JPS63210775A - ニワトリ伝染性フアブリキウス襄病診断用抗原の分離精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は、ニワトリ伝染性ファブリキウス嚢病ウィルス
（以下、ＩＢＤＶと略称する）を例えばウズラ胎児線維
芽細胞で増殖させ、限外濾過した後、夾雑タンパク成分
をアフイニテイクロマトグラフイーにより分離除去して
、ニワトリ伝染性ファブリキウス嚢病診断用抗原を高度
に精製する方法に関するものである。

〔発明の背景〕

伝染性ファブリキウス嚢病（以下ＩＢＤと略称する）は
、１９５７年、アメリカ東部プラウエア用の南部ガンボ
ロに初発したことから、別名ガンポロ病ともよばれるニ
ワトリの急性伝染病である。木屑にり患したヒナは、フ
ァブリキウス嚢が腫大し、出血し、後に萎縮するが、一
過性に経過し、多くのヒナでは軽い沈うつと下痢側を排
泄する程度で、死亡するものはまれである。

しかし、この病気で最も注目される点は、ニワトリのＢ
細胞の分化成熟の中枢器官であるファブリキウス嚢が決
定的に損傷を受けることである。それがために抗体の産
生が抑制され、他の感染病にかかり易くなる。

現在のところ、木屑の予防対策として、種ニワトリ用生
及び不活化ワクチンを用いた、いわゆるＬ−に法による
ワクチン接種が応用されている。これは、極熱を強固に
免疫することによりコマーシャルヒナに高い移行抗体を
保有させ、畔化後早期のＩＢＤウィルス感染を防御しよ
うとするものである。

このため、極熱のＩＢＤウィルス抗体の保有状況を把握
することは大変重要である。

ところで、従来このようなＩＢＤＶに対する抗体保育状
況の測定方法としては中和試験あるいは免疫拡散法が用
いられている。

しかしこれら従来法のうちの前者は、感度が高く感染防
御能との相関性もあるが、細胞培養を利用するため、手
技が煩雑で手間がかかり、判定までに時間を要するとい
う欠点がある。他方後者は、手技は簡単であるがその感
度に問題があることと、定量的な抗体測定が行えないと
いう欠点がある。

そこで、これらにかわる方法として、酵素免疫測定法（
以下ＥＬＩＳ＾と略称する）を利用する方法が考えられ
る。

ＥＬＩＳＡはエングバル（Ｅｎｇｖａ又ρ）とパールマ
ン（Ｐｅ、ｒ４ｍａｎｎ）によって開発された、抗体の
特異性と酵素反応の増幅効果を利用した感度の高い免疫
測定方法であり、感度及び特異性がすぐれ、手技も簡単
で、高価な設備も必要としないことから、近年、急速に
、種々のヒト及び動物の血清診断法に利用されるように
なっている。

しかし、末法は感度が非常に高い反面、反応に使用する
抗原中に微量に存在する夾雑タンパクによって非特異反
応がおこりやすく、これが実用化への大きな障害となっ
ている。特に野外のニワトリについてのＩＢＤウィルス
抗体の保有状況を把握する場合には、ワクチン接種によ
り異種動物成分のタンパク買により感作をうけているの
が普通であるから、このような異種動物由来のタンパク
買による非特異反応を除くためには、ＥＬＩＳＡに使用
する抗原中から細胞培養由来の異種動物成分をとり除く
精製技術が要求される。

〔発明の目的〕

本発明は、これらの問題を解決して、高度に精製された
ＩＢＤウィルス特異抗原を得る方法を提供することを目
的としてなされたものである。

〔発明の概要〕

本発明よりなるＩＢＤ診断用抗原の分離精製方法の特徴
は、ＩＢＤＶを、例えばウズラ胎児線維芽細胞等の培養
細胞中で増殖させ、ＩＢＤＶ特異抗原を含むウィルス培
養液を限外濾過し、つづいて抗細胞培養成分グロブリン
（例えば抗ウシ血清ウサギグロブリン）を親和性吸着体
として用いたアフィニテイクロマトグラフイーにより、
ウィルス培養液中に含まれていた霊雑タンパク成分を分
離除去して精製するようにしたところにある。

