FI117513B - Menetelmä PRRS-viruksen viljelemiseksi ja sen käyttö rokotteissa - Google Patents

Description

117513

Menetelmä PRRS-viruksen viljelemiseksi ja sen käyttö rokotteissa

Keksinnön tausta 5 Keksinnön ala Tämä keksintö koskee menetelmää kasvattaa "porcine reproductive and respiratory syndrome virus" (PRRSV) -iso-laattia, menetelmää valmistaa rokote sikojen "porcine reproductive and respiratory disease" -taudille, ja PRRSV-10 isolaattia sisöltävää kudosviljelmää.

Tekniikan tason lyhyt kuvaus "Porcine reproductive and respiratory syndrome" on tullut nopeasti esiin taloudellisesti tuhoisana tautiongelmana USA:n ja Euroopan sikatuottajilla. Syndrooma kuvattiin 15 ensiksi USA-.ssa 1987 ja samanlaisia kuvauksia ilmaantui Euroopassa ja Kanadassa 2-3 vuotta myöhemmin. Tautisyn-droomaa on kuvattu monilla eri nimillä, mukaan lukien "mystery swine disease", "abortus blau", "blue eared pig disease", "porcine epidemic abortion and respiratory syndrome" 20 (PEARS), "swine infertility and respiratory syndrome" (SIRS). Tästedes käytetään nimeä "porcine reproductive and *···· respiratory syndrome" (PRRS).

*· · : .· Tautisyndrooman aikaansaamiseen kykenevä etiologi- • · • *·· nen agenssi on tunnistettu pieneksi vaipalliseksi pyöreäksi • · * • 25 RNA-virukseksi, jolla virionin keskimääräinen halkaisija on : 62 nm ja 25 - 30 nm:n ydin on vaipan ympäröimä. Tämä virus Φ · · * ·*·*: on ryhmitetty alustavasti Togaviridae-heimon Arterivirus- sukuun. Tässä kuvattu PRRSV-isolaatti sopii tähän alusta- . .·. vaan luokitteluun ja sen on osoitettu saavan aikaan tau- * * * s”' 30 tisyndrooman.

• · *Γ PRRSV:hen liittyvälle tautisyndroomalle on luon- ·.·,· teenomaista akuutti ja krooninen lisääntymishäiriö aikui- • · * sissa naaraspuolisissa sioissa ja vakavasta lievään vaihte- :·. leva hengityselinsairaus nuorissa sioissa. Lisääntymishäi- • · · 35 riölle on luonteenomaista myöhäiset keskenmenot, jotka joh- • · tavat siihen että muumioituneita, kuolleena syntyneitä ja 2 117513 heikkona syntyneitä porsaita, joiden hengissäsäilymismah-dollisuudet ovat merkittävästi alentuneet, ilmenee enemmän kuin yleensä. Infektoituneissa emakoissa on myös kuvattu kroonisia ongelmia, jotka liittyvät viivästyneeseen paluu-5 seen kiimaan. Hengitystiesairauden jälkitilat vaihtelevat selvästä kuumeesta ja interstitiaalisesta pneumoniasta lieviin ylempien hengitysteiden oireisiin (se on: aivastelu, yskiminen ja nenän tai silmän erite) nuorissa sioissa. Hil-jattaiset (1990) serologiset tutkimukset ja sikayksiköiden 10 historiaa koskevat tutkimukset viittaavat siihen että ainakin 50 % USA:n sikayksiköistä on altistunut PRRSV:lle tai niillä on osoittautunut olevan lisääntymishäiriöitä ja hengitystiesairauksia, jotka viittaavat PRRSV-infektioon.

Tämän tautisyndrooman äskettäisen ilmaantumisen 15 vuoksi taudin patogeneesiä, epidemiologiaa ja ehkäisyä on tutkittu niukasti. On ymmärrettävää, että PRRSV:n sisältävien antigeenien tehokas kasvattaminen ja käsittely edistää PRRSV-rokotteen kehittämistä apuna PRRS:n ehkäisyssä ja torjunnassa.

20 Keksinnön yhteenveto

Edellä esitetyn mukaisesti tämä keksintö koskee me- .¾ netelmää kasvattaa virusisolaattia, jolle on annettu nimek- *· · : .* si ISU-P, joka on edullinen kun halutaan valmistaa anti- • · • *·* geenejä PRRS:n diagnostiikkaa varten ja indusoida suojaava • 25 immuunivaste PRRSV:tä vastaan. Keksintö käsittää myös mene- : :*: telmiä, joilla voidaan tehdä ja käyttää antigeenejä.

• · · · ·* ;*·*; Tässä keksinnön suoritusmuodossa PRRSV-isolaatti ; voidaan hankkia menetelmällä, joka käsittää PRRSV:n eristä- . .·. misen niin, että virusinfektoituneista sioista peräisin • · · 30 olevia 10-prosenttisia (w/v) keuhkohomogenaatteja viljel- • m *Γ lään yhdessä sian primääristen alveolaaristen makrofaagi- • · viljelmien tai jatkuvien solulinjaviljelmien kanssa 35 °C:n lämpötilassa.

;·] Tämä keksintö käsittää lisäksi sen, että virustiit- * . 35 teri kasvatetaan korkeaksi tietyissä solulinjoissa, kuten • · vihermarakatin (African Green Monkey) jatkuvassa munuaisso- 3 117513 lulinjassa (MA 104) ja tämän ainutlaatuisessa kloonatussa johdannaisessa (9009B).

