ES2300286T3 - Procedimiento de inactivacion de microorganismos. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para aumentar la inactivación de un microorganismo, en el que dicho procedimiento incluye la aplicación simultánea de un aldehído y un compuesto aziridina aparte al microorganismo, en el que dicha aplicación simultánea proporciona un efecto sinérgico que aumenta la inactivación del microorganismo.
Description
Procedimiento de inactivación de
microorganismos.
Esta invención se refiere a procedimientos de
inactivación de microorganismos y fabricación de vacunas, a vacunas
fabricadas mediante dichos procedimientos y a kits que incorporan
dichos microorganismos inactivados. Más especialmente, pero no
exclusivamente, esta invención se refiere a procedimientos de
inactivación de virus y fabricación de vacunas de virus y a las
vacunas fabricadas a partir de dichos procedimientos.
La inactivación del virus y las pruebas de
seguridad son las etapas más críticas de la fabricación de vacunas
inactivadas. En el caso de vacunas para la enfermedad de la fiebre
aftosa (FMD, por sus siglas en inglés) en especial, es esencial
garantizar la seguridad porque cualquier aparición de la enfermedad
causará un bloqueo de todo el mercado de exportación de animales y
productos animales.
Un procedimiento clásico de inactivación del
virus de la FMD y de preparación de una vacuna para la FMD es con
formaldehído como se describe en Waldmann y col.: Waldmann O, Pyl
G, Hobohm KO, Mohlmann H: "Die Entwicklung des Riemser
Adsorbatimpfstoffes gegen Maul-und Klauenseuche und
seine Herstellung". Zbl Bakt I Orig 148: 1, 1941.
En el pasado este procedimiento se utilizó para
la preparación de vacunas para FDM y, por ejemplo, se aplicó a la
preparación de vacunas basadas en cultivos de tipo Frenkel; Frenkel
S: "Modifications de la méthode de culture du virus aphteuse
selon Frenkel. Valeur des vaccins selon les données du
laboratoire". Bull OIE 61: 985, 1964.
El formaldehído es conocido por su acción de
entrecruzamiento (fijación) de proteínas, que probablemente causa
la elevada estabilidad y el prolongado periodo de validez (de hasta
5 años o más) de las vacunas inactivadas con formaldehído (FA)
(Frenkel).
Varios estudios han mostrado que a la
concentración de FA prescrita por Waldmann, las gráficas de
inactivación no eran lineales y a menudo mostraban una especie de
"cola", que puede producir una inactivación incompleta. Esto se
demostró en las siguientes publicaciones:
- Graves JH: "Formaldehyde inactivation of
foot-and-mouth disease virus as
applied to vaccine preparation", Am J Vet Res 24, 1131;
- Weslen, T. y Dinter, Z.: "The inactivation
of foot-and-mouth disease virus by
formalin". Arch. Ges. Virusforsch. 1957, 7, 394;
- Barteling SJ, Woortmeijer R, Visser N:
"Innocuity testing of
foot-and-mouth disease vaccines. I.
Formaldehyde-inactivated alhydrogel vaccines", J
Biol. Stand. 1983, 11, 297.
Las vacunas inactivadas con formaldehído
inducían un buen grado de inmunidad y se demostró que en
condiciones bien definidas pueden obtenerse gráficas de
inactivación lineales con FA (Barteling SJ, Woortmeijer R:
"Formaldehyde inactivation of
foot-and-mouth disease virus.
Conditions for the preparation of safe vaccine", Arch Virol.
1984, 80, 103). Sin embargo, la inactivación con FA seguía bajo
sospecha y la inactivación con aziridinas (por ejemplo,
acetiletilenimina, AFT), que produce una inactivación más rápida
con gráficas de inactivación lineales, se convirtió en el
procedimiento de elección.
