DE60037907T2

DE60037907T2 - Verfahren zur inaktivierung von mikroorganismen

Info

Publication number: DE60037907T2
Application number: DE60037907T
Authority: DE
Inventors: Simon Johannes Barteling
Original assignee: Simbar Holding N V; SIMBAR HOLDING NV; INST ANIMAL SCIENCE AND HEALTH; INSTITUTE FOR ANIMAL SCIENCE AND HEALTH RESEARCH; Agricultural Research Council
Current assignee: INSTITUTE FOR ANIMAL SCIENCE AND HEALTH RESEAR, NL; SIMBAR HOLDING N.V., CURACAO, AN; Agricultural Research Council
Priority date: 1999-12-20
Filing date: 2000-12-18
Publication date: 2009-07-09
Anticipated expiration: 2020-12-19
Also published as: CA2394946A1; EP1240310B1; WO2001046390A3; JP2003517834A; WO2001046390A2; TR200202104T2; US6673349B2; US20030035811A1; AU2979601A; EP1240310A2; ATE384786T1; ES2300286T3; CY1107420T1; CA2394946C; DE60037907D1; BR0016563A; PT1240310E; DK1240310T3; AU782907B2

Description

Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Inaktivierung von Mikroorganismen und Herstellung von Impfstoffen, sie betrifft Impfstoffe, die durch derartige Verfahren hergestellt wurden und Kits, welche derartige inaktivierten Mikroorganismen einschließen. Insbesondere, aber nicht ausschließlich, betrifft diese Erfindung Verfahren zur Inaktivierung von Viren und die Herstellung von Virusimpfstoffen und sie betrifft Impfstoffe, die durch derartige Verfahren hergestellt werden.
Die Virusinaktivierung und die Sicherheitsprüfungen sind die kritischsten Schritte in der Produktion von inaktivierten Impfstoffen. Speziell in dem Fall von den Maul-und-Klauenseuche(MKS)-Impfstoffen ist eine garantierte Sicherheit unbedingt notwendig, weil jedes Auftreten der Krankheit eine Blockade des gesamten Exporthandels von Tieren und tierischen Produkten verursachen wird.
Ein klassisches Verfahren zur Inaktivierung des MKS-Virus und der Herstellung des MKS-Impfstoffes verwendet Formaldehyd, wie in Waldmann et al.: Waldmann O, Pyl G, Hobohm K O, Mohlmann H: "Die Entwicklung des Riemser Adsorbatimpfstoffes gegen Maul- und Klauenseuche und seine Herstellung". Zbl. Bakt. I. Orig. 148: 1, 1941 beschrieben.
In der Vergangenheit wurde dieses Verfahren bei der Herstellung von MKS-Impfstoffen verwendet und z. B. bei der Herstellung von Impfstoff auf der Grundlage von Kulturen nach Frenkel angewendet; Frenkel S: "Modifications de la méthode de culture du virus aphteuse selon Frenkel. Valeur des vaccins selon les données du laboratoire". Bull. OIE 61: 985, 1964.
Formaldehyd (FA) ist für seine Vernetzungswirkung (Fixierung) auf Proteine bekannt, welche möglicherweise die hohe Stabilität und die lange Lagerbeständigkeit – bis zu 5 Jahre und länger – von FA-inaktivierten (Frenkel) Impfstoffen verursachte.
Verschiedene Untersuchungen zeigten, dass bei der von Waldmann vorgeschriebenen FA-Konzentration die grafischen Darstellungen der Inaktivierungen nicht linear waren und häufig ein „langsames Auslaufen" aufwiesen, welches eine unvollständige Inaktivierung hervorrufen kann. Dies wurde in den nachfolgenden Veröffentlichungen demonstriert:

– Graves J H: "Formaldehyde inactivation of foot-and-mouth-disease virus as applied to vaccine preparation", Am. J. Vet. Res. 24, 1131;
– Weslen, T. und Dinter, Z.: The inactivation of foot-and-mouth disease virus by formalin". Arch. Ges. Virusforsch. 1957, 7, 394;
– Barteling S J, Woortmeijer R, Visser N: "Innocuity testing of foot-and-mouth disease vaccines. I. Formaldehyde-inactivated alhydrogel vaccines", J. Biol. Stand. 1983, 11, 297.