Keksintöön kuuluvat myös menetelmät, joilla voidaan valmistaa elävää virusta tai tapetusta viruksesta peräisin 5 olevia antigeenejä (tavanomaisia tai rekombinanttisia) sisältäviä rokotteita, siten että yhdistetään immunologisesti tehokas annos virusta laimennusaineen ja/tai vastaavasti adjuvantin kanssa.

On havaittu, että emakoiden suora kokeellinen im-10 munisointi elävällä viruksella, tai kontakti elävällä viruksella immunisoitujen emakoiden kanssa esti lisääntymishäiriöt, jotka johtuivat nenänsisäisestä altistuksesta vi-rulentilla PRRSV:llä.

On myös havaittu, että inaktivoidut, adjuvantoidut 15 PRRSV-rokotteet suojasivat sikoja PRRS-infektiolta altis tuksen jälkeen, mikä mitattiin sillä, että viruksen repli-kaatio puuttui rokotetuilta verrattuna rokottamattomiin kontrollisikoihin.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 20 Kuten edellä on esitetty, tämä keksintö koskee PRRSV-isolaatin ISU-P kasvattamista, tarkoituksena hankkia * * virusantigeeneja rokotteissa ja diagnostisissa määrityksis- ·· · : *.· sä käytettäväksi. ISU-P-isolaatti hankittiin heikkona syn- • · • *·· tyneen porsaan keuhkokudoksesta. 10-prosenttinen (w/v) ku- : **: 25 doshomogenaatti keuhkosta, pernasta ja imusolmukkeesta vai- ^ • ;*: niistettiin esimerkinomaisesti MEM:iin, johon oli lisätty ··· · .*j*. antibiootteja (MEM + A) kontaminaation mahdollisuuden mini- moimiseksi. Epäpuhdas homogenaatti kirkastettiin sentrifu- . goimalla 4 C:n lämpötilassa 15 minuuttia 1 500 g:n kiihty- • » · 30 vyydellä. Kirkastettu supernatantti laimennettiin 1:5 MEM + • * • · “* A:lla ja 1,0 ml adsorboitiin 48 tuntia vanhaan konfluent- • · tiin MA 104-solujen yksikerroksiseen solumattoon tai pri- määrisiin alveolaarisiin makrofaageihin 25 cm2 pulloissa. 2 ;·] tunnin adsorptioajan jälkeen 35 °C:n lämpötilassa yksiker- * · · ' 35 roksiset solumatot pestiin kahdesti MEM + Ailia ja lisät- * · tiin 5,0 ml MEM + Aita johon oli lisätty 5,0 % gammasätei- 4 117513 lytettyä fetaalivasikan seerumia. Viruseristyspulloja inku-boitiin 35 °C:n lämpötilassa 5 % C02-ilmakehässä ja niitä tarkkailtiin päivittäin jotta saataisiin todisteita sympaattisesta vaikutuksesta (CPE). PRRSV ISU-P:n sytopaatti-5 nen vaikutus alkoi siten, että pienet, 5-10 solun muodostamat fokukset alkoivat pyöristyä, ja eteni siten, että mo- ^ nista soluista tuli pyknoottisia ja ne irtosivat alustasta 4-7 päivän kuluttua infektiosta.

ISU-P-isolaatti vahvistettiin PRRSV-isolaatiksi 10 fluoresoivalla vasta-ainevärjäyksellä PRRSV-ryhmäspesifi-sellä monoklonaalisella vasta-aineella, jolle on annettu julkisuudessa ("public domain") nimeksi SDOW17. Lisäksi negatiivi värjättyjä virusinfektoituja soluja tutkittiin transmissioelektronimikroskoopilla viruspartikkeleiden läs-15 näoloa silmälläpitäen. Havaitut viruspartikkelit olivat pyöreitä ja vaipallisia, ja virionin keskimääräinen halkaisija oli 65 nm ja ytimen halkaisija 27 nm. Tällä tavalla karakterisoitua kudosviljelmävirusta käytettiin saamaan aikaan kokeellisesti myöhäisen vaiheen keskenmeno ja lisään-20 tymishäiriö tiineissä emakoissa (taulukko 1) . Taulukko 1 osoittaa, että raskaana olevat nuoret emakot, jotka oli ai-*:**· tistettu joko iSU-P-infektoiduille keuhko-homogenaateille • *,ί (PRRS-hm) tai ISU-F:lle joka oli kasvatettu soluviljelmässä (PRRS-tc) , osoittavat tyypillisiä PRRS:n oireita. PRRS-hm- ·*·’: 25 ryhmissä ei porsittu normaaleja porsaita. PRRS-tc-ryhmissä • · | .*. vain 4 33 porsaasta porsittiin normaaleina. Vertailun vuok- * · · · '

si 29 30-.stä (96,7 %) ei-altistuneista porsaista oli nor- I

• « * maaleja porsituksessa. Se seikka että ISU-P, jopa kudosvil-. jelmässä puhdistuksen jälkeenkin, voi saada aikaan PRRS- i • · · .t 3 0 taudin, vahvistaa sen että tämä isolaatti luokitellaan oi- • · *·;·* kein Togaviridae-heimoon sisältyvän Arterivirus-suvun jäse- neksi. Tämän isolaatin on myös havaittu tuottavan lievän • · interstitiaalisen pneumonian kokeellisesti infektoituneissa * * * ..* sioissa.

