ES2300286T3

ES2300286T3 - Procedimiento de inactivacion de microorganismos.

Info

Publication number: ES2300286T3
Application number: ES00993526T
Authority: ES
Inventors: Simon Johannes Barteling
Original assignee: INST ANIMAL SCIENCE AND HEALTH; INSTITUTE FOR ANIMAL SCIENCE AND HEALTH RESEARCH; Agricultural Research Council
Current assignee: INST ANIMAL SCIENCE AND HEALTH; INSTITUTE FOR ANIMAL SCIENCE AND HEALTH RESEARCH; Agricultural Research Council
Priority date: 1999-12-20
Filing date: 2000-12-18
Publication date: 2008-06-16
Anticipated expiration: 2020-12-18
Also published as: JP2003517834A; AU782907B2; AU2979601A; ATE384786T1; CA2394946C; WO2001046390A2; EP1240310B1; CA2394946A1; DE60037907T2; TR200202104T2; US20030035811A1; US6673349B2; WO2001046390A3; DE60037907D1; BR0016563A; DK1240310T3; PT1240310E; CY1107420T1; EP1240310A2

Abstract

Un procedimiento para aumentar la inactivación de un microorganismo, en el que dicho procedimiento incluye la aplicación simultánea de un aldehído y un compuesto aziridina aparte al microorganismo, en el que dicha aplicación simultánea proporciona un efecto sinérgico que aumenta la inactivación del microorganismo.

Description

Procedimiento de inactivación de microorganismos.

Introducción y antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a procedimientos de inactivación de microorganismos y fabricación de vacunas, a vacunas fabricadas mediante dichos procedimientos y a kits que incorporan dichos microorganismos inactivados. Más especialmente, pero no exclusivamente, esta invención se refiere a procedimientos de inactivación de virus y fabricación de vacunas de virus y a las vacunas fabricadas a partir de dichos procedimientos.

La inactivación del virus y las pruebas de seguridad son las etapas más críticas de la fabricación de vacunas inactivadas. En el caso de vacunas para la enfermedad de la fiebre aftosa (FMD, por sus siglas en inglés) en especial, es esencial garantizar la seguridad porque cualquier aparición de la enfermedad causará un bloqueo de todo el mercado de exportación de animales y productos animales.

Un procedimiento clásico de inactivación del virus de la FMD y de preparación de una vacuna para la FMD es con formaldehído como se describe en Waldmann y col.: Waldmann O, Pyl G, Hobohm KO, Mohlmann H: "Die Entwicklung des Riemser Adsorbatimpfstoffes gegen Maul-und Klauenseuche und seine Herstellung". Zbl Bakt I Orig 148: 1, 1941.

En el pasado este procedimiento se utilizó para la preparación de vacunas para FDM y, por ejemplo, se aplicó a la preparación de vacunas basadas en cultivos de tipo Frenkel; Frenkel S: "Modifications de la méthode de culture du virus aphteuse selon Frenkel. Valeur des vaccins selon les données du laboratoire". Bull OIE 61: 985, 1964.

El formaldehído es conocido por su acción de entrecruzamiento (fijación) de proteínas, que probablemente causa la elevada estabilidad y el prolongado periodo de validez (de hasta 5 años o más) de las vacunas inactivadas con formaldehído (FA) (Frenkel).

Varios estudios han mostrado que a la concentración de FA prescrita por Waldmann, las gráficas de inactivación no eran lineales y a menudo mostraban una especie de "cola", que puede producir una inactivación incompleta. Esto se demostró en las siguientes publicaciones:

- Graves JH: "Formaldehyde inactivation of foot-and-mouth disease virus as applied to vaccine preparation", Am J Vet Res 24, 1131;

- Weslen, T. y Dinter, Z.: "The inactivation of foot-and-mouth disease virus by formalin". Arch. Ges. Virusforsch. 1957, 7, 394;

- Barteling SJ, Woortmeijer R, Visser N: "Innocuity testing of foot-and-mouth disease vaccines. I. Formaldehyde-inactivated alhydrogel vaccines", J Biol. Stand. 1983, 11, 297.