上記した非特異反応として特に重要となるのは増殖培地
中に加えられるウシ血清等の異種動物血清由来のタンパ
ク成分である。また併せてＩＢＤＶを感染させる上記ウ
ズラ胎児線維芽細胞等の培養細胞由来のタンパク成分に
ついても分離除去することが好ましい。

本発明方法の全工程の概略−例を示すと以下の通りであ
る。

常法にもとづきウズラ胎児線維芽細胞シートを作製する
。

ウィルス接種前に細胞表面をよく洗浄し、ＩＢＤＶをＭ
、Ｏ，１，（ＭｕＮｌｔｉｐＵｉｃｉｔｙ　ｏｆ　　Ｉ
ｎｆｅｃｔｉｏｎ）１程度で感染させる。維持培地には
、血清を含まないイーグル最小必須（Ｅａｇｌｅ　ＭＥ
Ｍ　）培地を用い、３７℃で培養する。

細胞変性効果が充分に認められた時点（３〜４日後）で
培養上清を回収し、遠心操作により細胞残漬を除去する
。

この上清を例えば分子量３００万以下の物質を透過する
限外濾過膜により　１／１００〜１１５００に濃縮する
。

さらにこの濾過後の材料を、抗細胞培養成分（ウズラ）
グロブリン分画を結合した、例えばＣＮ　Ｂｒ−５ｅｐ
ｈａｒｏｓｅ　４Ｂカラムを用いてアフイニティクロマ
トグラフィーを行い、カラムに非吸着の分画を回収して
、これが最終産物である診断用抗原となる。

以上によって本発明のＩＢＤ診断用抗原の分離精製を行
なうことができるが、本発明は上記概要−例の方法に限
定されるものではない０例えばアフィニティクロマトグ
ラフィーにおいては、要するにＩＢＤＶの培養に際して
用いる細胞。

培地由来の成分が、該診断用抗原を用いたＥＬＩＳＡの
際に夾雑タンパク成分として非特異的な反応を生じ弊害
となるので除去するのであるから、このアフィニティク
ロマトグラフィーで使用する親和性吸着体はＩＢＤＶの
培養に使用する細胞、培地に応じ作製した抗細胞培養成
分グロブリンが用いられる。また限外濾過はいわゆる限
外濾過膜を使用する場合の他、精密濾過膜。

逆浸透濾過膜等を用いて上記限外濾過膜使用相当の濾過
を行なうものであってもよいことは言うまでもない。要
は例えば概ね分子量３００万程度の濾過により細胞培養
由来の食雑タンパク成分の大部分を除去するものであれ
ばよい。

この診断用抗原を用いたＥＬＩＳＡは常法に従い行うこ
とができる。例えば酵素標識抗体に、西洋ワサビペルオ
キシダーゼを結合した抗ニワトリイムノグロブリン軽鎖
のモノクローン抗体を用い、発色程度はＥＬＩＳ＾用オ
ートリーダーにより、４９２ｎｍでの吸光度で測定する
ことで行なうことができる。

〔発明の実施例〕

つぎにＩＢＤＶ　Ｉ　Ｑ株を用い、高度に精製されたＥ
ＬＩＳＡに用いる診断用抗原を得るための行程、及び得
られた抗原を用いて行ったＥＬＩＳＡの結果を、実施例
をあげて具体的に説明する。

実施例（ウィルス特異抗原の精製） ウィルスは財団法人：日本生物科学研究所で分離し、継
代・維持されているＩＢＤＶ　Ｉ　Ｑ株を使用した。常
法にもとづき、ウズラ胎児線維芽細胞を作製し、ウシ血
清を加えた培地を用いてセルシート形成後、細胞表面を
血清成分を含まないイーグル最小必’Ｊ　（Ｅａｇｌｅ
　ＭＥＭ　）培地により２回洗浄した。