La inactivación con AEI se describe en la
siguiente publicación:
- Brown F, Hyslop NSG, Crick J, Morrow AW:
"The use of acetyl-ethyleneimine in the
production of inactivated
foot-and-mouth disease vaccines",
J Hyg (Camb) 1963b, 61: 337.
Un procedimiento ampliamente utilizado para la
inactivación del virus de la FMD mediante aziridina se describe en
H.G. Bahnemann: "Inactivation of viral antigens for vaccine
preparation with particular reference to the application of binary
ethylenmine". Vaccine, 1999, 8, 299.
Sin embargo, a diferencia del FA, las aziridinas
no tienen reactividad de entrecruzamiento y las vacunas preparadas
a partir de algunas cepas inestables de FMD (vacuna) mostraban
periodos de validez cortos. Por tanto, algunas cepas de vacunas
lábiles se fijan primero con FA antes de que la inactivación se
complete con un compuesto aziridina como BEI. Este procedimiento se
ha descrito en las siguientes 3 publicaciones:
- Rowlands y col. (1972) - Stabilizing the
immunizing antigen of
foot-and-mouth disease virus by
fixation with formaldehyde. Arch. Ges. Virusforsch. 39,
274-283;
- Mowat y col. (1973) - Enhancement of
immunizing potency of
foot-and-mouth disease vaccine for
cattle by treatment of the antigen with formaldehyde. Arch. Ges.
Virusforsch. 41, 365-370; y
\global\parskip0.900000\baselineskip
- M M Rweyemamu y col. (1989) - Effect of
formaldehyde (FA) and binary ethyleneimine (BEI) on the integrity
of foot-and-mouth disease virus
capsid. Rev. sci. tech. Off. Int. Epiz. 8,
747-767.
También se conoce la inactivación del virus
primero con BEI y, a continuación, entrecruzar o fijar las
partículas o antígenos del virus inactivado con FA, por ejemplo, el
antígeno del virus de la FMD de la cepa SAT2 Zim 7/83.
Mowat y col., (1973) Arch. Gesamte Virusforsch.
41 (4), páginas 365-70, y N° de acceso a la base de
datos STN 79:90381, describe la inmunización de ganado vacuno
frente a la enfermedad de la fiebre aftosa utilizando un antígeno
que ha sido tratado con formaldehído.
El documento US 5.242.686 describe la
utilización de una combinación de agentes de inactivación para
preparar una vacuna inactivada para Chlamydiae. Aunque que
el formaldehído y la etilenimina binaria se citan en la lista de
agentes de inactivación, no se describe ninguna selección
específica de dichos reactivos.
Una desventaja de los procedimientos conocidos
es que es necesario un tiempo relativamente largo (+/- 2 días)
para obtener niveles satisfactorios de inactivación, con el
resultado de que parte del antígeno del virus puede degradarse. Las
vacunas fabricadas con dichos antígenos viricos inactivados son,
por tanto, relativamente menos eficaces cuando se utilizan.
Adicionalmente, BEI no siempre proporciona una
inactivación satisfactoria. En la práctica, los resultados
extrapolados indican algunas veces que sigue existiendo la
posibilidad de presencia de partículas vírica en el lote al final
de la inactivación (a las 48 horas). Esto significa que dicho lote
no es aceptable y debe destruirse.
Son objeto de la presente invención proporcionar
procedimientos de inactivación de microorganismos y fabricación de
vacunas, proporcionar vacunas fabricadas por dichos procedimientos
y proporcionar kits que incorporan dichos microorganismos
inactivados, que suponen mejoras de los procedimientos, vacunas y
kits conocidos.
La presente invención proporciona un
procedimiento para aumentar la inactivación de un microorganismo en
el que dicho procedimiento incluye la aplicación simultánea de un
aldehído y un compuesto aziridina aparte a dicho microorganismo, en
el que dicha aplicación simultánea proporciona un efecto sinérgico
que aumenta la inactivación del microorganismo.