Las vacunas inactivadas con formaldehído inducían un buen grado de inmunidad y se demostró que en condiciones bien definidas pueden obtenerse gráficas de inactivación lineales con FA (Barteling SJ, Woortmeijer R: "Formaldehyde inactivation of foot-and-mouth disease virus. Conditions for the preparation of safe vaccine", Arch Virol. 1984, 80, 103). Sin embargo, la inactivación con FA seguía bajo sospecha y la inactivación con aziridinas (por ejemplo, acetiletilenimina, AFT), que produce una inactivación más rápida con gráficas de inactivación lineales, se convirtió en el procedimiento de elección.

La inactivación con AEI se describe en la siguiente publicación:

- Brown F, Hyslop NSG, Crick J, Morrow AW: "The use of acetyl-ethyleneimine in the production of inactivated foot-and-mouth disease vaccines", J Hyg (Camb) 1963b, 61: 337.

Un procedimiento ampliamente utilizado para la inactivación del virus de la FMD mediante aziridina se describe en H.G. Bahnemann: "Inactivation of viral antigens for vaccine preparation with particular reference to the application of binary ethylenmine". Vaccine, 1999, 8, 299.

Sin embargo, a diferencia del FA, las aziridinas no tienen reactividad de entrecruzamiento y las vacunas preparadas a partir de algunas cepas inestables de FMD (vacuna) mostraban periodos de validez cortos. Por tanto, algunas cepas de vacunas lábiles se fijan primero con FA antes de que la inactivación se complete con un compuesto aziridina como BEI. Este procedimiento se ha descrito en las siguientes 3 publicaciones:

- Rowlands y col. (1972) - Stabilizing the immunizing antigen of foot-and-mouth disease virus by fixation with formaldehyde. Arch. Ges. Virusforsch. 39, 274-283;

- Mowat y col. (1973) - Enhancement of immunizing potency of foot-and-mouth disease vaccine for cattle by treatment of the antigen with formaldehyde. Arch. Ges. Virusforsch. 41, 365-370; y

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- M M Rweyemamu y col. (1989) - Effect of formaldehyde (FA) and binary ethyleneimine (BEI) on the integrity of foot-and-mouth disease virus capsid. Rev. sci. tech. Off. Int. Epiz. 8, 747-767.

También se conoce la inactivación del virus primero con BEI y, a continuación, entrecruzar o fijar las partículas o antígenos del virus inactivado con FA, por ejemplo, el antígeno del virus de la FMD de la cepa SAT2 Zim 7/83.

Mowat y col., (1973) Arch. Gesamte Virusforsch. 41 (4), páginas 365-70, y N° de acceso a la base de datos STN 79:90381, describe la inmunización de ganado vacuno frente a la enfermedad de la fiebre aftosa utilizando un antígeno que ha sido tratado con formaldehído.

El documento US 5.242.686 describe la utilización de una combinación de agentes de inactivación para preparar una vacuna inactivada para Chlamydiae. Aunque que el formaldehído y la etilenimina binaria se citan en la lista de agentes de inactivación, no se describe ninguna selección específica de dichos reactivos.

Una desventaja de los procedimientos conocidos es que es necesario un tiempo relativamente largo (+/- 2 días) para obtener niveles satisfactorios de inactivación, con el resultado de que parte del antígeno del virus puede degradarse. Las vacunas fabricadas con dichos antígenos viricos inactivados son, por tanto, relativamente menos eficaces cuando se utilizan.

Adicionalmente, BEI no siempre proporciona una inactivación satisfactoria. En la práctica, los resultados extrapolados indican algunas veces que sigue existiendo la posibilidad de presencia de partículas vírica en el lote al final de la inactivación (a las 48 horas). Esto significa que dicho lote no es aceptable y debe destruirse.