その後、ＩＢＤＶ　Ｉ　Ｑ株をＭ、０．１．１．５テ接
種し、血清成分を含まないイーグル最小必須　（Ｅａｇ
ｌｅＭＥＭ　）培地により３７℃４日間培養した。

４日後、培養上清を回収し、３０００Ｘ　ｇ、１０分間
遠心することにより細胞残渣を除き、これをウィルス培
養液とした。つぎに、分子量３００万以下の物質を透過
するｒ過膜を用いた限外ｒ通を行った。装置は東洋ソー
ダ社製５ｃａｏ型を、膜は同社製ＴＳ−３０００型を使
用した。

培養液は水冷下で循環させ、純水透過流量を２．５ｍｌ
／分となるように調整した。濃縮液が出発量の約１７５
０となった時点で、１００ｍＭ塩化ナトリウム、Ｉ　Ｉ
ＩＩＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、１
０ｍＭトリス塩酸ｍ衝液ｐ）１７．８により出発量の１
７１０量になるまで稀釈し、この後再び濃縮を行うこと
を２回繰り返し、夾雑タンパクの除去を行った。最終的
には、出発量の約１７２７０に濃縮した。

出発材料及び濃縮材料のウィルス回収率及び含有タンパ
ク量を表１に示す。

限外濾過後の材料では、総ウィルス感染価でみた回収率
は出発材料の５１．４％であり、タンパク当たりのウィ
ルス感染価でみた濃縮率は１４９倍であった。これらの
ことから、本行程によって効率的にウィルス及びその特
異抗原が濃縮され、培地成分由来の大部分の夾雑タンパ
クがとり除かれたことから、精製度が上昇したことがわ
かる。

次に上記特異抗原の精製度を高めるため、抗細胞培養成
分ウサギグロブリンを結合したＣＮ　Ｂｒ−５ｅｐｈａ
ｒｏｓｅ　４Ｂカラムを用いたアフィニティクロマトグ
ラフィーを行った。グロブリンを結合したゲルは、ウシ
血清、ＴＰＢ　（Ｔｒｙｐｔｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ
　ｂｒｏｔｈ）及びウズラ胎児線維芽細胞抽出物を含む
材料を抗原として高度に免疫したウサギ血清から、硫安
分画法によって分画した免疫グロブリンと、活性化した
ＣＮ　Ｂｒ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂゲル（ファルマシ
ア社）とを、添、付のマニュアルに従いカップリング反
応を行うことにより作製した。

すなわち限外濾過した上記濃縮材料を、前述の方法で作
製したゲルを充てんしたカラム（直径１．４ｃｍ　、高
さ２０ｃｍ）に添加し、閉鎖系で試料を循環させた。室
温、４時間循環させた後、カラムの吸着しなかった分画
を集め、これを精製抗原とした。

参考例、１（精製抗原の評価） アフィニティクロマトグラフイー精製抗原の精製度をみ
るため、免疫拡散法、ＥＬＩＳＡ　＆びソゲイウムドデ
シルサルフェート−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
（ＳＯ５−ＰＡＧＥ）による分析を行った。なお、従来
の報告にある超遠心法で精製した抗原についても、ＥＬ
ＩＳＡの反応性について、今回作製した抗原と比較して
みた。

免疫拡散法の結果を表２に示した。

抗ＩＢＤＶ血清に対する反応は、限外濾過濃縮後強くな
り、ウィルス特異抗原が濃縮されたことを示している。

抗つズラ胎児線維芽細胞に対する反応は、培養上清でか
すかな沈降線が認められたが、限外濾過濃縮後には消失
し、この過程で細胞由来タンパクは除かれたことが示さ
れた。一方、抗ウシ血清との反応性は培養上清で最も強
く、限外濾過の材料では反応は弱くなったが沈降線は認
められた。しかし、アフィニティクロマトグラフィー精
製後の材料ではこの沈降線の形成はみられなくなり、抗
原中からウシ血清成分はほぼ除かれたものと思われた。

