DE69636427T2

DE69636427T2 - Ein im Wesentlichen von nicht vom Wirt stammendem Albumin freier adjuvierter Impfstoff

Info

Publication number: DE69636427T2
Application number: DE69636427T
Authority: DE
Inventors: Kristina J. Parkville Hennessy; Karen K. Parkville Brown; Jennifer K. Shawnee Lane; Sandra L. De Soto Trump
Original assignee: Bayer Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1995-09-21
Filing date: 1996-09-11
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2016-09-12
Also published as: DK0764446T3; EP0764446A2; US7482020B2; MX9604185A; CA2184132A1; NZ299405A; JPH09110719A; US20050232948A1; CA2184132C; EP0764446B1; AU716702B2; ATE335508T1; EP0764446A3; PT764446E; DE69636427D1; ES2270433T3; AU6569196A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft serumbasierte Vakzinen, die Wirtsalbumin enthalten und im Wesentlichen frei von Nicht-Wirtsalbumin sind, sowie die Verarbeitung zur Herstellung und Verwendung dieser Vakzinen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung das erfinderische Konzept von Vakzinen, die negative systemische Reaktionen nach der Impfung, die mit mit Adjuvanzien versehenen Impfprogrammen zusammenhängen, unterbinden oder im Wesentlichen reduzieren.
Kurze Beschreibung des Standes der Technik
Auf dem Gebiet der Erfindung ist bekannt, dass die Impfung von Tieren mit Impfprogrammen; die die Verwendung von Adjuvanzien einbinden, negative systemische Reaktionen hervorrufen kann. Das Impfprogramm kann die Verabreichung von deaktivierter Vakzine, die ein Adjuvans enthält, umfassen. Alternativ dazu kann das Impfprogramm die Verabreichung einer modifizierten Lebendvakzine und einer deaktivierten Vakzine, die ein Adjuvans enthält, umfassen. Als ein Beispiel umfassen die meisten Impfprogramme für feline Arten die Verabreichung einer Vakzine, die einen modi fizierten Lebendorganismus enthält, gleichzeitig mit einer Vakzine, die einen deaktivierten Organismus und ein Adjuvans enthält. Mit diesen Impfprogrammen assoziiert sind negative systemische Reaktionen nach der Impfung. Beispielsweise kann die Verwendung von felinen Leukämievakzinen (FeLV) Reaktionen nach der Impfung einschließlich übermäßigen Speichelflusses, Erbrechen und Diarrhöe hervorrufen. Siehe die Monographie zu FEL-O-VAX-Lv-K-Vakzine in: Compendium of Veterinary Products, 3. Auflage, 486 (1995-1996). Die negativen systemischen Reaktionen umfassen anaphylaktische Reaktionen, Hypersensibilität und atypische Reaktionen wie Erbrechen und Diarrhöe.
Im Gegensatz zum vorliegenden Konzept der Erfindung wurden gemäß dem aktuellen Wissensstand die oben genannten systemischen Reaktionen der Gegenwart von Adjuvanzien, Endotoxinen, Zelltrümmerresten, hohen Konzentrationen an modifizierten Lebendviren oder hoher Antigenmasse zugeschrieben. Dodds, Vaccine Safety and Efficacy Revisited: Autoimmune and Allergic Diseases on the Rise, Vet. Forum, 68-71 (Mai 1993), verzeichnete einen Anstieg bei Autoimmun- und allergischen Erkrankungen nach Verabreichung von Impfungen. Dodds postulierte, dass dieser Anstieg auf die immunologische Belastung von empfindlichen Tieren, die einer Kombinationsvakzine, die zugleich modifizierte Lebendorganismen und mit Adjuvanzien versehene, getötete Bakterine (als Verdünnungsmittel) in sich vereint, ausgesetzt werden, zurückzuführen sei. Dodds postulierte ebenfalls, dass die immunologische Belastung durch die Wirkung der modifizierten Lebendorganismen hervorgerufen wird.
Die Suche nach sicheren und wirksamen Vakzinen war bisher durch das kärgliche Wissen um die Ursache des Problems von Reaktionen nach der Impfung einge- schränkt. In der Literatur oder an anderer Stelle gibt es keinen Hinweis darauf, dass diese systemischen Reaktionen durch eine Wechselwirkung von Nicht-Wirtsalbumin mit einem Adjuvans verursacht werden könnten. Was eher auf das Gegenteil schließen lassen würde, ist die weit verbreitete Verwendung von Nicht-Wirtsalbumin in der Gegenwart von Adjuvanzien. Hunde erhalten die mit Adjuvanzien versehene Tollwut vakzine zugleich mit modifizierten Kombinations-Lebendvakzinen, die Nicht-Wirtsalbumin enthalten. Katzen erhalten die mit Adjuvanzien versehene FeLV-Vakzine in einem Impfprogramm, das die gleichzeitige Verabreichung einer modifizierten Lebendvakzine, die Nicht-Wirtsalbumin enthält, umfasst. Auch Kombinationen von Albumin und Adjuvanzien werden auf dem Gebiet der Erfindung häufig verwendet, um die Wirksamkeit von Adjuvanzien zu bewerten. Albumin, im Allgemeinen in der Form von bovinem Serumalbumin (BSA), wird mit verschiedenen Adjuvanzien formuliert, und jede dieser Formulierungen wird in nicht-bovine Tiere injiziert. Den Tieren wird später Blut abgenommen, und ihre Seren werden auf Antikörperreaktionen auf BSA untersucht. Von den Tieren, die die besten Antikörperreaktionen zeigen, wird angenommen, dass sie die wirksamsten Adjuvanzien erhalten haben. Prince et al., US-Patent Nr: 4.164.565, offenbaren die Verwendung von Nicht-Wirtsalbumin als Stabilisator in Vakzinen. Wiedmeier et al., Pediatric Research, Bd. 3, 262-267 (September 1987), offenbaren die Reaktivität in Mäusen, die durch Immunisierung mit Bordetella pertussis, kombiniert mit bovinem Albumin, hervorgebracht wird. Vor allem berichten Wiedmeier et al. davon, dass die Ursache von Reaktivität das Pertussis-Toxin in Kombination mit Albumin ist.
Um die Reduktion der systemischen Reaktionen zu unterstützen, können Vakzinen gereinigt werden, um Komponenten davon zu entfernen, die, wie angenommen wird, die systemischen Reaktionen verursachen. Tiervakzinenpräparate werden typischerweise mittels herkömmlicher Verfahren wie Filtration, Diafiltration oder Zentrifugation gereinigt, um Komponenten wie Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Andere Reinigungsverfahren, die hochgereinigte Antigene hervorbringen, werden selten verwendet, da sie bei der Herstellung von Tiervakzinen mit untragbaren Kosten verbunden sind. Beispiele für die anderen Reinigungsverfahren sind Säulenchromatographie, einschließlich lonenaustauschchromatographie, Molekularsiebchroma- tographie und Hydrophobchromatographie. Darüber hinaus ist es schwierig, stark gereinigte Antigene mit üblicherweise verwendeten Adjuvanzien zu versehen, da diese nicht ausreichend wirksam sind, um eine Schutzreaktion mit gereinigten Antigenen zu stimulieren. In jedem Fall waren diese Reinigungsverfahren zur Entfernung von Nicht-Wirtsalbumin von Vakzinen oder Vorläufern davon nicht wirksam.
Auf dem Gebiet der Erfindung wurde die Ursache systemischer Reaktionen nicht der Gegenwart von Adjuvanzien und Nicht-Wirtsalbumin zugeschrieben. Gewiss wurde auf dem Gebiet der Erfindung die Ursache systemischer Reaktionen nicht dem Vorhandensein von Nicht-Wirtsalbumin in Impfprogrammen zugeschrieben, die die Verwendung von Adjuvanzien einbinden.
Die EP 327.305 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Untereinheits-Vakzine gegen Pseudotollwut-Infektion, worin das Virus in fötalem bovinem Serum kultiviert und die Untereinheits-Vakzine an einer Lectin-Säule gereinigt wird.
Dank der vorliegenden Erfindung wurde erkannt, dass die Gegenwart von Nicht-Wirtsalbumin in einer mit Adjuvanzien versehenen-Vakzine oder einem entsprechenden Impfprogramm systemische Reaktionen hervorrufen kann. Durch die vorliegende Erfindung wird eine neue, serumbasierte, mit Adjuvanzien versehene Vakzine oder ein entsprechendes Impfprogramm, die bzw. das im Wesentlichen frei von Nicht-Wirtsalbumin ist, und ein Verfahren zur Herstellung dieser Vakzine bzw. dieses Impfprogramms bereitgestellt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der obigen Einführung umfasst die vorliegende Erfindung eine serumbasierte Vakzine, die eine immunogen wirksame Menge eines Antigens und ein Adjuvans umfasst, worin die Vakzine weniger als 1,0 mg/ml Wirtsalbumin enthält und im Wesentlichen frei von Nicht-Wirtsalbumin ist. Die Bezeichnung „serumbasiert" wird hierin verwendet, um darauf hinzuweisen, dass die Vakzinen der Erfindung oder ihre Vorläufer Serum einschließlich Nicht-Wirtsserum verwenden. Typischerweise wird das Serum in Wachstumsmedien verwendet, um das Wachstum von Organismen, die zur Herstellung der Vakzine verwendet werden, zu fördern. Unter der Bezeichnung „Vorläufer der Vakzine" werden Vakzinenkomponenten, insbesondere Antigen, Proteine, die kein Antigen sind, ganze Organismen und Erntematerial, verstanden. Unter der Bezeichnung „immunogen wirksame Menge" wird verstanden, dass das Antigen eine Schutzkomponente in einer Konzentration enthält, die ausreichend ist, um Tiere vor einer Target-Erkrankung zu schützen, wenn eine mit Adjuvanzien versehene Vakzine, die das Antigen enthält, den Tieren verabreicht wird. Unter der Bezeichnung „Antigen" wird ein biologisches Material (neutral, rekombinant oder synthetisch) verstanden, das eine schützende Immunantwort in Tieren stimuliert. Unter der Bezeichnung „mit Adjuvanzien versehene Vakzine" wird eine Vakzine verstanden, die ein Adjuvans enthält, oder eine Vielzahl an Vakzinen, die als Teil eines Impfprogramms verabreicht werden, worin zumindest eine der Vakzinen ein Adjuvans enthält. Unter der Bezeichnung Nicht-Wirtsalbumin wird Albumin aus dem Serum einer Tierspezies, die eine andere als die zu impfende Tierspezies ist, verstanden. Albumin ist ein einfaches Protein, das in Serum zu finden ist, und weist ein Molekulargewicht von etwa 66.000 Da auf. Eine Vakzine, die im Wesentlichen frei von Nicht-Wirtsalbumin ist, enthält weniger als 1,0 mg/ml Nicht-Wirtsalbumin.