Son objeto de la presente invención proporcionar procedimientos de inactivación de microorganismos y fabricación de vacunas, proporcionar vacunas fabricadas por dichos procedimientos y proporcionar kits que incorporan dichos microorganismos inactivados, que suponen mejoras de los procedimientos, vacunas y kits conocidos.

La presente invención proporciona un procedimiento para aumentar la inactivación de un microorganismo en el que dicho procedimiento incluye la aplicación simultánea de un aldehído y un compuesto aziridina aparte a dicho microorganismo, en el que dicha aplicación simultánea proporciona un efecto sinérgico que aumenta la inactivación del microorganismo.

La presente invención proporciona también un procedimiento de fabricación de una vacuna que incluye las etapas de proporcionar un patógeno; e inactivar el patógeno, en el que dicho procedimiento incluye la aplicación simultánea de un aldehído y un compuesto aziridina aparte a dicho patógeno, en el que dicha aplicación simultánea proporciona un efecto sinérgico que aumenta la inactivación del microorganismo.

Sorprendentemente, los solicitantes han encontrado que utilizando simultáneamente un aldehído con un compuesto aziridina se consigue un efecto sinérgico o aumentado a través del cual se inactivan los microorganismos, no sólo más extensamente sino también en un tiempo relativamente mucho más corto en comparación con los procedimientos de la técnica anterior.

Los solicitantes han encontrado además que las vacunas fabricadas según la invención son eficaces cuando se utilizan, probablemente debido al hecho de que el periodo de inactivación es relativamente más corto y a que el aldehído fija los antígenos del microorganismo fijados con el aldehído, lo que los hace más accesibles.

Los solicitantes consideran que los antígenos se preservan de este modo y no se degradan y, por tanto, se espera que las vacunas fabricadas según la invención sean más estables con periodos de validez más largos que las vacunas conocidas. También, los solicitantes además consideran que las vacunas dependerán menos de las condiciones estrictas de la cadena del frío durante el transporte y utilización en el campo.

El aldehído puede ser un dialdehído.

Preferiblemente, el aldehído es formaldehído (FA).

Los solicitantes además consideran que, al menos en el caso de FA, el agente de entrecruzamiento prepara el virus para la inactivación mediante el agente de inactivación.

El compuesto aziridina puede ser una etilenimina.

Preferiblemente, la etilenimina es etilenimina binaria (BEI).

El procedimiento puede incluir la etapa adicional de detener el proceso de inactivación.

El proceso de inactivación puede detenerse mediante la adición de uno cualquiera o más de entre tiosulfato sódico, bisulfito sódico y trishidroximetilaminometano (tampón Tris).

Según un segundo aspecto de la invención se proporciona una vacuna que incluye un microorganismo inactivado mediante el procedimiento anterior según el primer aspecto de la invención.

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Según un tercer aspecto de la invención se proporciona un procedimiento de fabricación de una vacuna que incluye las etapas de:

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- proporcionar un patógeno;

- inactivar el patógeno aplicado a dicho patógeno un agente aldehído simultáneamente con un compuesto aziridina aparte;

- el agente de entrecruzamiento también puede inactivar al patógeno (debido a su actividad de entrecruzamiento).

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El aldehído puede ser un dialdehído.

Preferiblemente, el aldehído es formaldehído (FA).

El compuesto aziridina puede ser una etilenimina.

Preferiblemente, la etilenimina es etilenimina binaria (BEI).

Los solicitantes han encontrado además que los procedimientos anteriores según la invención son especialmente eficaces para la inactivación de virus y la preparación de vacunas frente a patógenos virales.

El virus puede ser de la familia Picornaviridae.

Preferiblemente, el virus es el virus de la enfermedad de la fiebre aftosa, pero se apreciará que los procedimientos según la invención serán eficaces con respecto a la mayoría de los virus e incluso a otros microorganismos.