Die mit Formaldehyd inaktivierten Impfstoffe induzierten eine gute Immunität und es konnte gezeigt werden, dass unter eindeutig definierten Bedingungen lineare Inaktivierungsdiagramme mit FA erhalten werden können (Barteling S J, Woortmeijer R: "Formaldehyde inactivation of foot-and-mouth disease virus. Conditions for the preparation of safe vaccine", Arch. Virol. 1984, 80, 103). Die Inaktivierung mit FA blieb jedoch suspekt und so wurde die Inaktivierung mit Aziridinen (z. B. Acetylethylenimin, AEI), welche rascher inaktivieren und lineare Inaktivierungsdiagramme aufweisen, die Methode der Wahl.
Die Inaktivierung mit AEI ist in der nachfolgenden Veröffentlichung beschrieben:

– Brown F, Hyslop N S G, Crick J, Morrow A W: "The use of acetylethyleneimine in the production of inactivated foot-and-mouth disease vaccines", J. Hyg. (Camb) 1963b, 61: 337.

Ein weitverbreitetes Verfahren zur Inaktivierung des MKS-Virus durch ein Aziridin ist durch H. G. Bahnemann: "Inactivation of viral antigens for vaccine preparation with particular reference to the application of binary ethylenimine". Vaccine, 1999, 8, 299, beschrieben.
Im Unterschied zu FA weisen die Aziridine jedoch keine Vernetzungsaktivität auf und die Impfstoffe, die aus einigen instabilen MKS(Impf-)-Stämmen hergestellt wurden, zeigten eine kurze Lagerfähigkeit. Dementsprechend werden einige labile Impfstämme zuerst mit FA fixiert, bevor die Inaktivierung mit einer Aziridin-Verbindung wie beispielsweise BEI vervollständigt wird. Dieses Verfahren ist in den 3 nachfolgenden Veröffentlichungen beschrieben worden:

– Rowlands et al. (1972) – Stabilizing the immunizing antigen of foot-and-mouth disease virus by fixation with formaldehyde. Arch. Ges. Virusforsch. 39, 274–283;
– Mowat et al. (1973) – Enhancement of immunizing potency of foot-and-mouth disease vaccine for cattle by treatment of the antigen with formaldehyde. Arch. Ges. Virusforsch. 41, 365–370; and
– M M Rweyemamu et al. (1989) – Effect of formaldehyde (FA) and binary ethyleneimine (BEI) on the integrity of foot-and-mouth disease virus capsid. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 8, 747–767.