• · * ·* * . 35 Keksinnön piirteenä on, että keksinnön mukaisesti PRRSV voidaan kasvattaa tietyissä kudosviljelmäsoluissa, 117513 : 5 -':Ί jotka replikoivat tehokkaasti virusta tasolle, joka on riittävä tarjotakseen tarvittavan antigeenisen massan sisällytettäväksi rokotteisiin, jotka voivat suojata porsaita ja/tai tiineitä nuoria emakoita tai emakoita PRRS-altis-5 tukselta. PRRSV:tä voidaan kasvattaa esimerkiksi kudosvil-jelysolussa, jolle Whittaker BioProducts on antanut nimeksi MA 104. Viruskasvatuskokeet, joissa käytettiin identtisiä viljelyolosuhteita MA 104 -soluilla, jotka hankittiin kolmesta eri lähteestä, viittaavat siihen että MA 104 -solujen 10 välillä esiintyy suurta vaihtelua mitä tulee kykyyn tukea PRRSV:n lisääntymistä korkeaan tiitteriin. Yksi MA 104 -soluviljelmä, jolle Miles Inc., Agriculture Division, Animal *

Health Products Group, on antanut nimeksi MA 104(M), ja joita käytettiin tässä kuvatuissa tutkimuksissa, tuki jat- 15 kuvasti PRRSV:n replikaatiota korkeatiitteriseksi. Lisäksi solulinjaklooni, jonka oli tuottanut Miles Inc., Agriculture Division, Animal Health Products Group, ja joka oli peräisin MA 104(M):stä, nimeltään 9009B, tukee PRRSV:n replikaatiota korkeammiksi tiittereiksi kuin lähtösolulinja.

20 Niinpä edullinen kudosviljelmäsolu ISU-P:n kasvattamiseksi on 9009B. Seuraava havainnollistaa täydellisemmin PRRSV

***** * * ISU-P:n kasvattamista soluviljelmässä.

• · · : *.· Kudosviljelysolut [MA 104 (m) ja 9009B] kasvatettiin • · • *·· ja pidettiin yllä Dulbeccon modifioidussa minimielatusai- : 25 neessa, vahva glukoosi (DMEM/HG), johon oli lisätty 5 % fe- : :*.· taalivasikan seerumia ja joka oli puskuroitu natriumbikar- ··* * ;*·*; bonaatilla (1,3 g/1) . Solupasaaseja tehtiin riittävillä so- * lumäärillä jotta 80 - 100-prosenttisen konfluentti yksiker- '

. ,·. roksinen solumatto saatiin aikaan 48 tunnissa. PRRSV ISU-P

• · · 30 -virusstokit laimennettiin DMEM/HG-elatusaineeseen, johon • · *Γ oli lisätty 5 % fetaalivasikan seerumia ja joka oli pusku- • * ·.·.· roitu pH-arvoon 6,8 PIPES:llä. Virus siirrostettiin soluma- ϊ.>#ϊ tolle alhaisella infektiokertoimella (MOI) ja inkuboitiin ;·. 36 °C:n lämpötilassa. Infektoituja viljelmiä tarkkailtiin • ·· ^ päivittäin CPE:tä silmälläpitäen 4-7 päivän ajan. Infektoidut viljelmät kerättiin kun 90 - 100 %:n CPE oli ilmei- 6 117513 nen. Yhden -70 °C:n pakastus/sulatus-syklin jälkeen saatiin maksimaalinen viruksen antigeeninen massa. MA 104 (M) -soluissa kasvattamalla saatiin keskimääräiset virustiitterit, jotka olivat välillä ΙΟ3,0 - 104'5 fluoresoivan vasta-aineen 5 infektiivinen annosso/ml (FAIDso/ml) . 9009B-solukloonissa kasvattamalla saadut virustiitterit ovat välillä 105'5 -106'5 FAlD50/ml. Tämän suuruusluokan tiitterit mahdollistavat sen, että riittävä antigeeninen massa voidaan sisällyttää kaupallisen mittakaavan PRRSV-rokoteformulaatioihin, 10 jotka ovat tilavuudeltaan yli 50 1.

On ammattimiesten ymmärrettävissä, että kun PRRSV voidaan kasvattaa korkeisiin antigeenisen massan tasoihin, tämän viruksen johdannaisia, mukaan lukien sen alayksiköt, jotka ovat tehokkaita keksinnön mukaisesti, voidaan hankkia 15 alalla tunnetuilla menetelmillä kuten viruksesta uuttamalla. Lisäksi suojaavia antigeenejä voidaan tunnistaa mole-kyylitasolla ja tuottaa jälleen ja ekspressoida rekombi-nanttiteknologialla.

Virusnesteitä rokoteformulaatiota varten inaktivoi- 20 tiin kahdella menetelmällä. Valitut inaktivoivat aineet olivat formaliini ja binäärinen etyleeni-imini (BEI). Inak- ***** tivaatio suoritettiin standardimenetelmin, jotka kuvataan • · · • *,* täydellisemmin tässä. Formaliini-inaktivaatio saatiin ai- kaan sekoittamalla virusnesteitä 37 % formaldehydikantaliu- ·*·*· 25 oksen kanssa, niin että formaliinin loppukonsentraatio oli • · • 0,05 %. Formaliini-virusseosta pidettiin huoneenlämpötilas- • · * * sa (noin 25 °C) jatkuvasti sekoittaen 24 tunnin ajan. Näyt- ' teitä otettiin 0, 8, 12 ja 24 tunnin kohdalla ja määritet-. tiin 9009B-soluissa elävää virusta silmälläpitäen. Syto- • · t # II; 30 paattinen vaikutus 3a fluoresenssivärjäys ryhmäspesifisellä • * *·;·* monoklonaalisella vasta-aineella osoitti elävää PRRSV: tä : :*: vain aikapisteessä 0 tuntia.