つぎに、ＥＬＩＳＡにより、末法で得られた精製抗原が
、ウシ血清、ウズラ胎児線維芽細胞抽出物などの組織培
養成分を注射したニワトリ血清と反応するかどうかを検
討した。

限外濾過濃縮後材料では、ＥＬＩＳＡにより組織培養成
分注射ニワトリとの反応性が認められた（第１図参照）
。これは免疫拡散法の結果よリ、抗原中に残存している
ウシ血清成分に起因するものであると推察された。しか
し、アフィニティークロマトグラフィー精製後の抗原で
は、細胞培養成分注射ニワトリ血清との反応性も正常ニ
ワトリ血清と変わらないレベルとなり、この精製操作に
よってほぼ完全に抗原中から組織培養成分、特にウシ血
清が除去されたものと思われた。

木屑のＥＬＩＳＡに関する従来の報告では、ＥＬＩＳＡ
抗原の精製はすべて超遠心法によって行われている。し
かし、これらの報告の中では、抗原の細胞培養成分に対
する抗体との反応性、及び、その特異性に関しては詳細
には述べられていない。本発明者らはマクワードらの方
法（Ｍａｑｕａｒｄｔ。

Ｗ、Ｗ、　ｅｔ　ａｉ、：Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓ、、２４
．３７５．１９７９）にもとづき、培養上清を３０００
０　Ｘ　ｇ、　３時間超遠心することによフて抗原を作
製し、この抗原の反応性をみた。その結果、第１図に示
すように、この抗原はＥＬＩＳＡにより、細胞培養成分
注射ニワトリ血清との反応が認められた。すなわち、こ
の操作では完全に抗原中から細胞培養由来成分が除去さ
れていないことがわかった。この点で、本発明の分離・
精製方法によれば、従来法に比べより精製度の高い抗原
が得られることが分る。

さらに、タンパク質レベルでの抗原の精製度をみるため
、５０５−ＰＡＧＥによる分析を行った。濃度ゲルは５
％、分離ゲルは１２．５％のものを使用し、３０ｍＡ、
６時間株動をした。染色はコマジ−ブリリアントブルー
で行った。その結果、精製抗原には９４ｋｄ、９０ｋｄ
、６９．５ｋｄ、４２ｋｄ、３７ｋｄ、３２ｋｄ及び２
９ｋｄの７つのタンパク質が認められた。この結果を過
去の成績と比較すると、９４ｋｄ、９０ｋｄのタンパク
質はＶＰ−１ニｍ、４２ｋｄはＶＰ−Ｘｌ、：、３７ｋ
ｄはＶＰ−２ニ、３２ｋｄはＶＰ−３ｋｍ、及び２９ｋ
ｄはＶＰ−４１，１ｍ相当するものと思われた（下記表
２参照）。

これらの結果から、本実施例による精製抗原は、夾雑タ
ンパク質がほぼ除去され、はとんど全てのウィルス構成
タンパク貿が含まれた精製抗原であることが示された。

参考例、２（精製抗原を用いたＥＩＪＳＡの抗体測定へ
の応用） 精製抗原を用いたＥＬＩＳＡによって、ニワトリのＩＢ
ＤＶに対する抗体測定が可能かどうか、従来より行われ
ている中和試験と比較し、検討を試みた。　抗原は、０
．０５ａ＋Ｍ炭酸重炭酸ｉ衝液ｐＨ９，６により稀釈し
、１ウエル当たり５０μｇのタンパク量をＥＬＩＳ＾プ
レートに吸着させた。被検材料には、種々の中和抗体価
をもつＩＢＤ生及び不活化ワクチン接種野外ニワトリ血
清（１４０日令〜４１７日令）２４例を用いた。　ＥＬ
ＩＳ＾抗体価は、（試料のＯＤ値−標準陰性血清の００
値）÷（標準陽性血清のＯＤ値−標準陰性血清のＯＤ値
）を算出、これをＥ　（ＥＬＩＳＡ）値として示した。