La presente invención proporciona también un
procedimiento de fabricación de una vacuna que incluye las etapas
de proporcionar un patógeno; e inactivar el patógeno, en el que
dicho procedimiento incluye la aplicación simultánea de un aldehído
y un compuesto aziridina aparte a dicho patógeno, en el que dicha
aplicación simultánea proporciona un efecto sinérgico que aumenta
la inactivación del microorganismo.
Sorprendentemente, los solicitantes han
encontrado que utilizando simultáneamente un aldehído con un
compuesto aziridina se consigue un efecto sinérgico o aumentado a
través del cual se inactivan los microorganismos, no sólo más
extensamente sino también en un tiempo relativamente mucho más
corto en comparación con los procedimientos de la técnica
anterior.
Los solicitantes han encontrado además que las
vacunas fabricadas según la invención son eficaces cuando se
utilizan, probablemente debido al hecho de que el periodo de
inactivación es relativamente más corto y a que el aldehído fija
los antígenos del microorganismo fijados con el aldehído, lo que
los hace más accesibles.
Los solicitantes consideran que los antígenos se
preservan de este modo y no se degradan y, por tanto, se espera
que las vacunas fabricadas según la invención sean más estables con
periodos de validez más largos que las vacunas conocidas. También,
los solicitantes además consideran que las vacunas dependerán menos
de las condiciones estrictas de la cadena del frío durante el
transporte y utilización en el campo.
El aldehído puede ser un dialdehído.
Preferiblemente, el aldehído es formaldehído
(FA).
Los solicitantes además consideran que, al menos
en el caso de FA, el agente de entrecruzamiento prepara el virus
para la inactivación mediante el agente de inactivación.
El compuesto aziridina puede ser una
etilenimina.
Preferiblemente, la etilenimina es etilenimina
binaria (BEI).
El procedimiento puede incluir la etapa
adicional de detener el proceso de inactivación.
El proceso de inactivación puede detenerse
mediante la adición de uno cualquiera o más de entre tiosulfato
sódico, bisulfito sódico y trishidroximetilaminometano (tampón
Tris).
Según un segundo aspecto de la invención se
proporciona una vacuna que incluye un microorganismo inactivado
mediante el procedimiento anterior según el primer aspecto de la
invención.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Según un tercer aspecto de la invención se
proporciona un procedimiento de fabricación de una vacuna que
incluye las etapas de:
\vskip1.000000\baselineskip
- proporcionar un patógeno;
- inactivar el patógeno aplicado a dicho
patógeno un agente aldehído simultáneamente con un compuesto
aziridina aparte;
- el agente de entrecruzamiento también puede
inactivar al patógeno (debido a su actividad de
entrecruzamiento).
\vskip1.000000\baselineskip
El aldehído puede ser un dialdehído.
Preferiblemente, el aldehído es formaldehído
(FA).
El compuesto aziridina puede ser una
etilenimina.
Preferiblemente, la etilenimina es etilenimina
binaria (BEI).
El procedimiento puede incluir la etapa
adicional de detener el proceso de inactivación.
El proceso de inactivación puede detenerse
mediante la adición de uno cualquiera o más de entre tiosulfato
sódico, bisulfito sódico y trishidroximetilaminometano (tampón
Tris).
Los solicitantes han encontrado además que los
procedimientos anteriores según la invención son especialmente
eficaces para la inactivación de virus y la preparación de vacunas
frente a patógenos virales.
El virus puede ser de la familia
Picornaviridae.
Preferiblemente, el virus es el virus de la
enfermedad de la fiebre aftosa, pero se apreciará que los
procedimientos según la invención serán eficaces con respecto a la
mayoría de los virus e incluso a otros microorganismos.
Según otro aspecto de la invención se
proporciona un kit de ensayo que incluye un microorganismo
inactivado mediante el procedimiento anterior de la invención. El
microorganismo inactivado puede estar en forma de alergeno o de
antígeno para su uso en un ELISA.