• · :***: Inaktivaatio BEIrllä saatiin aikaan yhdistämällä

./ 0,1 M BEi-kantaliuos (20,5 g/1 2-bromi-etyyliamiini-HBR

* · 9 * . 35 0,175 N NaOH:ssa) virusnesteiden kanssa, niin että BEI:n loppukonsentraatio oli 1,0 mM. Inaktivaatio suoritettiin 7 117513 pitämällä BEI-virusseosta huoneenlämmössä jatkuvasti se- : koittaen 48 tunnin ajan. Virusinaktivaatio pysäytettiin lisäämällä 1,0 M natriumtiosulfaattia, niin että loppukon-sentraatio oli 0,1 mM, 2 tunnin ajaksi. Näytteitä otettiin 5 aikapisteissä 0, 2, 4, 8, 12, 24 ja 48 tuntia ja määritettiin elävää virusta silmälläpitäen edellä kuvatulla tavalla. Elävä PRRSV havaittiin vain aikapisteissä 0, 2 ja 4 tuntia.

Keksinnön mukaisessa modifioidun elävän tai heiken-10 netyn rokotteen valmistuksessa PRRSVrtä muutetaan siten että se voi infektoida edelleen isännän rajoitetulla tavalla mutta ei voi saada aikaan taudin merkkejä isännässä. Normaalisti sellainen viruksen muuttaminen tapahtuu pasasoi-malla sitä ei-isäntäsolun, kuten vihermarakatin solujen, 15 kautta. Aluksi virus ei saata kasvaa hyvin tai edes ollenkaan. Jälkimmäisessä tapauksessa voi olla välttämätöntä pakottaa virus sopeutumaan soluviljelmässä kasvavaksi. Tämä voidaan tehdä lisäämällä virus soluviljelmään korkealla tai ! matalalla infektiokertoimella (MOI). Virus voidaan vaihto- 20 ehtoisesti pasasoida väkisin tai sokkona yhdessä solujen kanssa, kunnes havaitaan riittävästi sytopaattista vaiku-tusta, mikä viittaa täten siihen että virus adaptoituu.

• ♦ · j \l Adaptaation myötä virustiitteri nousee, mikä havaitaan sil- ·*·., loin kun PRRSV-isolaatti ISU-P pasasoidaan MA 104 (M) -solu- • 25 linjasta 9009B-solulinjaan. Taulukko 1 osoittaa, että ku- • · : ,·. dosviljelmässä pasasoitu PRRSV ISU-P (PRRS-tc) voi olla vä- • · * ··· · /·. hemmän virulentti kuin keuhkohomogenaateista eristetty: • · · tyypillinen adaptaation tulos. Taulukossa 2 esitetyt tulok- . set viittaavat siihen, että tämän keksinnön mukainen rokot- • · · lii 30 teiden valmistusmenetelmä on erityisen tehokas antamaan • · *·;·* suojaa PRRS:ää vastaan.

:Y: Inaktivoitu PRRSV ISU-P adjuvantoitiin seuraavasti.

• · :***: Inaktivoidut nesteet adjuvantoitiin adjuvantilla, joka oli • · · ..* joko Freundin täydellinen adjuvantti (FCA) , Freundin epä- # * * . 35 täydellinen adjuvantti (FIA), karbopolipohjäinen adjuvantti • · · · a ja Diamond Scientific Adjuvant B (Adj B) . Nämä adjuvantit 117513 i 8 edustavat rokotuotannossa käytettäviä päätyyppejä. Öljypohjaisia adjuvantteja edustavat FCA, fia ja ADJ B. Vesipohjaisia adjuvantteja edustaa karbopoli. Inaktivoitu PRRSV ISU-P voi mahdollisesti sisältää soveliaan säilöntäaineen.

5 Rokoteformulaatiot joissa oli FCA tai FIA valmis tettiin emulgoimalla inaktivoitu virus tyypillisesti käyttämällä yhtä suuria tilavuuksia inaktivoitua virusnestettä ja adjuvanttia ja 18 gaugen kaksois-"luer-lock"-laitetta ja kahta ruiskua. Nesteitä puristettiin toistuvasti ruiskujen 10 välisen laitteiston läpi kunnes muodostui paksu puolikiin-teä emulsio. Emulsiot ladattiin suoraan ruiskuihin antamista varten.

Adj B:n sisältävät rokoteformulaatiot valmistettiin sekoittamalla Adj B -kantaliuos yhtä suureen tilavuuteen 15 inaktivoitua PRRSV ISU-P -virusnestettä. Adjuvantti ja virus sekoitettiin sekoittamalla huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Adjuvantoitu rokote siirrettiin aseptisesti sterii-leihin moniannosampulleihin ja varastoitiin 4 °C:n lämpötilaan ennen antamista.