Es ist ebenfalls bekannt, den Virus zuerst mit BEI zu inaktivieren und anschließend die inaktivierten Viruspartikel oder Antigene mit FA zu vernetzen oder zu fixieren, beispielsweise das MKS-Virus-Antigen von dem SAT2-Zim 7/83-Stamm.
In Mowat et al. (1973), Arch. Gesamte Virusforsch. 41 (4), Seite 365–370, und in der STN DATABASE, Zugangs-Nr. 79:90381, ist die Immunisierung von Rindern gegen die Maul-und-Klauenseuche unter Verwendung eines Antigens, welches mit Formaldehyd behandelt worden ist, beschrieben worden.
Die US-Patentschrift Nr. 5,242,686 beschreibt die Verwendung einer Kombination von inaktivierenden Mitteln zur Herstellung eines inaktivierten Chlamydien-Impfstoffes. Während Formaldehyd und binäres Ethylenimin in der Liste der inaktivierenden Mittel aufgeführt sind, ist keine spezifische Auswahl irgendeiner Kombination an inaktivierenden Mitteln offengelegt.
Ein Nachteil der bekannten Verfahren ist, dass sie relativ lange (+/–2 Tage) benötigen, um befriedigende Werte der Inaktivierung zu erreichen, mit der Folge, dass ein Anteil von dem Virusantigen sich abbauen kann. Die aus derartig inaktivierten Virusantigenen hergestellten Impfstoffe sind folglich bei der Anwendung relativ gering wirksam.
Darüber hinaus ergibt BEI nicht immer eine zufriedenstellende Inaktivierung. In der Praxis weisen die extrapolierten Ergebnisse manchmal darauf hin, dass immer noch Risiken für das Vorhandensein von überlebenden Viruseinheiten in einer Charge am Ende von der Inaktivierung (bei 48 Stunden) vorhanden sind. Dies bedeutet, dass eine derartige Charge nicht annehmbar ist und vernichtet werden muss.
Die erfindungsgemäßen Aufgaben sind die Bereitstellung von Verfahren zur Inaktivierung von Mikroorganismen und Herstellung von Impfstoffen, die Bereitstellung von Impfstoffen, die durch derartige Verfahren hergestellt sind und die Bereitstellung von Kits, die solche inaktivierten Mikroorganismen enthalten, welche alle Verbesserungen der bekannten Verfahren, Impfstoffe und Kits darstellen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Steigerung der Inaktivierung von einem Mikroorganismus bereit, wobei das Verfahren die simultane Applikation von einem Aldehyd und einer separaten Aziridin-Verbindung an den Mikroorganismus beinhaltet, wobei die simultane Applikation einen synergistischen Effekt bereitstellt, welcher die Inaktivierung des Mikroorganismus steigert.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes bereit, welches die Schritte der Bereitstellung eines Erregers und die Inaktivierung des Erregers beinhaltet, wobei das Verfahren die simultane Applikation von einem Aldehyd und einer separaten Aziridin-Verbindung an den Erreger einschließt und wobei die simultane Applikation einen synergistischen Effekt bereitstellt, welcher die Inaktivierung des Mikroorganismus steigert.
Die Antragsteller haben überraschenderweise gefunden, dass durch die Verwendung eines Aldehyds simultan mit einer Aziridin-Verbindung ein synergistischer oder steigernder Effekt erreicht wird, wodurch die Mikroorganismen inaktiviert werden, aber nicht nur gründlicher, sondern ebenfalls in einer relativ bedeutend kürzeren Zeitspanne im Vergleich mit den Verfahren des Standes der Technik.
Die Antragsteller haben ferner gefunden, dass die erfindungsgemäß hergestellten Impfstoffe bei der Anwendung wirkungsvoll sind, möglicherweise aufgrund der Tatsache, dass die Zeitspanne der Inaktivierung relativ kürzer ist und dass das Aldehyd die Antigene von dem Mikroorganismus fixiert, sobald sie frei werden. Die Antragsteller meinen, dass die Antigene dadurch bewahrt und nicht abgebaut werden und dementsprechend erfindungsgemäß hergestellte Impfstoffe voraussichtlich stabiler sind und eine längere Lagerfähigkeit aufweisen als die bekannten Impfstoffe. Die Antragsteller glauben ebenfalls, dass die Impfstoffe während des Transportes und der Verwendung auf dem Gebiet weniger abhängig von strikten Kühlkettenbedingungen werden.
Der Aldehyd kann ein Dialdehyd sein.
Vorzugsweise ist der Aldehyd Formaldehyd (FA).
Die Antragsteller meinen ferner, dass mindestens im Falle von FA, das Vernetzungsmittel den Virus für die Inaktivierung durch das inaktivierende Agens vorbereitet.
Die Aziridin-Verbindung kann ein Ethylenimin sein.
Vorzugsweise ist das Ethylenimin ein binäres Ethylenimin (BEI).
Das Verfahren kann den weiteren Schritt des Einstellens des Inaktivierungsprozesses beinhalten.
Der Inaktivierungsprozess kann durch das Hinzufügen von jeweils eines oder mehrerer an Natriumthiosulfat, Natriumbisulfit und Trishydroxymethylaminomethan (Tris-Puffer) eingestellt werden.
Gemäß einem zweiten Aspekt von der Erfindung wird ein Impfstoff bereitgestellt, welcher einen Mikroorganismus beinhaltet, der durch das vorgenannte Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung inaktiviert wurde.
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung wird hier ein Verfahren zur Herstellung von einem Impfstoff bereitgestellt, beinhaltend die Schritte:

- Bereitstellung eines Erregers;
- Inaktivierung des Erregers durch die simultane Anwendung eines Aldehyd-Agens mit einer separaten Aziridin-Verbindung auf den Erreger;
– das Vernetzungsmittel kann ebenfalls den Erreger inaktivieren (durch seine Vernetzungsaktivität).

Der Aldehyd kann ein Dialdehyd sein.
Vorzugsweise ist der Aldehyd Formaldehyd (FA).
Die Aziridin-Verbindung kann ein Ethylenimin sein.
Vorzugsweise ist das Ethylenimin ein binäres Ethylenimin (BEI).
Das Verfahren kann den weiteren Schritt des Einstellens des Inaktivierungsprozesses beinhalten.
Der Inaktivierungsprozess kann durch das Hinzufügen von jeweils eines oder mehrerer an Natriumthiosulfat, Natriumbisulfit und Trishydroxymethylaminomethan (Tris-Puffer) eingestellt werden.
Die Antragsteller haben ferner gefunden, dass die vorangehenden erfindungsgemäßen Verfahren insbesondere bei der Inaktivierung von Viren und der Herstellung von Impfstoffen für virale Erreger wirkungsvoll sind.
Der Virus kann aus der Familie der Picornaviridae stammen.
Vorzugsweise ist der Virus ein Maul-und-Klauenseuche-Virus, aber es wird auch geschätzt werden, dass die erfindungsgemäßen Verfahren mit Bezug auf die meisten Viren und sogar andere Mikroorganismen wirksam sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt von der Erfindung wird ein Testkit bereitgestellt, welches einen Mikroorganismus beinhaltet, der durch das vorgenannte Verfahren der Erfindung inaktiviert wurde. Der inaktivierte Mikroorganismus kann in der Form eines Allergens oder eines Antigens für die Verwendung in einem ELISA vorliegen.
Eine bevorzugte Ausführungsform von der Erfindung wird nachfolgend mittels eines nicht einschränkenden Beispiels beschrieben.
Um die Wirkung von BEI in Kombination mit FA auf den MKS-Virus zu untersuchen, wurden zwei Gruppen mit Viren und zwar eine Testgruppe und eine Kontrollgruppe, wie nachfolgend dargelegt, inaktiviert.
BEISPIEL
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Inaktivierung des Maul-und-Klauenseuche-Virus (MKSV) mit einer Kombination aus Formaldehyd (FA) und einem binärem Ethylenimin (BEI) ist nachfolgend dargelegt. Eine Standardarbeitsanweisung (SOP) für die Inaktivierung von dem MKSV zum Zwecke der MKS-Impfstoff-Produktion ist ebenfalls in allen Einzelheiten nachfolgend hierin erläutert. Es wird hier nur Bezug genommen auf die Prozedur, die bei der Testgruppe befolgt wurde. Im Wesentlichen wird jedoch denselben Prozeduren im Falle von den Test- und den Kontrollgruppen gefolgt, mit der Ausnahme, dass in der Testgruppe das BEI und der FA simultan appliziert werden, während in der Kontrollgruppe ausschließlich BEI als das Inaktivierungsmittel verwendet wurde.
Nachfolgend verwendete Definitionen und Abkürzungen