Ebenfalls im Rahmen der Erfindung liegt ein Verfahren zur Herstellung der serumbasierten Vakzine gemäß den Ansprüchen, die im Wesentlichen frei von Nicht-Wirtsalbumin ist, umfassend das Entfernen von Nicht-Wirtsalbumin aus der Vakzine oder einem Vorläufer davon. Ein alternatives Verfahren zur Herstellung der serumbasierten Vakzine, die im Wesentlichen frei von Nicht-Wirtsalbumin ist, umfasst das Bereitstellen eines Wirtsserums, das Wirtsalbumin enthält, bei der Herstellung der Vakzine.
Gemäß der Erfindung wird eine Vakzine durch das Zusetzen von Wirtsserum oder Wirtsalbumin zum Vakzinen-Antigen nach dem Ernten oder Reinigen des Antigens aus einer Kultur eines Organismus, aus dem das Antigen abstammt, jedoch vor dem Zusetzen der Adjuvanzien zum Antigen hergestellt. Darüber hinaus kann das Wirtsserum oder -albumin zum Antigen nach dem Ernten, jedoch vor dem Lyophilisieren des Antigens, sofern das Antigen ein modifizierter Lebendorganismus ist, zugesetzt werden. Wird das Wirtsserum oder Wirtsalbumin auf diese Weise verwendet, so wirkt es als Stabilisator. Die Bezeichnung „Stabilisator" bezieht sich auf jegliches Additiv, das zu einer Vakzine zugesetzt wird, um den Abbau des Antigens und den daraus folgenden Verlust von Immunogenität der Vakzine zu unterbinden.
Gemäß den Ansprüchen umfasst das Verfahren zur Herstellung einer serumbasierten Vakzine, die eine immunogen wirksame Menge an Antigen und ein Adjuvans enthält, worin die Vakzine im Wesentlichen frei von Nicht-Wirtsalbumin ist:

(a) das Züchten eines Organismus, der das Antigen produziert, in einer Kultur, die Nicht-Wirtsalbumin enthält;
(b) das Ernten der Kultur;
(c) das Klären der Ernte;
(d) das Abtrennen von Antigen und Nicht-Wirtsalbumin von der geklärten Ernte;
(e) das Abtrennen des Nicht-Wirtsalbumins vom Antigen;
(f) das Gewinnen des Antigens; Zusetzen von Wirtsserum oder Wirtsalbumin; und
(g) das Formulieren des Antigens mit einem Adjuvans.

Gemäß den Ansprüchen kann das Verfahren zur Herstellung einer serumbasierten Vakzine, die eine immunogen wirksame Menge an Antigen und ein Adjuvans enthält, worin die Vakzine im Wesentlichen frei von Nicht-Wirtsalbumin ist, Folgendes umfassen:

(a) das Züchten eines Organismus, der das Antigen produziert, in einer Kultur, die Nicht-Wirtsalbumin enthält;
(b) das Ernten der Kultur;
(c) das Klären der Ernte;
(d) das Abtrennen von Antigen vom Nicht-Wirtsalbumin mittels Durchführen der geklärten Ernte durch eine Säule mit einer Matrix, die das Antigen selektiv bindet;
(e) das Waschen der Säulenmatrix, um überschüssiges Nicht-Wirtsalbumin zu entfernen;
(f) das Verwerfen der Waschlösung;
(g) das Waschen der Säulenmatrix mit einer Lösung, die das Antigen von der Säu- lenmatrix eluiert;
(h) das Gewinnen des Antigens; Zusetzen von Wirtsserum oder Wirtsalbumin; und
(i) das Formulieren des Antigens mit einem Adjuvans.

(a) das Züchten eines Organismus, der das Antigen produziert, in einer Kultur, die Nicht-Wirtsalbumin enthält;
(b) das Ernten der Kultur;
(c) das Klären der Ernte;
(d) das Abtrennen von Antigen vom Nicht-Wirtsalbumin mittels Durchführen der geklärten Ernte durch eine Säule mit einer Matrix, die das Nicht-Wirtsalbumin selektiv bindet;
(e) das Gewinnen des Antigens; Zusetzen von Wirtsserum oder Wirtsalbumin; und
(f) das Formulieren des Antigens mit einem Adjuvans.

Auch im Rahmen der Erfindung liegt ein Verfahren zum Stabilisieren eines Antigens wie in den Ansprüchen definiert, umfassend das Zusetzen von Wirtsserum oder Wirtsalbumin zu dem Antigen vor dem Zuführen von Adjuvanzien zum Antigen. Solch ein Verfahren zum Stabilisieren eines Antigens kann auch das Zusetzen von Wirtsserum oder Wirtsalbumin zu dem Antigen vor dem Lyophilisieren des Antigens umfassen.
Die Vakzinen der Erfindung sind bei der Verwendung zur Prävention oder Behandlung von Erkrankungen aller Tierspezies einsetzbar. Sie sind besonders bei der Verwendung zur Prävention oder Behandlung von Krankheiten von Haustieren wie Katzen, Hunden und Pferden geeignet, die besonders empfindlich auf mit Adjuvanzien versehene Impfprogramme, die Nicht-Wirtsalbumin umfassen, sind. Insbesondere sind die Vakzinen der Erfindung zur Verwendung bei der Prävention von feliner Leukämie (FeLV) und Tollwut geeignet, da sie die Probleme, die typischerweise solche Vakzinen mit sich bringen, nicht aufweisen. FeLV-Vakzinen sind dafür bekannt, negative Reaktionen wie übermäßigen Speichelfluss, Erbrechen, Diarrhöe und manch mal auch den Tod auszulösen. Häufig treten diese Reaktionen innerhalb von wenigen Minuten nach Verabreichung der Vakzine auf.
Überraschenderweise wurde erkannt, dass Tiere, denen die Vakzinen der Erfindung verabreicht wurden, praktisch keine negativen systemischen Reaktionen zeigten. Die Entdeckung, dass Nicht-Wirtsalbumin in einer Vakzine, die ein Adjuvans enthält oder in einem Impfprogramm mit einer Vakzine, die ein Adjuvans enthält, verabreicht wird, systemische Reaktionen hervorrufen kann, ist somit ein Teil der Erfindung. Dieser und andere Aspekte der Erfindung werden nachstehend noch näher beschrieben.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm, das einen Vergleich der Reaktivität einer Vakzine, die ein Adjuvans kombiniert mit Nicht-Wirtsalbumin enthält, mit dem Mangel an Reaktivität einer Vakzine, die ein Adjuvans in Kombination mit Wirtsalbumin enthält, darstellt.
2 ist eine Photographie eines SDS-PAGE-Gels, an dem 9 verschiedene feline Vakzinen verglichen werden, worin der Nicht-Wirtsalbumingehalt gezeigt wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie zuvor erläutert, umfasst die vorliegende Erfindung die Herstellung einer serum- basierten Vakzine, die eine immunogen wirksame Menge eines Antigens und ein Adjuvans umfasst, worin die Vakzine im Wesentlichen frei von Nicht-Wirtsalbumin ist, sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben. Darüber hinaus umfasst sie ein Verfahren zum Stabilisieren eines Antigens, das das Zusetzen von Wirtsserum oder Wirtsalbumin zum Antigen vor dem Versehen des Antigens mit Adjuvanzien umfasst. Solch ein Verfahren zur Stabilisierung eines Antigens kann auch das Zusetzen von Wirtsserum oder Wirtsalbumin zum Antigen vor dem Lyophilisieren des Antigens umfassen.
Nicht-Wirtsalbumin stammt aus Nicht-Wirtsserum, das typischerweise beim Züchten von Organismen, aus denen die Antigene abgeleitet werden, verwendet wird. Typische Beispiele für Nicht-Wirtsserum (das Nicht-Wirtsalbumin umfasst) können aus der aus bovinem Serum, fötalem bovinem Serum, equinem Serum, fötalem equinem Serum, Schafserum und Ziegenserum bestehenden Gruppe ausgewählt sein. Andererseits enthält, wenn equines Albumin in einer equinen Vakzine vorhanden ist, die Vakzine Wirtsalbumin.