Ahora se describirá una realización preferida de
la invención mediante un ejemplo no limitante.
Para investigar el efecto de la BEI en
combinación con FA sobre el virus de la FMD, se inactivaron dos
grupos de virus, a saber, un grupo de ensayo y un grupo control,
como se muestra a continuación.
Ejemplo
A continuación se muestra un procedimiento según
la invención para la inactivación del virus de la enfermedad de la
fiebre aftosa (FMDV) con una combinación de formaldehído (FA) y
etilenimina binaria (BEI). También se explica en detalle a partir
de ahora en el presente documento un procedimiento operativo
estándar (POE) para la inactivación del FMDV con la intención de
producir una vacuna para la FMD. Se hace sólo referencia al
procedimiento seguido en el grupo de ensayo. Sin embargo, se
siguieron sustancialmente los mismos procedimientos en el caso de
los grupos de ensayo y de control, con la excepción de que en el
grupo de ensayo, BEI y FA se aplicaron simultáneamente, mientras
que en el grupo control, BEI se utilizó como el propio agente de
inactivación.
- BEI:
- Etilenimina binaria
- BEA:
- Hidroxibromuro de 2-bromoetilamina
- NaOH:
- Hidróxido sódico
- STS:
- Tiosulfato sódico
- FA:
- Formaldehído
- ITT 1:
- Primer depósito de inactivación
- ITT 2:
- Segundo depósito de inactivación
\vskip1.000000\baselineskip
Lentejas de hidróxido sódico (NaOH) p.a.-
Merck
Bromuro de 2-bromoetilamonio
(BrCH_{2}CH_{2}NH_{3}-Br) - Merck
Solución de violeta de
\beta-naftol
Solución de formalina p.a. que contiene
formaldehído a aproximadamente el 37% - Merck
\vskip1.000000\baselineskip
Probeta graduada de 1.000 ml
Botella de reactivo estéril de 5 litros
Agitador magnético estéril
Agua destilada estéril
Botellas McCarthy estériles de 10 ml.
Campana de extracción
Medidor de pH Orion (electrodo combinado)
Balanza
Agitador magnético
Autoclave
\vskip1.000000\baselineskip
Un cultivo de virus SAT 2 cepa Zim 7/83 tratado
con cloroformo y filtrado se llevó a una temperatura de 30°C y, a
continuación, se inactivó con una combinación de BEI y FA
(BEI-FA). Esta combinación inactiva muy rápidamente
al virus de la FMD (DI_{50} >2 log_{10} por hora).
El cultivo estaba contenido en un depósito.
Debido al hecho de que puede que la mezcla BEI-FA
no entre en algunas partes del depósito, como en el sifón
invertido, pudiera ser que el virus no se inactive por completo y
podría, al final del procedimiento, contaminar el antígeno vírico
inactivado. Por tanto, después de aproximadamente 4 horas, la
mezcla de inactivación completa se transfirió a un segundo depósito
de inactivación (sólo con BEI durante 24 horas).
Se tomaron muestras cada 20 minutos para
controlar la inactivación y verificar la forma correcta de la recta
de regresión. En el presente procedimiento, en lotes de 150
litros, la gráfica de inactivación extrapolada debería estar por
debajo de una DI_{50} de -6,3 log_{10} al final de la
inactivación (a las 24 horas). La inactivación se detiene mediante
la adición de STS al 2%, que neutraliza la BEI.
Tanto la BEI como el formaldehído son sustancias
tóxicas y deben manipularse con cuidado. La BEI se prepara en una
campaña de extracción. Tras la ciclación (véase a continuación), la
solución de BEI debe manejarse con extremo cuidado ya que es muy
tóxica y probablemente carcinógena. El remanente de BEI debe
neutralizarse con una solución de STS al 20% antes de su
eliminación.