Según otro aspecto de la invención se proporciona un kit de ensayo que incluye un microorganismo inactivado mediante el procedimiento anterior de la invención. El microorganismo inactivado puede estar en forma de alergeno o de antígeno para su uso en un ELISA.

Ahora se describirá una realización preferida de la invención mediante un ejemplo no limitante.

Para investigar el efecto de la BEI en combinación con FA sobre el virus de la FMD, se inactivaron dos grupos de virus, a saber, un grupo de ensayo y un grupo control, como se muestra a continuación.

Ejemplo

A continuación se muestra un procedimiento según la invención para la inactivación del virus de la enfermedad de la fiebre aftosa (FMDV) con una combinación de formaldehído (FA) y etilenimina binaria (BEI). También se explica en detalle a partir de ahora en el presente documento un procedimiento operativo estándar (POE) para la inactivación del FMDV con la intención de producir una vacuna para la FMD. Se hace sólo referencia al procedimiento seguido en el grupo de ensayo. Sin embargo, se siguieron sustancialmente los mismos procedimientos en el caso de los grupos de ensayo y de control, con la excepción de que en el grupo de ensayo, BEI y FA se aplicaron simultáneamente, mientras que en el grupo control, BEI se utilizó como el propio agente de inactivación.

Definiciones y abreviaturas utilizadas a continuación

BEI:: Etilenimina binaria

BEA:: Hidroxibromuro de 2-bromoetilamina

NaOH:: Hidróxido sódico

STS:: Tiosulfato sódico

FA:: Formaldehído

ITT 1:: Primer depósito de inactivación

ITT 2:: Segundo depósito de inactivación

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Compuestos químicos

Lentejas de hidróxido sódico (NaOH) p.a.- Merck

Bromuro de 2-bromoetilamonio (BrCH_{2}CH_{2}NH_{3}-Br) - Merck

Solución de violeta de \beta-naftol

Solución de formalina p.a. que contiene formaldehído a aproximadamente el 37% - Merck

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Materiales y equipo

Probeta graduada de 1.000 ml

Botella de reactivo estéril de 5 litros

Agitador magnético estéril

Agua destilada estéril

Botellas McCarthy estériles de 10 ml.

Campana de extracción

Medidor de pH Orion (electrodo combinado)

Balanza

Agitador magnético

Autoclave

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Procedimiento

Un cultivo de virus SAT 2 cepa Zim 7/83 tratado con cloroformo y filtrado se llevó a una temperatura de 30°C y, a continuación, se inactivó con una combinación de BEI y FA (BEI-FA). Esta combinación inactiva muy rápidamente al virus de la FMD (DI_{50} >2 log_{10} por hora).

El cultivo estaba contenido en un depósito. Debido al hecho de que puede que la mezcla BEI-FA no entre en algunas partes del depósito, como en el sifón invertido, pudiera ser que el virus no se inactive por completo y podría, al final del procedimiento, contaminar el antígeno vírico inactivado. Por tanto, después de aproximadamente 4 horas, la mezcla de inactivación completa se transfirió a un segundo depósito de inactivación (sólo con BEI durante 24 horas).

Se tomaron muestras cada 20 minutos para controlar la inactivación y verificar la forma correcta de la recta de regresión. En el presente procedimiento, en lotes de 150 litros, la gráfica de inactivación extrapolada debería estar por debajo de una DI_{50} de -6,3 log_{10} al final de la inactivación (a las 24 horas). La inactivación se detiene mediante la adición de STS al 2%, que neutraliza la BEI.

Tanto la BEI como el formaldehído son sustancias tóxicas y deben manipularse con cuidado. La BEI se prepara en una campaña de extracción. Tras la ciclación (véase a continuación), la solución de BEI debe manejarse con extremo cuidado ya que es muy tóxica y probablemente carcinógena. El remanente de BEI debe neutralizarse con una solución de STS al 20% antes de su eliminación.