20 Karbopolipohjäiset rokoteformulaatiot valmistettiin > sekoittamalla karbopoliadjuvantin kantaliuos inaktivoitui- t j, hin virusnesteisiin, niin että adjuvantin loppukonsentraa- Γ*’: tio oli 10 % v/v. Adjuvantti ja virus sekoitettiin keske- * * nään sekoittamalla huoneenlämpötilassa 4 tunnin ajan. Adju- • '> 25 vantoitu rokote siirrettiin aseptisesti steriileihin mo- • φ • .*, niannosampulleihin ja varastoitiin 4 °C:n lämpötilaan ennen ··* · ..* antamista.

• · · • · ·

Kuvatuissa erilaisissa rokoteformulaatioissa käy- . tettiin PRRSV ISU-P -virusta niinkin matalassa esi-inakti- • * * *"·* 3 0 vaatiotiitterissä kuin 105'0 FAiDso/ml.

• · · • · *·..* Sen osoittamiseksi, että PRRSV-isolaatti ISU-P pys- v tyisi suojaamaan PRRS:ltä, suoritettiin kaksi rokote/altis- • · ·*". tus-tutkimusta. Ensimmäisessä tutkimuksessa 4 nuorta emak- • · * · · „* koa immunisoitiin elävällä PRRSV ISU-P:llä suun ja nenän • · • *] 35 kautta tapahtuvalla virusaltistuksella joko suoraa reittiä ’ * tai kontaktilla sairaiden sikojen kanssa. Kaksi samanikäis- '9 117513 tä nuorta emakkoa jätettiin immunisoimatta (altistamatta) ja ne sijoitettiin eri tilaan kontrolleiksi. Suoran altistuksen kohteeksi joutuvat rokotettavat (nro 57 ja 58) saivat 3,0 ml virusymppiä nenänsisäisesti. Ne serokonvertoi-5 tuivat 14 päivän kuluttua altistuksen jälkeen epäsuoran fluoresenssivasta-ainetestin perusteella. Kontaktilla altistetut nuoret emakot (nro 476 ja 480) immunisoitiin suun ja nenän kautta sen jälkeen kun ne olivat olleet läheisessä kontaktissa sairaiden sikojen kanssa. Nämä siat serokonver-10 toituivat 90 päivän kuluttua altistuksen jälkeen. Serokon-versiota osoittaa IFA-tiitteri joka on yli 1:20.

Sen jälkeen kun immunisoidut nuoret emakot serokon-vertoituivat, niiden kiima synkronoitiin ja ne hedelmöitettiin. Raskaus varmistettiin ultraäänellä. Kantamisen päivä-15 nä 90 rokotetut ja kontrollit raskaana olevat emakot saivat sieraimensisäisesti 3,0 ml PRRS-altistusvirusta, jonka tiitteri oli 1 x 104 FAID50. :

Kontrolliemakoissa 52 ja 477 näkyi taudin varhaisia merkkejä sikäli että niiden ruokahalu oli heikentynyt ja 20 ruumiinlämpö oli kohonnut (103 - 104 °F, 39,4 - 40 °C) , kaksi tai kolme päivää altistuksen jälkeen. iSU-P:lle ai- ? *ϊ"ϊ tistetuissa (rokotetuissa) nuorissa emakoissa ei näkynyt ;***: taudin kliinisiä merkkejä. Nämä tulokset osoittavat suojan • * •\# kliiniseltä hengityssairaussyndroomalta.

♦ 25 Kaikkia nuoria emakoita hoidettiin, kunnes porsaat • · • ,·. vieroitettiin (4 viikkoa porsimisen jälkeen) . Taulukko 2 i • · · [I*/ osoittaa porsimistulokset tästä kokeesta.

* 1 · * Porsimistuloksista merkittiin muistiin kantoaika (PRRS-infektio lyhentää normaalisti tiineysaikaa), kuollee- • · · '•h* 30 na syntyneet tai kuolleet sikiöt, heikot porsaat ja muumi- ♦ ·· ot. Nämä porsimisongelmat viittaavat kaikki PRRS-infektioon ·*.*· raskaina olevissa nuorissa emakoissa tai emakoissa. Lisäksi • · · • * .*·*. normaalien porsaiden lukumäärä merkittiin muistiin.

• · ##· Kumpikaan kontrolliemakoista ei porsinut normaaleja * ♦ • ** 35 porsaita (0 22 porsaasta oli normaaleja). Seitsemän (7) 22 ’***· porsaasta syntyi kuolleena ja 15 22:sta oli heikkona synty- 10 117513 neitä porsaita. Kontrolliemakoiden kantoaika lyheni 2,5 päivää, mikä on tyypillistä PRRS:lle raskaina olevissa sioissa. Immunisoidussa ryhmässä (n = 50) 40 porsasta tai 80 % syntyi normaalina. Porsituksessa kuusi (6) 50 porsaas-5 ta syntyi kuolleena ja 4 50 sikiöstä vaikutti muumioituneelta. Rokoteryhmässä ei ollut heikkoja porsaita. On selvää, että nuoret emakot, jotka on aikaisemmin altistettu elävälle PRRSV ISU-P:lle, jotka hedelmöitetään ja sitten altistetaan, ovat suojattuja altistukselta, minkä osoittaa 10 taudin suorien kliinisten merkkien puute nuorissa emakoissa ja niiden kantamien sikiöiden suoja.

