CN1134112A - 衣原体感染的疫苗及治疗方法 - Google Patents
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Abstract
提供了治疗衣原体感染的疫苗，该疫苗由来自衣原体的外膜蛋白(MOMP)制剂和脂类多糖(LPS)制剂组成。还提供治疗和免疫动物对衣原体感染的方法。
Description
沙眼衣原体是今日美国最普遍的经由性传播的细菌病原体。由它引发的合并症可能是极其严重的。患者可能患盆腔疾病，如尿道炎、尿道综合症及泌尿道感染。孕妇因感染沙眼衣原体而可能导致自发性流产这一点已被证实。此外，婴儿可经由母亲生殖道而被感染，并患衣原体结膜炎和衣原体肺炎。
动物和人体受衣原体感染的情况是很相似的。鹦鹉热衣原体这种动物身上的衣原体主要侵犯眼及生殖道的粘膜上皮细胞。感染后动物通常表现出在应激下才显出症状的慢性携带者状态。远端生殖道上皮细胞携带鹦鹅热衣原体的无症状雌性动物被认为会在分娩时感染它们的新生儿。在许多国家，绵羊中的衣原体感染是一种经济上灾难性的疾病。羊的衣原体性的流产，被称作羊地方性兽病性流产(OEA)，即来源于鹦鹉热衣原体的感染。该病原体引起羊的坏死性胎盘炎及其后发生的羊羔的流产。鸡胚产生的鹦鹉热衣原体株经福尔马林灭活制备而成的疫苗诱发ewes的免疫力，从而对抗羊衣原体性流产。该疫苗及类似产物曾在数十年内成功地被用于预防OEA病原体。但是在最近，这种疫苗的效果变得很不稳定，出现了疫苗免疫过的羊群的暴发性衣原体OEA感染。异种激发试验指出该情况可能是变异株导致的。
最近，使用含主要外膜蛋白MOMP的亚细胞疫苗及含源于OEA衣原体株的基体EBs的亚片段疫苗被证明可防止OEA。(Tan等人，1990，感染免疫58：3101-3108)Tan等人使用一种改进的方法去分离衣原体的外膜复合物(COMC3)以得到含丰富未变性之MOMP的亚细胞疫苗。这一产品，用20微克蛋白的单一剂量，可保护绵羊免于OEA。另一种由纯化EBs制备而来的疫苗，单一剂量160微克蛋白，同样可防止OEA。Tan等人认为MOMP即是OEA疫苗中的主要保护成分，并建议使用重组DNA方法来对抗OEA，因为他们相信，仅仅40KD的MOMP抗原就足以达到这一目的。但是，Tan等人的疫苗被发现含残量的脂多糖(LPS)，这一成分并不认为在对抗OEA衣原体感染的疫苗中是重要的，因为含抗LPS抗体的血清在被动转移试验中并不能诱发对OEA的预防。被认为对抗LPs的种特异的抗原决定簇的抗体经补体固定后发现与对抗鹦鹉热衣原体引发的绵羊流产并无联系。
感染动物及人体的其它衣原体株的疫苗的研制并不那么成功。以缩短寿命或灭活的细菌株制备而得的疫苗可能防止鹦鹉热衣原体感染。但是，这些疫苗仅仅导致疾病严重程度的下降，而非预防疾病或排除病原体。人体沙眼衣原体疫苗使用杀死的，完整的基体，它被证明有某种保护性，但是，在一些情况下，延迟型超敏反应会发生，从而加重疾病。眼部使用57KD的热休克蛋白被显示出可诱发动物体的单核细胞炎症反应。除了热休克蛋白，衣原体的脂多糖成分同样被认为在衣原体导致的眼部疾病的疾病发生中起作用。
当完整的病毒衣原体疫苗被认为有某种保护性时，它们同样被认为引起有害的效果。这一点导致对在亚单元或重组疫苗中使用的个别成分的评估。抗沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)的多克隆及单克隆抗体被认为可以中和灵长类动物模型上这种病原体引起的眼部感染。猴子口服免疫纯化的来自沙眼衣原体的MOMP仅仅导致对其后发生的眼部不适的部分预防。由于MOMP的保护能力及特异性抗MOMP的抗体的中和感染的能力，研究重点放在识别T、B细胞对这种蛋白的抗原决定簇上。