Das Antigen wird aus einem Organismus, ausgewählt aus der aus Bakterien, Viren, Parasiten, Rickettsiae und Protozoen bestehenden Gruppe, erhalten. Beispiele für Bakterien können aus der aus Bordetella spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Clostridium spp., Leptospira spp., Escherichia spp., Salmonella spp., Pasteurella spp., Mycobacteria spp., Mycoplasma spp., Moraxella spp., Haemophilus spp., Borrelia spp., Fusobacteria spp., Bacteroides spp. und Rhodococcus spp. bestehenden Gruppe ausgewählt sein. Beispiele für Viren können aus der aus Herpesviren, Parainfluenzaviren, Reoviren, Rotaviren, Morbilliviren, Retroviren, Coronaviren, Ade- noviren, Togaviren, Parvoviren, Parapoxviren, Paramyxoviren, Zytomegalieviren, Arboviren und Hantaviren bestehenden Gruppe ausgewählt sein. Insbesondere würden solche Viren felines Leukämievirus, feline Rhinotracheitis, felines Calicivirus, felines Panleukopenievirus, felines Immunschwächevirus, felines infektiöses Peritonitisvirus, canine Hepatitis, canines Adenovirus Typ 2, canines Parvovirus, Tollwutvirus, canines Parainfluenzavirus, canines Coronavirus, equine Herpesviren, equine Influenzaviren und equine Enzephalomyelitisviren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt darauf. Beispiele für Parasiten und Protozoen können aus der aus Neospora spp., Toxoplasma spp., Dirofilaria spp., Cryptosporidium spp., Giardia spp., Babesia spp. und Coccidia spp. bestehenden Gruppe ausgewählt sein. Ein Beispiel für Rickettsia kann aus der aus Chlamydia spp. Potomac Horse Fever, Ehrlichia canis und anderen Ehrlichia spp. bestehenden Gruppe ausgewählt sein.
Die Antigene können aus einem Element, ausgewählt aus der aus einer ganzen Kultur eines Organismus wie z.B. einer gesamten Kulturernte, einer teilweise gereinigten gesamten Kulturernte, einer gereinigten Untereinheit, die aus der Ernte extrahiert wurde, einer Untereinheit, die über Rekombinationsverfahren erhalten wurde und in einem homologen oder heterologen Organismus exprimiert wird, einer Deletionsmutante des gesamten Organismus (herkömmliche oder Gen-deletierte rDNA-Mutanten), Peptiden, nackter DNA, chemisch synthetisierten Antigenen, revers transkribierter nackter cDNA oder Kombinationen davon bestehenden Gruppe, erhalten werden.
Im Allgemeinen kann das Antigen durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren zum Kultivieren und Ernten von Organismen, Einengen und/oder herkömmlichen Reinigen von Antigenen solcher Organismen hergestellt werden. Beispielsweise kann das Antigen durch Züchten des selektierten Organismus in einer Kultur, die Wachstumsmedium aufweist, das ein Nicht-Wirtsserum enthält, (serumbasierte Kultur) hergestellt werden. Insbesondere kann der Organismus in einer Gewebekultur, hergestellt aus Säugetier- oder Pflanzenzellen, gezüchtet werden, worin Nicht-Wirtsserum zum Medium zugesetzt wird, um das Wachstum des Organismus zu fördern. Der Organismus kann auch in Fermentationsmedium gezüchtet werden, worin der Organismus ohne Gewebekultur wächst, zum Medium jedoch ein Wachstumsmedium zugesetzt hat, das ein Nicht-Wirtsserum enthält. Typischerweise kann das Nicht-Wirtsserum aus der aus fötalem bovinem Serum, bovinem Serum, Kälberserum, fötalem equinem Serum, Pferdeserum, Ziegenserum, Lammserum und Schafserum bestehenden Gruppe ausgewählt sein. Bei vollendetem Wachstum wird die Kultur geerntet und, sofern erforderlich, herkömmlich gereinigt, beispielsweise durch Filtration und/oder Ultrafiltration, um Zellen, Zelltrümmer und fremde verunreinigende Substanzen zu entfernen. Diese Verfahren entfernen jedoch nicht das Nicht-Wirtsalbumin. An diesem Punkt enthält die Kulturernte stets Nicht-Wirtsalbumin und würde nicht annehmbar sein, wenn sie mit Adjuvans kombiniert und/oder in einem Impfprogramm mit einer mit Adjuvanzien versehenen Vakzine verabreicht werden würde. Daher wird die resultierende Kulturernte gemäß dieser Erfindung weiter gereinigt, um das Nicht-Wirtsalbumin vor ihrer Formulierung zu einer mit Adjuvanzien versehenen Vakzine zu entfernen.
Gemäß der Erfindung kann das Nicht-Wirtsalbumin durch ein Verfahren zur Reinigung der Vakzine oder eines Vorläufers der Vakzine auf solche Weise entfernt werden, dass das Nicht-Wirtsalbumin entfernt wird. Das Verfahren zur Reinigung des Vorläufers der Vakzine kann durch ein Chromatographieverfahren, ausgewählt aus der aus „Perfusion Chromatography^TM" (PerSeptive Biosystems), lonenaustauschchromatographie, Molekularsiebchromatographie, Hydrophobchromatographie, Affinitätschromatographie und Kombinationen davon bestehenden Gruppe, erfolgen. Vorzugsweise erfolgt das Reinigungsverfahren mittels Perfusion Chromatography^TM unter Verwendung Hydrophobchromatographie-Matrices oder einer Kombination von Hydrophobchromatographie und lonenaustauschchromatographie. Es folgt eine veranschaulichende, jedoch nicht einschränkende Beschreibung der Hydrophobchromatographie mit einer „Perfusion Chromatography^TM"-Matrix unter Verwendung von POROS-Medium (PerSeptive Biosystems).
Perfusion Chromatography^TM erfolgt unter Verwendung einer Matrix (POROS-Medium) mit großen kanalisierten Poren, die Moleküle durch Konvektionsstrom rasch in das Innere von jeder Perle tragen, sowie Diffusionsporen, die von den kanalisierten Poren abzweigen und eine große innere Oberfläche für Bindung bereitstellen. Diese Porenkombination sorgt für Reinigung mit hoher Kapazität, hoher Auflösung und hoher Geschwindigkeit. Hydrophobchromatographie bindet die Verwendung polarer Gruppen an einer ungeladenen Matrix ein, die mit polaren Resten (z.B. Phenylalanin) an Proteinen wechselwirken und eine Retardierung und Trennung von Proteinen basierend auf ihren relativen Hydrophobizitätsgraden verursachen. Die Verwendung der POROS-Mediummatrix ermöglicht viel größere Durchflussraten bei höherem Druck, sodass die Reinigungsdauer reduziert wird, wodurch die Kosten ebenfalls reduziert werden und Chromatographie für Veterinärprodukte kostenwirksam erfolgen kann.
Hydrophobchromatographie erfolgt durch das Zusetzen eines Puffers mit hoher lonenstärke zu Flüssigkeiten der Kulturernte, die das Nicht-Wirtsalbumin enthält, bevor solche Flüssigkeiten zur hydrophoben Säule zugesetzt werden. Die Säule wird mehrere Male mit einem Puffer hoher lonenstärke wie z.B. 20 mM Natriumphos phat/650 mM Natriumsulfat gewaschen, bevor die mit Puffer hoher lonenstärke gepufferten Flüssigkeiten der Kulturernte, die das Nicht-Wirtsalbumin enthalten (Säulen-Feedmaterial), zugesetzt werden. Mehrere Säulenvolumina von Säulen-Feedmaterial werden durch die Säule laufen gelassen. Die Säulenmatrix bindet sowohl das Nicht-Wirtsalbumin als auch das Antigen (innerhalb der gepufferten Flüssigkeiten der Kulturernte enthalten). Um Nicht-Wirtsalbumin aus der Säule zu eluieren, wird die Säule mehrere Male mit einem Puffer hoher lonenstärke wie z.B. 20 mM Natriumphosphat/650 mM Natriumsulfat gewaschen oder auch so lange gewaschen, bis die Ablesung der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 280 Nanometer (nm) des Eluats weniger als 0,03 beträgt. Das Antigen (gereinigt) wird aus der Säule durch Waschen der Säulenmatrix mit mehreren Volumina einer Lösung mit geringer lonenstärke, die steriles Wasser sein kann, eluiert. Das gereinigte Antigen wird in einem separaten Sammelbehälter gesammelt, wenn die optische Dichte des Eluats über 0,15 steigt. Das Sammeln des Eluats wird gestoppt, wenn die optische Dichte des Eluats unter 0,10 fällt.
Ein anderes Verfahren zur Entfernung von Nicht-Wirtsalbumin gemäß dieser Erfindung umfasst die Verwendung von Affinitätschromatographie zur Bindung von entweder dem Antigen oder dem Nicht-Wirtsalbumin. Das Antigen kann beispielsweise durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren des Kultivierens und Erntens von Organismen und Klärens, Einengens und/oder herkömmlichen Reinigens von Antigenen solcher Organismen wie zuvor beschrieben hergestellt werden. Zur Entfernung des Nicht-Wirtsalbumin kann die geklärte Ernte zu einer Säule zugesetzt werden, die eine Matrix enthält, die entweder das Antigen oder das Nicht-Wirtsalbumin bindet. Solch eine Matrix könnte ein Lectin wie CibaCron^TM Blue (Pharmacia) oder Mimetic Blue (Affinity Chromatography Ltd.) sein, die beide Nicht-Wirtsalbumin binden, oder auch eine Matrix, die einen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper enthält, der für das Antigen oder Nicht-Wirtsalbumin, je nachdem, welches an die Matrix gebunden ist, spezifisch ist. Die geklärte. Ernte wird zum Säulen-Feedmaterial und wird zur Säule zugesetzt. Enthält die Säule eine Matrix wie z.B. ein Lectin, einen polyklonalen Antikörper oder einen monoklonalen Antikörper, der für Nicht-Wirtsalbumin spezifisch ist, so wird das Nicht-Wirtsalbumin an die Säule ge bunden, und das Antigen wird durch die Säule durchgeführt und abgenommen. Das abgenommene Antigen wird anschließend mit Adjuvans formuliert, um eine Vakzine herzustellen. Enthält die Säule eine Matrix wie z.B. einen polyklonalen Antikörper oder monoklonalen Antikörper, der für das Antigen spezifisch ist, so wird das geklärte Erntematerial zur Säule zugesetzt, und das Antigen wird an die Matrix gebunden. Das Nicht-Wirtsalbumin wird durch die Säule durchgeführt und verworfen. Überschüssiges Nicht-Wirtsalbumin wird aus der Säulenmatrix durch Waschen mit einem Puffer, der das Antigen nicht entfernt, entfernt. Dann wird die Matrix mit einer Lösung gewaschen, die das Antigen aus der Säulenmatrix eluiert. Solche Wasch- und Elutionspuffer können auf pH-, lonenstärke- oder Polaritätsunterschieden des zu eluierenden Antigens basieren. Das Antigen wird dann abgenommen und mit einem Adjuvans formuliert, um die Vakzine zu produzieren. Wird ein Lectin verwendet, um Nicht-Wirtsalbumin zu binden, so wird das Antigen, das abgenommen wird, durch eine zweite Lectinsäule oder unter Verwendung einer anderen Art von Chromatographie gereinigt werden müssen, um das gesamte Nicht-Wirtsalbumin zu entfernen.