Nota: Debería omitirse el uso de Tris o
de otras sales de amonio cuaternario, por ejemplo, para la
corrección del pH debido a que reaccionan con el FA. También puede
utilizarse Tris para detener el entrecruzamiento/inactivación
adicional debido a FA.
La preparación de la solución de
BEI-FA debe realizarse en una campana de extracción
(a temperatura ambiente) como sigue:
- Introducir 2.970 ml de agua destilada estéril
en una botella de reactivo estéril de 5 litros.
- Añadir 21 g de NaOH a los 3 litros de agua
destilada.
- Añadir un agitador magnético estéril y agitar
hasta que se haya disuelto todo el NaOH (para ahorrar tiempo, el
NaOH puede prepararse previamente el día anterior al que se
necesita la BEI).
- Medir el pH de la solución de NaOH y anotar la
medida del valor de pH en la botella y en la hoja de registro.
- Añadir 61,5 g de BEI a los 3 litros de
solución de NaOH.
- Añadir 1,5 ml de una solución de violeta de
\beta-naftol al 1% a la BEI.
- Dejar que se produzca la ciclación de BEI
durante 1 hora a 37°C con agitación magnética.
- Medir el pH tras la ciclación (intervalo de pH
de 10 a 11).
- Comprobar el color de la solución.
- Después de la ciclación, el color del violeta
de \beta-naftol ha cambiado de violeta a
naranja.
- Para la inactivación con la combinación
BEI-FA, añadir 30 ml de solución de formalina.
\vskip1.000000\baselineskip
- Añadir 10 ml de BEI 0,1 M por litro de virus
recogidos hasta alcanzar una concentración final de 1 mM.
- Tomar durante las primeras 6 horas de
inactivación una muestra cada hora (30 ml, véase a
continuación).
- Después de 24 horas de inactivación, cuando se
espera que el título del virus esté por debajo de cero (menos de 1
partícula vírica por ml), añadir la misma cantidad de BEI y
transferir la mezcla de inactivación al segundo recipiente de
inactivación (ITT2).
- Tomar una muestra de 100 ml.
- Comprobar el pH de la muestra.
- A las 48 horas añadir el 10% de una solución
de STS al 20% y agitar (concentración final de STS: 2%).
- Tomar una muestra de 600 ml para comprobar el
pH y para las pruebas de seguridad in vitro, 146 S y
esterilidad (ver los correspondientes POE).
- Enfriar el ITT2 haciendo fluir agua fría a
través de su chaqueta.
- Ahora, el antígeno inactivado puede
transferirse a la "zona divisoria" para su procesamiento
posterior.
\vskip1.000000\baselineskip
- Añadir 10 ml de BEI-FA 0,1 M
por litro de virus recogidos hasta alcanzar una concentración final
de 1 mM de BEI y 0,04% de FA (aproximadamente 1 mM).
- Tomar durante las primeras 3 horas una muestra
cada 20 minutos.
- Después de 4 horas de inactivación, cuando se
espera que el título del virus esté por debajo de cero (menos de 1
partícula vírica por ml), transferir la mezcla de inactivación al
segundo recipiente de inactivación (ITT2).
- Tomar una muestra de 100 ml.
- A las 20 horas de inactivación añadir el 10%
de una solución de STS al 20% y agitar (concentración final de
STS: 2%).
- Tomar una muestra de 600 ml para comprobar el
pH y para las pruebas de seguridad in vitro, 146 S y
esterilidad (ver los correspondientes POE).
- Enfriar el ITT2 haciendo fluir agua fría a
través de su chaqueta.
- Ahora, el antígeno inactivado puede
transferirse a la "zona tampón" para su procesamiento
posterior.
Ambos depósitos de esterilización están
equipados con dispositivos de recogida de muestras que se
esterilizan con vapor entre cada muestreo.