现在发现，以衣原体制备MOMP，或者单独或者以基体或外膜复合物形式出现，与LPS结合后，是一种抗动物衣原体感染的有效疫苗，这种结合物比单独的变性的MOMP在诱发抗衣原体感染的保护性反应上更为有效。
一方面，目前的发明提供了治疗衣原体感染的一种疫苗，它由衣原体主要外膜蛋白及脂多糖组成。
另一方面，目前的发明提供了治疗衣原体感染的一种方法，包括给予感染动物有效剂量的疫苗，它由原体的主要外膜蛋白及脂多糖组成。
除此以外，目前的发明提供了免疫健康动物以抵御衣原体感染的一种方法，包括给予健康动物以疫苗，它由衣原体细菌的主要外膜蛋白及脂多糖组成。
目前的发明提供了在动物中治疗和免疫防御衣原体感染的疫苗。疫苗由单独的纯粹形式的主要外膜蛋白(MOMP)或伴有基体(EBs)的主要外膜蛋白或外膜复合物(COMCs)以及衣原体细菌的脂多糖(LPS)组成，其中衣原体优选鹦鹉热衣原体或沙眼衣原体，最好是Baker株的鹦鹉热衣原体。可能加入佐剂疫苗的效果会被增强。
疫苗中的MOMP或以纯粹方式或以与EBs相伴方式或以COMCs方式存在、MOMP可由各种途径纯化得来，并不仅限于层析法或电泳法。
电泳法纯化MOMP(MOMP-E)可按如下进行：衣原体收获液离心，沉淀重悬于水中，样品用凝胶电泳分析，最好是SDS-PAGE。样品中的蛋白最好在95℃Tris缓冲液(pH6.8，含SDS、2-疏基乙醇、甘油、溴苯酚蓝)中加热5分钟使之溶解。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，胶染色后轻微脱色，40KD的带切下后放在透析袋中，蛋白于是被电洗脱出凝胶。
层析法纯化(MOMP-C)是这样进行的：从EBs中去掉非MOMP蛋白，最好通过37℃下在含EDTA的磷酸盐缓冲液PBs中与N-月桂酰-肌氨酸作用1个小时来达到。之后，溶液被离心，沉淀洗后重悬于最好是含MgCl2、脱氧核糖核酸酶及核糖核酸酶A的磷酸盐缓冲液中，之后悬浮液置37℃下孵育2小时，离心，沉淀洗后重悬于最好含SDS、EDTA的PBs中，悬浮液再次37℃孵育、离心，上清透析置于最好是含二硫苏糖醇及SDS的磷酸盐缓冲液中，之后，加样于事先用相同缓中液平衡的羟基磷灰石柱上，柱子用线性梯度(0.1-0.6M)的磷酸盐(pH6.4，含二硫苏糖醇及SDS)缓冲液冲洗。SDS提取后的沉淀被再次提取，上清部分及含MOMP的沉淀混合后透析置于水中。
疫苗中MOMP的制备也可以伴有EBs或COMCs。
EB亚片段制剂是从衣原体收获液中分离出来的。衣原体最好选用鹦鹉热衣原体，如用在哺乳动物细胞中传播的Baker株的鹦鹉热衣原体则更好。细胞收获液浓缩、铺在35％的Renogratin-76上，离心，沉淀重悬，再次铺于泛影葡胺(diatrizoate meglanione)及泛影酸钠的不连续梯度上并离心，含EBs的位于44—52％交界处的带被收集，洗并重悬于最好是0.01M的磷酸盐缓冲洗，(pH8.0，含0.15M NaCl)，之后EBs被灭活，最好用BEI(二元氮丙啶)，β-内酯、福尔马林或戊二醛，如果用BE1则溶液最好加入硫代硫酸钠中和。
欲分离COMC制剂，灭活的EBs经离心、沉淀溶解于最好是含N-月桂酰-肌氨酸及EDTA的PBs中，溶液被离心，沉淀洗后重悬于PBs。
脂多糖(LPS)同样被加入疫苗，LPS通过电泳法被分离出，收获液沉淀的样品被制备用于如MOMP-E所描述的电泳，电泳在聚丙烯酰胺凝胶上进行。最好使用具有内部拆分能力的Tris/麦黄酮缓冲液系统或Tris/甘氨酸缓冲液系统。凝胶上6KD标记之下部分被切下并置于碱性溶液，最好是0.1M甘氨酸-氢氧化钠，pH11.0中孵育。液体从硅胶上分离出，pH调整到中性，然后透析。