Ist ein ganzer Organismus wie z.B. ein Virus oder eine Bakterie oder ein sehr großes Antigen, beispielsweise eines mit einem Molekulargewicht von über 100.000 Da, vorhanden, so kann Molekularsiebchromatographie verwendet werden, um das Antigen vom Nicht-Wirtsalbumin zu trennen, das ein Molekulargewicht von nur etwa 66.000 Da aufweist. Molekularsiebchromatographie trennt Moleküle basierend auf ihrem Molekulargewicht. Die Matrix wird so ausgewählt, dass niedermolekulare Moleküle wie z.B. Nicht-Wirtsalbumin schneller durch die Säule durchwandern als die hochmolekularen Moleküle wie z.B. große Antigene. Unter Verwendung dieses Verfahrens wird der Organismus in einer Kultur, die Nicht-Wirtsalbumin enthält, gezüchtet und mittels herkömmlicher Verfahren, die bereits zuvor beschrieben wurden, geerntet, geklärt und/oder eingeengt und gereinigt. Um das Nicht-Wirtsalbumin von beispielsweise einem ganzen Virus zu separieren, wird das Virus in Gewebekultur gezüchtet, durch Abnehmen der Flüssigkeiten aus der Gewebekultur geerntet und geklärt, um die Zelltrümmer zu entfernen. Diese geklärte Ernte ist das Säulen-Feedmaterial und wird zur Säule zugesetzt. Die erste Flüssigkeit, die durch die Säule durchgeführt wird, wird abgenommen und verworfen, da sie das Nicht-Wirtsalbumin enthält. Das Virus wandert langsamer durch die Säule und kann unter Verwendung von Puffern, die das Virus nicht beeinträchtigen; in einen Sammelbehälter hinein gewaschen werden. Virus, das auf diese Weise abgenommen wurde, kann mit einem Adjuvans formuliert werden, um eine Vakzine herzustellen.
Ein alternatives Verfahren zur Herstellung der serumbasierten Vakzine, die eine immunogen wirksame Menge eines Antigens und ein Adjuvans enthält, worin die Vakzine im Wesentlichen frei von Nicht-Wirtsalbumin ist, umfasst das Kultivieren des Organismus in Wirtsserum, in dem sich kein Nicht-Wirtsalbumin befindet. Durch dieses Verfahren wird der Organismus in Gewebekultur oder Fermentationsmedium, das Wirtsserum anstelle von Nicht-Wirtsserum enthält, gezüchtet. Herkömmliches Ernten, Einengen und Reinigen können verwendet werden, wenn ein reines Produkt erzielt wird. Keine weitere Reinigung zur Entfernung von Nicht-Wirtsalbumin ist erforderlich, da das Präparat kein Nicht-Wirtsalbumin enthält. Durch dieses Verfahren kann das rohe Erntematerial auch verwendet werden, um die Vakzine zu formulieren. Unter Verwendung dieses Verfahrens kann das Erntematerial zur Formulierung der Vakzi- ne einfach mit Adjuvans kombiniert werden.
Nach der Reinigung und/oder der Entfernung von Nicht-Wirtsalbumin oder Wachstum des Organismus in Wirtsserum wird das Antigen deaktiviert und mittels herkömmlicher Verfahren mit Adjuvanzien versehen. Allgemein gesprochen kann das Antigen durch Behandlung mit einem deaktivierenden Mittel, das die schützende Komponente des Antigens nicht denaturiert, deaktiviert werden. Insbesondere kann das Antigen durch chemische Behandlung, durch Bestrahlung, Erhitzen oder durch Tiefkühlen/Auftauen deaktiviert werden. Beispielsweise können chemische Deaktivierungsmittel, ausgewählt aus der aus Formalin, beta-Propiolacton, Detergenzien und binärem Ethylenimin bestehenden Gruppe, verwendet werden. Verschiedene dieser chemischen Deaktivierungsmittel werden für verschiedene Organismen bevorzugt.
Das deaktivierte Antigen kann auch mit anderem geernteten Antigen vor der Zufuhr von Adjuvanzien eingeengt oder gesammelt werden. Die Höhe der Konzentration wird so gewählt, dass die mittlere Menge an Antigen oder der Wert der relativen Po tenz (Relative Potency, RP) dem minimalen annehmbaren Wert für eine Vakzine entspricht oder diesen übersteigt. Das deaktivierte Antigen kann, sofern erforderlich, durch Ultrafiltration mit einem Molekulargewichts-Cut-off, der das Antigen in geeigneter Weise aufrechterhält und das Passieren und Verwerfen von verunreinigenden Substanzen ermöglicht, oder durch differenzielle Zentrifugation bis zum 100facher konzentriert werden. Nach der Deaktivierung muss der Antigenwert über dem annehmbaren minimalen Niveau oder RP-Wert liegen. Anschließend wird es bei Temperaturen von -70 °C bis +10 °C gelagert, bis es mit einem Adjuvans vermischt oder mikroverflüssigt wird.
Das deaktivierte Antigen wird mit einem Adjuvans formuliert oder kombiniert. Adjuvanzien sind Chemikalien oder bakterielle oder virale Komponenten, die zu Vakzinen zugesetzt werden, um das Hervorbringen einer Immunantwort im die Vakzine erhaltenden Tier zu fördern. Adjuvanzien sind den allgemeinen Kategorien der Polymere, Block-Copolymere, Öle, Öl-in-Wasser-Emulsionen, Aluminiumsalze und bakteriellen und viralen Extrakte zuzuordnen. Die meisten Adjuvanzien funktionieren durch Her- vorrufen einer Irritation an der Injektionsstelle, was Leukozyten (Immunzellen) dazu führt, in den Bereich zu infiltrieren, und/oder durch Hervorrufen einer Depotwirkung (wobei die Antigene so lange wie möglich an der Injektionsstelle gehalten werden). Manche der neueren Adjuvanzien wirken als langsam freisetzende Mechanismen, die Antigene, die in ihnen eingekapselt sind, über einen relativ langen Zeitraum hinweg freisetzen. Sogar neuere Adjuvanzien beeinträchtigen B-Zellen oder T-Zellen des Immunsystems direkt und werden als Immunstimulatoren, Immunregulatoren, Immunmodulatoren oder Immunenhancer bezeichnet. Verursacht ein Adjuvans übermäßige Infiltration von Leukozyten in die Injektionsstelle, so treten Schwellungen und Reaktionen an der Injektionsstelle auf. Die Immunantwort auf Adjuvanzien kann auch die Reaktivität auf verunreinigende Substanzen wie Endotoxine steigern, wodurch die Wahrscheinlichkeit des Auftretens systemischer Reaktionen wie anaphylaktischer Schocks erhöht wird. Daher können sie, auch wenn Adjuvanzien zur Stimulierung der Immunantwort durch Deaktivieren von Vakzinen erforderlich sind, abträgliche Nebenwirkungen hervorrufen. Das Adjuvans wird aus der aus Polymeren, Block-Copolymeren, Ölen, Öl-in-Wasser-Emulsionen, Aluminiumsalzen, Immunmo dulatoren und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt. Vorzugsweise ist das Adjuvans ein Polymer oder Block-Copolymer. Das Adjuvans kann in einer Menge von 0,01 % bis 50 % verwendet werden. Die Menge an Adjuvans steht in engem Zusammenhang mit dem verwendeten Adjuvanstyp. Es ist jedoch wichtig, dass das Adjuvans in einer wirksamen Menge verwendet wird, um die deaktivierten Antigene immunogen zu stimulieren. Wenn die Adjuvanzien in solch einer Menge verwendet werden, können sie negative Reaktionen auf Nicht-Wirtsalbumin stimulieren.