Nota: Debería omitirse el uso de Tris o de otras sales de amonio cuaternario, por ejemplo, para la corrección del pH debido a que reaccionan con el FA. También puede utilizarse Tris para detener el entrecruzamiento/inactivación adicional debido a FA.

Preparación de BEI y de BEI-FA (para la recogida de 300 1 de virus)

La preparación de la solución de BEI-FA debe realizarse en una campana de extracción (a temperatura ambiente) como sigue:

- Introducir 2.970 ml de agua destilada estéril en una botella de reactivo estéril de 5 litros.

- Añadir 21 g de NaOH a los 3 litros de agua destilada.

- Añadir un agitador magnético estéril y agitar hasta que se haya disuelto todo el NaOH (para ahorrar tiempo, el NaOH puede prepararse previamente el día anterior al que se necesita la BEI).

- Medir el pH de la solución de NaOH y anotar la medida del valor de pH en la botella y en la hoja de registro.

- Añadir 61,5 g de BEI a los 3 litros de solución de NaOH.

- Añadir 1,5 ml de una solución de violeta de \beta-naftol al 1% a la BEI.

- Dejar que se produzca la ciclación de BEI durante 1 hora a 37°C con agitación magnética.

- Medir el pH tras la ciclación (intervalo de pH de 10 a 11).

- Comprobar el color de la solución.

- Después de la ciclación, el color del violeta de \beta-naftol ha cambiado de violeta a naranja.

- Para la inactivación con la combinación BEI-FA, añadir 30 ml de solución de formalina.

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Procedimiento de inactivación sólo con BEI

- Añadir 10 ml de BEI 0,1 M por litro de virus recogidos hasta alcanzar una concentración final de 1 mM.

- Tomar durante las primeras 6 horas de inactivación una muestra cada hora (30 ml, véase a continuación).

- Después de 24 horas de inactivación, cuando se espera que el título del virus esté por debajo de cero (menos de 1 partícula vírica por ml), añadir la misma cantidad de BEI y transferir la mezcla de inactivación al segundo recipiente de inactivación (ITT2).

- Tomar una muestra de 100 ml.

- Comprobar el pH de la muestra.

- A las 48 horas añadir el 10% de una solución de STS al 20% y agitar (concentración final de STS: 2%).

- Tomar una muestra de 600 ml para comprobar el pH y para las pruebas de seguridad in vitro, 146 S y esterilidad (ver los correspondientes POE).

- Enfriar el ITT2 haciendo fluir agua fría a través de su chaqueta.

- Ahora, el antígeno inactivado puede transferirse a la "zona divisoria" para su procesamiento posterior.

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Procedimiento de inactivación con la combinación BEI-FA

- Añadir 10 ml de BEI-FA 0,1 M por litro de virus recogidos hasta alcanzar una concentración final de 1 mM de BEI y 0,04% de FA (aproximadamente 1 mM).

- Tomar durante las primeras 3 horas una muestra cada 20 minutos.

- Después de 4 horas de inactivación, cuando se espera que el título del virus esté por debajo de cero (menos de 1 partícula vírica por ml), transferir la mezcla de inactivación al segundo recipiente de inactivación (ITT2).

- Tomar una muestra de 100 ml.

- A las 20 horas de inactivación añadir el 10% de una solución de STS al 20% y agitar (concentración final de STS: 2%).

- Enfriar el ITT2 haciendo fluir agua fría a través de su chaqueta.

- Ahora, el antígeno inactivado puede transferirse a la "zona tampón" para su procesamiento posterior.

Control del proceso de inactivación General

Ambos depósitos de esterilización están equipados con dispositivos de recogida de muestras que se esterilizan con vapor entre cada muestreo.