抗原特性已得到证实，蛋白浓度也已确定。将MOMP-C，MOMP-E，EBs，COMCs和LPS放在小瓶中冷冻抽干。通过称量冻干粉样品的重量来确定LPS的量。然后样品再用药用适宜载体复溶，这种载体包括等渗盐、5％石旋糖水溶液或者水，最好还有佐剂，包括但不限于QuilA，AlhydrogeL，及含有QuilA和5％Alhydrogcl的组织培养基。含(装)有LPS的小瓶首先水化，然后该溶液再用水水化MOMP制品，这样就形成了一种包含MOMP及LPS的疫苗制剂。
该疫苗可用于患衣原体感染的动物，也可用来免疫健康动物，使之预防衣原体微生物的感染。该疫苗可皮下、肌肉内、腹腔内及静脉注射，还可口服，鼻吸或者做成栓剂，剂量范围是MOMP和LPS各0.01-100μg/剂量。
说明书中使用的“MOMP制剂”是指所有包含纯化MOMP的疫苗制剂，包括但不限于MOMP-E和MOMP-C，及与MOMP相关的EBs或COMCs。“LPS制剂”指含有纯化的脂多糖疫苗制剂。“有效剂量”是指使用疫苗量能够使感染衣原体的动物产生足够强大的免疫反应来杀死微生物。“佐剂”是指注射其本自身可引起一种非特异性免疫状态，表现为对感染的抵抗力加强。比如组织培养基中QuilA和5％Alhydrogel。本发明将进一步通过实例加以阐述。
实例1亚片段抗原制剂。
衣原体收集液，衣原体psittaci，Baker株在狗肾(DK)细胞中扩增，将DK细胞在含2％胎牛血清的DMEM中培养，收集上清，用1％BE1灭活，再用0.25％硫代硫酸钠中和。
衣原体基本成分(EBs)。没有灭活的衣原体收集液用搅拌的细胞浓缩器或离心机浓缩，浓缩物或小丸铺在35％Renographin-76上，43,000g离心1小时，沉积物(小丸)重新悬浮，然后再将其铺在40％，44％，52％的Renographin-76上的呈不连续密度梯度，用43，000g离心1小时，EBs在44～50％之间的带中，收集该带，用0.01M，pH8.0，含有0.15M NaCl的磷酸缓冲液洗涤，再悬浮。EBs用1％BEI灭活然后再加0.25％硫代硫酸钠中和。
衣原体外层膜复合物(COMCs)，灭活后的EBs在10℃，100，000g下离心1小时，然后将沉积物用含2％N-月桂酰-肌氨酸和1.5mM EDTA的PBs溶解，37℃，1小时该溶液再在100,000g条件下离心1小时，沉积物用PBs洗一次，最终悬浮在PBs中。实例2亚单位抗原制剂
色谱纯化的MOMP(MOMP-C)。MOMP的色谱纯化方法是采用Caldwell等(1981)lnter lmmun.31：1161-1176上所叙述的方法。简单地说，用前述方法制备EBs，然后在37℃用含2％N-月桂酰-肌氨酸和1.5mM EDTA的PBs处理1小时，从外层膜复合物中提取非MOMP蛋白。该溶液在100,000g条件下离心1小时，沉积物用PBs洗涤，然后用3～5ml含10mM MgCl2，25μg脱氧核糖核苷酶和25μg核糖核苷酸酶的0.2M磷酸钠悬浮，悬浮液在37℃孵育2小时，然后100,000g离心1小时，沉淀物用PBs洗涤，再悬浮于含2％SDS和1.5mM EDTA的PBs中，37℃孵育1小时，悬浮液在100,000g下离心1小时，然后上清用含1mM二硫苏糖醇和0.1％SDS(初始的缓冲液)的PBs透析，之后装在已用初始缓冲液平衡的羟基磷灰石柱上，该柱用初始缓冲液冲洗，然后再用150ml呈线性梯度的0.1到0.6MpH6.4的磷酸盐缓冲液冲洗，该缓冲液含1mM二硫苏糖醇和0.1％SDS，经每管1ml收集。SDS抽提后的沉积物在37℃条件下用下面的每种缓冲液：含1％N-月桂基-肌氨酸，pH7.4的0.01M磷酸盐；含1％-N-月桂基-肌氨酸和10mM二硫苏糖醇，pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液；含1％辛基糖苷和10mM二硫苏糖醇pH7.4的0.01M磷酸缓冲液；进行周期性声处理，再抽提30分钟，该方法是根据Bavoil等(1984年)lnfect Immun.44：479—485；从上清中收集的片段及含有MOMP的沉积物最终混合，用水透析。