Nach dem Deaktivieren des Antigens und Zuführen von Adjuvanzien zum Antigen kann die Potenz oder Relative Potenz (RP) des Antigens auf ein geeignetes Niveau eingestellt werden, das der minimalen annehmbaren Menge von Antigen, um eine immunogen wirksame Vakzine zu produzieren, entspricht oder diese übersteigt. Die zum Testen solcher Potenz oder relativer Potenz verwendeten Tests werden nachstehend beschrieben. Das/Die Antigene) kann/können mit anderen Antigenen formuliert werden. Deaktiviertes und mit Adjuvanzien versehenes felines Leukämievirus beispielsweise, das gemäß der Erfindung hergestellt wird, kann mit felinem Calicivirus, felinem Panleukopenievirus, felinem Rhinotracheitisvirus und felinen Chlamydien formuliert werden. Darüber hinaus kann deaktiviertes und mit Adjuvanzien versehenes Tollwutvirus, das gemäß der Erfindung hergestellt wird, mit caninem Parvovirus, caninem Distempervirus, caninem Parainfluenzavirus, caninem Adenovirus Typ 2 und verschiedenen Leptospira spp. formuliert werden. Auch deaktivierte und mit Adjuvanzien versehene equine Viren und bakterielle Antigenekönnen gemäß der Erfindung hergestellt werden. Manche oder alle dieser zusätzlichen Antigene können gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Manche der zusätzlichen Antigene können modifizierte Lebend-Antigene sein. Die endgültigen Kombinationsvakzinen sind jedoch im Wesentlichen frei von Nicht-Wirtsalbumin, wenn die Kombinationsvakzine oder das Impfprogramm, in dem die Kombinationsvakzine verabreicht wird, ein Adjuvans enthält. Die resultierende, mit Adjuvanzien versehene Vakzine, die im Wesentlichen frei von Nicht-Wirtsalbumin ist, ist sicher und wirksam und kann Tieren mit im Wesentlichen keinen negativen systemischen Reaktionen nach der Impfung verabreicht werden.
Als Maß für Vakzinenpotenz, die dem Vakzinenschutz im Wirtstier entspricht, wird jede einzelne Charge an Antigen (roh oder gereinigt) und Serie an Vakzinen Tests unterzogen. Die Messung kann das Impfen von Labortieren oder Wirtstieren, gefolgt von einer Provokation der Tiere, das Impfen von Labortieren oder Wirtstieren, gefolgt von einer Bewertung der serologischen Reaktion, oder die Durchführung einer enzymgekoppelten Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), um die Menge an Antigenen in der Vakzine zu messen, umfassen. Eine enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA) ist vorzuziehen, da sie Tierversuche ausspart. Im letztgenannten Verfahren wird die Antigenkonzentration in der Testvakzine gegenüber dem Antigengehalt in einer Bezugsvakzine, für die gezeigt wurde, dass sie im Wirtstier schützende Wirkung zeigt, gemessen. Eine Testvakzine, die mit 1,0 im Vergleich zur Bezugsvakzine gemessen wird, wird als potent betrachtet, und ihr wird eine relative Potenz (RP) von 1,0 zugesprochen. Die RP kann gemessen werden, bevor oder nachdem das Antigen geerntet, gereinigt, deaktiviert oder mit Adjuvanzien versehen wurde. Vor Deaktivieren und Hinzufügen von Adjuvanzien muss die RP über 1,0 liegen, sodass sie nach Deaktivierung und Hinzufügen von Adjuvanzien nicht unter 1,0 fällt.
Das gereinigte Antigen kann mit anderem gereinigten geernteten Antigen eingeengt oder gesammelt werden, sodass die mittlere Menge an Antigen dem minimalen annehmbaren Wert für eine Ernte entspricht oder diesen übersteigt. Das gereinigte An- tigen kann, sofern erforderlich, durch Ultrafiltration bei einem Molekulargewichts-Cut- oft, der das Antigen in geeigneter Weise aufrechterhält und es ermöglicht, dass verunreinigende Substanzen passieren können und verworfen werden, oder durch differenzielle Zentrifugation bis zum 100fachen eingeengt werden. Es ist wichtig anzumerken, dass, sogar wenn sehr geringe Konzentrationen an Serum zur Wachstumsförderungen verwendet werden, es praktisch unmöglich ist, seinen Albumingehalt aus Kulturen des Organismus oder der Vakzinen mittels herkömmlichen Reinigungsverfahren zu entfernen, insbesondere, wenn Einengung verwendet wird. Wird Antigen beispielsweise 100fach konzentriert, so würde eine Nicht-Wirtsalbumin-Konzentration von 0,1 % (1 mg/ml) im Antigen vor dem Einengen auf 10 % oder 100 mg/ml nach dem Einengen eingeengt werden. Solch eine Konzentration wäre in der endgültigen Vakzine absolut inakzeptabel.
Wie aus der obigen Beschreibung erkannt werden wird, ist eine charakteristische Eigenschaft der Erfindung die Entdeckung des Ursprungs des Problems von negativen systemischen Reaktionen nach der Impfung sowie die Lösungen auf eben dieses Problem. Ohne hier eine Einschränkung auf eine bestimmte Theorie zu beabsichtigen, wird angenommen, dass die negativen systemischen Reaktionen nach der Impfung aus der Gegenwart von Adjuvanzien und Nicht-Wirtsalbumin in Vakzinen oder Impfprogrammen resultieren. Durch diese Erfindung wurde nun eine Lösung entdeckt und offenbart, die das Entfernen von Nicht-Wirtsalbumin aus Vakzinen, die ein Adjuvans enthalten oder die im Rahmen von Impfprogrammen verabreicht werden, die mit Adjuvanzien versehene Vakzinen enthalten, oder das Verwenden von Wirtsserum zur Antigenherstellung anstelle von Nicht-Wirtsserum und das Verabreichen von Vakzinen und Impfprogrammen, die im Wesentlichen frei von Nicht-Wirtsalbumin sind, umfasst.
Diese und andere Aspekte der Erfindung werden nachstehend anhand der folgenden, nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht. In den Beispielen und in der gesamten Beschreibung sind die Anteile, außer anders spezifiziert, stets in Gewichtsanteilen angegeben.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Um zu bewerten, ob ein Unterschied in der Reaktivität zwischen equinen Vakzinen, die mit Nicht-Wirtsserum (fötalem bovinem Serum als herkömmlicher Ansatz) hergestellt wurden, und equinen Vakzinen, die mit Wirtsserum (fötalem equinem Serum) hergestellt wurden, besteht, wurden zwei Scheinvakzinen hergestellt. Eine Vakzine enthielt mit Adjuvanzien versehenes Medium mit 15 % fötalem bovinem Serum (Nicht-Wirtsserum-Ansatz), während die zweite Vakzine 15 % fötales equines Serum enthielt (Wirtsserum). Zwanzig Pferde wurden für diese Untersuchung verwendet. Das Adjuvans in den zwei Ansätzen stammte aus derselben Materialcharge und war ein „Carbopol"-basiertes Adjuvans. Die Pferde erhielten jeweils eine 2,0-ml-Dosis der Scheinvakzine, die fötales bovines Serum enthielt und die intramuskulär in den Hals injiziert wurde, und jedes von weiteren zehn Pferden erhielt eine 2,0-ml-Dosis der Scheinvakzine, die fötales equines Serum enthielt und intramuskulär in den Hals injiziert wurde. Eine Booster-Injektion der jeweiligen Vakzinen wurde alle 28 Tage in einem Zeitraum von etwa 8 Monaten verabreicht. Die Pferde wurden auf Reaktionen an den Tagen 1, 2, 3, 4, 7 und 14 nach jeder Injektion untersucht. Kurz vor der zweiten Injektion starb eines der Pferde, die das fötale bovine Serumpräparat erhielten, aufgrund einer Verwindung des Darms. Die verbleibenden 9 Pferde erhielten eine Boosterinjektion und wurden nach den Booster-Dosen der fötales bovines Serum enthaltenden Scheinvakzine beobachtet. Die Resultate dieser Beobachtungen sind in 1 gezeigt.
Nach der Verabreichung aller Injektionen der fötales equines Serum enthaltenden. Scheinvakzine gab es keine systemischen Reaktionen (0 von 480 möglichen Beobachtungen): Nur 2 unter den 480 möglichen Fällen wiesen eine Schwellung mit einem Durchmesser von 4" oder mehr auf. Die Schwellung trat in 2 aufeinander folgenden Beobachtungen desselben Pferdes nach Erhalt von 4 Injektionen auf. Das Anschwellen mit einem Durchmesser von 1-3" wurde bei 3 von 480 möglichen Beobachtungen festgestellt. Einunddreißig (31) Reaktionen von jeglichem Typ wurden unter den 480 möglichen Beobachtungen festgestellt. Alle Reaktionen traten in nur 1 der 10 Pferde (10 %) bis zur Impfung Nr. 8 auf, wonach 2 von 10 Pferden eine lokale Reaktion zeigten. Im Vergleich dazu gab es nach der Verabreichung aller Injektionen der Scheinvakzine mit fötalem bovinem Serum eine mögliche systemische Reaktion (den Tod von Pferd Nr. 606). Starke Schwellung (mit einem Durchmesser von mehr als 4") wurde in 22 von 432 möglichen Beobachtungen festgestellt. Sichtbare Schwellung (1–3" im Durchmesser) wurde in 34 von 432 möglichen Beobachtungen festgestellt. Einhundertsechsundvierzig (146) Reaktionen wurden aus 432 möglichen Beobachtungen bemerkt. Acht der verbleibenden neun Pferde (89 %) zeigten bis zu Impfung Nr. 8 Reaktivität, wobei 5 von 9 Pferden nach jeder Impfung routinemäßig reagierten. Diese Daten weisen darauf hin, dass bei wiederholter Injektion mit mit Adjuvanzien unterstützten Vakzinen die Gegenwart von Nicht-Wirtsserum (fötalem bovinem Serum in equinen Vakzinen) eine beträchtlich stärkere Reaktion hervorruft als die Gegenwart von Wirtsserum (fötalem equinem Serum).