BEI:: Binäres Ethylenimin
BEA:: 2-Bromethylamin-Hydrobromid
NaOH:: Natriumhydroxid
STS:: Natriumthiosulfat
FA:: Formaldehyd
ITT1:: Erster Inaktivierungs-Behälter
ITT2:: Zweiter Inaktivierungs-Behälter

Chemikalien

Natriumhydroxid-Plätzchen (NaOH) p. a. – Merck
2-Bromethylammonium-bromid (Br-CH₂CH₂NH₃-Br) – Merck β-Naphtholviolett-Lösung
Formalin-Lösung, p. a., enthält ungefähr 37% Formaldehyd – Merck

Materialien und Apparaturen

Messzylinder 1.000 ml
Sterile 5-Liter Reagenzienflasche
Steriler Rührmagnet
Steriles destilliertes Wasser
10-ml sterile McCarthy-Flaschen
Dunstabzug
pH-Meter (kombinierte Elektrode) Orion
Flache Waagschale
Magnetrührer
Autoklav

Verfahren
Eine filtrierte, mit Chloroform behandelte SAT2-Zim 7/83 Viruskultur wird auf eine Temperatur von 30°C gebracht und anschließend mit einer Kombination aus BEI und FA (BEI-FA) inaktiviert. Diese Kombination inaktiviert das MKSV sehr schnell (> 2Log10ID₅₀ pro Stunde).
Die Kultur wurde in einem Flüssigkeitsbehälter gehalten. Aufgrund der Tatsache, dass das BEI-FA eventuell in einige Bereiche von dem Flüssigkeitsbehälter, wie beispielsweise Tauchrohre, nicht eindringen kann, könnte der Virus nicht vollständig inaktiviert werden und könnte so, am Ende von dem Prozess, das inaktivierte Virusantigen kontaminieren. Deswegen wird nach annähernd 4 Stunden die gesamte Inaktivierungsmischung in einen zweiten Inaktivierungsbehälter überführt (mit BEI nur nach 24 Stunden).
Es werden alle 20 Minuten Proben entnommen, um die Inaktivierung zu kontrollieren und die vorschriftsmäßige Form der Regressionsgeraden zu bestätigen. In dem vorliegenden Verfahren, in Chargen von 150 Litern, muss die extrapolierte Inaktivierungsgrafik einen Wert unterhalb von –6,3Log10ID₅₀ am Ende von der Inaktivierung erreichen (nach 24 Stunden). Die Inaktivierung wird durch das Hinzufügen von 2% STS, welches das BEI neutralisiert, eingestellt.
Sowohl BEI als auch Formaldehyd sind toxische Substanzen und sollten vorsichtig behandelt werden. Das BEI wird in einem Dunstabzug hergestellt. Nach der Zyklisierung (siehe nachstehend) sollte die BEI-Lösung mit äußerster Vorsicht behandelt werden, da sie höchst toxisch und möglicherweise krebserregend ist. Die BEI-Rückstände müssen mit einer 20%-igen STS-Lösung vor ihrer Entsorgung neutralisiert werden.
Anmerkung: Die Verwendung von Tris oder anderen quaternären Ammoniumsalzen, z. B. zur Korrektur von dem pH-Wert, sollte unterlassen werden, da sie mit FA reagieren. Tris kann ebenfalls zum Einstellen weiterer Vernetzung/Inaktivierung durch FA verwendet werden.
Herstellung von BEI und von BEI-FA (für 300 l Virusansatz)
Die Herstellung von der BEI-FA-Lösung muss in einem Dunstabzug (bei Raumtemperatur), wie nachfolgend beschrieben, stattfinden:

– Es werden 2.970 ml steriles, destilliertes Wasser in eine sterile 5-l-Reagenzienflasche eingefüllt.
– Zu den 3 Liter destilliertes Wasser 21 g NaOH hinzufügen.
– Einen sterilen Magneten hinzufügen und solange rühren, bis das gesamte NaOH sich aufgelöst hat. (Um Zeit zu sparen, kann die NaOH am Tag bevor das BEI benötigt wird, hergestellt werden)
– Messen des pH-Wertes von der NaOH-Lösung und den gemessenen pH-Wert auf die Flasche und das Aufzeichnungsblatt schreiben.
– Zu den 3 Litern NaOH-Lösung 61,5 g BEI hinzufügen.
– 1,5 ml einer 1%-igen β-Naphtholviolett-Lösung zu der BEI-Lösung hinzufügen.
– Die Zyklisierung von BEI für 1 Stunde bei 37°C auf einem Magnetrührer stattfinden lassen.
– Messung des pH-Wertes nach der Zyklisierung (pH-Bereich von 10 bis 11).
– Die Farbe der Lösung kontrollieren.
– Nach der Zyklisierung ist die Farbe von dem β-Naphtholviolett von Violett nach Orange umgeschlagen.
– Zur Inaktivierung bei der BEI-FA-Kombination werden 30 ml Formalinlösung hinzugefügt.

Inaktivierungsverfahren bei BEI alleine

– 10 ml 0,1 M BEI pro Liter Virusansatz hinzufügen, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erreichen.
– Während der ersten 6 Stunden der Inaktivierung jede Stunde eine Probe entnehmen (30 ml, siehe nachstehend).
– Nach 24 Stunden der Inaktivierung, wenn erwartet wird, dass der Virustiter unterhalb von Null (weniger als 1 Viruspartikel pro ml) liegt, die gleiche Menge an BEI hinzufügen und die Inaktivierungsmischung in den zweiten Inaktivierungsbehälter (ITT2) überführen. 100 ml Probe entnehmen.
– Den pH-Wert von der Probe kontrollieren.
– Nach 48 Stunden 10% von einer 20%-igen STS-Lösung hinzufügen und rühren (endgültige STS-Konzentration: 2%).
– Eine Probe von 600 ml zur Kontrolle des pH-Wertes und der „in-vitro" Sicherheit, von 146S-Antigen und der Sterilitätstests entnehmen (siehe entsprechende SOPs).
– ITT2 mittels Durchströmen des Kühlmantels mit kaltem Wasser kühlen.
– Jetzt kann das inaktivierte Antigen zur weiteren Verarbeitung in den „Quarantänebereich" überführt werden.

Inaktivierungsverfahren bei der BEI-FA-Kombination

– 10 ml 0 M BEI-FA pro Liter Virusansatz hinzufügen, um eine Endkonzentration von 1 mM BEI und 0,04% FA (ungefähr 1 mM) zu erreichen.
– Während der ersten 3 Stunden alle 20 Minuten eine Probe entnehmen.
– Nach 4 Stunden der Inaktivierung, wenn erwartet wird, dass der Virustiter unterhalb von Null (weniger als 1 Viruspartikel pro ml) liegt, die Inaktivierungsmischung in den zweiten Inaktivierungsbehälter (ITT2) überführen.
– 100 ml Probe entnehmen.
– Nach 20 Stunden der Inaktivierung 10% von einer 20%-igen STS-Lösung hinzufügen und rühren (endgültige STS-Konzentration: 2%).
– Eine Probe von 600 ml zur Kontrolle des pH-Wertes und der „in-vitro" Sicherheit, von 146S-Antigen und der Sterilitätstests entnehmen (siehe entsprechende SOPs).
– ITT2 mittels Durchströmen des Kühlmantels mit kaltem Wasser kühlen.
– Jetzt kann das inaktivierte Antigen zur weiteren Verarbeitung in den „Pufferbereich" überführt werden.