\vskip1.000000\baselineskip
- Tomar muestras de al menos 30 ml (véase a
continuación)
- Dividir inmediatamente cada muestra en 3
partes de 8 ml y añadirlas a botellas de muestra que contienen 1 ml
de STS al 20% y 1 ml de suero fetal de ternera (SFT) sin actividad
frente al virus de la FMS, obteniéndose concentraciones finales de
FBS al 10% y de STS al 2%. Conservar una muestra a 4°C y 2
muestras, como reserva, a -70°C.
- Tomar una muestra de 100 ml a las 4 horas,
antes de que la mezcla de inactivación se transfiera al segundo
depósito de inactivación y medir el pH.
- Tomar una muestra final de 600 ml al final de
la inactivación.
- La reducción en el título del virus se
controla mediante valoración en placas de microvaloración con
células IBRS. Los valores se expresan como unidades logarítmicas en
base 10 por ml (por ejemplo, 1 millón de dosis infecciosas por ml
supone un valor de 6) y se representan gráficamente.
\vskip1.000000\baselineskip
El antígeno vírico inactivado se concentró
mediante ultrafiltración habitual hasta aproximadamente 2 litros.
Se tomaron muestras del antígeno concentrado y se enviaron para
análisis y controles habituales (esterilidad, producciones de
antígeno 146 S y ELISA). Otras muestras y la mayor parte del
antígeno concentrado se conservaron a -70°C.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una vacuna experimental
Al(OH)3-saponina a partir de una
mezcla de las 5 cepas de vacuna inactivadas con
FA-BEI. Las vacunas contenían 0,8 \mug del
antígeno 146 S de cada cepa de vacuna por cada dosis de 3 ml, con
la excepción de SAT3 KNP90/3 de la cual se añadieron 1,6 \mug. Se
vacunó a 5 terneros con 1/4 de la dosis (0,75 ml). Las muestras de
suero sanguíneo tomadas tras la vacunación se emplearon en un ensayo
de neutralización del virus.
\vskip1.000000\baselineskip
En la fig. 1a se proporciona una gráfica
representativa de la inactivación obtenida sólo con BEI. Según la
experiencia de los autores, sólo con BEI, las tasas de inactivación
varían entre 0,4 y 1,0 log por hora (véase también Bahnemann, 1990)
y en algunas ocasiones, a tasas bajas de inactivación, las gráficas
principales sugieren ciertas "colas".
De manera habitual, la inactivación se realiza
durante 48 horas. A las 24 horas se añade una segunda porción de
BEI. Por tanto, incluso a las tasas de inactivación más bajas,
puede esperarse una seguridad suficiente y que pasen las pruebas de
seguridad finales.
En las figuras 1a a f incluidas, se muestran las
gráficas de inactivación obtenidas sólo con BEI (a) para una de
las cepas de vacuna SAT y con BEI-FA
(b-f) para las 5 cepas de vacunas.
Las tasas de inactivación variaban de 2,0
(SAT1-SAR9/81, fig. 1b) a más de 3 log por hora
(SAT2-ZIM 7/83 y SAT2 KNP-19/89/2,
fig. 1d y 1e respectivamente, tabla 1). Por tanto, la inactivación
es de más de 20 a aproximadamente 100 veces más rápida si se añade
FA.
Es difícil decir qué causa este efecto
sinérgico. En condiciones óptimas, FA inactiva en una tasa de tan
sólo aproximadamente 0,3 log/h (Barteling, 1984). Por tanto, es
difícil esperar que ninguna adición produzca una inactivación más
rápida que la de BEI.
A partir de estas gráficas queda claro que
mediante la combinación FA-BEI se obtenían gráficos
lineales y se encontraba que los valores del virus se reducían en
más de 2 log por hora. Por tanto, se lograba de hecho una
inactivación suficiente en 8 horas con una seguridad aceptable. En
consecuencia, no podían detectarse virus supervivientes en una
muestra grande (200 ml) tomada después de 6 horas, como era el caso
de las muestras finales (a las 20 horas).