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Toma de muestras y valoración

- Tomar muestras de al menos 30 ml (véase a continuación)

- Dividir inmediatamente cada muestra en 3 partes de 8 ml y añadirlas a botellas de muestra que contienen 1 ml de STS al 20% y 1 ml de suero fetal de ternera (SFT) sin actividad frente al virus de la FMS, obteniéndose concentraciones finales de FBS al 10% y de STS al 2%. Conservar una muestra a 4°C y 2 muestras, como reserva, a -70°C.

- Tomar una muestra de 100 ml a las 4 horas, antes de que la mezcla de inactivación se transfiera al segundo depósito de inactivación y medir el pH.

- Tomar una muestra final de 600 ml al final de la inactivación.

- La reducción en el título del virus se controla mediante valoración en placas de microvaloración con células IBRS. Los valores se expresan como unidades logarítmicas en base 10 por ml (por ejemplo, 1 millón de dosis infecciosas por ml supone un valor de 6) y se representan gráficamente.

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Procesamiento corriente abajo

El antígeno vírico inactivado se concentró mediante ultrafiltración habitual hasta aproximadamente 2 litros. Se tomaron muestras del antígeno concentrado y se enviaron para análisis y controles habituales (esterilidad, producciones de antígeno 146 S y ELISA). Otras muestras y la mayor parte del antígeno concentrado se conservaron a -70°C.

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Vacuna experimental

Se preparó una vacuna experimental Al(OH)3-saponina a partir de una mezcla de las 5 cepas de vacuna inactivadas con FA-BEI. Las vacunas contenían 0,8 \mug del antígeno 146 S de cada cepa de vacuna por cada dosis de 3 ml, con la excepción de SAT3 KNP90/3 de la cual se añadieron 1,6 \mug. Se vacunó a 5 terneros con 1/4 de la dosis (0,75 ml). Las muestras de suero sanguíneo tomadas tras la vacunación se emplearon en un ensayo de neutralización del virus.

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Resultados obtenidos con la invención

En la fig. 1a se proporciona una gráfica representativa de la inactivación obtenida sólo con BEI. Según la experiencia de los autores, sólo con BEI, las tasas de inactivación varían entre 0,4 y 1,0 log por hora (véase también Bahnemann, 1990) y en algunas ocasiones, a tasas bajas de inactivación, las gráficas principales sugieren ciertas "colas".

De manera habitual, la inactivación se realiza durante 48 horas. A las 24 horas se añade una segunda porción de BEI. Por tanto, incluso a las tasas de inactivación más bajas, puede esperarse una seguridad suficiente y que pasen las pruebas de seguridad finales.

En las figuras 1a a f incluidas, se muestran las gráficas de inactivación obtenidas sólo con BEI (a) para una de las cepas de vacuna SAT y con BEI-FA (b-f) para las 5 cepas de vacunas.

Las tasas de inactivación variaban de 2,0 (SAT1-SAR9/81, fig. 1b) a más de 3 log por hora (SAT2-ZIM 7/83 y SAT2 KNP-19/89/2, fig. 1d y 1e respectivamente, tabla 1). Por tanto, la inactivación es de más de 20 a aproximadamente 100 veces más rápida si se añade FA.

TABLA 1 Tasas de inactivación (con BEI-FA) de las cinco cepas de vacunas SAT

1

Es difícil decir qué causa este efecto sinérgico. En condiciones óptimas, FA inactiva en una tasa de tan sólo aproximadamente 0,3 log/h (Barteling, 1984). Por tanto, es difícil esperar que ninguna adición produzca una inactivación más rápida que la de BEI.

A partir de estas gráficas queda claro que mediante la combinación FA-BEI se obtenían gráficos lineales y se encontraba que los valores del virus se reducían en más de 2 log por hora. Por tanto, se lograba de hecho una inactivación suficiente en 8 horas con una seguridad aceptable. En consecuencia, no podían detectarse virus supervivientes en una muestra grande (200 ml) tomada después de 6 horas, como era el caso de las muestras finales (a las 20 horas).