Überwachung des Inaktivierungsprozesses
Allgemein
Beide Inaktivierungsbehälter sind mit Probenentnahmgeräten ausgestattet, die zwischen den Probennahmen dampfsterilisiert werden.
Probennahme und Titration

– Proben von mindestens 30 ml entnehmen (siehe nachfolgend).
– Jede Probe unmittelbar in 3 Volumen von je 8 ml aufteilen und sie in die Probenfläschchen geben, welche 1 ml 20% STS und 1 ml fötales Rinderserum (fetal bovine serum; FBS), das frei von Anti-MKS-Virusaktivität ist, enthalten, was eine Endkonzentration von 10% FBS und 2% STS ergibt. Eine Probe bei 4°C und 2 Proben, als Sicherheitsproben, bei –70°C lagern.
– Nach 4 Stunden vor der Überführung der Inaktivierungsmischung in den zweiten Inaktivierungsbehälter eine Probe von 100 ml entnehmen und den pH-Wert messen.
– Am Ende der Inaktivierung eine letzte Probe von 600 ml entnehmen.
– Die Verringerung des Virustiters wird mittels Titration in Mikrotiterplatten mit IBRS-Zellen kontrolliert. Die Titer werden in logarithmische Einheiten (Log10) pro ml angegeben (z. B. ergeben 1 Million infektiöse Dosen pro ml einen Titer von 6) und werden grafisch aufgezeichnet.

Aufreinigungsverfahren (Down-Stream Processing)
Das inaktivierte Virusantigen wurde routinemäßig mittels Ultrafiltration auf annähernd 2 Liter konzentriert. Von dem konzentrierten Antigen wurden Proben entnommen und für laufende Prüfungen und Kontrollen (Sterilität, Ausbeuten an 146S-Antigen und ELISA) versendet. Andere Proben und der Hauptteil des konzentrierten Antigens wurden bei –70°C gelagert.
Versuchsimpfstoff
Ein Al(OH)3-Saponin-Versuchsimpfstoff wurde aus einer Mischung von allen 5 durch BEI-FA inaktivierten Impfstämmen hergestellt. Die Impfstoffe ent hielten pro 3-ml Dosis 0,8 μg 146-S-Antigen von jedem Impfstamm, mit der Ausnahme von SAT KNP 90/3, wovon 1,6 μg hinzugefügt wurden. Es wurden 5 Rinder mit einem ¼ von der Dosis (0,75 ml) geimpft. Die Blutserumproben, die nach der Impfung genommen wurden, wurden in einem Virus-Neutralisationstest untersucht.
Mit der Erfindung erhaltene Ergebnisse
Ein repräsentatives Inaktivierungsdiagramm, welches nur mit BEI alleine erhalten wurde, ist in 1a dargestellt. Nach unserer Erfahrung variieren, mit BEI alleine, die Inaktivierungsgeschwindigkeiten zwischen Log0,4 und 1,0 pro Stunde (siehe auch Bahnemann, 1990) und manchmal, bei niedrigen Inaktivierungsgeschwindigkeiten, zeigen die Primärdiagramme ein etwas „langsames Auslaufen" an.
Die Inaktivierung wird routinemäßig für 48 Stunden durchgeführt. Nach 24 Stunden wird eine zweite Portion BEI hinzugefügt. Folglich kann selbst bei den niedrigsten Inaktivierungsgeschwindigkeiten eine ausreichende Sicherheit erwartet werden und die endgültigen Sicherheitstests werden bestanden.
In den eingeschlossenen 1a bis 1f sind die Inaktivierungsdiagramme dargestellt, die mit BEI alleine (a) für einen SAT-Impfstamm und mit BEI-FA (b–f) für 5 Impfstämme erhalten wurden.
Die Inaktivierungsgeschwindigkeiten variierten von 2,0 (SAT1-SAR 9/81, 1b) bis mehr als 3 Log-Einheiten pro Stunde (SAT2-ZIM 7/83 und SAT2 KNP – 19/89/2, 1d beziehungsweise 1e, Tabelle 1). Folglich ist die Inaktivierung von mehr als 20- bis über 100-fach schneller, wenn FA hinzugefügt wird. Tabelle 1: Inaktivierungsgeschwindigkeiten (mit BEI) von fünf SAT-Impfstämmen.

Stamm Inaktivierungsgeschwindigkeit

SAT1-SAR 9/81 2,0 Log/Std.

SAT1-KNP 91/1 2,5 Log/Std.

SAT2-ZIM 7/83 3,1 Log/Std.

SAT2-KNP 89/2 3,3 Log/Std.

