少なくとも１種のＦｅＬＶ亜型で感染させた安定なネコＴ細胞リンパ腫細胞株を適当な培養培地で培養し、蛋白質を細胞溶解物または該培養培地より単離することにより得られるＦｅＬＶ亜型蛋白質であって、その細胞株がネコ・オンコーナウイルス細胞付随の膜抗原のないことを特徴とするＦｅＬＶ亜型蛋白質。
５．さらに、細胞株が細胞膜上にＴ細胞ＣＤ４およびＣＤ８抗原を保持することを特徴とする請求項４記載の蛋白質。
６．医薬上許容される担体中、少なくとも１種のＦｅＬＶ亜型で感染させた安定なネコＴ細胞リンパ腫細胞株により産生される有効量のＦｅＬＶ抗原蛋白質からなり、該細胞がネコ・オンコーナウイルス細胞付随の膜抗原のないことを特徴とする、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）の１種以上の菌株により引き起こされる疾患を防御するためのワクチン。
７．さらに、細胞株が細胞膜上にＴ細胞ＣＤ４およびＣＤ８抗原を保持することを特徴とする請求項６記載のワクチン。
８．ＦｅＬＶ亜型が、ＦｅＬＶ亜型Ａ、ＦｅＬＶ亜型ＢおよびＦｅＬＶ亜型Ｃからなる群より選択される請求項６記載のワクチン。
９．追加のネコ白血病ウイルス抗原蛋白質からなり、ネコ白血病ウイルスの異なる菌株による感染からの防御能を有する請求項６記載のワクチン。
１０．抗原蛋白質を細胞株の細胞膜から誘導する請求項６記載のワクチン。
１１．医薬上許容される担体中、少なくとも１種のＦｅＬＶ亜型で感染させた、有効量の失活させた安定なネコＴ細胞リンパ腫細胞からなり、該細胞株がネコ・オンコーナウイルス細胞付随の膜抗原のないことを特徴とする、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）の１種以上の菌株により引き起こされる疾患を防御するためのワクチン。
１２．さらに、細胞株が細胞膜上にＴ細胞ＣＤ４およびＣＤ８抗原を保持することを特徴とする請求項１１記載のワクチン。
１３．ＦｅＬＶ亜型が、ＦｅＬＶ亜型Ａ、ＦｅＬＶ亜型ＢおよびＦｅＬＶ亜型Ｃからなる群より選択される請求項１１記載のワクチン。
１４．追加のネコ白血病ウイルス抗原蛋白質からなり、ネコ白血病ウイルスの異なる菌株による感染からの防御能を有する請求項１１記載のワクチン。
１５．有効量の請求項６または請求項１１に記載のワクチンを感染していないネコ科動物に投与することを特徴とするネコ白血病の臨床的徴候の予防方法。
１６．有効量の請求項６または請求項１１に記載のワクチンをネコ科動物に同時または連続的に投与することにより、選択された非ＦｅＬＶネコ・ワクチンに対する免疫応答を高める方法。