On käsitettävissä, että IFA-testireagenssit, joita käytettiin määrittämään nuorien emakoiden serologinen tila tässä tutkimuksessa, olivat peräisin PRRSV ISU-P:stä ja 15 koska on olemassa suora korrelaatio nuorien emakoiden serologisen tilan ja PRRS-suojan kanssa, PRRSV ISU-P-isolaatti voi olla hyödyllinen diagnostisissa testeissä kuten epäsuorissa fluoresoivissa vasta-ainetesteissä kuten tässä osoitetaan, ELISA-määrityksissä, seerumineutralisaatiomäärityk-20 sissä, suorissa fluoresoivissa vasta-ainemäärityksissä ja muissa alalla tunnetuissa diagnostisissa määrityksissä.

«

Niinpä diagnostinen määritys, joka on peräisin antigeenis- • · t • V ta, joka on hankittu PRRSV ISU-P:stä, voidaan valmistaa ja sitä voidaan käyttää keksinnön mukaisesti.

:*·*: 25 Toisessa rokote/altistustutkimuksessa nuoret por- • * • ;*; saat (4-6 viikkoa vanhoja) rokotettiin useilla inakti- • at·; .*;·. voiduilla, adjuvantoiduilla PRRSV iSU-P-rokotteilla. Roko- • * ·

teantigeeniyhdistelmä valmistettiin inaktivoimalla PRRSV

, ISU-P BEI:llä aikaisemmin kuvatulla tavalla ja adjuvantoi- *" 30 tiin joko karbopolilla, FCA/FIA:lla tai Adj B:llä. Toinen < • * *·;** rokoteantigeeniyhdistelmä valmistettiin inaktivoimalla ΐ : : : PRRSV ISU-P formaliinilla aikaisemmin kuvatulla tavalla ia * * ^ :***; adjuvantoitiin samoilla kolmella adjuvantilla. Kolme kont- • · · rollirokotetta valmistettiin sen varmistamiseksi, etteivät • i ' • Φ · • . 35 adjuvantit ja solut pystyisi stimuloimaan väärää immunolo- • · · m « gista vastetta. Kontrollirokotteet valmistettiin adjuvan- : 11 117513 toimalla infektoimattomia kudosviljelmäsoluja. Kaksi porsasta rokotettiin kullakin rokotteella. Rokotteet annettiin ihonalaisesti päivinä 0, 21, 42 ja 64. Seitsemän päivää viimeisestä rokotuksesta porsaat altistettiin nenänsisäi-5 sesti 103'5 FAID5o:llä virulenttia elävää PRRSVitä. Kaikkia porsaita tarkkailtiin päivittäin altistuksen jälkeen taudin kliinisiä merkkejä silmälläpitäen. Lisäksi verinäytteitä otettiin ja ne käsiteltiin silmälläpitäen viruksen saamista talteen kudosviljelmässä. Verenkierrosta altistuksen jäl-10 keen löytyvä elävä virus on merkkinä siitä, että on tapahtunut viremia.

Seerumineutralisaatiotiitterit arvioitiin tutkimuk-< sen alussa altistuspäivänä ja 19. päivänä altistuksen jälkeen. Pitäisi panna merkille, että seerumineutralisaatio-15 testi on vähemmän herkkä kuin aikaisemmassa tutkimuksessa käytetty IFA-testi. Niinpä näitä tiitterituloksia ei voida verrata aikaisempiin tiitterituloksiin.

Taulukossa 3 on lueteltu altistuksen tulokset. Rokotetuissa tai kontrollisioissa ei havaittu taudin kliini-20 siä merkkejä. Lisäksi rokotusaikana seerumineutralisaatio-tiittereitä ei kehittynyt rokotetuissa tai kontrolleissa.

:*** Tämä viittaa siihen, että tänä aikana ei tapahtunut altis- • · * • V tumista elävälle virukselle (kontrollit pysyivät negatiivi- J sinä) ja viittaa myös siihen, että rokotteet eivät stimu- ·***: 25 loineet humoraalista vastetta, joka olisi ollut riittävän • · • korkea seerumineutralisaatiotestillä havaittavaksi. Se t · * * seikka, että seerumineutralisaatiotiitterivaste oli altis- • * · tuksen jälkeen merkittävä, viittaa siihen että kaikki por- . saat olivat altistuneet tehokkaasti elävälle PRRS-viruk- ’ • * « • · · 30 selle. Tämän altistuksen todistus on niiden kontrollisiko- • · jen prosenttiosuus, joissa osoittautui olevan viremia. Yhtä ί_ί#ϊ lukuun ottamatta kaikki kontrollisiat (87,5 %) infektoitui- vat. Immuunivaste rokotetuissa sioissa oli niin vahva, että • · · ./ ne pystyivät estämään viremian. Vain l:llä 12:sta rokote- « ·· ' . 35 tusta siasta (8,3 %) osoittautui olevan viremia. Niinpä ro kotteet suojasivat 91,7 % sioista.

12 117513

Vaikka emme sitoudu mihinkään keksinnön tiettyyn teoriaan, uskotaan että alkuperäisen PRRSV-isolaatin pasa-sointi väkisin MA104(M)-vihermarakattisolujen erityisadap-toituun klooniin (9009B) on mahdollisesti muuttanut onnis-5 tuneesti yhtä tai useampaa viruksen epitooppia, mikä johtaa tämän viruksen tehostuneeseen immunogeenisyyteen, joka on mahdollistanut rokotteen tuottamisen alalla, jolla muut tutkijat ovat epäonnistuneet.

• · · · · • 1 · • · · • « • · t • · • ♦ • ♦· ♦ ··· • · · • ♦ • · • · # · · ...