BEISPIEL 2A
CRFK-Zellen (Crandell Feline Kidney), die dauerhaft mit FeLV infiziert waren, wurden bis zu 95%iger Konfluenz wie folgt gezüchtet. Die Zellen wurden in Rollflaschen mit 850 cm², die unter Rotation bei 37 °C inkubiert wurden, gezüchtet. Als Wachstumsmedium wurde Dulbecco's Minimal Essential Medium mit hohen Glucosekonzentrationen (DMEM-Hi), das 10 % fötales bovines Serum und 30 μg/ml Neomycin enthielt, verwendet. Nachdem die Zellen Konfluenz erreicht hatten, wurde das Medium gegen Erhaltungsmedium (DMEM-Hi-Medium, das 5 % fötales bovines Serum enthielt) getauscht. Nach vier Tagen wurde dieses Medium dekantiert, und virale Flüssigkeiten wurden geerntet. Die Zellen wurden mit Erhaltungsmedium neuerlich gefüttert, und virale Flüssigkeiten wurden alle drei bis vier Tage abgenommen, wobei insgesamt sieben Ernten durchgeführt wurden. Dekantierte virale Flüssigkeiten aus jeder Ernte wurden auf Sterilität getestet, in sterilen Kunststoffbehältern in Alquoten aufgeteilt und tiefgekühlt bei -70 °C gelagert. Bei zufrieden stellenden Sterilitätstests wurden virale Flüssigkeiten bei Raumtemperatur aufgetaut und in einem einzelnen sterilen Aufnahmebehälter gesammelt. Virale Flüssigkeiten wurden durch ein 3-μm-Polypropylenfilter geklärt, um Zelltrümmer zu entfernen, und anschließend 10fach unter Verwendung einer Tangentialdurchfluss-Ultrafiltrationsvorrichtung bei einem 30.000-Da-Molekulargewichts-Cut-off eingeengt. Die Flüssigkeiten wurden dann in 50 mM Na₂HPO₄ zur Erreichung eines 9fachen Endkonzentrationsfaktors gewaschen. Das gesammelte Konzentrat wies einen gesamten Proteingehalt von 16,59 mg/ml auf.
Eine Kationenaustausch-Chromatographiesäule wurde anfänglich verwendet, um das Virus und seine Untereinheiten vom Rückstand der Flüssigkeiten zu reinigen. Eine Säule mit 1 l Volumen und Ausmaßen von 14 cm × 10 cm wurde mit Q- Sepharose-Chromatographieharz (Pharmacia) gepackt und mit zwei Säulenvolumina an 1 M NaOH sterilisiert. Darüber hinaus wurde Säulenzubehör wie Pumpen, Röhren und Klemmen an der Säule mit 1 M NaOH sterilisiert. Die Säule und das gesamte Zubehör wurden dann mit 50 mM Na₂HPO₄-Puffer (pH 7,0) abgespült, bis der Abfluss von der Säule einen pH von 7,0 aufwies. Alle Puffer wurden vor der Verwendung durch ein 0,2-μm-Filter sterilisiert. Ein BioPilot-Chromatographiesystem (Pharmacia) wurde im Rahmen dieses gesamten Prozesses als Vorrichtung verwendet.
Eine 1.500-ml-Probe der eingeengten FeLV-Virusflüssigkeiten (Säulen-Feedmaterial) wurde auf die Säule injiziert. Die Säule wurde mit 9 Säulenvolumina Puffer A (50 mM Na₂HPO₄) bei 80 ml/min gewaschen, bevor Elution des Virus mit einem linearen Gradienten von Puffer B (50 mM Na₂HPO₄, 1 M NaCl) von 0 % bis 50 % Puffer B innerhalb von 10 Säulenvolumina erfolgte. Eine abschließende Elution von restlichem Virus erfolgte mit 5 Säulenvolumina an 100 % Puffer B. Fraktionen, die aus der Säule eluiert wurden, wurden abgenommen und auf den Gesamtproteingehalt untersucht. Der Gesamtproteingehalt betrug 3,12 mg/ml. Etwa die Hälfte hiervon war Nicht-Wirtsalbumin. Fraktionen, die das Virus enthielten, wurden dann gesammelt und neuerlich über eine Hydrophobsäule chromatographiert, um den Rest des Nicht-Wirtsalbumingehalts zu entfernen.
Ammoniumsulfat wurde zu den eluierten Virusfraktionen aus der Q-Sepharose-Säule (die stets > 1 mg/ml Nicht-Wirtsalbumin enthielt) zugesetzt, um eine Endkonzentration von 0,5 M zu erreichen. Dieses Virusfraktions-Säulen-Feedmaterial wurde auf eine hydrophobe 1-1-Phenylsepharose-Wechselwirkungssäule mit geringer Substitution, die davor mit 50 mM Na₂HPO₄ äquilibriert worden war, geladen. Die Säule wurde mit einer Kombination von 50 mM Na₂HPO₄ und 0,5 M (NH₄)₂SO₄ für 5 Säulenvolumina gewaschen. Das Virus wurde dann aus der Säule mit einem 50-mM-Na₂HPO₄-Puffer eluiert. Aus der Säule eluierte Virusfraktionen wurden auf Sterilität, Gesamtprotein- und Nicht-Wirtsalbumingehalt getestet. Alle Virusfraktionen waren steril, der Gesamtproteingehalt lag zwischen 0,9 und 1,2 mg/ml, und der Nicht-Wirtsalbumingehalt lag unter 0,5 mg/ml. Die virale Fraktion (Flüssigkeiten) wurden mit 0,03 % Formalin deaktiviert und durch Kombinieren mit entweder 5 % POLYGEN^TM- Adjuvans (erhalten bei MVP Laboratories, Ralston, Nebraska), 0,25 % Glycerin/EDTA-Stabilisator und 30 μg/ml Nystatin (FLV011) oder 0,125 % Carbopol-Adjuvans, 0,25 % Glycerin/EDTA-Stabilisator und 30 μg/ml Nystatin (FLV009) zu Vakzinen formuliert.
Zehn bis zwölf Wochen alte Katzen wurden mit einer 1-ml-Dosis an Vakzine subkutan immunisiert. Drei Wochen später wurde den Katzen eine 1-ml-Booster-Immunisierung verabreicht. Die Katzen wurden zehn Tage nach der Booster-Impfung mit virulentem felinem Leukämievirus provoziert. Dieser Challenge wurde wie folgt durchgeführt: 1) die Katzen wurden mit 10 mg Methylprednisolonacetat pro kg Körpergewicht intramuskulär an zwei aufeinander folgenden Tagen immunsupprimiert; und 2) die Katzen wurden mit etwa 1,5 × 10⁶ Fokus-bildenden Einheiten (FFU) an virulentem felinem Leukämievirus intranasal an jedem Tag der Immunsuppression provoziert. Die Katzen wurden an Tag 15 und Tag 1 vor der Challenge-Aussetzung untersucht, um sicherzustellen, dass sie nicht bereits mit FeLV infiziert waren oder Träger waren. Beginnend drei Wochen nach dem Challenge wurde den Katzen neun aufeinander folgende Wochen lang Blut abgenommen, und dieses Blut wurde mittels eines indirekten Immunfluoreszenztests auf „p27e"-Antigen untersucht. Alle Resultate der geimpften Katzen und Kontrollkatzen sind in Tabelle 1 dargestellt. Ein positives Testresultat für eine Katze wurde definiert als drei aufeinander folgende Wochen von Virämie oder fünf Wochen Virämie während der zwölfwöchigen Phase. Die Resultate weisen darauf hin, dass 100 % der Katzen, die mit „FLV011"-Vakzine geimpft wurden, und 70 % der Katzen, die mit „FLV009"-Vakzine geimpft wurden, vor dem Challenge geschützt waren, während 81 % der Kontrollkatzen durch die Challenge-Dosis infiziert wurden. Dieses Resultat entspricht jenem des Schutzes, der durch herkömmlich produzierte, jedoch reaktive handelsübliche FeLV-Vakzinen bereitgestellt wird, die 15 bis 80 % der geimpften Katzen bei einem ähnlich intensiven Challenge schützen, oder übertrifft jenes sogar. Diese FLV009-Vakzinenserie wurde der Standardbezug für zukünftige ELISA-Tests und enthält, per definitionem, eine RP von 1,0.
BEISPIEL 2B
Die Vakzine aus BEISPIEL 2A wurde von 21 praktizierenden Veterinärärzten in klinischen Feldversuchen, die in fünf verschiedenen Staaten durchgeführt wurden, auf Sicherheit getestet und evaluiert. Insgesamt wurden 913 Vakzinen-Dosen an 850 Katzen, die zwischen 8 Wochen und 15 Jahren alt waren, verabreicht. Die Veterinärärzte wurden angehalten, jegliche systemische Reaktion spezifisch festzuhalten und die Umstände, die mit solchen Zwischenfällen einhergehen, sollten diese auftreten, aufzuzeichnen. Es wurde nur eine systemische Reaktion verzeichnet. Diese Reaktion trat in einer Katze auf, die eine begleitende modifizierte feline Lebend-Kombinationsvakzine, die Nicht-Wirtsalbumin enthielt, erhalten hatte. Daher wird daraus geschlossen, dass die FeLV-Vakzine sicher ist und dass systemische Vakzinenreaktivität durch Verabreichen von Vakzinen, die keine Kombination aus Nicht-Wirtsalbumin und einem Adjuvans enthalten, unabhängig davon, ob in derselben Vakzine verabreicht oder ob in einer begleitenden Vakzine als Teil eines Impfprogramms verabreicht, eliminiert werden kann.