SAT3-KNP 10/90-3 2,2 Log/Std.
Es ist schwierig zu sagen, was die synergistische Wirkung verursacht. Unter optimalen Bedingungen inaktiviert FA alleine nur mit einer Geschwindigkeit von ungefähr 0,3 Log/Std. (Barteling, 1984). Demzufolge ist fast keine Zunahme für die bedeutend schnellere Inaktivierung von BEI zu erwarten.
Aus diesen Diagrammen folgt deutlich, dass durch die Kombination FA-BEI lineare Diagramme erhalten wurden und für die Virustiter wurde gefunden, dass sie mit mehr als 2 Log pro Stunde vermindert werden. Folglich wurde innerhalb von 8 Stunden eine ausreichende Inaktivierung mit einer annehmbaren Sicherheit erreicht. Damit übereinstimmend konnte kein überlebender Virus in einer großen (200 ml) Probe nachgewiesen werden, welche nach 6 Stunden entnommen wurde, wie es ebenfalls bei den endgültigen Proben (nach 20 Stunden) der Fall war.
Es sollte angemerkt werden, dass in dem Mikrotiter-System die unverdünnten und die 10-fach verdünnten Proben eine zellschädigende Wirkung besaßen, aber dies auf die Toxizität von dem Formaldehyd (oder der Kombination FA-BEI) zurückzuführen war und kein Virus aus diesen Vertiefungen vermehrt werden konnte.
Demzufolge kann die Inaktivierung anstelle der 48 Stunden, die für die Inaktivierung mit BEI alleine benötigt werden, innerhalb der Zeitspanne von einem Arbeitstag oder einfach über Nacht durchgeführt werden. Dies führt zu einer größeren Flexibilität bei den wöchentlichen Fertigungszeitplänen.
Mit BEI alleine waren die Antigenausbeuten (der SAT-Stämme) häufig um 10 bis 30 Prozent während der 48 Stunden der Inaktivierung reduziert. Keine Verringerung in der Konzentration des 146-S-Antigens wurde nach den 24 Stunden der Inaktivierung mit FA-BEI beobachtet. Wo die Bedingungen ansonsten identisch waren, konnte eine Verringerung von annähernd der Hälfte der mit BEI beobachteten Verringerung erwartet werden. Die optimalen Ausbeuten sind möglicherweise auf die Fixierung von dem Antigen durch die Vernetzungswirkung von FA zurückzuführen (Barteling, 1984).
Die Ergebnisse, die nach der Impfung von 5 Rindern mit dem Impfstoff erhalten wurden, welcher aus den 5 BEI-FA-inaktivierten Antigenen hergestellt worden war, sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2: Mittelwerte der Virusneutralisationstiter 2 Wochen nach der Impfung und Belastungs-Ergebnisse. Die Tiere wurden mit einem ¼ einer Dosis geimpft, die 0,2 μg von jedem von den SAT1- und SAT2-Stämmen und 0,4 μg von dem SAT3-Stamm enthielt.