Debe apreciarse que en el sistema de microvaloración, las muestras sin diluir y diluidas 10 veces producían un efecto citopatogénico, pero esto era debido a la toxicidad del formaldehído (o de la combinación FA-BEI) y no se podían propagar virus a partir de dichos pocillos.

Por tanto, la inactivación puede realizarse en el lapso de tiempo de un día de trabajo o bien durante la noche en lugar de las 48 horas necesarias para la inactivación sólo con BEI. Esto ofrece una flexibilidad mayor en los programas semanales de fabricación.

Sólo con BEI, los rendimientos de antígeno (de las cepas SAT) se reducían a menudo del 10 al 30 por ciento durante las 48 horas de inactivación. No se observó reducción en la concentración de antígeno 146 S después de las 24 horas de inactivación con FA-BEI. Cuando las condiciones eran por lo demás idénticas, podría esperarse una reducción de aproximadamente la mitad de la observada con BEI. Los rendimientos óptimos probablemente son debidos a la fijación del antígeno mediante la acción de entrecruzamiento del FA (Barteling, 1984).

Los resultados obtenidos tras la vacunación de 5 terneros con las vacunas preparadas a partir de los 5 antígenos inactivados con BEI-FA se presentan en la tabla 2.

TABLA 2 Títulos promedio de neutralización del virus 2 semanas después de la vacunación y resultados de la estimulación. Los animales se vacunaron con 1/4 de una dosis que contenía 0,2 \mug de cada una de las cepas SAT 1 y SAT 2 y 0,4 \mug de SAT 3

2

La estimulación 3 semanas después de la vacunación) se realizó con SAT 1 KNP 196/91-1. De los 5 animales, 2 estaban protegidos y 1 lo estaba parcialmente (1 lesión).

Considerando las bajas cantidades de antígeno (y adyuvantes) que se incorporaban a la vacuna, ésta funcionaba bastante bien. Las vacunas contenían 0,8 \mug de cada cepa de vacuna de la FMD por dosis de 3 ml y se inyectó 1/4 de dosis (0,75 ml).

Dos semanas después de la vacunación, se obtuvo una respuesta de anticuerpos neutralizantes menor frente a SAT 1 KNP 91/1 (con un valor medio de 1,8 log) y, por tanto, se seleccionó esta cepa como cepa de estimulación (tabla 2). Dos animales estaban protegidos y uno lo estaba parcialmente, lo que indicaba un nivel de protección de aproximadamente el 50% (1 PD 50). Puesto que la dosis de vacuna inyectada contenía aproximadamente 0,4 g por tipo de virus de la FMD (por ejemplo, de SAT1), dichos resultados indican que (para el antígeno más débil) puede esperarse un nivel de protección de aproximadamente 2,5 PD 50 por \mug, lo que es, en comparación con el estándar de la industria, sorprendentemente bueno.

La estabilidad del antígeno 146 S es un parámetro importante para la selección de una nueva cepa de vacuna. Mediante la acción de entrecruzamiento del FA, que estabiliza el antígeno 146 S, este parámetro se convierte en menos crítico y, por tanto, el procedimiento de inactivación con BEI-FA hará que la introducción rápida de nuevas cepas de vacuna sea relativamente más fácil.

Debido a la fijación del antígeno mediante la acción de entrecruzamiento del FA, los solicitantes esperan que las vacunas tengan una estabilidad superior. Esto es especialmente importante para países en vías de desarrollo (por ejemplo en África), donde el mantenimiento de las condiciones de la cadena del frío no es siempre posible.

Se apreciará que el procedimiento de inactivación según la presente invención presenta tasas de inactivación muy aumentadas, donde se alcanzan niveles de seguridad suficientes en aproximadamente 8 horas o menos, en comparación con los +/- 2 días con los procedimientos conocidos. Por tanto, la inactivación durante 20 horas con el procedimiento de la invención no deja ninguna posibilidad de discusión sobre la seguridad de un lote.