Debe apreciarse que en el sistema de
microvaloración, las muestras sin diluir y diluidas 10 veces
producían un efecto citopatogénico, pero esto era debido a la
toxicidad del formaldehído (o de la combinación
FA-BEI) y no se podían propagar virus a partir de
dichos pocillos.
Por tanto, la inactivación puede realizarse en
el lapso de tiempo de un día de trabajo o bien durante la noche en
lugar de las 48 horas necesarias para la inactivación sólo con BEI.
Esto ofrece una flexibilidad mayor en los programas semanales de
fabricación.
Sólo con BEI, los rendimientos de antígeno (de
las cepas SAT) se reducían a menudo del 10 al 30 por ciento
durante las 48 horas de inactivación. No se observó reducción en la
concentración de antígeno 146 S después de las 24 horas de
inactivación con FA-BEI. Cuando las condiciones
eran por lo demás idénticas, podría esperarse una reducción de
aproximadamente la mitad de la observada con BEI. Los rendimientos
óptimos probablemente son debidos a la fijación del antígeno
mediante la acción de entrecruzamiento del FA (Barteling,
1984).
Los resultados obtenidos tras la vacunación de 5
terneros con las vacunas preparadas a partir de los 5 antígenos
inactivados con BEI-FA se presentan en la tabla
2.
La estimulación 3 semanas después de la
vacunación) se realizó con SAT 1 KNP 196/91-1. De
los 5 animales, 2 estaban protegidos y 1 lo estaba parcialmente (1
lesión).
Considerando las bajas cantidades de antígeno (y
adyuvantes) que se incorporaban a la vacuna, ésta funcionaba
bastante bien. Las vacunas contenían 0,8 \mug de cada cepa de
vacuna de la FMD por dosis de 3 ml y se inyectó 1/4 de dosis (0,75
ml).
Dos semanas después de la vacunación, se obtuvo
una respuesta de anticuerpos neutralizantes menor frente a SAT 1
KNP 91/1 (con un valor medio de 1,8 log) y, por tanto, se
seleccionó esta cepa como cepa de estimulación (tabla 2). Dos
animales estaban protegidos y uno lo estaba parcialmente, lo que
indicaba un nivel de protección de aproximadamente el 50% (1 PD
50). Puesto que la dosis de vacuna inyectada contenía
aproximadamente 0,4 g por tipo de virus de la FMD (por ejemplo, de
SAT1), dichos resultados indican que (para el antígeno más débil)
puede esperarse un nivel de protección de aproximadamente 2,5 PD 50
por \mug, lo que es, en comparación con el estándar de la
industria, sorprendentemente bueno.
La estabilidad del antígeno 146 S es un
parámetro importante para la selección de una nueva cepa de vacuna.
Mediante la acción de entrecruzamiento del FA, que estabiliza el
antígeno 146 S, este parámetro se convierte en menos crítico y, por
tanto, el procedimiento de inactivación con BEI-FA
hará que la introducción rápida de nuevas cepas de vacuna sea
relativamente más fácil.
Debido a la fijación del antígeno mediante la
acción de entrecruzamiento del FA, los solicitantes esperan que
las vacunas tengan una estabilidad superior. Esto es especialmente
importante para países en vías de desarrollo (por ejemplo en
África), donde el mantenimiento de las condiciones de la cadena del
frío no es siempre posible.
Se apreciará que el procedimiento de
inactivación según la presente invención presenta tasas de
inactivación muy aumentadas, donde se alcanzan niveles de seguridad
suficientes en aproximadamente 8 horas o menos, en comparación con
los +/- 2 días con los procedimientos conocidos. Por tanto, la
inactivación durante 20 horas con el procedimiento de la invención
no deja ninguna posibilidad de discusión sobre la seguridad de un
lote.