BEISPIEL 3
CRFK-Zellen, die fortdauernd mit FeLV infiziert waren, wurden bis zu 95%iger Konfluenz in DMEM-Hi, das 10 % fötales bovines Serum und 30 μg/ml Neomycin enthielt, unter Verwendung von 850-cm²-Rollflaschen, die unter Rotation bei 37 °C inkubiert wurden, wie in BEISPIEL 2A gezüchtet. Nachdem die Zellen Konfluenz erreicht hatten, wurde das Medium gegen Erhaltungsmedium (DMEM-Hi-Medium, das 5 % fötales bovines Serum enthielt) ausgetauscht. Nach vier Tagen wurde dieses Medium dekantiert, und virale Flüssigkeiten wurden geerntet. Die Zellen wurden neuerlich mit Erhaltungsmedium gefüttert, und virale Flüssigkeiten wurden alle drei bis vier Tage, insgesamt im Rahmen von sieben Ernten, abgenommen. Dekantierte virale Flüssigkeiten aus jeder Ernte wurden auf Sterilität getestet. Alle geernteten Flüssigkeiten wurden als steril erkannt. Virale Flüssigkeiten aus jeder Ernte wurden in sterilen Kunststoffbehältern in Aliquoten aufgeteilt und tiefgekühlt bei -70 °C gelagert. Bei zufrieden stellenden Sterilitätstests wurden virale Flüssigkeiten bei Raumtemperatur aufgetaut und in einem einzelnen sterilen Aufnahmebehälter gesammelt. Der gesamte Proteingehalt dieses gepoolten FeLV betrug 2,5 mg/ml. Virale Flüssigkeiten wurden durch ein 5-μm- und ein 1-μm-Polypropylenfilter geklärt, um Zelltrümmer zu entfernen.
Geklärte virale Flüssigkeiten (geerntetes flüssiges Säulen-Feedmaterial) wurden unter Verwendung eines Reinigungsverfahrens, das Perfusion Chromatography^TM unter Verwendung einer Hydrophobchromatographiematrix umfasst, gereinigt, um Nicht-Wirtsalbumin zu entfernen. Die verwendete Matrix wurde von PerSeptive Biosystems erhalten und war deren POROS-PE-50-Medium. Dieses Verfahren verwendet polare Gruppen an einer ungeladenen Matrix, um mit polaren Resten (z.B. Phenylalanin) an Proteinen wechselzuwirken und dadurch eine Retardierung und Trennung von Proteinen, basierend auf deren relativen Hydrophobizitäten, zu verursachen. Diese Wechselwirkung wurde durch den Zusatz von Natriumsulfat/Natriumphosphat mit hoher lonenstärke zu den viralen Flüssigkeiten, bevor diese zur hydrophoben Säule zugesetzt wurden, verstärkt. Die Säule wurde mit drei Säu- lenvolumina eines Puffers, der 20 mM Natriumphosphat, 650 mM Natriumsulfat enthielt, vor dem Zusatz von Ernteflüssigkeit-Säulen-Feedmaterial, gewaschen. Das Äquivalent von fünf Säulenvolumina an Ernteflüssigkeit-Säulen-Feedmaterial (vor Verdünnung mit Natriumsulfat/Natriumphosphat) wurde dann durch die Säule laufen gelassen. Um Nicht-Wirtsalbumin aus der Säule zu eluieren, wurde die Säule mit fünf Säulenvolumina von 20 mM Natriumphosphat/650 mM Natriumsulfat oder bis die op- timale Dichteablesung des Eluats < 0,03 bei einer Wellenlänge von 280 nm betrug gewaschen. Die resultierenden gereinigten viralen Komponenten wurden aus der Säule durch Waschen des Säulenharzes mit fünf Säulenvolumina an sterilem Wasser eluiert. Gereinigte virale Fraktionen wurden in einem separaten Sammelbehältnis gesammelt, wenn die optische Dichte (bei 280 nm) des Eluats über 0,15 anstieg, und das Abnehmen des Eluats endete, wenn die optische Dichte des Eluats unter 0,10 abfiel.
Gereinigte virale Flüssigkeiten wurden quantitativ auf Gesamtproteingehalt und qualitativ durch SDS-PAGE auf Nicht-Wirtsalbumingehalt getestet. Das Gesamtprotein betrug 1,35 mg/ml, und der Nicht-Wirtsalbumingehalt betrug weniger als 0,5 mg/ml. Um überschüssige Salze zu entfernen, die von den gereinigten Virusflüssigkeiten zurückgehalten werden, wurden diese Flüssigkeiten mit zehn Volumina an Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung unter Verwendung einer Tangentialdurchfluss-Ultrafiltrationsvorrichtung bei einem 30.000-Da-Molekulargewichts-Cut-oft diafiltriert. Die Flüssigkeiten wurden zu diesem Zeitpunkt eingeengt, um eine für die Dosierung der Vakzine ausreichende Endkonzentration an FeLV gp70 zu erreichen. Virale Flüssigkeiten wurden mit 0,03 % Formalin 72 h lang bei 4 °C deaktiviert.
Eine feline Leukämievakzine wurde aus gereinigten, deaktivierten viralen Flüssigkeiten durch den Zusatz von 0,125 mg/ml Carbopol, 0,25 % Glycerin/EDTA und 30 μg/ml Nystatin zu den deaktivierten viralen Flüssigkeiten in einer ausreichenden Konzentration, um bei Kombination mit dem Adjuvans immunogen aktiv zu sein, hergestellt. Diese Vakzine wurde mit der Vakzine aus BEISPIEL 2A unter Verwendung einer ELISA (enzymgekoppelten Immunadsorptionsbestimmung) verglichen, um Potenz (immunogene Wirksamkeit) zu messen. Diese ELISA misst die Menge an anti- gener Komponente in der FeLV-Vakzine im Vergleich zu einem Standardbezug. Der Standardbezug ist die Vakzine, wie sie in den Beispielen 2A und 2B beschrieben wurde (FLV 009), für die in einer Impf/Challenge-Studie gezeigt wurde, dass sie Katzen schützt. Ein Resultat von 1,00 in der ELISA weist darauf hin, dass die Menge an FeLV-Schutzantigenkomponente in der getesteten Vakzine jener der Vakzine aus den Beispielen 2A und 2B entspricht und Katzen gleich gut schützt. Die Vakzine aus diesem Beispiel zeigte eine Potenz von 1,32. Sie enthielt einen Proteingehalt von 1,1 mg/ml mit keinem nachweisbaren Nicht-Wirtsalbumin.
Es wurde somit gezeigt, dass das Durchführen von FeLV-Erntematerial, das Nicht-Wirtsalbumin enthält, durch eine hydrophobe Matrix alleine das Albumin entfernen kann und verwendet werden kann, um eine immunogen wirksame Vakzine zu produzieren.
BEISPIEL 4
Sechs Scheinvakzinen wurden formuliert, die nur 5 % Rinder-Fraktion-V-Albumin (Nicht-Wirtsalbumin), verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung und kombiniert mit verschiedenen Adjuvanzien, enthielten. Die Vakzinenformulierungen wurden achtundfünfzig (58) Katzen in einem Alter von etwa 22–26 Wochen verabreicht, die davor zwei Dosen einer Kombinationsvakzine aus abgetötetem Rhinotracheitisvirus/ Calicivirus/Panleukopenievirus, die Serumproteine aus Gewebekulturkomponenten enthielt, erhalten hatten. Die Katzen waren auch mit einer gereinigten felinen Leukämievakzine, die kein nachweisbares Nicht-Wirtsalbumin enthielt, geimpft worden. Katzen wurden nach dem Zufallsprinzip einer Nicht-Wirtsalbumin/Adjuvansvakzinen-Gruppe zugeordnet und wurden wöchentlich mit einer 1,0-ml-Dosis an Vakzine in drei aufeinander folgenden Wochen immunisiert. Tägliche Beobachtungen wurden zur Bewertung von Reaktivität getätigt. Die Resultate dieser Beobachtungen sind in Tabelle 2 dargestellt. Etwa sechs Stunden nach der ersten wöchentlichen Impfung zeigten zwei Katzen klinische Zeichen systemischer Reaktionen. Die diesen Katzen. verabreichten Impfungen stammten aus zwei unterschiedlichen Nicht-Wirtsalbumin/Adjuvans-Formulierungen. Klinische Zeichen umfassten Schwäche und fehlerhafte Koordination, Lautgebung, Erbrechen von blutig gefärbtem, schaumigem Auswurf, zyanotische Extremitäten, blasse Schleimhautmembranen mit verzögerter Kapillarauffüllung (3,5 s), Hypersalivation und Hyperpnoe. Behandlung mit Dexametha- son und subkutanen Flüssigkeiten konnten die Symptome nur geringfügig mildern. Diese zwei Katzen wurden daraufhin getötet.
Etwa vier Stunden nach der zweiten wöchentlichen Injektion zeigte eine weitere Katze etwas mäßigere Anzeichen einer systemischen Reaktion auf die Impfung. Klinische Zeichen im Zusammenhang mit diesem Tier umfassten Lethargie, rote Schleimhautmembranen, zyanotische/gerötete Ohrmuscheln und angeschwollene Augen. Dieser Versuch zeigt, dass die unübliche Reaktivität, die üblicherweise mit FeLV-Vakzinen (Erbrechen und Diarrhöe) assoziiert ist, durch eine Kombination von Nicht-Wirtsalbumin mit einem Adjuvans reproduziert werden kann. Die Reaktionsrate, die in diesem Versuch aufgezeigt wurde, scheint niedrig zu sein. Im klinischen Um feld jedoch werden solche Reaktionen nur bei weniger als 1,0 % der Katzen beobachtet. Dieser Versuch zeigte eine 2,0%ige Reaktionsrate, wenn alle Katzen in die Berechnung miteinbezogen wurden.