·♦·;·.· ··· · • · · • · · • · ♦ • · · ♦ · f ··♦ • · · • · * · 1 • · • ♦ · ♦ · · • · ··· • · • · * · · • · • · · * · · · · • 1 i 117513 : : 13

Taulukko 1

Myöhäisen vaiheen keskenmenon ja lisääntymishäiriön tuottaminen uudelleen emakoissa, jotka on altistettu PRRSV-isolaatille ISU-P, ei-altistettuihin kontrolliemak-5 koihin verrattuna - I. PRRSille altistettu ryhmä

Emakko Kantoaika Virusvalmiste Kuol- Heikko- Muu- Nor- nro leena ja miolta maa- synty- le ja neitä

S^^^^^SSSSSSS^^^S

57 112 päivää PRRS-hmb 6 8 0 0 10 54 108 päivää I PRRs-hm I 6 I 1 0 I 0 II ' | 649 112 päivää PRRS-hm 3 7 0 0 58 112 päivää PRRS-hm 4 4 3 0 166 112 päivää PRRS-tcc 0 2 6 1 164 113 päivää PRRS-tcd 2 2 5 1

15 SO I 110 päivää I PRRS-tce I 2 I 2 I 2 I 2 II

Kaikkiaan 23 26 16 4 a = normaali sian kantoaika on 114 . b = PRRSV-positiivisen gnotobioottisen sian keuhkohomoge- • · , 20 naattiymppi • · · c = kudosviljelmästä peräisin oleva PRRSV, 1030 fluoresoi- * 1 • 2 3 van vasta-aineen infektiivinen annos 50/ml (FAID 50/ml) • · · : ,1 d = kudosviljelmästä peräisin oleva PRRSV, 1040 FAID 50/ml • · ·,· 1 e = kudosviljelmästä peräisin oleva PRRSV, 105-0 FAID 50/ml • » · • · » * 1 · ·#· *·· ·· • · · * · · • · Φ 2 * 1 3 • · • 1 · * • · • · • . :·)ι • . < ··1· 1 14 117513 II. Ei-altistettu kontrolliryhmä

Emakko Kantoaika Virusvalmiste Kuol- Heikko- Muu- Nor- nro leena Ja miöitft maa- synty- leja neita 52 114 päivää ei 0 0 0 11 ^ 5 56 115 päivää ei 0 0 0 12 163 116 päivää ei 10 0 7

Kaikkiaan 1 Ö 0 30 * · ' Ί *· « * 1 · • 1 • 1 • · • · • · · * ·1· • · · • · • · • · • · · • · Φ ····.' Φ Φ Φ * « · ···,: ♦ • · *·· • · · **· • Φ * · f · · ' "i • 1 • · · ··· . · · ··· • · * · • · 1 • Φ • ·1 a * · 15 117513

Taulukko 2 ISU-P:llä immunisoitujen ja ei-immunisoitujen nuorien emakoiden porsimistuloksia

Nuori iFA-tiit- Kantoaika Kuolleena Heikkoja Muu- Normaa- 5 emakko teri syntyne!- porsaita mioita leja nro ta tai kuolleita 57v + 113 päivää 21 0 0 7 58V + 114 päivää 4 0 3 11 476V + 113 päivää 0 0 1 10

iO Il 480V I + I 114 päivää I 0 I 0 I 0 I 12 II

52 C - 111 päivää 5 7 0 0 477 - 112 päivää 2800

Kaikkiaan 6 roko- 0 roko- 4 roko- 40 rokotettua tettua tettua tettua 7 kont- 15 kont- 0 kont- 0 kontrollia rollia rollia rollia \ 15 + tarkoittaa IFA-tiitteriä >20 - tarkoittaa IFA-tiitteriä <20 V tarkoittaa rokotettuja * C tarkoittaa kontrolleja *· 1 * 1 1 * · • 1 aa • · • M Φ • · · ····.

• 1 • · • « · • · Φ • · · » ,· Ml Φ · • a φ « • • Φ Φ a · ·

Ml

III

• · φ Φ a · • a a at· * · • aa • · a • 4 a • a · a · «aa • ! m

Mill a a 16 117513

Taulukko 3

Inaktivoidun PRRSV:n sisältävän rokotteen kokeilun yhteenveto S Rokoteryhmä . SN:n keskiarvo SN:n keskiarvo Viruseristys

Kukin altistus Altistuksen jälkeen BEI, PRRS-Karbopoli n = 2 <1:2 1:82 neg/neg BEi, PRRS-FCA/FIA n = 2 <1:2 1:4 neg/neg BEI, PRRS- AdjB n = 2 <1:2 1:5 neg/neg

Formaliini, PRRS-Karbopoli n = 2 <1:2 1:23 neg/neg 10 Formaliini. PRRS-FCA/FIA n = 2 <1:2 12 neg/neg I ' '/

Formaliini. PRRS-AdjB n * 2 1:3 1:8 neg/neg

Valerokoteryhmä

Valeantigeeni - karbopoli n = 2 <1:2 <1:2 pos/pos ' Valeantigeeni - FCA/F1A n = 2 <1:2 <1:2 pos/pos

15 I Valeantigeeni - AdjB I n = 2 I <1:2 <1·2 I pos/pos H

a = SN-vaste päivänä 19 altistuksen jälkeen, kokeen lopetus .