El nuevo procedimiento de inactivación según la
invención acorta el proceso de fabricación de vacunas en al menos
un día. Esto hace que el sistema de fabricación de vacunas sea
mucho más flexible y permite que el proceso (incluyendo el
tratamiento con cloroformo) se adapte a 4 jornadas laborales por
semana.
Los solicitantes además consideran que durante
el procedimiento según la invención, el FA fija los antígenos del
virus durante la inactivación y, por tanto, dará lugar a vacunas
relativamente más eficaces con un periodo de validez relativamente
más largo.
Donde la inactivación sólo con BEI produce, en
condiciones favorables, tasas de inactivación de 0,5 a 1,0 log por
hora (Rweyemamu y col.), las 5 cepas de vacuna estudiadas hasta el
momento mostraron que el procedimiento según la invención presenta
tasas de inactivación de 2,0 a 3,3 log (fig. 2b - 2f, tabla 1).
Por tanto, el procedimiento de la invención puede ofrecer una
garantía de inactivación suficiente en 8 horas. Esto también
significa que la inactivación puede realizarse en el espacio de
tiempo de una jornada laboral. Esto es una gran ventaja en el
proceso de fabricación de vacunas (fabricación del virus, recogida,
aclarado, inactivación y concentración del antígeno) que, según la
técnica anterior hasta ahora sólo puede ajustarse a una semana
laboral completa.
Los solicitantes prevén que pueda prepararse un
kit de ensayo que incluya un microorganismo inactivado según el
procedimiento anterior de la invención. En el kit de ensayo, el
microorganismo inactivado puede estar en forma de alergeno o de
antígeno para su uso en un ELISA.
Claims (17)
1. Un procedimiento para aumentar la
inactivación de un microorganismo, en el que dicho procedimiento
incluye la aplicación simultánea de un aldehído y un compuesto
aziridina aparte al microorganismo, en el que dicha aplicación
simultánea proporciona un efecto sinérgico que aumenta la
inactivación del microorganismo.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1
en el que el aldehído es un dialdehído.
3. Un procedimiento según la reivindicación 2
en el que el aldehído es formaldehído (FA).
4. Un procedimiento según la reivindicación 1
en el que el compuesto aziridina es una etilenimina.
5. Un procedimiento según la reivindicación 4
en el que la etilenimina es etilenimina binaria (BEI).
6. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes que incluye la etapa adicional de
detener el proceso de inactivación.
7. Un procedimiento según la reivindicación 6
en el que el proceso de inactivación se detiene mediante la adición
de uno cualquiera o más de entre tiosulfato sódico, bisulfito
sódico y trishidroximetilaminometano (tampón Tris).
8. Un procedimiento de fabricación de una
vacuna que incluye las etapas de proporcionar un patógeno; e
inactivar el patógeno, en el que dicho procedimiento incluye la
aplicación simultánea de un aldehído y un compuesto aziridina aparte
a dicho patógeno, en el que dicha aplicación simultánea proporciona
un efecto sinérgico que aumenta la inactivación del patógeno.
9. Un procedimiento según la reivindicación 8 en
el que el aldehído es un dialdehído.
10. Un procedimiento según la reivindicación 9
en el que el aldehído es formaldehído (FA).
11. Un procedimiento según la reivindicación 8
en el que el compuesto aziridina es una etilenimina.
12. Un procedimiento según la reivindicación 11
en el que la etilenimina es etilenimina binaria (BEI).
13. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 12 que incluye la etapa adicional de detener
el proceso de inactivación.
14. Un procedimiento según la reivindicación 13
en el que el proceso de inactivación se detiene mediante la
adición de una cualquiera o más de entre tiosulfato sódico,
bisulfito sódico y trishidroximetilaminometano (tampón Tris).
15. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el microorganismo es un virus.
16. Un procedimiento según la reivindicación 8,
en el que el patógeno es un virus.
17. Un procedimiento según la reivindicación 15
ó 16, en el que el virus es de la familia
Picornaviridae.
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