BEISPIEL 5
Feline Fünfer-Kombinationsvakzinen, hergestellt aus modifiziertem, lebendem oder deaktiviertem felinem Rhinotracheitisvirus, felinem Calicivirus, felinem Panleukopenievirus, felinem Chlamydienvirus und felinem Leukämievirus, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und sind auch mit der zuvor beschriebenen Reaktivität assoziiert. Eine Kombinationsvakzine aus deaktiviertem felinem Rhinotracheitisvirus, felinem Calicivirus, felinem Panleukopenievirus, felinem Chlamydienvirus und felinem Leukämievirus wurde gemäß dieser Erfindung hergestellt. Die felinen Rhinotracheitisvirus-, felinen Calicivirus-, felinen Panleukopenievirus- und felinen Chlamydienvirus-Schutz-Antigenkomponenten wurden einzeln in Gewebekultur ohne die Verwendung von Serum oder Albumin gezüchtet. Die schützenden Antigenkomponenten wurden geerntet, und alle enthielten Zelltrümmer. Die einzelnen Ernteflüssigkeiten wurden durch 3-μm-Filter geklärt, einzeln mit 0,1 M binärem Ethylenimin deaktiviert und einzeln mit 5 % Polygen^TM mit Adjuvanzien versehen. Das für diese Kombination verwendete feline Leukämievirus war jenes, das in Beispiel 3 hergestellt worden war. Einzeln deaktivierte und mit Adjuvans versehene Komponenten wurden in angemessenen Anteilen kombiniert, um ein Dosisvolumen von 1,0 ml zu bilden. Für alle fünf schützenden Antigenkomponenten wurde durch Testen in spezifischen ELISA-Tests, wie in Beispiel 3 beschrieben, gezeigt, dass sie immunogen wirksam waren. Die feline Rhinotracheitiskomponente wies eine RP von 1,12 auf, verglichen mit einer Vakzine mit einem Wert von 1,0, die 100 % der Katzen in einem anspruchsvollen Impf/Challenge-Test schützte. Die feline Caliciviruskomponente wies eine RP von 1,69 auf, verglichen mit einer Vakzine mit einem Wert von 1,0, die 100 % der Katzen in einem anspruchsvollen Impf/Challengetest schützte. Das feline Panleukopenievirus wies eine RP von 1,26 auf, verglichen mit einer Vakzine mit einem Wert von 1,0, die 100 % der Katzen in einem anspruchsvollen Impf/Challenge-Test schützte. Die Chlamydienkomponente wurde auf ihre Schutzfähigkeit in einem Katzen-Impf/Challenge-Test getestet. Sie schützte 100 % der geimpften Katzen.
Die fünffache feline Kombination dieser Erfindung wurde mit Konkurrenzprodukten verglichen, die dafür bekannt sind, Reaktivität der Art hervorzurufen, wie sie unter Verwendung von SDS-PAGE beschrieben wurde. 2 ist eine Photographie dieses Gels, das die Mengen an Nicht-Wirtsalbumin und anderen Proteinen in den verschiedenen Produkten zeigt. Es gilt anzumerken, dass für solche Elektrophoreseverfahren bereits gezeigt wurde, dass sie Albumin in Konzentrationen von 0,5 mg/ml in Vakzinen nachweisen. Die Gelspuren sind von links nach rechts nummeriert, wobei Nr. 1 die Spur links außen und Nr. 10 die Spur rechts außen ist. In 2 sind die Spuren 1, 2 und 4 einwertige FeLV-Vakzinen, für die erkannt wurde, dass sie auf dem betreffenden Gebiet hoch reaktiv sind. Sie enthalten eine signifikante Menge (>1,0 mg/ml) an Nicht-Wirtsalbumin, das durch eine Bande bei etwa 66.000 Da nachweisbar ist. Diese Vakzinen verursachten systemische Reaktionen des zuvor beschriebenen Typs sowie den Tod in einer maßgeblichen Anzahl an Tieren, wenn sie in Sicherheitsversuchen getestet wurden, die jenen aus Beispiel 2B ähnlich wa- ren. Spur 3 ist ein Molekulargewichtsmarker, der Banden bei 14,3, 20, 29, 34,8, 58,1 und 97 kDa enthält. Spur 5 ist die Vakzine, wie sie gemäß Beispiel 2A hergestellt wurde, die keine systemischen Reaktionen hervorrief, wenn sie auf Sicherheit im in Beispiel 2B beschriebenen Feldversuch getestet wurde. Sie enthält eine nicht nach- weisbare Konzentration an Nicht-Wirtsalbumin. Die Bande, die bei 70 kDa aufscheint, ist ein Hinweis auf die Gegenwart der antigenen gp70-Komponente. Spur 6 ist 5%iges bovines Serumalbumin (BSA), das als eine Nicht-Wirtsalbumin-Kontrolle dient. Es gilt anzumerken, das die gp70-Bande in Spur 5 leicht über dem Mittelpunkt dieser Nicht-Wirtsalbuminbande liegt. Spur 7 ist eine 5fache deaktivierte feline Kombinationsvakzine mit denselben Komponenten wie zuvor erwähnt, die von Fort Dod- ge Laboratories unter dem Namen FEL-O-VAX^R LvK IV vermarktet wird. Wie zuvor erwähnt weist das Compendium of Veterinary Products darauf hin, dass systemische Reaktionen mit dieser Vakzine in Verbindung gebracht wurden. Spur 8 ist eine 5fache modifizierte feline Lebend-/deaktivierte Kombinationsvakzine mit denselben Komponenten wie zuvor erwähnt, die von Solvay unter dem Namen Eclipse^R 4 + FeLV vermarktet wird. Diese Vakzine ist auch dafür bekannt, in Katzen reaktiv zu sein. Spur 9 enthält eine 3fache modifizierte feline Lebendkombinationsvakzine, die nur felines Rhinotracheitisvirus, felines Calicivirus und felines Panleukopenievirus enthält und von Intervet unter dem Namen PROTEX^TM-3 vermarktet wird. Diese Vakzine enthält kein FeLV, sodass kein gp70 vorhanden sein sollte. Daher ist die Bande bei 66 kDa Nicht-Wirtsalbumin. Diese Vakzine, sofern sie mit einer deaktivierten und mit Adjuvans versehenen FeLV-Vakzine im selben-Impfprogramm kombiniert wurde, verursachte in einer Studie, die in Zusammenarbeit mit den Erfindern durchgeführt wurde, systemische Reaktionen. Spur 10 ist eine 3fache modifizierte feline Lebendkombinationsvakzine, die felines Rhinotracheitisvirus, felines Calicivirus und felines Panleukopenievirus enthält, kein Adjuvans enthält und von Solvay unter den Namen Eclipse^R-3 vermarktet wird. Sie enthält kein FeLV und sollte somit keine Banden zwischen 60 und 70 kDa aufweisen. Es ist jedoch eine schwache Bande bei etwa 66 kDa zu erkennen, was darauf hinweist, dass diese Vakzine Nicht-Wirtsalbumin enthält. Es würde angenommen werden, dass dieses Produkt, wenn es in einem Impfprogramm zusammen mit einer mit Adjuvans versehenen Vakzine verwendet wird, systemische Reaktionen hervorruft. Aus dieser Figur geht eindeutig hervor, dass die FeLV-5fach-Kombinationsvakzine, hergestellt gemäß dieser Erfindung, unter jeglichen Vakzinen, die die fünf Komponenten enthalten, die geringste Menge an Nicht-Wirtsalbumin enthält. Auch ist es eindeutig, dass alle der reaktiven Vakzinen eine ausgeprägte Bande aufweisen, die für Nicht-Wirtsalbumin in einer Konzentration. von über 0,5 mg/ml steht.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung, die ein Antigen und ein Adjuvans enthält, zur Herstellung einer Vakzine, worin die Zusammensetzung im Wesentlichen frei von Nicht-Wirtsalbumin ist und weniger als 1,0 mg/ml an Nicht-Wirtsalbumin enthält und die Zusammensetzung wie folgt erhalten wird: (a) Züchten eines Organismus, der das Antigen produziert, in einer Kultur, die Nicht-Wirtsalbumin enthält; (b) Ernten der Kultur; (c) Klären der Ernte; (d) Abtrennen von Antigen und Nicht-Wirtsalbumin von der geklärten Ernte; (e) Abtrennen des Nicht-Wirtsalbumins vom Antigen; (f) Gewinnen des Antigens; Zusetzen von Wirtsserum oder Wirtsalbumin; und (g) Formulieren des Antigens mit einem Adjuvans.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Antigen aus der aus Viren, Bakterien, Rickettsiae, Parasiten, Protozoen, Untereinheiten davon und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 2, worin das Virusantigen aus der aus Retroviren, Herpesviren, Adenoviren, Paramyxoviren, Coronaviren, Morbilliviren, Hantaviren, Reoviren, Rotaviren, Togaviren, Parvoviren, Parapoxviren, Zytomegalieviren, Arboviren, Parainfluenzaviren, Untereinheiten davon und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 2, worin das Antigen ein aus der aus Clostridium spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Bordetella spp., Pasteurella spp., Salmonella spp., Myobacteria spp., Mycoplasma spp., Leptospira spp., Borrelia spp., Fusobacteria spp., Bacteroides spp., Rhodococcus-spp., Escherichia spp., Salmonella spp., Moraxella spp. Haemophilus spp., Untereinheiten davon und Kombinationen davon bestehenden Gruppe ausgewähltes Bakterium ist.
Verwendung nach Anspruch 2, worin das Antigen eine Rickettsia, ausgewählt aus der aus Chlamydia spp., Ehrlichia spp., Untereinheiten davon und Kombinationen davon bestehenden Gruppe, ist.
Verwendung nach Anspruch 2, worin das Antigen ein Parasit, ausgewählt aus der aus Toxoplasma spp., Dirofilaria spp., Cryptosporidium spp., Coccidia spp., Babesia spp., Neospora spp., Untereinheiten davon und Kombinationen davon bestehenden Gruppe, ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Adjuvans aus der aus Polymeren, Block-Copolymeren, Ölen, Öl-in-Wasser, Aluminiumsalzen und nichtspezifischen Im- munstimulanzien bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Adjuvans in einer Menge von 0,01 bis 50 % vorliegt.