M#t» b viruseristys plasmasta milloin tahansa altistuksen • · _ Ί „ . 20 jälkeisen testiäjänjakson 19 päivän aikana.

i · » |# ·* Viruseristys havaittiin CPE:llä 9009B-soluissa ja vahvis- • · : tettiin näiden FA-värjäyksellä PRRSV-ryhmäspesifisellä mo- ·· · : noklonaalisella vasta-aineella SD0W17.

* * : Vaikka keksintö on kuvattu yksityiskohtaisesti ha- " .¾ * * * '1 ϊ 25 vainnollistamistarkoituksissa, on ymmärrettävä että sel lainen yksityiskohtaisuus on pelkästään tätä tarkoitusta • ·*· varten ja että ammattimiehet voivat tehdä siihen muutoksia • * · .***. poikkeamatta keksinnön hengestä ja suojapiiristä, paitsi • · · .*. miten sitä mahdollisesti rajoittavat patenttivaatimukset.

• · • · · * · · · * * * * * · * ...

·* • · • ·· ··»·· • * 117513 WO 94/18311 PCT/US94/00951 -17-

INDICATIONS RELATING TO Λ DEPOSITED MICROORGANISM

(PCT Rule libis) ‘ Λ. The indications made below relate lo the microorganism referred to in Ihc description on page _ .line __ B. IDENTIFICATION OF DEPOSIT Further deposits are identified on an additional sheet [ [

Name of depositary institution

AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION

Address of depositary institution (includingpostal code and counity)

12301 Parklawn Drive Rockville, MD 20652 USA

Date of deposit Accession Number

March 16, 1993 ATCC VR 2402 and ATCC CRL 11302 C. ADDITIONAL INDICATIONS (ienueblank if net applicthk) This information is continued on an additional sheet j [

None ····* ___ . _ . _______________ _____ D. DESIGNATED STATES FOR WHICH INDICATIONS ARE MADE (if iheindieaiionsnre tw( for *11 designated Siam)

• I

• · - - .1 .

«* • · « ·· aii • # • · • · • · · 1 • · ·«· · • · * • · · ...

*·· • _ __ E. SEPARATE FURNISHING OF INDICATIONS (leave blank if not applicable) Φ | _ *(*a· The indications listed below will be submitted to the International Bureau Ixier (specify the gcrta*i nature of lito indications c.g., ’Accession ··· Alumber cf Deposit') • · **·

• · J

• · · : - ···.··.

* * * ♦ * • · · j ··· • · III --------— —— - ---- , , _ I ( • ** For receiving Office use only Γ· For Intcmilional Bureau use only

***'! |/^| This sheet was received with ibe international application □ This sheet was received by the International Bureau on: I

2U<~.J..±__________

Authorized office; Authorized officer

Form PCT/R0/134 (July 1992)

Claims (9)

1. Menetelmä PRRSV:n kasvattamiseksi infektiolle alttiissa kudosviljelmässä, jotta virusta saataisiin repli- 5 koitua riittävänä määränä eläinten suojaamiseksi PRRS:ltä tai käytettäväksi PRRS:n diagnoosissa tai PRRSV:n molekyy- . lirakenteen tunnistamiseksi rekombinanttituotteiden kehittämistä varten, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää talletusnumerolla ATCC VR 2404 talletetun PRRSV-isolaatin 10 ymppäämisen kudosviljelmään ja replikoituneen viruksen keräämisen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kudosviljelmä käsittää solulinjan.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tun-15 nettu siitä, että kudosviljelmä on vihermarakatin munu- aissolulinja.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vihermarakatin munuaissolulinja on tyyppiä jolle on annettu nimeksi MA 104(M).

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että solulinja on vihermarakatin solulinjan * * klooni, jolle kloonille on annettu nimeksi 9009B. • · · • V

6. Kudosviljelmä, tunnettu siitä, että se si- j *·· sältää talletusnumerolla ATCC VR 2404 talletettua PRRSV- ;***i 25 isolaattia.

• · • :*; 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen kudosviljelmä .*!*. kaupallisessa mittakaavassa > 25 1 tiitterinä FAIDso >105, °/ml.

, ,·. 8. Menetelmä, jolla voidaan valmistaa rokote, joka • * · !!! 30 suojaa tehokkaasti sikoja PRRS-.ää vastaan, tunnettu • · *.** siitä, että talletusnumerolla ATCC VR 2404 talletettu *,V PRRSV-isolaatti tarjotaan käyttöön, virus vapautetaan ku- dosviljelmän soluista ja antigeeninen massa säädetään lai- ··] mentamalla, konsentroimalla tai uuttamalla, jotta saadaan • ·· . 35 tuotettua immunologisesti tehokas määrä antigeenistä massaa » · 117513 modifioitua elävää (heikennettyä), inaktivoitua, alayksikkö- tai rekombinanttiformulaatiota varten.

9. Menetelmä PRRSV:n adaptoimiseksi modifioidun elävän tai heikennetyn rokotteen tuottamiseksi, tunnet -5 tu siitä, että talletusnumerolla ATCC VR 2404 talletettu PRRSV-isolaatti pasasoidaan väkisin ei-isäntäsolujen ja -solulinjojen kautta, kunnes virus ei enää aiheuta PRRS:n oireita. « ··1· • 1 ·· · • · · • 1 . . • · • # • 9 • »« ♦ ·♦····'' ? • · · • · • · • · • · · ·«· 1 ··· • · · . • · · • · · • · 1 • · · ··· • · • · • · • · ♦ · 1 • 1 • · ·1· • · • · • ·· ·♦··1 • · 117513