El nuevo procedimiento de inactivación según la invención acorta el proceso de fabricación de vacunas en al menos un día. Esto hace que el sistema de fabricación de vacunas sea mucho más flexible y permite que el proceso (incluyendo el tratamiento con cloroformo) se adapte a 4 jornadas laborales por semana.

Los solicitantes además consideran que durante el procedimiento según la invención, el FA fija los antígenos del virus durante la inactivación y, por tanto, dará lugar a vacunas relativamente más eficaces con un periodo de validez relativamente más largo.

Donde la inactivación sólo con BEI produce, en condiciones favorables, tasas de inactivación de 0,5 a 1,0 log por hora (Rweyemamu y col.), las 5 cepas de vacuna estudiadas hasta el momento mostraron que el procedimiento según la invención presenta tasas de inactivación de 2,0 a 3,3 log (fig. 2b - 2f, tabla 1). Por tanto, el procedimiento de la invención puede ofrecer una garantía de inactivación suficiente en 8 horas. Esto también significa que la inactivación puede realizarse en el espacio de tiempo de una jornada laboral. Esto es una gran ventaja en el proceso de fabricación de vacunas (fabricación del virus, recogida, aclarado, inactivación y concentración del antígeno) que, según la técnica anterior hasta ahora sólo puede ajustarse a una semana laboral completa.

Los solicitantes prevén que pueda prepararse un kit de ensayo que incluya un microorganismo inactivado según el procedimiento anterior de la invención. En el kit de ensayo, el microorganismo inactivado puede estar en forma de alergeno o de antígeno para su uso en un ELISA.

Claims

1. Un procedimiento para aumentar la inactivación de un microorganismo, en el que dicho procedimiento incluye la aplicación simultánea de un aldehído y un compuesto aziridina aparte al microorganismo, en el que dicha aplicación simultánea proporciona un efecto sinérgico que aumenta la inactivación del microorganismo.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1 en el que el aldehído es un dialdehído.

3. Un procedimiento según la reivindicación 2 en el que el aldehído es formaldehído (FA).

4. Un procedimiento según la reivindicación 1 en el que el compuesto aziridina es una etilenimina.

5. Un procedimiento según la reivindicación 4 en el que la etilenimina es etilenimina binaria (BEI).

6. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que incluye la etapa adicional de detener el proceso de inactivación.

7. Un procedimiento según la reivindicación 6 en el que el proceso de inactivación se detiene mediante la adición de uno cualquiera o más de entre tiosulfato sódico, bisulfito sódico y trishidroximetilaminometano (tampón Tris).

8. Un procedimiento de fabricación de una vacuna que incluye las etapas de proporcionar un patógeno; e inactivar el patógeno, en el que dicho procedimiento incluye la aplicación simultánea de un aldehído y un compuesto aziridina aparte a dicho patógeno, en el que dicha aplicación simultánea proporciona un efecto sinérgico que aumenta la inactivación del patógeno.

9. Un procedimiento según la reivindicación 8 en el que el aldehído es un dialdehído.

10. Un procedimiento según la reivindicación 9 en el que el aldehído es formaldehído (FA).

11. Un procedimiento según la reivindicación 8 en el que el compuesto aziridina es una etilenimina.

12. Un procedimiento según la reivindicación 11 en el que la etilenimina es etilenimina binaria (BEI).

13. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 que incluye la etapa adicional de detener el proceso de inactivación.

14. Un procedimiento según la reivindicación 13 en el que el proceso de inactivación se detiene mediante la adición de una cualquiera o más de entre tiosulfato sódico, bisulfito sódico y trishidroximetilaminometano (tampón Tris).

15. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el microorganismo es un virus.

16. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que el patógeno es un virus.

17. Un procedimiento según la reivindicación 15 ó 16, en el que el virus es de la familia Picornaviridae.