电泳方法纯化MOMP(MOMP-E)。富含衣原体收集液在25，000g条件下离心，沉积物复溶在双蒸水中，样品用SDS-PAGE溶解，蛋白质在含2％(W/V)SDS，5％2-巯基乙醇(V/V)，3％(W/V)甘油、0.002％(W/V)溴酸兰和50mM Tris(pH6.8)的缓冲液中加热至95℃5分钟溶解。电泳是在10％(W/V)聚丙烯酰胺凝胶(1.5mm厚)上，用不连续缓冲系统完成的，该方法参见Laemmli(1970)Nature(自然)(Londorl.227：680-685，凝胶用溶于50％甲醇和10％乙酸溶液中考马斯亮兰G染色，再用50％甲醇和10％乙酸溶液脱色，切下40KPa带，放在能阻滞分子量为12-14KPa的透析袋中，蛋白质在50V，1小时条件下电泳扩散到凝胶外。
脂多糖(LPS)。收集样品准备电泳的方法同MOMP-E。电泳是用Tris/麦黄酮缓冲系统在12.5％聚丙烯酰胺凝胶上完成的。该方法参见Schagger和Von Jagow(1987)，Anal.Bio Chenr 166：368-379.阴极用的缓冲液是0.1M Tris，0.1 M麦黄酮，0.1％SDS，pH8.25，阳极用的缓冲液是0.2M Tris，pH8.9，将低于6KDa的带切下，放在0.1M甘氨酸-NaOH，pH11.0缓冲液中37℃孵育3小时。然后再将溶液弃去，将pH调至中性，之后用阻滞分子量1KDa的透析膜透析，双蒸水作为透析液。
实例3，蛋白质和LPS定量及评估。
蛋白质是用BCA分析试剂盒(Pierce，p.o.Box 1A，Rockford llli-nois，61105)定量的。LPS的量是用冷冻干燥后的样品称重得到的。在制备疫苗前，抗原的纯度是通过用于50％甲醇和10％乙酸中的Coomassie兰G对SDS-聚丙酰胺染色，然后在50％甲醇和10％乙酸中大致脱色来评估的。抗原鉴定是通过Wester Blot分析确认的。该方法用对猫产生的C.psittaci专一的多克隆抗血清，该实验程序包括电泳转移SDS胶上的抗原片段到lmmobilon膜上(Milliporeration，Badford，MA 01730)，该膜用含5％即溶脱脂奶粉的PBS封闭，随后与特异性抗体在室温培育1小时，再用含0.3％Tween(V/V)的PBs冲洗，再与羊抗猫碱性磷酸酶标记的的抗体孵育(Kirkegaavd & Perry Laboratories lnc，2 Cessna court，Gaithes burg，Mary Land 20879)，膜经充分洗涤后，用BCIP/NBT底物显色(KirKegaard & Perry Lab.lnc.2，Cessna Court，Gaithesburg Mary Land20879)，染色的凝胶和杂交斑点用生物显像系统的光显像扫描分析(Milliport Corporation，Badford，MA 01750)。实例4疫苗制品