中和抗体価は、ニワトリ胎児線維芽細胞を用いた５０％
プラーク減少法により行った。

それぞれの血清についてＥＬＩＳＡ抗体価と中和抗体価
を測定した結果を比較した。

その結果、ＥＬＩＳＡで測定した抗体価と中和試験によ
り測定した抗体価との間には、ｒ・０．９０８で正の相
関関係が認められた　（第２図参照）このことは、本抗
原を用いたＥＬＩＳＡによって高い特異性をもった抗体
価測定が可能で、ざらにＥＬＩＳ＾抗体価から、従来よ
り一般に用いられてきた中和抗体価を推定できることを
示している。なお、第２図の直線から、中和抗体　。

価とＥ値との関係式は中和抗体価　（Ｊ２ｏｇｌＯ）＝
ＥＥ値　３．３５８　＋　２．３０９となる。

さらに、本ＥＬＩＳ＾を野外の鶏群の抗体測定へ応用し
た。

３つの養鶏場において、ワクチンプログラムの異る鶏群
の免疫状態を調査する目的で、各々数羽ずつ採血を行い
、ＥＬＩＳＡによる抗体測定を行った。あわせて中和抗
体価も測定し、両者を比較した、その結果を下記表４（
表４”１〜４−３）に示した。

表４　　ＥＬＩＳＡによる免疫状態の測定への応用例表
４−Ｉ　Ａ農場 表４−２　Ｂ農場 表４−３０農場 例えばＡ農場においては第１群より第２群の平均Ｅ値は
高く、前述した関係式より求めた推定中和抗体価はそれ
ぞれ２６７０．９４８３であった。

実際に測定した中和抗体価はそれぞれ３５６６゜１２４
１７であり、ＥＬＩＳＡでの測定結果とほぼ同様の傾向
を示していた。Ｂ農場、Ｃ農場においても、群別に測定
した中和抗体価と、ＥＬＩＳＡで測定したＥ値及び推定
値とほぼ同じ傾向を示していた。これらのことから、木
ＥＬＩＳＡにより、従来行われていた中和試験に比べ、
はるかに簡易に鶏群の免疫状態が把握できることが明ら
かになった。

発明の効果〕 以上、実施例及び参考例１．２による結果を総合すると
、本発明法によって比較的容易に、かつ高度に精製され
たＩＢＤウィルスの診断用抗原を得ることができ、また
、この抗原を用いてＥＬＩＳＡを行った場合、従来の報
告にあるものより高い特異性をもった反応が得られるこ
とがわかった。このことより、本発明法は多くの利点を
もった血清診断法であるＥＬＩＳＡを実用化するにあた
り、不可欠な基礎技術となるものと思われた。

【図面の簡単な説明】 第１図は、本発明により得られた診断用抗原、限外濃縮
材料、及び従来の超遠心法による精製抗原にＥＬＩＳＡ
による反応性の結果を比較して示した図、第２図は種々
の抗体価をもつ２４例のニワトリ血清について、本発明
により得られた診断用抗原を用いて行ったＥＬＩＳＡの
反応結果（Ｅ値）と、中和試験により求めた抗体価（中
和抗体価）との相関を示した図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 培養細胞中で増殖させた伝染性ファブリキウス嚢病ウィ
   ルス特異抗原を含むウィルス培養液を、限外濾過し、次
   いで抗細胞培養成分グロブリンを親和性吸着体として用
   いたアフィニテイクロマトグラフィーにより夾雑タンパ
   ク成分を分離除去することを特徴とするニワトリ伝染性
   ファブリキウス嚢病診断用抗原の分離精製方法