Stamm Mittelwert Titer

SAT1 KNP 196/91-1 1,8

SAT1 SAR 9/81-1 2,4

SAT2 KNP 19/8-/2 2,0

Sat2 Zim 7/83-2 2,3

SAT3 KNP 10/90-3 2,3
Eine Belastung (3 Wochen nach der Impfung) wurde mit dem Stamm SAT1 KNP 196/91-1 durchgeführt. Von 5 Tieren waren 2 geschützt und 1 Tier war teilweise geschützt (1 Verletzung).
Unter Berücksichtigung der niedrigen Mengen an Antigen (und der Hilfsstoffe), welche in dem Impfstoff enthalten waren, wirkte der Impfstoff ganz gut. Die Impfstoffe enthielten pro 3-ml Dosis 0,8 μg von jedem MKS-Impfstamm und ¼ von einer Dosis (0,75 ml) wurde injiziert.
Bei 2 Wochen nach der Impfung wurde die niedrigste Reaktion für die neutralisierenden Antikörper gegen SAT1 KNP 91/1 (mit einem mittleren Ti terwert von Log1,8) gefunden und deswegen dieser Stamm als Belastungsstamm ausgewählt (Tabelle 2). Zwei Tiere waren geschützt und ein Tier war teilweise geschützt, was auf ein Schutzniveau von annähernd 50% (1 PD50) hinweist. Da die injizierte Impfstoffdosis ungefähr 0,4 μg pro MKS-Virustyp (z. B. von SAT1) enthielt, weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass (für das schwächste Antigen) pro μg ein Schutzniveau von annähernd 2,5 PD50 erwartet werden kann, was in dem Vergleich mit dem Industriestandard überraschenderweise gut ist.
Die Stabilität von dem 146-S-Antigen ist ein Parameter von großer Wichtigkeit bei der Auswahl von einem neuen Impfstamm. Durch die Vernetzungswirkung von FA, welche das 146-S-Antigen stabilisiert, wird dieser Parameter weniger kritisch und dementsprechend wird das BEI-FA-Inaktivierungsverfahren die schnelle Einführung von neuen Impfstämmen relativ leichter machen.
Aufgrund von der Fixierung von dem Antigen durch die Vernetzungswirkung von FA erwarten die Antragsteller, dass die Impfstoffe eine überdurchschnittliche Stabilität aufweisen. Dies ist insbesondere von Bedeutung für die Entwicklungsländer (z. B. in Afrika), wo die Aufrechterhaltung von Kühlketten-Bedingungen nicht immer möglich ist.
Es wird geschätzt werden, dass das Verfahren der Inaktivierung gemäß der vorliegenden Erfindung deutlich verbesserte Inaktivierungsgeschwindigkeiten aufweist, womit, im Vergleich mit den +/–2 Tagen bei den bekannten Verfahren, ausreichende Sicherheitsniveaus innerhalb von 8 Stunden oder weniger erreicht werden können. Demzufolge lässt die Inaktivierung für 20 Stunden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren keine Möglichkeit für eine Auseinandersetzung über die Sicherheit von einer Charge zu.
Das neue erfindungsgemäße Inaktivierungsverfahren verkürzt den Prozess der Impfstoffherstellung um mindestens einen Tag. Dies macht ein Herstellungssystem für Impfstoffe bedeutend flexibler und ermöglicht es, den Prozess (einschließlich einer Chloroform-Behandlung) innerhalb von einer Arbeitswoche mit 4 Tagen einzupassen.
Die Antragsteller glauben weiterhin, dass während des erfindungsgemäßen Verfahrens das FA die Virusantigene während der Inaktivierung fixiert und dementsprechend in relativ wirksameren Impfstoffen mit einer relativ langen Lagerbeständigkeit resultiert.
Während die Inaktivierung mit BEI alleine, unter günstigen Bedingungen, Inaktivierungsgeschwindigkeiten von 0,5–1,0 Log pro Stunde ergibt (Rweyemamu et al.), zeigten die 5 Impfstämme, die bisher untersucht wurden, dass das erfindungsgemäße Verfahren Inaktivierungsgeschwindigkeiten von 2,0 bis 3,3 Log pro Stunde präsentiert (2b–2f, Tabelle 1). Demzufolge kann das erfindungsgemäße Verfahren eine Garantie für eine ausreichende Inaktivierung innerhalb von 8 Stunden bieten. Dies bedeutet ebenfalls, dass die Inaktivierung innerhalb des Zeitrahmens von einem Arbeitstag durchgeführt werden kann. Dies ist von großem Vorteil in einem Prozess zur Impfstoff-Herstellung (Virusproduktion, Ernte, Klärung, Inaktivierung und Konzentrierung von dem Antigen), welcher gemäß dem Stand der Technik bis jetzt nur in eine vollständige Arbeitswoche hineinpasste.
Die Antragsteller sehen voraus, dass ein Testkit, einschließlich eines Mikroorganismus, der gemäß dem voranstehenden, erfindungsgemäßen Verfahren inaktiviert wurde, hergestellt werden kann. In dem Testkit kann der inaktivierte Mikroorganismus in der Form von einem Allergen oder von einem Antigen für die Verwendung in einem ELISA vorliegen.

Claims

Verfahren zur Steigerung der Inaktivierung eines Mikroorganismus, wobei das Verfahren die simultane Applikation eines Aldehyds und einer separaten Aziridin-Verbindung an den Mikroorganismus beinhaltet, wobei die simultane Applikation einen synergistischen Effekt bereitstellt, welcher die Inaktivierung des Mikroorganismus steigert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Aldehyd ein Dialdehyd ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Aldehyd Formaldehyd (FA) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Aziridin-Verbindung ein Ethylenimin ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Ethylenimin ein binäres Ethylenimin (BEI) ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welches den weiteren Schritt des Einstellens des Inaktivierungsprozesses beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Inaktivierungsprozess durch das Hinzufügen jeweils eines oder mehrerer an Natriumthiosulfat, Natriumbisulfit und Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris-Puffer) eingestellt wird.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes beinhaltend die Schritte der Bereitstellung eines Erregers; und Inaktivierung des Erregers, wobei das Verfahren die simultane Applikation eines Aldehyds und einer separaten Aziridin-Verbindung an den Erreger beinhaltet, wobei die simultane Applikation einen synergistischen Effekt bereitstellt, der die Inaktivierung des Erregers steigert.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Aldehyd ein Dialdehyd ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Aldehyd Formaldehyd (FA) ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Aziridin-Verbindung ein Ethylenimin ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Ethylenimin ein binäres Ethylenimin (BEI) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8–12, welches den weiteren Schritt des Einstellens des Inaktivierungsprozesses beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Inaktivierungsprozess durch das Hinzufügen jeweils eines oder mehrerer an Natriumthiosulfat, Natriumbisulfit und Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris-Puffer) eingestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus ein Virus ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Erreger ein Virus ist.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei das Virus aus der Familie der Picornaviridae stammt.