继小鼠疫苗制品之后，用于研究I-III的亚片段抗原制品也已出现，自从先前已研究了它的有效性后，为研究I，将特异未经处理的感染组织培养液作为阳性对照，制备这种疫苗干粉后再用RPMI复溶，在RPMI中加200μg/ml QuilA和5％Alhydrogel，在以前的实验中表明可以保护小鼠，蛋白量为8.1μg/100ml.疫苗中EBs的量是根据收集液中经Western Blot之后MOMP带纯度决定的，基于这一点，EB疫苗中蛋白浓度0.575μg/100μl也可以得到收集液和EB疫苗的3个10倍系统列稀释液。
研究II，EBs和COMCs是按以下方式形成的。疫苗中COMCs的量是由纯化EB制品时MOMP带电强度决定的，然后纯化的EB制品用PBS稀释，调整到于COMCs中MOMP浓度相等。将它们进一步稀释，总蛋白浓度达5μg/100μl用同样方法制备COMC疫苗，最终蛋白浓度分别为2.8μg/100μl和0.28μg/100μl。
在阐明亚单位抗原前，先确定每种抗原的量，将每种抗原分装，冷冻抽干，瓶内装有MOMP-C，MOMP-E和LPS，用含200μg/mlQuilA和5％Alhydrgcl的RPMI培养液复溶，浓度调至100μg/100μl，为提供MOMP＋LPS疫苗，在复溶LPS后用其溶液在复溶MOMP-E。最终在100μl总容量中两种抗原各100μg，3个10倍稀释度的上述4个疫苗在含200μg/ml QuilA和5％Alhydrogel的RP-MI培养液中。所有疫苗在制备和应用期间都保存在4℃。(1天用第一剂量，14天用第二剂量)。例5：疫苗和接种
雌性Swiss White CF-1小鼠重12-14g，间隔两周皮下注射100μl疫苗2次。10μg MOMP-C组、MOMP-E，LPS，MOMP-E＋LPS组；0.058μg EB组和0.81μg收集液组每组为10只小鼠。其余组8只小鼠为一组。在第二次免疫后两周，两只另外的小鼠在这些组中处死取血，并在这一天把余下的小鼠接种。接种组和对照组腹腔注射C.psittaci.Cello株(Ceull(1967)Am.J.ophlhamol.，63：1270-1273)。
每次研究，另外三组(10只小鼠)用10倍的系列免疫物的稀释度免疫小鼠的确定LD50。在通常用的免疫接种的衣原体稀释度和在此免疫物1∶10的稀释度时，所有的对照组小鼠(每组10只)死亡。
所有的亚单位提取物，除LPS，当以100μg/剂量应用时可100％保护小鼠。用滴定法也观察了保护效果的剂量依赖关系。同时对应用10μg剂量的不同的含MOMP的提取物进行比较表明单独应用MOMP-C和MOMP-E加LPS能保护100％的小鼠，而单独的MOMP-E只能诱导60％的保护水平。用1.0μg和0.1μg剂量的MOMP-C和MOMP-E加LPS提取物观察了保护的水平。这些水平显著比单独MOMP-E诱导的高。见表1提供资料。
表1
衣原体亚单位制剂对小鼠的保护作用
| 亚单位制剂抗原/佐剂 | 总蛋白(μg) | 保护水平(％)#总的存活数 |
| MOMP-C2％ALOH，25μg Quil A | 100 | 8/8(100) |
| 10 | 8/8(100) | |
| 1.0 | 6/8(75) | |
| 0.1 | 0/8(0) | |
| MOMP-E2％ALOH，25μg Quil A | 100 | 8/8(100) |
| 10 | 5/8(62.5) | |
| 1.0 | 3/8(37/5) | |
| 0.1 | 0/8(0) | |
| LPS2％ALOH，25μg Quil A | 100 | 3/8(37/5) |
| 10 | 3/8(37/5) | |
| 1.0 | 0/8(0) | |
| 0.1 | 2/8(25) | |
| MOMP－E＋LPS2％ALOH，25μg Quil A | 100 | 8/8(100) |
| 10 | 8/8(100) | |
| 1.0 | 5/8(63.5) | |
| 0.1 | 1/8(12.5) |
EBs用甲醇固定，按1μg/孔加入96孔圆形底的2块培养板中。平板用双蒸水冲洗，然后用3％马血清(溶在PBs中)室温封闭1小时。鼠血清用含0.3％的PBS稀释加入平板中。室温培养1小时，平板用含0.3％吐温的PBs冲洗，然后与过氧化酶标记的小鼠IgG抗血清孵育(Kirkegard & Perry Laboratories lnc.，2 Cessna Court，Gaithesburg，Maryland 20879)。平板然后用含0.3％吐温的PBs冲洗并加ABTS底物显色(Kirkegaard & Perry Leboratories lnc.，2Cessna Conrt，Gaithesburg，Maryland 20879)。30分钟后测O.D.405-490。滴度的小鼠血清稀度OD值为0.200表示。空白对照在0.002-0.004单位之间。
血清滴度的确定是在免疫之前随机从每一剂量组选2只小鼠。观察了疫苗保护小鼠感染和EB特异血清反应相互关系。对单独用MOMP-C和MOMP-E加LPS免疫的小鼠进行了Western blot分析。表明此反应总是对MOMP特有的。
Claims (24)
1.用于治疗衣原体感染的疫苗，其包括从衣原体制备的MOMP和LPS。
2.权利要求1中的疫苗，其中MOMP制剂是在EBs或COMCs背景下从MOMP-E，MOMP-C，和MOMP组份中选出来的。
3.权利要求2中的疫苗，其中MOMP制剂包括在EBs背景下的MOMP。
4.权利要求2中的疫苗，其中MOMP制剂包括MOMP-E。
5.权利要求1疫苗，其中衣原体包括鹦鹅热衣原体。
6.权利要求5疫苗，其中鹦鹅热衣原体包括Baker株。
7.权利要求1中的疫苗，其中还包括佐剂。
8.用于治疗衣原体感染的疫苗，其包括在EBs、LPS和佐剂背景下的MOMP。
9.治疗衣原体感染的方法，其包括对感染衣原体的动物应用有效量的包括从衣原体来源的RMOMP制剂和LPS制剂的疫苗。
10.权利要求9的方法，其中疫苗中MOMP制剂是在EBs或COMCs背景下从MOMP-E，MOMP-C和MOMP组中选择出的。
11.权利要求10的方法，其中疫苗中的MOMP制剂包括在EBs背景下的MOMP。
12.权利要求10的方法，其中疫苗中MOMP制剂包括MOMP-E。
13.权利要求9方法，其中衣原体包括鹦鹉热衣原体。
14.权利要求13方法，其中的鹦鹅热衣原体包括Baker株。
15.权利要求9方法，其中的疫苗还包括佐剂。
16.治疗衣原体感染的方法，其包括对感染衣原体的动物给予在EBs、LPS和佐剂背景下的有效量的疫苗。
17.免疫动物抵抗衣原体感染的方法，其包括对健康的动物给予包括来自衣原体的MOMP制剂和LPS制剂的疫苗。
18.权利要求17的方法，其中疫苗中MOMP制剂是在EBs或COMCs背景下从MOMP-E、MOMP-C和MOMP组中选择出的。
19.权利要求18方法，其中疫苗中的MOMP制剂包括在EBs背景下的MOMP。
20.权利要求18的方法，其中疫苗中的MOMP制剂包括MOMP-E。
21.权利要求17的方法，其中衣原体包括鹦鹉热衣原体。
22.权利要求21中的方法，其中鹦鹅热衣原体包括Baker株。
23.权利要求17的方法，其中疫苗还包括疫苗的佐剂。
24.免疫动物抗衣原体感染的方法，其包括对健康的动物给予包括在EBs、LPS和佐剂背景下的MOMP的疫苗。
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